杂合基质和杂合基质混合物的制作方法

专利名称：杂合基质和杂合基质混合物的制作方法
本申请书要求对1999年10月5日提交的美国申请系列号09/413,715和2000年9月14日提交的美国申请系列号09/662,037的优先权。
本发明领域是在体内或在体外用于生产和输送医学上有用的物质的医学装置。
背景技术：
用来输送医学上有用的物质的装置能显著影响其效能。许多这样的物质的标准施用途径是口服、静脉内或皮下。其每一种均有固有的局限，这可影响所输送的物质的治疗效果。而且，许多基于蛋白质的药物具有较短的半衰期和较低的生物利用度，这是在其配制和输送中必须考虑的因素。尽管已经研制了许多装置来输送医学上有用的物质，包括便携式泵和导管，但仍然十分需要改进的输送装置。
许多医学上有用的物质(包括蛋白质、糖蛋白和某些肽和非肽激素)可由培养的细胞比通过人工合成途径更有效地产生。合适的细胞一般在生物反应器中培养，并且从中纯化希望的产物，用来通过标准方法对患者施用，例如口服或静脉内或皮下注射。此外，也能直接将细胞植入患者体内，在此产生并输送希望的产物(参见，例如，美国专利号6,063,630和6,054,288)。尽管该方法比注射产物本身具有许多理论上的优点，包括可以控制正常细胞反馈机制以输送生理学合适水平的产物的可能性，但它引起了额外的复杂性。其中之一涉及细胞植入时的适宜环境。将植入的细胞以与包含植入物的细胞型天然体内环境相容的方式组织起来将是希望的(例如，成纤维细胞在主要由胶原组成的胞外基质的丰富网络中天然存在)。有时也需要确保植入的细胞仍位于患者体内的特定部位，使得能监测它们，并且或许可在不再需要时去除。
为此目的测试的一种技术使用一种由包埋有细胞的固体、单片胶原凝胶(一种“胶原基质”)组成的植入装置(例如，Bell，美国专利号4,485,096和美国专利号5,965,125)。在胶原植入体中也可含有其它物质，如聚四氟乙烯(PTFE)纤维(Moullier等人，Nature Genetics，4154，1993；WO 94/24298)，以赋予胶原凝胶强度和其它希望的特性。
发明概述曾经发现，向胶原基质中加入微载体(即任何形状的小球体)，由此形成此处所说的“杂合基质”，能大大提高胶原基质的功能。这在胶原胶凝形成基质前将微载体与细胞和可溶性胶原混合可以实现。为了提高包埋细胞的生存力、生长和/或功能，本发明的基质可含有用下列一种或多种试剂包被或包封的固体底物(例如，琼脂糖珠、胶原珠、胶原线或胶原或非胶原纤维)。
申请人也已经发现，通过将微载体和细胞(和任选的与下列一种或多种试剂结合(例如，结合、包被或包封)的固体底物)在液体中悬浮，并通过如注射将该悬液导入体内，能将细胞导入动物体内。悬液除了细胞、微载体和上处所述任何试剂包被或包封的固体底物之外，还可包含可溶性胶原。这些成分混合在一起，并作为液体悬液输送到动物体内。输送可以通过可注射系统，如连有一个针头或导管的注射器。使用大孔微载体可显著提高细胞附着的表面积，也能为附着并迁移到微载体孔中的细胞提供保护。在含有胶原的混合物中，胶原部分聚合，在动物体的输送部位形成胶原凝胶固体块。该凝胶在悬浮成分(细胞、微载体和任选的固体底物)周围原位形成。凝胶有助于使注射的成分保持一定的距离，其大小将取决于植入材料的体积、植入部位的空间大小和周围组织的结构。胶原的存在能保护细胞免于在植入过程中产生的剪切应力。另外，通过提供保护性屏障，胶原可帮助降低宿主炎症细胞对植入细胞的潜在破坏。含胶原的混合物被称为“胶原基质混合物”(CMM)，用CMM(在体内或体外)形成的固体基质被称为“胶原基质”(CM)。
希望时，微载体和细胞能一起培养一段时间，使得在加入非胶凝的胶原溶液和固体底物之前，细胞附着于微载体；此外，也能将三种或四种成分基本上同时或以任何希望的顺序混合，希望时，随后可溶性胶原在体外胶凝，形成由不溶性胶原原纤维、细胞和微载体组成的凝胶混合物。凝胶混合物通过液体的排除逐渐变小，形成固体、相对有弹性的可植入单位，其中含有在不溶性胶原原纤维网络中包埋的微载体和细胞(和任选的与下列任何试剂结合(例如，结合、包被或包封)的固体底物)。当含有微载体时，得到的CMM在此被称为“杂合胶原基质混合物”(HCMM)，由这种HCMM产生的基质被称为“杂合胶原基质”(HCM)。不含胶原或含胶原替代物(见下文)的混合物被称为“基质混合物”；当这些混合物含有微载体时，它们也被命名为“杂合基质混合物”(“HMM”)。应当理解，微载体可以由胶原或除胶原之外的物质组成。
本发明因此包括具有由基质材料制成的主体的制品、组合物或装置，基质材料包含不溶性胶原原纤维，并在主体中分散有(a)大量脊椎动物细胞(特别是哺乳动物细胞，如来自人、黑猩猩、小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、兔、母牛、马、猪、山羊、绵羊、狗或猫的细胞)；(b)与固体底物结合(例如，结合、包被或包封)的一种或多种试剂(见下文)；和(c)大量微载体，每一种优选地主要由(即，其干重的50％以上是)一种或多种选自胶原(优选地I型胶原)、聚苯乙烯、葡聚糖、聚丙烯酰胺、纤维素、藻酸钙、乳胶、聚砜、玻璃(例如，凝胶(如胶原)包被的玻璃，以提高细胞的粘附)和明胶(例如多孔明胶)的物质组成。一般每种微载体干重的至少70％、优选地至少80％(最优选地约90％-100％，例如，至少95％)是一种或多种所列物质。所述基本由纯化胶原组成的微载体的商品实例包括ICN CellagenTM珠和Hyclone GelatinCultisphere。微载体优选地具有多孔一致性，但也可以是光滑的，一般是直径约为0.1-2mm(例如约0.3-1mm)的近似球形的形状。当然，来自任一批次或制品的微载体的形状和大小将在制造公差内变化。
能使制品成形，以便植入动物(例如哺乳动物，如病人)体内，或者能设计用于在体外生产细胞产物；例如，在体外生物反应器装置中(其具有一个使血液从动物分流到制品、然后回到动物血管中的工具)，或在一种生物反应器或其它容器中(能从中回收含有希望的细胞产物的培养基，用于药剂的纯化和制备)。
细胞可以来源于取自患者的一种或多种细胞，优选地是含有编码一种或多种多肽(例如，医学上有用的多肽，如酶、激素、细胞因子、集落刺激因子、血管生成因子、疫苗抗原、抗体、凝集因子、调节蛋白、转录因子、受体或结构蛋白)的外源DNA的遗传工程(例如转染的)细胞。这些多肽的例子包括人生长激素(hGH)、因子VIII、因子IX、促红细胞生成素(EPO)、白蛋白、血红蛋白、α-1抗胰蛋白酶、降钙素、葡糖脑苷脂酶、低密度脂蛋白(LDL)受体、IL-2受体、珠蛋白、免疫球蛋白、催化抗体、白介素、胰岛素、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、促胰岛素(insulinotropin)、甲状旁腺激素(PTH)、肥胖蛋白、干扰素(IFN)(例如IFN-α、IFN-β或IFN-γ)、神经生长因子、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、酸性FGF(aFGF)、表皮生长因子(EGF)、内皮细胞生长因子、血小板衍生生长因子(PDGF)、转化生长因子、内皮细胞刺激血管生成因子(ESAF)、血管生成素、组织纤溶酶原激活剂(t-PA)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、促卵泡激素(FSH)、α-半乳糖苷酶、β-gluceramidase、α-艾杜糖醛酸苷酶、艾杜糖-2-硫酸酯酶、葡糖胺-N-硫酸酯酶、α-N-乙酰氨基葡糖苷酶、乙酰辅酶Aα-氨基葡糖苷酶-N-乙酰转移酶、N-乙酰葡糖胺-6-硫酸酯酶、β-半乳糖苷酶、N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶、β-葡糖醛酸酶、血管内皮生长因子(VEGF)、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C和VEGF-D。此外，外源DNA还可含有调节序列，任选地可激活内源基因表达的其它元件(例如，利用如WO94/12650-PCT/US93/11704所述的同源重组，在此引用作为参考)。
在本发明的基质中通常能使用可附着胶原和/或微载体，并显示希望的性质(如医学上有用的细胞产物的表达，或必需结构或代谢功能的表现)的任何类型的细胞。例子包括脂肪细胞、星形细胞、心肌细胞、软骨细胞、内皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞、神经节细胞、腺细胞、胶质细胞、造血细胞、肝细胞、角质细胞、成肌细胞、神经细胞、成骨细胞、胰腺β细胞、肾细胞、平滑肌细胞和横纹肌细胞，以及上述任一种的前体。希望时，在特定基质中能包含一种以上的细胞。细胞能以纯系(clonal)或异系群体存在。
尽管本发明的基质不需要含有胶原，但它们优选地含有。基质材料中的胶原优选地是I型，但可以是其它任何类型的胶原。基质材料能任选地包含两种或多种类型的胶原(例如，选自I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X和XI型)，以及能赋予产生的基质希望的特性的其它任何成分例如，琼脂糖、藻酸盐、纤连蛋白、层粘连蛋白、透明质酸、硫酸乙酰肝素、硫酸皮肤素、硫酸软骨素、硫酸蛋白聚糖、血纤蛋白、弹性蛋白、细胞粘合素、肝素或多糖(如纤维素、淀粉、葡聚糖或壳聚糖)。此外，代替胶原或除胶原以外，基质中能包含下列物质，来赋予它们胶原的性质，或增强这些性质绞碎的脂肪组织、绞碎的网膜组织、甲基纤维素、藻酸盐、明胶或血纤蛋白。上述任何胶原或非胶原的成分都能来自人类来源或其它动物或植物来源。如果来自动物来源并且可能具有免疫原性，优选地动物与将要植入的受者相同。在该装置中也能包含胶原或非胶原纤维。胶原纤维可以是在基质材料主体内分散的交联的胶原线形式。非胶原纤维能由例如包括尼龙、涤纶、聚四氟乙烯、聚乙醇酸、聚乳酸/聚乙醇酸聚合物混合物、聚苯乙烯、聚氯乙烯共聚物、兽肠线、棉花、亚麻、聚酯或丝在内的材料制成。
杂合基质中能含有大量细胞。例如，能制备杂合基质，假定接种的细胞数和最初产量相等，其含有至少约为单独用可溶性胶原制备的基质两倍(优选地约三倍)的细胞。在一定时间内，在特定杂合基质中包埋的细胞所表达的多肽(例如医学上有用的多肽)的总量一般显著高于由等量原材料制备的标准胶原基质所达到的(例如，至少高50％，优选地至少高100％，更优选地至少高200％)。
本发明的杂合基质也含有一种或多种(例如至少2、3、4、5、6、8或10种)试剂，旨在改善基质功能，例如提高增殖和/或细胞保持。例如，这些试剂可包括促进血管形成的因子、细胞因子或生长因子。尽管在特定杂合基质中使用的试剂和基质中细胞产生的多肽(例如医学上有用的多肽)可以是同一物质，但这两种物质一般是不同的。该试剂与加入同一混合物中的固体底物结合(例如，结合、包被或包封)。固体底物可以是微载体本身，或者可以是独立的物体(例如，包埋于基质中的多个固体底物颗粒，或单片)。固体底物可以与肝素或硫酸乙酰肝素蛋白聚糖结合，作为促进试剂结合的工具。这种固体底物的一个例子是主要由琼脂糖组成的底物(例如，Sepharose、Affi-GelTM、肝素凝胶或肝素-琼脂糖)，含或不含与之结合的肝素或硫酸乙酰肝素蛋白聚糖；这种固体底物也可含有藻酸钙。能用来生产固体底物的其它物质包括胶原、明胶、乙烯-醋酸乙烯酯共聚物、聚乳酸/乙醇酸共聚物、血纤蛋白、八硫酸蔗糖、葡聚糖、聚乙二醇、藻酸盐、聚丙烯酰胺、纤维素、乳胶、聚羟乙基丙烯酸酯、尼龙、涤纶、聚四氟乙烯、聚乙醇酸、聚乳酸、聚苯乙烯、聚氯乙烯共聚物、兽肠线、棉花、亚麻、聚酯和丝。固体底物可以呈多种物理形式，例如，珠、不规则颗粒、片或线。当试剂包封于固体底物中时，该试剂随时间逐渐释放。这些固体底物能作为微载体，以及试剂库。因此，当本发明的特殊基质包括能作为微载体的固体底物时，含有上述任何微载体不是必需的。
能在基质中使用的试剂的例子包括碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、VEGF、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、内皮细胞生长因子、血小板衍生生长因子(PDGF)、内皮细胞刺激血管生成因子(ESAF)、白三烯C4、前列腺素、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、血管生成素、转化生长因子-α(TGF-α)、转化生长因子-β(TGF-β)、抗坏血酸、表皮生长因子(EGF)、制瘤素M或angiopoietin 1、2、3或4。
