专利名称：萎叶的叶提取物的抗单核细胞活性的制作方法
技术领域：
本发明涉及萎叶的叶提取物的抗单核细胞活性。髓性白血病是致命的，通常对化学疗法没有反应而导致不良的预后。萎叶的叶提取物的抗单核细胞活性表明其治疗髓性白血病的潜在用途。本发明还涉及治疗髓性白血病的方法，该方法使用萎叶的叶提取物治疗患有髓性白血病的动物包括人。
背景技术：
萎叶具有强烈的刺激性香味，并作为咀嚼剂广泛使用。通常，已经停止生长但还没有变脆的成熟或过于成熟的叶子，被用于咀嚼。用于咀嚼目的的基本制剂包括涂有水合石灰和儿茶的萎