每种试剂的生物活性浓度非常不同。初始范围由厂商提供，通常是根据利用如细胞增殖程度作为终点的标准生物活性测定。一般而言，试剂可以以任何浓度范围(最低是出售者报道具有生物活性的浓度，最高是报道浓度的约1000倍)与底物(如肝素-Sepharose珠)结合；这些珠掺入HCM中；用合适的检测系统(例如免疫测定)监测试剂随时间的体外释放。对于这些释放测定，基质被置于含10％血清的生长培养基中。一旦确定基质释放出可检测量的试剂，即进行生物活性测定。含一定浓度范围的试剂的基质能被置于多孔插入物(3-8μm孔)上，其位于例如众所周知应答该试剂增殖的细胞(例如对于VEGF和bFGF为内皮细胞，对于bFGF和PDGF为成纤维细胞，如厂商所述)之上，并确定细胞生长曲线。估测体外生物活性测定结果，记录认为没有生物活性的剂量以及确定为“毒性”(即，导致细胞数低于对照)的剂量。为了确定每一基质的试剂最佳浓度，能将根据体外生物活性结果含一定浓度范围的试剂的基质植入无免疫应答小鼠中。每一基质的最佳试剂浓度一般是使最大量治疗蛋白质在体内释放最长时间的浓度。
代替在基质材料主体内与固体底物结合或包封的所述试剂(或除它们之外)，杂合基质除可表达一种多肽(例如医学上有用的多肽)的第一种培养的遗传工程脊椎动物细胞群之外，还可含有表达和分泌一种或多种(例如至少2、3、4、6、8或10种)试剂的第二种培养的脊椎动物细胞群。第二种培养的脊椎动物细胞群可遗传改造(如下所述)以表达该试剂，或者可以是产生该试剂的细胞，而没有遗传工程的益处。对于后者，如果细胞不组成型产生多肽，或极低量地产生，则能通过基因激活诱导细胞产生该试剂，或更高量地产生。本发明的基质可含有另一群培养的脊椎动物细胞，它们表达和分泌上述试剂的其它实例。产该试剂的群体的培养的脊椎动物细胞可以是，例如脂肪细胞、星形细胞、心肌细胞、软骨细胞、内皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞、神经节细胞、腺细胞、胶质细胞、造血细胞、肝细胞、角质细胞、成肌细胞、神经细胞、成骨细胞、胰腺β细胞、肾细胞、平滑肌细胞、横纹肌细胞，或上述任一种的前体。细胞优选地是人细胞，但也可以是任何脊椎动物(例如，哺乳动物，如非人灵长类动物，猪、母牛、马、山羊、绵羊、狗、猫、小鼠、大鼠、兔、豚鼠或仓鼠)的细胞。当基质中包含产生该试剂的细胞时，也可任选地包含固体底物，以在从细胞分泌时结合一部分试剂。这提供了一种控制从杂合基质释放试剂的速率的方法。
在一个优选实施方案中，本发明的杂合基质含有角质细胞，例如，(a)作为产生多肽(例如，医学上有用的多肽)的细胞，(b)作为产生试剂的细胞，(c)(a)和(b)两者，或(d)作为既不产生多肽又不产生试剂的群体。加入角质细胞的杂合基质优选地含有成纤维细胞作为产生上述多肽(例如，医学上有用的多肽)和/或试剂的细胞。角质细胞和成纤维细胞能从同一个体获得，并且能向杂合基质中加入一种或多种角质细胞分化因子(例如，浓度为1.5-2mM的钙离子、TGF-β或角质细胞分化因子-1(KDF-1))。
类似地，优选地除产生多肽(例如，医学上有用的多肽)的成纤维细胞外，甚至除成纤维细胞和角质细胞外，本发明的杂合基质还能含有内皮细胞。能向杂合基质中加入一种或多种内皮分化因子(例如，10ng-10μg的VEGF或bFGF)，诱导基质内内皮管的形成。分化因子能在形成过程中直接加入基质中，或加入基质生长培养基中，或此两者。
本发明的杂合基质一般通过包括下列步骤的方法制备形成一种混合物，该混合物包含(a)大量脊椎动物细胞；(b)大量微载体，每一种均优选地主要由一种或多种选自胶原、聚苯乙烯、葡聚糖、聚丙烯酰胺、纤维素、藻酸钙、乳胶、聚砜和玻璃的物质组成；(c)一种含有可溶性胶原的溶液；和(d)一种或多种与固体底物结合(例如，结合、包被或包封)的上述试剂；和使该混合物中的可溶性胶原形成包埋有细胞和微载体的不溶性胶原原纤维凝胶；和将凝胶置于可使凝胶通过液体排除而变小的培养条件下，从而形成制品主体。胶凝一般通过将相对酸性胶原溶液的pH提高到5以上来引发，例如，加入浓缩的、缓冲的培养基，于是胶原形成不溶性原纤维。当该步骤在模子中进行时，凝胶将成为模子内部的形状。凝胶的收缩一般受混合物中的细胞影响，它们附着于原纤维，使凝胶收缩为模制形状(例如，当模子是圆柱形的培养皿时，为圆盘)的较小形式。基质能在生产后立即使用，能培养提高基质中存在的细胞数量，或改进其作用，或能在0℃以下无限期冻存。它们也能临时贮存在较高温度的冰箱中，例如约4℃。
为了制备这些含有一种或多种上述试剂的杂合基质，向混合物中加入有关试剂(结合或包封于上述任一种固体底物中)，以及以上所列的其它成分。试剂和固体底物能一起或以任何顺序分开加入混合物中。另外，混合物也可含有第二种(任选地，第三、第四、第五、第六或更多种)培养的脊椎动物细胞群，它们分泌一种或多种所述试剂。该混合物也可含有一种或多种上述固体底物，它们包含一种或多种与试剂结合的物质(例如肝素或硫酸乙酰肝素)。为了制备含角质细胞的杂合基质，能在收缩步骤之前向混合物中加入角质细胞，或者能在凝胶收缩后加入组合物主体中。
在制备本发明的任一种杂合基质中，能在填充混合物至深度约为0.18cm(例如，约0.1-0.3cm，优选地约0.15-0.21cm)的平底模子中形成凝胶。例如，能使用体积(V)的混合物，在内半径(r)的平底圆柱形模子中形成凝胶，使r2/V约为1.8(例如1.5-2.0)。本发明包括使用特定深度的混合物和/或特定r2/V比产生的杂合基质，因此具有特有的厚度。例如，能使用4ml的体积，在半径约为2.65cm的圆柱形模子中形成凝胶，或在半径不是2.65cm(即更大或更小)的模子中形成，所用混合物的体积成比例改变。
多肽(例如，医学上有用的多肽)，如以上所列的，可以通过一种处理方法输送给患者，该方法包括提供含有可分泌目的多肽的细胞的杂合基质，将制品植入患者的所选部位，例如皮下、腹膜内、网膜内、肾小囊下、腹股沟、肌内或鞘内部位。当多肽是促进创伤愈合的多肽(例如PDGF或IGF-I)时，能将基质植入预先存在的创伤部位。如上所述，细胞可来源于取自患者的一种或多种细胞，优选地用编码该多肽的外源DNA体外转染。此外，它们也可以是自然分泌多肽或行使希望的代谢功能的细胞(例如角质细胞或胰腺β细胞)。细胞能通过基因激活诱导，分泌多肽，分泌较高量的多肽，或行使希望的代谢功能。用于对患者施用多肽的合适的杂合基质可以是上述任一种。
在另一个实施方案中，可通过上述装置分流患者的部分血液，使杂合基质中的细胞分泌的多肽与血液混合，来对患者施用多肽(例如医学上有用的多肽)。本领域技术人员公知的任何这类装置一般都适于容纳本发明的基质。例如，分流到含有围绕本发明的基质的渗透选择性膜的装置中的血液将使基质的治疗产物输送到血液中。一种类似于人工胰脏的装置(Sullivan等人，Science 252718-721，1991)能用于该目的。另外，此处所述的任何杂合基质都能用于这些装置。
本发明的杂合基质的另一种用途是作为体外生产希望的多肽(例如，此处所列的任何多肽)的工具。该方法包括下列步骤将杂合基质置于基质中的细胞可表达并分泌多肽的条件下；将基质与液体接触，使细胞向液体中分泌多肽；从液体中获得多肽，例如，通过适合于特定多肽的标准纯化技术。在一个实施方案中，将基质锚定于一种表面，并用液体洗浴；此外，基质也可自由漂浮于液体中。包埋于杂合基质中的细胞在小空间中高水平地作用。而且，与大多数标准细胞培养方法相比，使用这些基质，纯化表达的多肽的第一步(从培养基中去除细胞)明显更有效。
本发明也包括一种液体混合物，其含有(a)培养的脊椎动物群(例如，以上所列的任何哺乳动物)，其通常表达一种多肽；(b)大量微载体，如以上所列；和(c)至少一种选自促进血管形成的因子、细胞因子、生长因子和抗坏血酸的试剂，至少一种试剂与胶原溶液中悬浮的固体底物结合(例如结合、包被或包封)。
细胞可以是上述可在基质中使用的任何细胞，并且可以类似地遗传改造以表达相同的多肽。
尽管本发明的液体混合物不需要含有胶原，但它们优选地含有。混合物中的胶原可以是此处所列的任何类型，或是任何类型的组合。混合物中有足量的胶原，使混合物在pH5以上胶凝。液体混合物也可含有以上列出的其它任何成分。代替胶原或除胶原以外，混合物中能包含下列物质，以赋予由该混合物产生的基质胶原的性质，或增强这些性质绞碎的脂肪组织、绞碎的网膜组织、甲基纤维素、藻酸盐、明胶和血纤蛋白。
微载体允许在本发明的混合物中含有高浓度的细胞。例如，当使用可溶性胶原使植入的混合物形成原位杂合基质时，这种杂合基质将具有体外形成的杂合基质的优点(见上文)。
本发明的混合物也可含有一种或多种(例如，至少2、3、4、5、6、8或10种)上述试剂，旨在改进由该混合物产生的基质的作用，例如，通过提高增殖和/或细胞的保持。而且，能以对于基质所述的任何形式，将试剂加入混合物中，例如，在溶液中游离，或包被于固体底物上。
测定在本发明的混合物中使用的每种试剂生物活性浓度的方法与以上对于基质所述的方法基本相同。然而另外，也能向小鼠中导入混合物，使得在进行所述体内测定之前原位形成杂合基质。
代替加入混合物中的所述试剂本身(或除它之外)，混合物中除表达一种多肽(例如，医学上有用的多肽)的第一种培养的脊椎动物细胞群之外，还可含有以上对于本发明的基质所述的任何第二种培养的脊椎动物细胞群。
在一个优选实施方案中，本发明的混合物含有能获得的角质细胞，它们与在基质中起相同的作用，并以相同方式作用。另外，混合物也可含有上述相同的角质细胞分化因子。而且，如对于基质所述，本发明的混合物可含有内皮细胞，和任选地，上述内皮分化因子。
本发明的混合物一般如下制备在水溶液中合并(a)上述任一细胞群；和(b)大量上述任一微载体。优选地也向混合物中加入可溶性胶原，或上述一种或多种替代物。
为了制备这些含有一种或多种上述试剂的混合物，向混合物中加入有关试剂(结合或包封于上述任一种固体底物中)，以及上述其它成分。试剂和固体底物能一起或以任何顺序分开加入混合物中。另外，也能向混合物中加入分泌一种或多种所述试剂的第二种(任选地，第三、第四、第五、第六或更多种)培养的脊椎动物细胞群。此外，也能向混合物中加入一种或多种上述固体底物，它们包含一种或多种与试剂结合的物质(例如肝素或硫酸乙酰肝素)。也能向混合物中加入角质细胞。
多肽(例如，医学上有用的多肽)，如以上所列的，可以通过一种处理方法输送给患者，该方法包括提供含有细胞(例如，分泌目的多肽的细胞)的本发明的上述任一种混合物，将制品导入患者的所选部位，如皮下、腹膜内、网膜内、肾小囊下、腹股沟、肌内或鞘内部位。当细胞产生的多肽是促进创伤愈合的多肽(例如PDGF或IGF-I)时，能将混合物导入预先存在的创伤部位。向患者中导入混合物可通过适合于液体悬液的任何工具例如，移液管、导管或任选地加有注射针头或导管的皮下注射器。本发明包括一种方法，其中向动物中导入混合物与由成分(例如，培养的脊椎动物细胞、微载体和胶原)形成混合物基本上同时发生。如上所述，细胞可来源于取自患者的一种或多种细胞，优选地用编码多肽的外源DNA体外转染。此外，它们也可以是自然分泌多肽或行使希望的代谢功能的细胞(例如角质细胞或胰腺β细胞)。细胞能通过基因激活诱导，分泌多肽，分泌更大量的多肽，或行使希望的代谢功能。用于向患者输送多肽的合适的液体混合物可以是(a)上述任一种；或(b)缺少微载体的上述任一种。
本发明也包括含有本发明的上述任何液体混合物的容器。容器可以是，例如，玻璃或塑料皮下注射器、瓶、试管、摇瓶或小瓶。也可以是塑料袋，例如，血袋。例如，容器能用于将本发明的混合物从生产地点或零售点运输到使用地点，例如医院或医务室或兽医室。例如，将容器的内容物保持在约8℃以下，能抑制在向患者中导入混合物之前的胶凝作用。在使用另一种容器(例如小瓶或瓶)时，可在基本上发生胶凝之前，将混合物转移到一种适于向患者中导入该混合物的装置(例如皮下注射器或血袋)中。本发明的这种容器可与运输材料(例如运输容器)一起包含于一个试剂盒中。
本发明也表征了一种包含运输容器的试剂盒，其包含(a)第一个容器，其中含有(i)表达一种多肽的培养的脊椎动物细胞群(例如表达多肽的遗传工程化细胞)，和(ii)大量微载体；(b)第二个容器，含有胶原溶液；和(c)第三个容器，含有液体培养基。
在胶原溶液中有足量的胶原，使得通过混合容器(a)、(b)和(c)内容物形成的混合物胶凝。胶原溶液可以是酸性pH，培养基可以是碱性pH。欲导入动物中的混合物用试剂盒制备，包括(a)合并第二个和第三个容器中的内容物，形成胶原/培养基溶液；和(b)将胶原/培养基溶液与第一个容器的内容物合并，形成混合物。步骤(b)及向患者导入液体混合物应当在胶原/培养基溶液形成后不久进行，即，在胶原恰好胶凝之前，混合物不再是液体时。第二个容器中胶原溶液的酸性pH(约pH2.0-pH4.0)防止胶原在贮存中胶凝。因此，直到用碱性培养基将酸性胶原溶液中和为约pH7.2-7.8、优选地约7.4-7.8时才发生混合物胶凝，形成固体基质。此外，第二个容器中的胶原溶液可以约为pH7.2-7.8，优选地约7.4-7.8，通过将胶原溶液保持在低于10℃的温度下(例如，约3℃-8℃)，直到混合并导入动物中之前，来抑制胶凝。在这两种情况中，待形成混合物后，立即导入动物中，即，在聚合继续超过能容易地将混合物转移到植入部位时之前。试剂盒优选地包含包装材料和根据本发明的方法的使用说明书。
此外，试剂盒也可包含运输容器，包括两个容器(a)第一个容器，其中含有(i)表达一种多肽的培养的脊椎动物细胞群(例如表达多肽的遗传工程化细胞)，和(ii)大量微载体；和(b)第二个容器，含有胶原溶液。
在胶原溶液中有足量的胶原，使得通过混合容器(a)和(b)的内容物形成的混合物胶凝。胶原溶液可以是酸性pH。此时，可在混合物形成之前，用碱性溶液(如浓度约为0.01N-1.0N的NaOH溶液)将胶原溶液的pH调节为约7.2-7.8，优选地约7.4-7.8。试剂盒可任选地包含(1)第三个容器，其中含有这种碱性溶液，和/或(2)一种pH指示剂，如pH试纸、度量计或含染料的溶液。此外，第二个容器中的胶原溶液也可包含pH指示剂染料。
在另一个实施方案中，第二个容器中的胶原溶液约为pH7.2-7.8，优选地约7.4-7.8，通过将第二个容器的内容物保持于8℃以下，直到混合物形成前，来抑制胶凝作用。另外，在混合物形成之后一般立即将混合物导入动物中，除非混合物保持在8℃以下，以防止胶凝作用。
在所有情况下，试剂盒优选地包含合适的包装材料和标签和/或详细使用说明书。包装材料可能包括，例如，适于将混合物成分运输到零售商处或使用地点(例如医院或医务室)的容器。合适的运输容器包括，例如塑料(或其它合成聚合物)、泡沫聚苯乙烯、纸板、木材或金属盒。纸或塑料(或其它合成聚合物)袋、包裹或薄膜包装也能用作运输容器。运输容器也可包括防撞击材料，如塑料(例如聚苯乙烯)纤维或碎屑、泡沫包裹或碎纸，或具有适于容纳容器的狭槽的模制塑料，并且可以是隔热的。
这些试剂盒中使用的容器可以是玻璃或塑料皮下注射器、瓶、试管、摇瓶或小瓶。也可以是塑料袋，类似于血袋。它们能置于隔热容器中，以使一种或多种成分保持在恒定温度，例如，约8℃以下的温度。
在这些试剂盒中，胶原可以是此处列出的任何类型。而且，胶原能用此处所述的任何替代物代替或补充。培养的脊椎动物细胞可以是所列出的任何细胞，它们能用此处所述的任何方法产生和/或遗传改造。这些细胞表达的多肽和微载体可以是上述任何种类。在任一种或多种容器中能含有上述非胶原纤维。
这些试剂盒在任何容器中还可含有一种或多种(例如，二、三、四、五、六、七、八、九或十种)试剂，例如，促进血管形成的因子、细胞因子、生长因子或抗坏血酸。试剂可以是此处列出的任何试剂。与试剂任选地结合的固体底物的例子如上所述。在试剂盒的容器中任选地也含有第二种、第三种、第四种、第五种、第六种、第七种、第八种、第九种或第十种培养的脊椎动物细胞群，它们分泌一种或多种(例如，二、三、四、五、六、七、八、九或十种)试剂，例如，如上所述的促进血管形成的因子、细胞因子或生长因子。
当试剂盒包含成纤维细胞作为培养的脊椎动物群之一时，试剂盒的容器还可含有如上所述的内皮细胞和/或角质细胞，和任选地角质细胞分化因子(例如，浓度为1.5-2mM的钙离子)。例如，成纤维细胞和内皮细胞和/或角质细胞能从同一个体获得。
本发明也表征了一种将混合物导入患者内的装置。该装置包括至少两个(例如，两个、三个、四个、五个或六个)容器，每一个都有一个与输送工具液体连通的出口。该装置可含有(a)胶原水溶液，其中胶原可以是此处列出的任何胶原，(b)表达此处公开的任何多肽的培养的脊椎动物细胞群(例如表达任何这种多肽的遗传工程细胞)，和(c)大量上述任一种微载体。每个容器中都能含有(a)、(b)或(c)中的一种或多种。在胶原溶液中有足量的胶原，使得通过混合成分(a)、(b)或(c)形成的混合物胶凝。一个或多个容器能与具有两端的活塞结合，第一端适于插入容器的内部，第二端适于从容器内部延伸出来。输送工具可以是注射针头或导管或其它管，它们有(a)两个或多个适于与容器出口液体连通的入口，和(b)一个出口。此外，输送工具也可以是一个转接器，它具有一个与每个容器的出口液体连通的连接体、一个混合室和一个与注射针头、导管或其它管液体连通的出口；该连接体可包括至少两个入口(例如，两个、三个、四个、五个或六个)，每一个均只与一个容器的出口液体连通。该装置还可含有一个或多个物理连接至少两个容器的连接体。另外，每个活塞的第二个末端也可与压力板连接。该装置也可包含其它任何细胞群，胶原、非胶原纤维或此处所述的试剂的替代物。
在此使用时，“固体底物”是一种物体，或大量物体(成形的，例如，作为颗粒或线)，用作固体底物中所含或与之结合的物质(例如，促进血管形成的因子)的贮存器或库。该物质逐渐从固体底物释放到环境中。当固体底物是珠形时，珠一般近似于球形，直径约为0.005-2.0mm。当固体底物是线形时，线的直径一般约为0.01-1.0mm。在凝胶形成之前，线可以编织或折叠到网筛中，或切割成(约5-10mm的)小片。当线折叠时，其长度应当约为用来生产相关杂合基质的模子的直径的1-3倍(例如约2倍)。在此使用时，“固体底物”不是细胞。
除非另外说明，此处使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员通常理解的相同的含义。如果冲突，以本文件(包括定义)为准。优选的方法和材料在以下叙述，尽管在实施或测试本发明时也能使用与此处所述类似或相当的其它方法和材料。此处描述的材料、方法和实施例只是说明性的，并非旨在限制。此处提及的所有公开文本、专利申请书、专利和其它参考文献均完整引用作为参考。
根据权利要求书，和以下的详述，本发明的其它特点和优点将是显然的。
附图简述

图1是hFVIII表达质粒pXF8.198的图谱。
图2是一张线图，显示植入了肝素-Sepharose杂合胶原基质(HSHCM)的小鼠血浆中的人因子VIII(hFVIII)水平，该HSHCM中含有产生hFVIII的细胞和用碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)包被或未包被的肝素-Sepharose珠。
图3是一张线图，显示植入了HSHCM的小鼠血浆中的hFVIII水平，该HSHCM中含有产hFVIII的细胞、两种微载体之一和bFGF包被或未包被的肝素-Sepharose珠。
图4是一张线图，显示植入了HSHCM的小鼠血浆中的hFVIII水平，该HSHCM中含有产hFVIII的细胞和用不同浓度bFGF包被的肝素-Sepharose珠。
图5是一张线图，显示植入了HSHCM的小鼠血浆中的hFVIII水平，该HSHCM中含有产hFVIII的细胞、bFGF包被的肝素-Sepharose珠、血管内皮生长因子(VEGF)包被的肝素-Sepharose珠，或bFGF包被的肝素-Sepharose珠和VEGF包被的肝素-Sepharose珠的混合物。
图6是描述pXVEGF.1质粒的图示。
图7是一张线图，显示植入了HSHCM的小鼠血浆中的hFVIII水平，该HSHCM中只含有产hFVIII的第一种细胞群，或者还含有产生VEGF的第二种细胞群。
图8是一张线图，显示皮下注射1mL或2mL I-HSHCMM的小鼠血浆中的hFVIII水平，该I-HSHCMM中含有产hFVIII的细胞和bFGF包被的肝素-Sepharose珠。
图9是hFVIII表达质粒pXF8.186的图谱。
图10是一张线图，显示网膜内注射下列物质的小鼠血浆中的hFVIII水平产hFVIII的细胞，产hFVIII的细胞和bFGF(50ng)包被的肝素-Sepharose珠，或产hFVIII的细胞和VEGF(100ng)包被的肝素-Sepharose珠。
图11是一张线图，显示网膜内注射下列物质的小鼠血浆中的hFVIII水平产hFVIII的细胞，产hFVIII的细胞和bFGF(500ng)包被的肝素-Sepharose珠，或产hFVIII的细胞和VEGF(100ng)包被的肝素-Sepharose珠。
图12是一张线图，显示网膜内注射下列物质的小鼠血浆中的hFVIII水平产hFVIII的细胞和微载体，微载体和肝素-Sepharose珠，微载体和bFGF(500ng)包被的肝素-Sepharose珠，或微载体和VEGF(100ng)包被的肝素-Sepharose珠。
图13A是能用来同时形成本发明的混合物并将其输送给患者的装置的图示。
图13B是图13A所示装置的转接器4组件的横断面视图。
发明详述以下所述的实施例说明本发明的几个实施方案。这些实施例只是为了说明目的，并非意在限制。
实施例I肝素-Sepharose杂合胶原基质(HSHCM)概述HSHCM是通过将下列成分混合在一起产生的浓缩的Dulbecco’s改良Eagle’s培养基(DMEM)、胶原(例如，鼠尾I型或合适的备选物，例如，人胎盘I型或III型胶原)、微载体(例如，如上所述的胶原大孔微载体或多孔明胶微载体)、未包被或用血管生成因子、细胞因子或生长因子(例如碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血管内皮生长因子(VEGF)或血小板衍生生长因子(PDGF))包被的肝素-Sepharose珠，和表达治疗蛋白的细胞。在一个备选实施方案中，将多种细胞株混合到基质中，一种细胞株表达目的治疗蛋白，另一种细胞株表达血管生成因子、细胞因子或生长因子。也能使用既表达治疗蛋白又表达血管生成因子或生长因子的一种细胞株。在该实施方案中，肝素-Sepharose珠成分可能未包被，或用引入细胞株表达的相同或不同的生长因子包被，或者能同时省去。
微载体的制备用于生产基质的胶原微载体的制备如下。将胶原微载体(CellexBiosciences cat.#YB00-0015UW)从厂商提供的原始瓶(每瓶约10ml)中转移到50ml锥形管中(每瓶一管)。使微载体在管中沉淀，吸去贮存缓冲液。加入微载体洗涤培养基(含1％小牛血清和1％青霉素/链霉素的DMEM)，至刻度管的50ml刻度，使微载体沉淀，吸去培养基。这一系列洗涤步骤总共重复4次。用25ml塑料移液管将微载体转移到250ml三角烧瓶中，微载体的体积限制为每个250ml烧瓶100ml。加入微载体洗涤培养基至250ml刻度，烧瓶加盖，并置于37℃的组织培养箱中2-3小时。从培养箱中取出烧瓶，使微载体沉淀，吸去洗涤培养基。这一系列温育和洗涤步骤总共重复3次。
明胶微载体的制备如下进行。将1克干Cultisphere-GLTM明胶微载体(Hyclone目录#DG-1001-00)置于含50ml无钙或镁磷酸缓冲液(PBS)的100ml玻璃瓶中。使明胶微载体在室温下水合至少1小时。在121℃下高压灭菌15分钟。去除PBS，用DMEM+1％小牛血清+1％青霉素-链霉素洗涤3次(每次洗涤50ml)，使明胶微载体适用于基质。在洗涤之间轻轻涡旋明胶微载体并使之沉淀。调节的明胶微载体能在使用之前贮存于4℃。
肝素-Sepharose珠的制备与Sepharose琼脂糖珠偶联的肝素为肝素结合生长因子(如bFGF、VEGF和PDGF)的附着提供了固体支持。Sepharose是Pharmcia Biotech生产的一种高度交联的琼脂糖树脂，并且是厂家的注册商标。能使用与不同类型支持基质(例如聚合物)连接的肝素，代替肝素-琼脂糖珠。肝素-Sepharose6 Fast Flow珠(Pharmcia BiotechCat#17-0998-03)用dH2O洗涤3次，每次洗涤用5倍珠体积。加入dH2O后轻轻涡旋珠，并在每次洗涤步骤之间以500×g离心。121℃高压灭菌20分钟。将珠平衡为pH7.2-7.4，方法是用PBS充分洗涤，直到珠PBS的1∶1浆液的pH为7.2-7.4。将珠以与PBS 1∶1的浆液贮存于4℃下。
血管生成因子和生长因子如下与肝素-Sepharose珠结合。将平衡珠置于适当大小的无菌管中(例如，1.5ml Eppendorf管或15ml锥形管)，500×g离心4分钟。用PBS洗涤2次，每次洗涤之间有一个离心步骤。将血管生成因子和生长因子(例如，对于bFGF为50μg/ml)加到PBS中的珠中，PBS体积与珠的堆积体积相等，产生1∶1的珠∶PBS浆液，在室温下旋转(例如，用NutatorTM平台)进行结合1小时。从珠中吸去含任何未结合生长因子的PBS，用体积与珠堆积体积相等的PBS洗珠1次。去除PBS，将珠置于冰上直到基质形成。
HSHCM的制备用来制备HSHCM的不同成分在表1和表2中列出。这些表描述了用胶原微载体(表1)或明胶微载体(表2)生产HSHCM。每张表都列出了每ml生产培养基的每种成分的体积，以及生产例如10×4mlHSHCM所必需的体积。(下文中基质的体积和浓度分别是指收缩前的体积和浓度。)基质“预混合物”由10×DMEM、7.5％NaHCO3、1MHEPES、青霉素-链霉素、L-谷氨酰胺和dH2O组成。预混合物一般在与胶原、细胞和血管生成因子包被珠混合前1小时或2小时制备，并保存于4℃。通过胰蛋白酶消化收获将要包埋在HSHCM中的细胞，并测定细胞数。在室温下，以1500转/分(500×g)离心需要数量的细胞(每个基质的细胞数乘以产生的基质的总数)。将细胞沉淀重悬浮于体积等于如表1和表2所示的HSHCM生产培养基总体积10％的生长培养基中。每ml基质的细胞密度必要时可改变(例如，每ml基质0.1-10×106细胞)。由于是以生产培养基总体积10％的体积加入细胞悬液，所以每ml悬液的细胞数是每ml基质希望的细胞密度的10倍(例如，1-1000×106细胞/ml)。将适当体积的微载体置于锥形管中，向微载体中加入细胞悬液。用10ml塑料移液管，将细胞和微载体混合在一起，并在室温下放置约10-15分钟，之后加入生产培养基中。将预混合物置于冰上，向预冷的预混合物中加入胶原溶液(例如鼠尾胶原(RTC))，并用10ml塑料移液管充分混合。然后通过加入如表1或表2所示体积的1N NaOH，将生产培养基的pH调节为约7.8。将细胞/微载体混合物加到中和的生产培养基中，并用10ml塑料移液管混合。向珠中加入体积等于肝素-Sepharose珠堆积体积的生长培养基，将珠转移到生产培养基中，并用10ml塑料移液管混合。将一定体积的终HSHCM生产培养基加入适当大小的培养皿中。例如，4ml HSHCM生产培养基一般加到60mm培养皿中，10ml加到100mm培养皿中，30ml加到150mm培养皿中。改变生产培养基体积与培养皿表面积之比能改变HSHCM的厚度。将含有HSHCM生产培养基的培养皿转移到温度为37℃、温度为95％-98％、CO2水平为5％的培养箱中。1小时后，从培养箱中取出培养皿并检查。如果HSHCM生产培养基已经胶凝，则加入5ml生长培养基补充HSHCM。否则，将培养皿放回培养箱中再放置1小时，或者直到聚合完成，此时加入5ml生长培养基补充HSHCM。向生长培养基中补充10-100ng/ml用来包被HSHCM的肝素-Sepharose珠的相同生长因子或血管生成因子。
表1 HSHCM生产培养基组成胶原微载体组成
*在调节pH后加到生产培养基中表2 HSHCM生产培养基组成明胶微载体组成
*在调节pH后加到生产培养基中
HSHCM的体外保存和评价通过在第1天、然后每周2-3次补充基质，将HSHCM培养保存，使用下列方案1.小心吸去培养基2.加入需要体积的合适的生长培养基，考虑每种基质使用的培养皿的大小。培养基中可补充抗坏血酸2-磷酸和/或TGF-β(例如10-50μg/ml抗坏血酸2-磷酸和/或1-10ng/ml TGF-β)。用来补充基质的生长培养基的体积一般是能加入每个培养皿大小的最大体积，例如，每个60mm培养皿10ml，每个100mm培养皿20-30ml，每个150mm培养皿100-150ml。
基质直径和每个基质的细胞数量如下确定。
HSHCM的直径能用下列步骤确定1.将含待测基质的培养皿放置在暗背景上的米尺上方。
2.如希望地记录直径(厘米)例如，前2周每日，前2周后每隔一天，实验过程中细胞定量当天。
可如下从HSHCM中回收细胞并定量1.酶消化杂合胶原基质a.制备胶原酶IA的PBS溶液(HSHCM为1.0mg/ml，补充有抗坏血酸2-磷酸和/或TGF-β的HSHCM为2.0mg/ml)。
b.将胶原酶溶液分配到15ml锥形离心管中，对于接种1-5×106细胞的基质为每个基质1ml的体积，对于接种超过5×106细胞的基质为5ml。制备与将要计数的基质一样多的胶原酶管。
c.用扁平钳从培养皿中取出每个基质，用吸收纸巾(如果细胞在计数后弃去)或用无菌吸收垫从基质中仔细吸干过量的液体。
d.将每个基质置于单个含胶原酶管中，盖紧，置于组织培养箱中设为40转/分的轨道摇床上。
e.温育基质约1小时，或直到消化完全。为了加速消化，以5分钟的间隔通过移液破碎沉淀。
2.细胞计数
a.利用离心管侧的刻度测量消化的每种细胞悬液的总体积。
b.为了测定细胞生存力，吸出0.1ml细胞悬液加到1.5ml微量离心管中的0.1ml 0.08％台盼蓝中。轻拍离心管混合。
c.用血球计数器计数存活和死亡的细胞。必要时，在加入台盼蓝之前进一步用PBS稀释细胞悬液。计算细胞总数，考虑在步骤2a中测量的总体积。
实施例II该实施例描述了如实施例I所述制备的HSHCM的体内植入。含有未包被的肝素-Sepharose珠或bFGF包被的肝素-Sepharose珠(50μg/ml堆积珠；10μg总bFGF/基质)的HSHCM如表1所述制备。每4ml基质用5×106HF743 B1-35细胞形成，这是一种含有质粒pXF8.198(图1)并以20 000-30 000mU/24h/106细胞的水平表达hFVIII的人包皮成纤维细胞克隆。制备和转染适用于本发明的基质和混合物的细胞的更详细步骤在WO93/09222(PCT/US92/09627)中提供，在此引用作为参考。HSHCM在植入之前培养保存2天。为了皮下输入基质，Rag-2小鼠(129S6/SvEvTac-[KO]Rag2，Taconic Farms)如下麻醉和准备。小鼠以0.0175ml/g体重的剂量腹膜内注射AvertinTM(2％w/v2，2，2-三溴乙醇和2％v/v 2-甲基2-丁醇溶液)。使麻醉的小鼠侧卧，植入部位剃毛并用乙醇和BetadineTM(0.75％碘溶液)消毒。在动物左侧、肋骨的下部和尾部的皮层上切一个2cm的切口，清洗皮肤和外斜肌层之间的筋膜，并用无菌平头剪扩大。用10ml PBS洗涤2次制备用于植入的HSHCM。每个基质用无菌匙形刀折成四分之一，用无菌刀插入清洗过的皮肤间隙中。切口用创伤夹闭合。
在将小鼠置于含有甲氧氟烷(Pittman-Moore)的大烧杯中直到达到轻度麻醉后，通过眼眶后采血收集血液。利用基于两种小鼠单克隆抗体的hFVIII ELISA测定血浆hFVIII[Hornsey等人(1992)Transfus.Med.2(3)223-229]。通过消化并计数为此目的从HSHCM中回收的细胞确定估计的每个基质的细胞数。含有未包被的肝素-Sepharose珠的HSHCM平均每个基质有2.8×106个细胞，含有bFGF包被的肝素-Sepharose珠的HSHCM平均每个基质有3.1×106个细胞(每种条件下n＝3个基质)。植入当天，对于含有未包被的和bFGF包被的珠的HSHCM(每种条件下n＝3个基质)，每种基质类型的hFVIII体外产量分别是71 165mU/24h和85 657mU/24h。如图2所示，与不含生长因子的HSHCM相比，含有bFGF包被的肝素-Sepharose珠的HSHCM导致在宿主小鼠中检测到明显升高的血浆hFVIII水平(每种条件下n＝10只小鼠)。在第0天没有可检测到的hFVIII，在第14天达到血浆峰水平。
下列实施例描述了包括向Rag-2小鼠中皮下植入HSHCM(如实施例1所述制备)的其它研究，使用以上介绍的HF743-B1-35 hFVIII分泌细胞克隆。
实施例III含有未包被的肝素-Sepharose珠或bFGF包被的肝素-Sepharose珠的HSHCM(50μg/ml堆积珠，10μg总bFGF/基质)，以及胶原微载体或明胶微载体，分别如表1和表2所述制备。植入当天每个基质的平均细胞数和每个基质的hFVIII产量(每种条件下n＝3个基质)在表3中列出。
表3 植入当天每个HSHCM的细胞数和hFVIII产量概况
该实验中包括皮下(SC)细胞对照，其如下制备。以与制备HCM相同的方法通过胰蛋白酶消化收集细胞。计数胰蛋白酶消化的细胞，以500×g离心，在Hank’s缓冲液(不含钙和镁)中重悬浮，离心，在一定体积的PBS中重悬浮，根据收集后的原始细胞计数，得到100×106细胞/ml。计数细胞/PBS浆液中的细胞，将悬液中的细胞密度调节为50×106细胞/ml PBS。对于每次注射，将总共0.15ml的细胞浆液吸到1cc GlasspakTM注射器中，该注射器加上22G/1英寸针头。向小鼠左侧、肋骨下部和尾侧皮下注射细胞浆液。考虑针头的空隙容积，向每只对照动物中注射总共0.1ml或5×106个细胞(每种条件下n＝5只小鼠)。
图3显示，与其它条件下相比，含有明胶微载体和bFGF包被的肝素-Sepharose珠的HSHCM在植入小鼠中时产生水平明显升高的hFVIII(每种条件下n＝10只小鼠)。表达模式类似于在实施例II中观察到的，直到第7天才可检测到hFVIII，在第14天有最高表达。在植入1天后的任何时间点，接受皮下细胞注射的小鼠血浆中都没有可检测到的hFVIII。
实施例IV含有未包被的或bFGF包被的肝素-Sepharose珠(12.5、25或50μg/ml堆积珠)的HSHCM用胶原微载体配方制备(表1)。掺入包被的珠后每个基质的bFGF总量估计分别约为2、4和10μg。植入当天每个基质的平均细胞数和每个基质的hFVIII产量(每种条件下n＝3个基质)总结于表4中。
表4 植入当天每个HSHCM的细胞数和hFVIII产量概况
图4表明，与含有4μg和2μg bFGF的基质相比，在植入含有10μg bFGF的基质后，血浆hFVIII水平明显升高(每种条件下n＝5只小鼠)。表达模式类似于在实施例II和III中观察到的。
实施例V含有未包被的、bFGF包被的或bFGF和VEGF两者包被的肝素-Sepharose珠的HSHCM根据明胶微载体配方制备(表2)。对于含有两种生长因子包被的珠的HSHCM组，每个基质接受0.1ml bFGF包被的珠和0.1mlVEGF包被的珠，以使珠体积与以前的实验一致。对于该条件，每种生长因子的包被浓度是100μg/ml堆积珠，使每个HSHCM含有总共大约10μg的每种生长因子。在HSHCM+bFGF+VEGF中，含有大约每种10μg的bFGF和VEGF。植入当天每个基质的平均细胞数和每个基质的hFVIII产量(每种条件下n＝3个基质)总结于表5中。
表5 植入当天每个HSHCM的细胞数和hFVIII产量概况
实验中包括网膜内(IO)植入对照，以便将皮下输送来自HSHCM的hFVIII与已经在小鼠模型中证明成功用于输送hFVIII的另一种植入方法相比较。IO对照如下制备。以与制备HCM相同的方法通过胰蛋白酶消化收集细胞。计数胰蛋白酶消化的细胞，以500×g离心，在Hank’s缓冲液(不含钙和镁)中重悬浮，再次离心，在一定体积的PBS中重悬浮，根据收集后的原始细胞计数，得到15×106细胞/ml。计数细胞/PBS浆液中的细胞，将体积等于5×106细胞的细胞悬液分配到1.5ml无菌微量离心管中，并在微量离心机中以500×g离心4分钟。含有细胞沉淀和PBS的离心管置于冰上，用下列方法将每种细胞沉淀植入Rag-2小鼠的网膜隐窝中。在植入细胞之前，用1.25％AvertinTM麻醉小鼠，使其侧卧。肋骨之间的左胁与膝用酒精垫擦拭，并用BetadineTM预备。在肋骨后部和脊柱腹侧切一个小(0.5-1.0cm)切口。暴露脾脏，并轻轻取出。沿颅侧和内侧之上的脾脏轴线向与脾脏门表面相邻的薄膜内注射细胞。将脾脏放回腹腔中，闭合切口。
图5表明，与第14天和第21天的其它条件相比，对于含有bFGF和VEGF组合的HSHCM，血浆hFVIII水平明显升高(每种条件下n＝5只小鼠)。网膜内注射细胞导致第1天血浆hFVIII水平明显升高，但到下一时间点(第7天)，IO对照中观察到的水平下降到用含有生长因子的植入体获得的水平之下(每种条件下n＝5只小鼠)。
实施例VI制备含有2种成纤维细胞克隆(表达hFVIII的HF743 B1-35，和含有质粒pXVEGF.1并表达VEGF的HF811-M15(图6))组合的HSHCM用于植入[Kock等人，Science 2461309-1312，1989]。HF811-M15克隆在植入时平均产生85ng VEGF/24h/106细胞。按照胶原微载体配方(表1)制备基质。肝素-Sepharose珠成分未包被。两组HSHCM用一种或另一种克隆以每个基质5×106细胞制备。另两组用恒定数量的HF743 B1-35细胞(5×106)和另外1×106或2.5×106个HF811-M15细胞制备。表6总结了不同条件和每种条件下hFVIII和VEGF的体外产生水平(每种条件下n＝5个基质)。
表6 植入当天每个HSHCM的hFVIII和VEGF产量概况
图7显示了每种HSHCM条件下随时间变化的血浆hFVIII水平。含有2.5×106个HF811-M15细胞的HSHCM组产生最高的hFVIII血浆水平，在第14天时达到峰值，在第42天前下降，此时hFVIII不可检测到。含有1×106个HF811-M15细胞的HSHCM产生略低于含有2.5×106个HF811-M15的组，但明显高于不含产VEGF细胞的HSHCM的血浆hFVIII水平，表明VEGF对植入物输送hFVIII产生剂量依赖的影响。
血浆标本中VEGF的量通过ELISA检测(R&D系统VEGF免疫测定试剂盒)。结果总结于表7中。在植入由2.5×106或5×106个HF811-M15细胞制成的HSHCM的小鼠的血浆中，从第14天到第28天可检测的VEGF下降。在植入不含HF811-M15细胞或由1×106个HF811-M15细胞制成的HSHCM的动物血浆中，VEGF水平不可检测。第1天和第7天的血浆标本不可测定，但数据表明VEGF水平在植入时与第14天之间的某一点达到峰值。
表7植入含有不同数量HF811-M15细胞的HSHCM的Rag-2小鼠血浆中VEGF表达概况
实施例VII用来制备本发明的基质的混合物的体积基于0.18cm的液柱高度(即深度)。发现在60mm培养皿(半径2.65cm)中体积为4ml的混合物可产生对于该尺寸培养皿最佳的细胞生存力和蛋白质表达。根据公式V＝πr2h，其中V＝混合物体积，r＝培养皿半径，h＝液柱高度(即培养皿中混合物的深度)，最佳体积4ml＝π(2.65cm)2h，因此最佳深度＝0.18cm，最佳r2/V比＝1.8。下表(表8)表明不同培养皿尺寸的最佳体积，包括得出0.18cm的高度的60mm尺寸。
表8 不同尺寸培养皿的最佳体积和r2/V比
*根据方程式体积＝πr2×0.18cm尽管发现约1.8的比率对于细胞生存力和蛋白质表达是最佳的，但约1.0-3.0、优选地1.5-约2.0的比率是足够的。这分别对应于约0.21cm和约0.16cm的深度。
实施例VIII如下制备本发明的HSHCM用于植入人体中。
从组织培养皿中收集希望的细胞，一般是来自患者的稳定转染的自体细胞，处理用于通过上述任何方法生产HSHCM。根据使用较大或较小基质，向患者体内植入不同数量的基质，和/或当构建基质时使用每种细胞表达不同水平产物的细胞，对于特定患者的剂量(即，基质产生的生理有效量的治疗产物)可能不同。患者中产生的治疗产物的量也可能由于基质中的细胞暴露于改变治疗基因表达的药理或生理信号而改变。例如，如果治疗基因位于糖皮质激素反应性启动子控制之下，则细胞在体内暴露于药物(如地塞米松)(以确保药物到达植入体的方式对患者施用药物)将改变治疗基因的表达。
一般植入在60mm培养皿中产生、每个基质含有约10×106个细胞的大量小直径基质(约1-2cm)。因此，用10个小基质能植入约1亿个细胞。使用细胞密度明显提高的基质(例如，通过掺入抗坏血酸2-磷酸产生的)将产生特定患者所需的较少量基质。此外，较大的培养皿(直径＞150mm)也能用作模子来生产能直接植入或切成可植入的较小片的较大基质。
在植入之前，基质能在生长培养基或者能使细胞保持存活的其它任何溶液中贮存或运输。此外，基质也能通过在合适的冷冻培养基中冷冻而冷藏，这些培养基能在植入前洗掉。
基质能在多个部位植入，包括但不限于皮下、腹膜内、脾内、网膜内、腹股沟、鞘内、心室内和肌内部位，以及淋巴结内或脂肪组织内。在适当部位切开一个手术切口，插入基质，闭合切口。
实施例IX有许多静态和灌注大规模体外培养系统适合用于利用在本发明的杂合基质中保存的细胞进行蛋白质生产。这些选择在靶蛋白纯化之前的必要补料和培养基收获步骤中提供了不同水平的便利。以下叙述几点。
1.HSHCM在常规培养皿中形成并成熟后(例如，在10-25天温育后)，能将大量HSHCM无菌转移到无菌微载体摇瓶中(250-100ml容量)。这些HSHCM在可使每种基质内的存活细胞密度达到最大的条件下生产并保存。对于每1ml基质体积，一般需要5-20ml的培养基。配制蛋白质生产培养基，使之含有最少的不确定成分(例如血清)，可包含添加的旨在使每个细胞的蛋白质产量达到最大的因子。将摇瓶放置在位于设置为30-70转/分的磁力搅拌平台上的37±1℃、5％±1％CO2潮湿培养箱中。1-3天后，将摇瓶转移到等级100的生物安全柜中，在不干扰沉淀的基质的情况下，无菌吸去含有表达的蛋白质的生产培养基。向摇瓶中加入相当体积的新鲜蛋白质生产培养基，将摇瓶放回培养箱内的搅拌平台中。
2.可将以上(1)中所述的基质无菌转移到具有一个可控搅拌叶轮轴的1-5L生物反应器中(例如Brunswick)。通过生物反应器控制系统设置生产培养基水平。培养基收获和补充由无菌封闭系统控制，以使污染达到最小。
3.为产生大体积的HSHCM，由组成成分形成基质，并使之在组织培养滚瓶中胶凝。这些滚瓶以静态直立位置温育，直到基质收缩产生自由浮动结构(3-5天)。然后补充生长培养基，瓶中充5％CO2，置于37℃培养箱内的滚动装置中。每2-3天补充生长培养基，直到HSHCM成熟(总温育10-25天后)，此时HSHCM暴露于蛋白质生产培养基。1-3天后，将瓶转移到等级100的生物安全柜中，在不干扰基质的情况下，无菌吸去含有表达的蛋白质的生产培养基。向瓶中加入相当体积的新鲜蛋白质生产培养基，将摇瓶放回滚动装置中。
4.将HSHCM的成分通过可密封口无菌导入无菌透气TeflonTM袋中。使成分在袋内胶凝，具有它的形状和结构。将袋子在37±1℃、5％±1％CO2潮湿培养箱中温育。当HSHCM收缩，体积减少时，调节生长培养基体积补偿。培养基收获和补充通过嵌入袋内的无菌连接管系统完成。使用有口的培养箱和延伸的管路能设计循环收获/泵料系统，这将不需要在生产过程中从培养箱中取出袋子。
5.能将HSHCM的成分无菌导入定制设计的大容量热成型盘中。最简单的结构是具有气体交换能力的开盖矩形盘，其设计在CO2组织培养箱中使用。另一种设计包括一个封闭系统，它具有与培养基库的通路，用于控制补料及培养基收获，类似于生物反应室。
实施例X可注射肝素-Sepharose杂合胶原基质混合物(I-HSHCMM)的概述通过将下列成分混合在一起制备I-HSHCMM浓缩DMEM(不含酚红)、鼠尾I型胶原(或合适的替代物，例如，人胎盘I型或III型胶原)；多孔微载体(例如，胶原大孔微载体或多孔明胶微载体)；任选的未包被或用血管生成因子或生长因子(例如碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血管内皮生长因子(VEGF)或血小板衍生生长因子(PDGF))包被的肝素-Sepharose珠；和表达治疗蛋白的细胞。在一个备选实施方案中，将细胞株组合混合到胶原溶液中，一种细胞株表达目的治疗蛋白，另一种细胞株表达血管生成因子或生长因子。也能使用同时表达治疗蛋白和血管生成因子或生长因子的一种菌株。在该实施方案中，肝素-Sepharose珠成分可以不包被，或用引入细胞株表达的相同或不同的生长因子包被，或者能同时省去。本发明的可注射基质混合物包括不含胶原或此处公开的任何胶原替代物的基质。而且，本发明中包括不含血管生成因子或生长因子来源的混合物。也应当理解，混合物可能缺乏微载体，但这些混合物一般包含一种试剂，如血管生成因子、细胞因子、生长因子或抗坏血酸。尽管不是必要条件，但这些试剂能与此处所述的任何固体底物结合。这些固体底物能用作细胞附着的微载体，也能作为相关试剂的贮存库。
微载体的制备和肝素-Sepharose珠的制备微载体和肝素-Sepharose珠如以上实施例1所述制备。在混合物形成前，通过用无血清PBS洗涤3-5次除去血清蛋白。
I-HSHCMM的制备用来制备I-HSHCMM的不同成分在表9中列出，表9描述了用明胶珠作为微载体的I-HSHCMM的制备。该表给出了每ml生产培养基的每种成分的体积，以及生产例如10×1ml和10×2ml I-HSHCMM所需的体积。基质“预混合物”由不含酚红的4×DMEM、7.5％NaHCO3、1M HEPES、青霉素-链霉素、L-谷氨酰胺和dH2O组成。预混合物通常提前1小时或2小时制备并在4℃下保存。从组织培养容器中收获将与基质成分一起注射的细胞，以500×g离心10分钟获得细胞沉淀。细胞沉淀用PBS洗涤1次，去除PBS，将沉淀重悬浮于体积等于I-HSHCMM生产培养基总体积10％的不含酚红的1×DMEM中，如表9所示。每ml基质生产培养基的细胞密度可适当变化(例如每ml可注射基质0.1-10×106个细胞)。由于加入体积为生产培养基总体积10％的细胞悬液，每ml悬液的细胞数应当比每ml基质混合物的希望的细胞密度高10倍(例如，每ml 1-100×106个细胞)。在锥形离心管中放入适当体积的微载体(例如，Cultipheres)，将细胞悬液加到微载体中。用10ml玻璃移液管将细胞和微载体混合在一起，在掺入生产培养基中之前在室温下放置约10-15分钟。预混合物置于冰上，向预冷的预混合物中加入胶原溶液(例如鼠尾胶原(RTC))，并用10ml玻璃移液管充分混合。然后通过加入体积如表9所示的1N NaOH，将生产培养基调节为约pH7.8。以500×g离心5分钟沉淀细胞/微载体混合物，吸去上清液，向管中加入一定体积的不含酚红的DMEM，达到等于细胞悬液体积加微载体体积的终体积，如表9所示。向中和的生产培养基中加入细胞/微载体悬液，用10ml玻璃移液管混合。向珠中加入体积等于肝素-Sepharose珠包装体积的不含酚红的DMEM，将珠转移到中和的生产培养基中，并用10ml玻璃移液管混合。在注射前一直将完全生产培养基置于冰上，注射时将其装入适当大小的注射器中(例如10cc)。装入后，注射器加上针头(例如规格16)，并注射到希望的部位(例如皮下)。
表9 可注射HSHCMM生产培养基组成
*在调节pH后加入生产培养基中胶凝的混合物的体外评估如上所述，通过用16G针头注射器注射，向适当大小的培养皿中加入一定体积的终I-HSHCMM生产培养基。例如，向35mm培养皿中加入2ml I-HSHCMM生产培养基，向60mm培养皿中加入4ml，向100mm培养皿中加入10ml，向150mm培养皿中加入30ml。改变生产培养基体积与培养皿表面积之比能改变HSHCM的厚度。然后将含有I-HSHCMM生产培养基的培养皿转移到温度为37℃、湿度为95％-98％、CO2水平为5％的培养箱中。1小时后，从培养箱中取出培养皿并检查。如果I-HSHCMM生产培养基已经胶凝，则加入5m不含酚红的DMEM补充HSHCM，否则，将培养皿放回培养箱中再放置1小时，或者直到聚合完成。
HSHCM在培养中保存希望的时间。用来补加基质的培养基体积一般是能加到每种培养皿大小中的最大体积，例如，每个35mm培养皿5ml，每个60mm培养皿10ml，每个100mm培养皿20-30ml，每个150mm培养皿100-150ml。每个基质的细胞数、细胞生存力和多肽生产水平如上所述测定。
实施例XI本实施例描述如实施例X所述制备的I-HSHCMM混合液的体外注射。含bFGF包被的肝素-Sepharose珠的I-HSHCMM混合液如表9所示制备，2ml注射体积以100μg/ml堆积珠，1ml注射体积以200μg/ml堆积珠(每个植入体输送10μg总bFGF)。每个注射体积，掺入HF743 B1-35(一种含质粒pXF8.198(图1)并以20000-30000mU/24h/106细胞的水平表达hFVIII的人包皮成纤维细胞克隆)以及微载体，以达到每次注射总共5×106个细胞。为了皮下导入混合物，Rag-2小鼠(129S6/SvEvTac-[KO]Rag-2，Taconic Farms)如上所述麻醉及准备。位于动物左侧肋骨下部和尾侧的植入部位剃毛，并用酒精和BetadineTM消毒。注射前，将完全I-HSHCMM混合液装入10cc注射器中，其体积略高于希望的注射体积，以补偿针头的空隙体积。装好的注射器加上16G针头，立即向皮下部位注射I-HSHCMM。注射的溶液在皮肤组织与外斜肌之间的间隙内扩散。对注射点施加微小的压力，从皮肤中缓慢拔出针头。注射的溶液在注射后几秒钟之内开始凝固。在注射后立即将小鼠置于热垫上，以防止可能的体温过低。
如实施例II所述收集血液，利用基于两种小鼠单克隆抗体的hFVIII ELISA测定血浆hFVIII。通过消化并计数为此目的从培养皿中形成的HSHCM(35mm培养皿中2ml)中回收并放置的细胞，确定每个胶凝基质的估计的细胞数。在评价细胞数和生存力之前，HSHCM培养保持2天，并如实施例X所述在无血清DMEM中保存。胶凝的HSHCM(每种条件下n＝3个基质)平均每个基质有3.51×106±0.8×106个细胞。回收细胞的生存力是84.5±2.4％。胶凝基质的hFVIII体外产量是68 851±199mU/24h。图8显示在向Rag-2小鼠中皮下注射HSHCM生产培养基后，随时间变化的血浆hFVIII水平。误差线表明平均值的标准误(每个注射体积n＝5只小鼠)。在注射1天后达到峰值表达。
实施例XII本实施例描述向裸鼠中单独(即不含微载体)网膜内注射表达hFVIII的兔成纤维细胞，或与生长因子包被的肝素-Sepharose珠一起注射。肝素-Sepharose珠如实施例X所述用bFGF(1μg/ml堆积珠)或VEGF(2μg/ml堆积珠)包被。将包被珠分配到1.5ml聚丙烯微量离心管中，达到每个管50μl堆积珠的体积。用无菌吸收纱布通过毛细作用去除珠中的过量PBS。用常规方法从组织培养瓶中收获RF261B2-106细胞，它是一种含有质粒pXF8.186(图9)并以20000-25000mU/24h/106细胞的水平表达hFVIII的兔皮肤成纤维细胞克隆。离心沉淀胰蛋白酶消化的成纤维细胞(500×g，10分钟)，用Hank’s平衡盐溶液(HBSS)洗涤，离心，重悬浮于一定体积的PBS中，达到约为15×106细胞/ml的细胞密度。向空1.5ml微量离心管或含有50μl肝素-Sepharose珠的离心管中加入体积等于5×106的细胞，以500×g离心悬液3分钟。通过去除PBS将含有珠和细胞的离心管的终容积调节为100μl。每种条件进行12个重复。含有细胞沉淀和细胞/珠浆液的离心管置于冰上，并运送到动物设施。
为了网膜内注射(IO)细胞和珠，如实施例II所述麻醉和准备裸鼠(NIH Swiss nude(nu-nu，TacNIH(S)-Hfh1 1nu，Taconic Farms))。使动物侧卧，肋骨与膝之间的左胁用酒精垫擦拭，并用BetadineTM准备。在肋骨后部和脊柱腹侧切一个小(0.5-1.0cm)切口。暴露脾脏，并轻轻取出。用20规格的插管沿颅侧和内侧之上的脾脏轴线向与脾脏门表面相邻的薄膜内注射细胞沉淀和细胞/珠浆液。将脾脏放回腹腔中，闭合切口。
血液收集和hFVIII的测定方法如实施例II所述。图10显示在单独注射细胞、注射细胞和bFGF包被(每个植入体总共50ng)的肝素-Sepharose珠、注射细胞和VEGF包被(每个植入体总共100ng)的肝素-Sepharose珠后，随时间改变的血浆hFVIII水平。误差线表明平均值的标准误(每种条件n＝12只小鼠)。在第1天达到峰值表达。与其它条件相比，细胞/珠/VEGF组合在第28天与第70天之间达到显著升高的hFVIII水平。
实施例XIII本实施例描述向裸鼠中单独网膜内注射表达hFVIII的兔成纤维细胞，或与生长因子包被的肝素-Sepharose珠一起注射。
肝素-Sepharose珠如实施例1所述未包被，或用bFGF(10μg/ml堆积珠)或VEGF(2μg/ml堆积珠)包被。将未包被的和生长因子包被的珠如实施例XII所述分配到离心管中。用常规方法从组织培养瓶中收获RF302 B2-383细胞，它是一种含有质粒pXF8.186并以20000-25000mU/24h/106细胞的水平表达hFVIII的兔皮肤成纤维细胞克隆。如实施例VI所述处理细胞，分配到空的微量离心管或含有肝素-Sepharose珠的离心管中。网膜内注射、血液收集和hFVIII测定如图11显示在单独注射细胞、注射细胞和未包被的肝素-Sepharose珠、细胞和bFGF包被(每个植入体总共500ng)的肝素-Sepharose珠、细胞和VEGF包被(每个植入体总共100ng)的肝素-Sepharose珠后，随时间改变的血浆hFVIII水平。误差线表明平均值的标准误(每种条件n＝12只小鼠)。hFVIII峰值表达在第1天发生，在第1、7和14天与其它所有条件相比，bFGF组显著增高。在第7天，与单独的细胞和细胞/未包被的珠组合相比，细胞/珠/VEGF组合达到显著升高的hFVIII水平。
实施例XIV本实施例描述向裸鼠中网膜内注射表达hFVIII的兔成纤维细胞，以及大孔胶原微载体，或微载体与生长因子包被的肝素-Sepharose珠。
肝素-Sepharose珠如实施例I所述用未包被或用bFGF(10μg/ml堆积珠)或VEGF(2μg/ml堆积珠)包被。微载体和细胞如下所述制备。大孔胶原微载体(Cellex Biosciences)如实施例I所述处理。制备微载体的浆液(微载体∶条件培养基体积为1∶1)，向1.5ml微量离心管中加入0.1ml等份。这些离心管以500×g离心4分钟，吸干，用PBS洗涤2次。除去PBS，离心管在冰上贮存。向含有微载体的离心管中加入0.1ml肝素-Sepharose珠(未包被、bFGF包被或VEGF包被的)与PBS的1∶1(体积/体积)浆液，珠/微载体混合物以500×g离心4分钟。每个管中都除去PBS，珠/微载体沉淀贮存于冰上。RF302 B2-383细胞如实施例XII所述处理。向每个只含有微载体或含有微载体和肝素-Sepharose珠的管中加入含有5×106个细胞的细胞悬液，离心管以500×g离心4分钟。弃去每个管的上清液，加入10μl PBS。将离心管置于冰上并运送到动物设施。网膜内注射、血液收集和hFVIII测定如图12显示在注射细胞和微载体、细胞和微载体和未包被的肝素-Sepharose珠、细胞和微载体和bFGF包被的珠(每个植入体总共500ng)、细胞和微载体和VEGF包被的珠(每个植入体总共100ng)后，随时间改变的血浆hFVIII水平。误差线表明平均值的标准误(每种条件n＝12只小鼠)。hFVIII峰值表达在第1天发生，在第1、7和14天，与其它所有条件相比，bFGF组显著增高。
实施例XV角质细胞是皮肤的表皮细胞，在组织中通常与成纤维细胞相邻。对于适当的营养、分化信号和周围胞外基质的产生和保持，这两种细胞型彼此依赖。向此处所述含有成纤维细胞的任何基质或可注射混合物中添加角质细胞能以类似于皮肤中发生的方式有益于成纤维细胞。角质细胞和成纤维细胞能从同一皮肤活组织检查中分离。在混合物形成时能同时加入角质细胞和成纤维细胞，或者能接种到含有成纤维细胞的收缩基质上。能刺激基质内或基质上的角质细胞分化，或者不刺激，这取决于生长培养基组成和培养条件。例如，生长培养基中钙离子浓度提高，以及基质一侧暴露于空气，都能使基质内的角质细胞以类似于皮肤中发生的方式分层(Bell等人，J.Biomech.Eng.113113-119，1991；Parenteau等人，J.Cell.Biochem.45245-251，1991)。一旦分化，角质细胞落在由胶原、葡糖胺聚糖和层粘连蛋白组成的基底层上。例如，在基质植入患者中或由导入患者中的混合物在体内形成基质后，这些基底层成分以及胞外基质蛋白(可以是成纤维细胞合成的或生产培养基中含有的)提供了一个有利于成纤维细胞存活的生理框架。
实施例XVI内皮细胞形成血管和毛细胞血管腔。血管由分裂和分化构成邻管的一种内皮细胞形成。在必需环境因素存在下能刺激分化过程。这些因素包括胶原、细胞(如成纤维细胞和/或角质细胞)产生的胞外基质蛋白和生长因子(例如，碱性成纤维细胞生长因子或血管内皮生长因子)。如果分别向基质生产培养基或混合物中加入内皮细胞以及成纤维细胞，植入的基质，或在向患者中导入本发明的混合物后在体内形成的基质，能为内皮管形成提供适宜的环境。添加角质细胞能通过分泌因子(如血管内皮生长因子)有助于诱导内皮细胞分化以及基底层的产生。在基质内形成内皮管能通过先前存在的内皮管与生长的宿主血管连接，加速植入后基质的血管形成(Black等人，FASEB J.121331-1340，1998；Black等人，Cell Biol.Toxicol.15(2)81-90，1999)。内皮细胞通过释放促进新血管形成的因子也可能是有益的。
实施例XVII如下制备本发明的混合物用于向人体内导入。
从组织培养皿中收集希望的细胞，一般是来自患者的稳定转染的自体细胞，处理用于通过上述任何方法生产HCMM或PCHCMM。根据向患者体内导入较大或较小体积的混合物，和/或在制备混合物时使用每个细胞表达不同水平产物的细胞，对于特定患者的剂量(即，基质产生的生理有效量的治疗产物)可能不同。患者中产生的治疗产物的量也可能由于混合物中的细胞暴露于可改变治疗基因表达的药理或生理信号而改变。例如，如果治疗基因位于糖皮质激素反应性启动子控制之下，则细胞在体内暴露于药物(如地塞米松)(以确保药物到达植入体的方式对患者施用药物)将改变治疗基因的表达。其它药理反应性控制元件在Clackson，Gene Therapy 7120-125，2000中有述，在此完整引用作为参考。这些元件包括抗生素四环素或其类似物(例如强力霉素)、昆虫类固醇蜕皮激素或其类似物，抗孕酮米非司酮，和化学“二聚物”如纳巴霉素及其类似物(“rapalogs”)调节的元件。
混合物能含有任何微载体、胶原(或替代物)、试剂(任选地与固体底物结合的)和产生此处所述试剂的细胞。它们也能任选地含有角质细胞和/或内皮细胞。载有此处所述任何细胞的微载体能够冷冻，然后在用于可注射混合物中之前融解。
混合物能在多个部位导入，包括但不限于皮下、腹膜内、脾内、网膜内、腹股沟、鞘内、心室内和肌内部位，以及淋巴结内或脂肪组织内。例如，能用任选地加有针头或导管的皮下注射器(塑料或玻璃的)导入混合物。针头或导管的直径优选地大于微载体的直径(例如大于0.5mm)，以使对悬浮细胞和微载体的损伤减至最小。使用腹腔镜能帮助向适当内部部位的输送。在特定环境下，形成手术切口，导入混合物，然后闭合切口是希望的。
本发明的混合物能同时形成并导入患者中(或其它任何动物)。为此可构建一种合适的装置。图13A显示了这种装置的一个实例。该装置可包括两个或多个容器1，全部都通过出口2与转接器4内的入口3连接。图13B显示这种转接器4的横断面视图。转接器4内的入口3与两个或多个容器的出口2优选地以不透液体的方式液体连通。此外，转接器4也可包含一个连接体，它优选地以不透液体的方式与容器1的所有出口2液体连通。转接器也包含一个混合室5和一个出口6，出口6与注射针头8的针芯7中的一个入口优选地以不透液体的方式液体连通。这样，当使容器的内容物从容器1的出口2流出时(通过同时对活塞12施加压力)，它们进入转接器4中的混合室5，在此混合，产生的混合物从转接器4中的出口5流出，并流入注射针头8中。然后将混合物推入注射针头中的针头部分13，于是流入针头插入的动物组织或身体间隙中。容器通过固体连接体9彼此物理连接。其中包括一个与活塞12的顶部连接的“压力板”10，以便于同时推出容器的内容物。
在另一个实施方案中，代替转接器，能改造注射针头的针芯部分，使之具有分开的入口，它们优选地以不透液体的方式与容器中的各个出口液体连通。当所有容器的内容物由容器出口流出时(例如，当容器是注射器时，通过对活塞同时施加压力)，它们通过针芯的合适的入口进入注射针头的针芯，在针芯内形成的小室中混合，之后进入装置的针头部分。在此使用时，“输送工具”可以是(a)如述改造的注射针头，(b)上述转接器4和注射针头8，(c)导管，(d)插管，(e)移液器或适当改造的、如述起作用的任何管状物体。
在一种具有两个容器的装置中，一个容器可包含例如细胞、微载体和营养培养基中的试剂，另一个可包含胶原溶液。在三容器装置中，一个容器可包含例如细胞、微载体和营养培养基中的试剂；第二个容器可包含酸性pH的胶原溶液；第三个可包含碱性pH的培养基或稀释剂，使得当所有三个容器的内容物混合时，形成pH约为7.2-7.8，优选地7.4-7.8的水溶液。然而，应当理解，本发明的杂合基质混合物的不同成分可以以任何方便的组合分配于装置的两个或三个容器中。当使用这种装置时，在由成分形成混合物之后不久向动物中导入混合物，对于本发明，这两个事件可认为是同时发生。
本发明包括一个含有此处公开的任何混合物的容器(见“发明概述”)。这种容器能与运输材料(例如运输容器)一起包含于试剂盒中。评估了在一个含有所有成分的容器中运输可注射混合物的可行性。用可注射HSHCM混合液进行了两个研究。对于两者，肝素-Sepharose珠成分用50μg/ml堆积珠浓度的bFGF包被。向三个10cc塑料注射器的每一个中加入如表9所示制备的体积为10ml的完全生产培养基，然后加盖，并在4℃下贮存24小时。从4℃环境中取出注射器，加16G针头，将内容物注射到100mm培养皿中。培养皿置于温度为37℃、湿度为95％-98％、CO2水平为5％的培养箱中。1小时后，取出培养皿，加入20ml不含酚红的DMEM补充，并放回培养箱中。在37℃下温育24小时后，测定凝固基质的直径相对于混合液直径的降低(“直径减少”)、细胞数和细胞生存力。“直径减少”的测量方法包括将尺子放置在每个培养皿下，以厘米为单位测量基质直径，100mm培养皿直径减去基质直径。然后直径差除以100mm培养皿的直径，表示为百分数。细胞数和生存力如上所述评估。表10概括了两次贮存实验的结果。如述，实验#1和#2在每ml生产培养基中掺入的细胞数方面不同。(每次研究n＝3个注射器)表10 可注射HSHCM贮存研究
此外，由于中和的胶原溶液将比酸性胶原溶液更快地胶凝，为了将材料运送到现场，在一个试剂盒中分开可注射材料的成分是有利的。例如，一个试剂盒可包含三个容器(例如，管、注射器、瓶或小瓶)，其内容物在导入患者体内之前(即，在混合物凝固成不能容易地流经注射器、插管或用来输送悬液的任何装置的程度之前)立即合并。例如，成分以下列方式分开容器1可含有细胞+微载体，和任选地肝素-Sepharose珠浆液；容器2可含有酸性pH(约2.0-4.0)的胶原溶液；容器3可含有不含血清的碱性pH(约9.0-12.0)的浓缩培养基(例如，营养培养基或其它稀释剂)。选择浓缩培养基的pH，以确保在合并培养基和胶原溶液时，胶原溶液能中和为生理pH(例如pH7.4)。在向患者体内注射之前，立即将容器3的内容物(培养基)与容器2的内容物(胶原溶液)混合。然后将合并的培养基+胶原(此时已中和为生理pH)加入细胞/微载体/肝素-Sepharose珠浆液中，充分混合，形成终混合物。然后任选地使用皮下注射器或试剂盒提供的其它液体分配装置，将终混合物注射到患者体内。
此外，试剂盒也可包含两个容器，第一个容器含有与上述试剂盒中的容器1相同的成分。第二个容器可含有胶原溶液，其中胶原溶解于如营养培养基中，为酸性pH。在注射之前立即用一种碱性溶液(例如NaOH溶液)将胶原溶液的pH调节为约7.2-7.4，优选地约7.4-7.8。试剂盒的第三个容器中任选地包含一等份这种碱性溶液。
也能提供ph约为7.2-7.4、优选地约7.4-7.8的溶液，而不是提供酸性pH的胶原溶液，只要在与其它成分混合并导入患者中之前保持低温(例如低于8℃)。
本发明的试剂盒可任选地包含标签或试剂盒使用说明书，例如，关于如何合并容器内容物并对患者施用产生的混合物的说明书。使混合物保持低温可防止胶原胶凝。
其它实施方案本发明的基质和混合物适用于输送大量细胞产物，不仅包括hGH和因子VIII，而且包括因子IX、促红细胞生成素(EPO)、白蛋白、血红蛋白、α-1抗胰蛋白酶、降钙素、葡糖脑苷脂酶、低密度脂蛋白(LDL)受体、IL-2受体、珠蛋白、免疫球蛋白、催化抗体、白介素、胰岛素、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、促胰岛素、甲状旁腺激素(PTH)、肥胖蛋白、干扰素(IFN)(例如IFN-α、IFN-β或IFN-γ)、神经生长因子、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、酸性FGF(aFGF)、表皮生长因子(EGF)、内皮细胞生长因子、血小板衍生生长因子(PDGF)、转化生长因子、内皮细胞刺激血管生成因子(ESAF)、血管生成素、组织纤溶酶原激活剂(t-PA)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、α-半乳糖苷酶和FSH。例如，混合物中或包埋在基质中的细胞可以是因应血糖升高自然分泌胰岛素，因此能在糖尿病或前驱糖尿病患者中补充不充分胰岛素反应的胰腺β细胞。此外，它们也可以是在患者中表达和分泌高水平必需多肽(如凝集因子)的任何类型的遗传工程细胞。这种构建体能在组成型激活的启动子或适当生理或药理调节的启动子控制之下。
混合物或基质的胶原凝胶部分可完全由胶原组成，或者代替它(或除它之外)可含有其它成分例如，琼脂糖；藻酸盐；葡糖胺聚糖，如透明质酸、硫酸肝素、硫酸皮肤素、硫酸软骨素；硫酸蛋白聚糖；纤连蛋白；层粘连蛋白；弹性蛋白；血纤蛋白；细胞粘合素；绞碎的脂肪组织；绞碎的网膜组织；甲基纤维素；或明胶。这些成分(特别是在动物组织的胞外基质中发现的)有助于本发明的杂合基质和本发明的混合物体内凝固获得的基质的结构稳定性，和/或为基质中的细胞和基质植入部位的宿主组织提供另外的附着力。它们在导入动物中或在体外胶凝之前将混合到基质混合物中。
尽管本发明的混合物优选地含有胶原(或上述一种或多种替代物)，但应当理解，本发明也包括缺乏胶原的混合物(或上述任何替代物)。在这种情况中(即，当不使用基质材料时)，注射的溶液在动物体内不凝固形成分散块。注射物质从值入部位分散的程度取决于该部位的结构特征。微载体结合的细胞的分散在某些情况中可能是优选的。
其它可能的添加剂包括用于优化细胞保存或促进与宿主组织有益相互作用(例如血管形成)的细胞因子和/或生长因子，包括bFGF、aFGF、内皮细胞生长因子、PDGF、内皮细胞刺激血管生成因子(ESAF)、白三烯C4、前列腺素(例如PGE1、PGE2)、IGF-1、GCSF、血管生成素、TGF-α、TGF-β、抗坏血酸、制瘤素M、VEGF、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C和VEGF-D。这些添加剂能掺入基质中，方法包括将它们在胶凝或导入动物之前与胶原溶液混合，将它们导入微载体的空隙中，或在洗涤基质的培养基中含有它们。它们也可以结合或包封在基质或混合物中包含的分开的固体底物中(例如，肝素包被的琼脂糖珠或PLGA微胶囊)。此外，细胞也能遗传改造以表达希望的产物。例如，基质的细胞能用编码血管生成因子的DNA和编码第二种治疗蛋白的DNA共转染，或用与合适的表达控制序列连接的编码两种类型蛋白质的一种DNA构建体转染。
抗坏血酸通过促进原胶原的合适的翻译后修饰促进成纤维细胞产生成熟的胶原。在基质或混合物中包埋的成纤维细胞产生胶原将提高基质的物理强度，并提供能提高动物中细胞存活率的生理结构。
在基质和混合物中使用的胶原可以是任何合适的类型(例如I-XI型)，或是任两种或多种混合物。在胶原胶凝之前可在模子中放置纤维，使它们成为基质的整体部分，并有助于基质的坚固和易处理性。如果添加纤维，它们将主要由胶原(例如，猫肠)或非胶原材料(如尼龙、涤纶、聚四氟乙烯(Gore-TexTM或TeflonTM)、聚苯乙烯、聚氯乙烯共聚物、纤维素(例如棉花或亚麻)、聚酯、人造丝或丝制成。基质中的纤维能纺织成网或布，或用作单独的线。
人们能使用主要由另一种类型的胶原、聚苯乙烯、葡聚糖(例如CytodexTM，Pharmacia)、聚丙烯酰胺、纤维素、藻酸钙、乳胶、聚砜、玻璃(用促进细胞粘附的物质如胶原包被的)、明胶或胶原与以上任一种物质的组合物组成的微载体，而不是以上实施例中描述的I型胶原微载体。这些微载体可商品购得，或者能通过标准方法制备，然后灭菌，以在本发明的基质或混合物中使用。
其它实施方案在下列权利要求书中。
权利要求
1.一种组合物，其含有包含不溶性胶原原纤维的基质材料主体，在基质材料主体内包埋有(a)经遗传工程化以表达一种多肽的培养的脊椎动物细胞群；(b)大量微载体；和(c)与包埋在基质材料主体内的固体底物结合的一种试剂，其中该试剂选自促进血管形成的因子、细胞因子、生长因子和抗坏血酸。
2.权利要求1的组合物，其中所述固体底物包括(a)肝素或(b)硫酸乙酰肝素蛋白聚糖。
3.权利要求1的组合物，其中所述固体底物包括含有与肝素或硫酸乙酰肝素蛋白聚糖结合的琼脂糖。
4.权利要求3的组合物，其中所述固体底物还包含藻酸钙。
5.权利要求1的组合物，其中所述固体底物还包含藻酸钙。
6.权利要求1的组合物，其中所述固体底物包含一种选自胶原、明胶、乙烯-醋酸乙烯酯共聚物、聚乳酸/乙醇酸共聚物、血纤蛋白、八硫酸蔗糖、葡聚糖、聚乙二醇、藻酸盐、聚丙烯酰胺、纤维素、乳胶和聚羟乙基丙烯酸酯的物质。
7.权利要求6的组合物，其中肝素或硫酸乙酰肝素蛋白聚糖与所述底物结合。
8.权利要求1的组合物，其中所述组合物还包含选自促进血管形成的因子、细胞因子和生长因子的第二种试剂。
9.权利要求1的组合物，其中所述固体底物为珠形。
10.权利要求1的组合物，其中所述固体底物为线形。
11.权利要求1的组合物，其中所述试剂是碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。
12.权利要求1的组合物，其中所述试剂选自酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、内皮细胞生长因子、血小板衍生生长因子(PDGF)、内皮细胞刺激血管生成因子(ESAF)、白三烯C4、前列腺素、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、血管生成素、转化生长因子-α(TGF-α)、转化生长因子-β(TGF-β)、抗坏血酸、表皮生长因子(EGF)和制瘤素M。
13.权利要求1的组合物，其中所述试剂选自血管内皮生长因子(VEGF)、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C和VEGF-D。
14.权利要求1的组合物，其中所述试剂是angiopoietin 1、2、3或4。
15.权利要求1的组合物，其进一步含有分泌该试剂的细胞。
16.权利要求1的组合物，其中培养的脊椎动物细胞选自脂肪细胞、星形细胞、心肌细胞、软骨细胞、内皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞、神经节细胞、腺细胞、胶质细胞、造血细胞、肝细胞、角质细胞、成肌细胞、神经细胞、成骨细胞、胰腺β细胞、肾细胞、平滑肌细胞、横纹肌细胞和上述任一种的前体。
17.权利要求1的组合物，其中培养的脊椎动物细胞是人细胞。
18.权利要求1的组合物，其中所述多肽选自酶、激素、细胞因子、集落刺激因子、疫苗抗原、抗体、凝集因子、调节蛋白、转录因子、受体和结构蛋白。
19.权利要求1的组合物，其中所述多肽是因子VIII。
20.权利要求1的组合物，其中所述多肽是人生长激素。
21.权利要求1的组合物，其中所述多肽是因子IX。
22.权利要求1的组合物，其中所述多肽是促红细胞生成素。
23.权利要求1的组合物，其中所述多肽选自VEGF、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C和VEGF-D。
24.权利要求1的组合物，其中所述多肽是促胰岛素。
25.权利要求1的组合物，其中所述多肽选自α-1抗胰蛋白酶、降钙素、葡糖脑苷脂酶、低密度脂蛋白(LDL)受体、IL-2受体、珠蛋白、免疫球蛋白、催化抗体、白介素、胰岛素、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、甲状旁腺激素(PTH)、肥胖蛋白、神经生长因子、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、酸性FGF(aFGF)、表皮生长因子(EGF)、内皮细胞生长因子、血小板衍生生长因子(PDGF)、转化生长因子、内皮细胞刺激血管生成因子(ESAF)、血管生成素、组织纤溶酶原激活剂(t-PA)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。
26.权利要求1的组合物，其中所述小球体是I型胶原珠。
27.权利要求26的组合物，其中所述微载体是多孔的。
28.权利要求1的组合物，其中所述微载体是多孔的明胶珠。
29.权利要求1的组合物，其中所述大多数微载体近似于球形，直径约为0.1-2mm。
30.权利要求1的组合物，其中所述基质材料还含有一种选自第二种类型的胶原、琼脂糖、藻酸盐、纤连蛋白、层粘连蛋白、透明质酸、硫酸乙酰肝素、硫酸皮肤素、硫酸蛋白聚糖、血纤蛋白、弹性蛋白和细胞粘合素的物质。
31.权利要求1的组合物，其还含有在基质材料主体内分散的非胶原纤维。
32.权利要求31的组合物，其中所述非胶原纤维含有一种选自尼龙、涤纶、聚四氟乙烯、聚乙醇酸、聚乳酸/聚乙醇酸共聚物、聚苯乙烯、聚氯乙烯、兽肠线、棉花、亚麻、聚酯和丝的材料。
33.权利要求1的组合物，成形以便植入患者体内。
34.权利要求33的组合物，其中培养的脊椎动物细胞来源于取自患者的一种或多种细胞。
35.权利要求34的组合物，其中培养的脊椎动物细胞由无性群体组成。
36.权利要求1的组合物，其中每一种微载体主要由一种或多种选自胶原、聚苯乙烯、葡聚糖、聚丙烯酰胺、纤维素、藻酸钙、乳胶、聚砜和玻璃的物质组成。
37.权利要求1的组合物，其中培养的脊椎动物细胞是成纤维细胞。
38.权利要求1的组合物，其中所述微载体近似于球形。
39.权利要求37的组合物，其进一步含有角质细胞。
40.权利要求39的组合物，其中所述角质细胞和成纤维细胞从同一个体获得。
41.权利要求39的组合物，其进一步含有一种或多种角质细胞分化因子。
42.权利要求41的组合物，其中所述角质细胞分化因子含有浓度为1.5-2mM的钙离子。
43.权利要求1的组合物，其进一步含有内皮细胞。
44.权利要求37的组合物，其进一步含有内皮细胞。
45.权利要求44的组合物，其中所述内皮细胞和成纤维细胞从同一个体获得。
46.权利要求1的组合物，其中所述多肽选自干扰素-α(IFN-α)、干扰素-β(IFN-β)、干扰素-γ(IFN-γ)、促卵泡激素(FSH)、α-半乳糖苷酶、β-gluceramidase、α-艾杜糖醛酸苷酶、艾杜糖-2-硫酸酯酶、葡糖胺-N-硫酸酯酶、α-N-乙酰氨基葡糖苷酶、乙酰辅酶Aα-氨基葡糖苷酶-N-乙酰转移酶、N-乙酰葡糖胺-6-硫酸酯酶、β-半乳糖苷酶、N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶和β-葡糖醛酸酶。
47.权利要求1的组合物，其中基质材料还含有一种选自肝素、纤维素、淀粉和葡聚糖的物质。
48.一种制备组合物的方法，该方法包括形成一种混合物，该混合物包含(a)大量培养的可表达一种多肽的遗传工程化脊椎动物细胞；(b)大量微载体；(c)一种含有可溶性胶原的溶液；和(d)一种与固体底物结合的试剂，其中该试剂选自促进血管生成的因子、细胞因子、生长因子和抗坏血酸；将该混合物中的可溶性胶原置于可有效形成凝胶的条件下；和将凝胶置于可使凝胶收缩的培养条件下，从而形成组合物主体。
49.权利要求48的方法，其中溶液是可溶性胶原的一种酸性水溶液，而胶凝是通过提高溶液的pH而实现的。
50.权利要求48的方法，其中胶凝步骤在模子中发生，因此，在收缩步骤之前，凝胶为模子的形状。
51.权利要求48的方法，其中在与溶液混合之前，在微载体存在下培养所述培养的脊椎动物细胞。
52.一种对需要的患者施用多肽的方法，包括提供权利要求33的组合物，其中培养的脊椎动物细胞可分泌多肽；和将该组合物植入患者体内。
53.权利要求52的方法，其中培养的脊椎动物细胞来源于取自患者的一种或多种细胞，并且已经在体外遗传改造而表达和分泌多肽。
54.权利要求52的方法，其中在患者的皮下部位施行植入。
55.权利要求52的方法，其中在患者的腹膜内、肾小囊下、腹股沟、肌内、心室内、网膜内或鞘内部位施行植入。
56.权利要求52的方法，其中多肽是促进创伤愈合的一种多肽，在患者的预先存在的创伤部位施行植入。
57.权利要求48的方法，其中在填充混合物至深约0.18mm的平底模子中形成凝胶。
58.通过权利要求57的方法产生的一种组合物。
59.权利要求48的方法，其中在内半径(r)的平底圆柱形模子中形成凝胶；混合物体积为(V)；当r以cm表示，V以ml表示时，r2/V约为1.8。
60.制备权利要求39的组合物的一种方法，包括形成一种混合物，该混合物含有(a)大量培养的可表达一种多肽的遗传工程化脊椎动物细胞；(b)大量微载体；和(c)一种含有可溶性胶原的溶液；将该混合物中的可溶性胶原置于可有效形成凝胶的条件下；将凝胶置于可使凝胶收缩的培养条件下，从而形成组合物主体；和在凝胶收缩后向组合物主体中加入角质细胞。
61.一种组合物，其含有含不溶性胶原原纤维的基质材料主体，在基质材料主体内包埋有(a)第一种培养的可表达一种多肽的遗传工程化脊椎动物细胞群；(b)第二种培养的脊椎动物细胞群，它们可分泌一种选自促进血管形成的因子、细胞因子和生长因子的试剂；和(c)大量微载体。
62.权利要求61的组合物，其中第二种培养的脊椎动物细胞群被遗传改造而表达该试剂。
63.权利要求61的组合物，其还含有第三种培养的脊椎动物细胞群，它们表达和分泌选自促进血管形成的因子、细胞因子和生长因子的第二种试剂。
64.权利要求61的组合物，成形以便植入患者体内。
65.一种制备权利要求61的组合物的方法，包括形成一种混合物，该混合物含有(a)第一种培养的可表达一种多肽的遗传工程化脊椎动物细胞群；(b)第二种培养的脊椎动物细胞群，它表达并分泌一种选自促进血管形成的因子、细胞因子和生长因子的试剂；(c)大量微载体；和(d)一种含有可溶性胶原的溶液；将该混合物中的可溶性胶原置于可有效形成凝胶的条件下；和将凝胶置于可使凝胶收缩的培养条件下，从而形成组合物主体。
66.一种对需要的患者施用多肽的方法，包括提供权利要求64的组合物，其中第一种培养的脊椎动物细胞群分泌该多肽；和将该组合物输入患者体内。
67.一种制备组合物的方法，该方法包括形成一种混合物，其含有(a)大量培养的可表达一种多肽的遗传工程化脊椎动物细胞；(b)大量微载体；和(c)一种含有可溶性胶原的溶液；将该混合物中的可溶性胶原置于可有效形成凝胶的条件下；和将凝胶置于可使凝胶收缩的培养条件下，从而形成组合物主体，其中在填充该混合物至深度约为0.18cm的平底模子中形成凝胶。
68.通过权利要求67的方法产生的一种组合物。
69.一种制备组合物的方法，该方法包括形成一种混合物，其含有(a)大量培养的可表达一种多肽的遗传工程化脊椎动物细胞；(b)大量微载体；和(c)一种含有可溶性胶原的溶液；将该混合物中的可溶性胶原置于可有效形成凝胶的条件下；和将凝胶置于可使凝胶收缩的培养条件下，从而形成组合物主体，其中在内半径(r)的平底圆柱形模子中形成凝胶；混合物体积为(V)；当r以cm表示，V以ml表示时，r2/V约为1.8。
70.一种组合物，其含有含不溶性胶原原纤维的基质材料主体，在基质材料主体内包埋有(a)大量培养的可表达一种多肽的遗传工程化成纤维细胞；(b)大量角质细胞；和(c)大量微载体。
71.权利要求70的组合物，其中角质细胞和成纤维细胞从同一个体获得。
72.一种制备权利要求70的组合物的方法，包括形成一种混合物，其含有(a)大量培养的可表达一种多肽的遗传工程化成纤维细胞；(b)大量角质细胞；(c)大量微载体；和(d)一种含有可溶性胶原的溶液；将该混合物中的可溶性胶原置于可有效形成凝胶的条件下；和将凝胶置于可使凝胶收缩的培养条件下，从而形成组合物主体。
73.一种组合物，其含有含不溶性胶原原纤维的基质材料主体，在基质材料主体内包埋有(a)大量培养的可表达一种多肽的遗传工程化成纤维细胞；(b)大量内皮细胞；和(c)大量微载体。
74.权利要求73的组合物，其中内皮细胞和成纤维细胞从同一个体获得。
75.一种混合物，在胶原水溶液中悬浮有(a)大量培养的可表达一种多肽的遗传工程化脊椎动物细胞；(b)大量微载体；和(c)至少一种选自促进血管形成的因子、细胞因子、生长因子和抗坏血酸的试剂，其中至少一种试剂与胶原溶液中悬浮的固体底物结合，其中在混合物中有足量的胶原，使混合物在pH5以上时胶凝。
76.一种制备混合物的方法，该方法包括合并(a)大量培养的可表达一种多肽的遗传工程化脊椎动物细胞，(b)大量微载体，(c)至少一种选自促进血管形成的因子、细胞因子、生长因子和抗坏血酸的试剂，和(d)一种含有可溶性胶原的溶液，其中在混合物中有足量的胶原，使混合物在pH5以上时胶凝。
77.一种混合物，在胶原水溶液中悬浮有(a)第一种培养的可表达一种多肽的遗传工程化脊椎动物细胞群；(b)第二种培养的脊椎动物细胞群，它们可分泌一种选自促进血管形成的因子、细胞因子和生长因子的试剂；和(c)大量微载体，其中在混合物中有足量的胶原，使混合物在pH5以上时胶凝。
78.一种制备权利要求77的混合物的方法，该方法包括合并(a)第一种培养的可表达一种多肽的遗传工程化脊椎动物细胞群；(b)第二种培养的脊椎动物细胞群，它们可表达和分泌一种选自促进血管形成的因子、细胞因子和生长因子的试剂；(c)大量微载体；和(d)一种含有可溶性胶原的溶液，其中在混合物中有足量的胶原，使混合物在pH5以上时胶凝。
79.权利要求78的方法，该方法还包括在混合物中含有含与该试剂结合的物质的固体底物。
80.一种对需要的患者施用多肽的方法，该方法包括提供一种组合物，该组合物包含培养的可表达该多肽的遗传工程化脊椎动物细胞群，大量微载体，至少一种与基质材料主体内包埋的固体底物结合的试剂，其中至少一种试剂选自促进血管形成的因子、细胞因子、生长因子和抗坏血酸，和胶原，和将该组合物导入患者体内。
81.一种对需要的患者施用多肽的方法，该方法包括提供一种组合物，该组合物包含第一种培养的可表达一种多肽的遗传工程化脊椎动物细胞群，第二种培养的脊椎动物细胞群，它们分泌一种选自促进血管形成的因子、细胞因子和生长因子的试剂，大量微载体，和胶原，和将该组合物导入患者体内。
82.一种对需要的患者施用多肽的方法，该方法包括提供一种液体混合物，在水溶液中悬浮有培养的可表达该多肽的遗传工程化脊椎动物细胞群，大量微载体；和将该液体组合物导入患者体内。
83.权利要求82的方法，该混合物还含有可溶性胶原。
84.权利要求82的方法，该混合物还含有选自绞碎的脂肪组织、绞碎的网膜组织、甲基纤维素、藻酸盐、明胶和血纤蛋白的物质。
85.权利要求82的方法，其中向患者中导入混合物是通过皮下注射器。
86.权利要求85的方法，其中注射器加有注射针头或导管。
87.权利要求82的方法，其中向患者导入通过导管。
88.权利要求82的方法，其中向患者导入通过移液管。
89.权利要求83的方法，其中合并培养的脊椎动物细胞、微载体和可溶性胶原形成混合物与向患者导入混合物同时进行。
90.一种对需要的患者施用多肽的方法，该方法包括提供一种液体混合物，其含有胶原水溶液，在该溶液中悬浮有表达该多肽的培养的遗传工程化脊椎动物细胞群，大量微载体；和将该液体混合物导入患者体内。
91.一种包含运输容器的试剂盒，其包含(a)第一个容器，其中包含(i)表达一种多肽的培养的遗传工程化脊椎动物细胞群；和(ii)大量微载体；(b)第二个容器，含有胶原溶液；和(c)第三个容器，含有培养基。
92.权利要求91的试剂盒，其中胶原溶液为酸性pH，培养基为碱性pH。
93.权利要求91的试剂盒，其中胶原溶液温度低于8℃。
94.一种用权利要求91的试剂盒制备混合物的方法，该方法包括(a)合并第二个和第三个容器的内容物，形成稀释的胶原溶液；和(b)合并稀释的胶原溶液与第一个容器的内容物，形成混合物。
95.权利要求94的方法，还包括在混合物凝固之前向患者导入该混合物的步骤。
96.一种包含运输容器的试剂盒，其包含(a)第一个容器，其中包含(i)表达一种多肽的培养的遗传工程化脊椎动物细胞群；和(ii)大量微载体；和(b)第二个容器，含有胶原溶液。
97.权利要求96的试剂盒，其中胶原溶液为酸性pH。
98.权利要求96的试剂盒，其中胶原溶液温度低于约8℃。
99.权利要求96的试剂盒，其还包括含有碱性pH的溶液的第三个容器。
100.一种用权利要求96的试剂盒制备混合物的方法，该方法包括合并第一个和第二个容器的内容物形成混合物。
101.权利要求100的方法，其还包括在混合物凝固之前向患者化导入混合物的步骤。
102.一种包含运输容器的试剂盒，包括一个含有胶原水溶液的容器，该溶液中悬浮有(a)表达一种多肽的培养的遗传工程化脊椎动物细胞群；和(b)大量微载体，其中水溶液温度低于约8℃。
103.一种对需要的患者施用多肽的方法，该方法包括提供一种液体混合物，在胶原水溶液中悬浮有表达该多肽的培养的遗传工程化脊椎动物细胞群；和将该液体混合物导入患者，其中在混合物中有足量的胶原，使混合物在pH5以上时胶凝。
104.一种将混合物导入患者体内的装置，该装置包括至少两个容器，每一个容器都有一个与输送工具液体连通的出口，其中该装置包含(a)一种胶原水溶液，(b)表达一种多肽的培养的遗传工程化脊椎动物细胞群，和(c)大量微载体。
105.权利要求104的装置，其中每个容器含有(a)、(b)、(c)之一或更多。
106.权利要求104的装置，其中一个或多个容器与一个具有两端的活塞结合，第一端适合插入容器的内部，第二端适合从容器的内部延伸出来。
107.权利要求104的装置，其中输送工具是一种注射针头，它具有(a)一个或多个适合与容器出口液体连通的入口，和(b)一个出口。
108.权利要求104的装置，其中输送工具包括一个转接器，其具有一个与每个容器出口液体连通的连接体，一个混合室和一个与注射针头液体连通的出口。
109.权利要求108的装置，其中所述连接体包括至少两个入口，每一端只与一个容器的出口液体连通。
110.权利要求104的装置，其进一步含有一个或多个物理连接至少两个容器的连接体。
111.权利要求106的装置，其中每个活塞的第二个末端与一个压力板连接。
112.一种容器，含有一种混合物，其在胶原水溶液中悬浮有(a)表达一种多肽的培养的遗传工程化脊椎动物细胞群；(b)大量微载体，和(c)一种与固体底物结合的试剂，其中该试剂选自促进血管形成的因子、细胞因子、生长因子和抗坏血酸，其中在混合物中有足量的胶原，使混合物在pH5以上时胶凝。
113.一种容器，含有一种混合物，在胶原水溶液中悬浮有(a)表达一种多肽的第一种培养的遗传工程化脊椎动物细胞群；(b)第二种培养的脊椎动物细胞群，它们可分泌一种选自促进血管形成的因子、细胞因子和生长因子的试剂；和(c)大量微载体，其中在混合物中有足量的胶原，使混合物在pH5以上时胶凝。
全文摘要
一种组合物,具有由不溶性胶原原纤维组成的基质材料主体,其中分散有:a)大量脊椎动物细胞;b)大量微载体;和c)一种试剂,如促进血管形成的因子、细胞因子、生长因子或抗坏血酸。本发明也表征了一种对动物施用多肽的方法。该方法包括向动物中导入一种流体混合物,该混合物含有:a)表达该多肽的培养的遗传工程脊椎动物细胞群;和b)大量微载体。
文档编号A61P17/02GK1377257SQ00813699
公开日2002年10月30日 申请日期2000年10月4日 优先权日1999年10月5日
发明者R·米尼奥－翰施克, J·C·拉姆萨, D·阿巴罗斯－克勒 申请人:核转移治疗公司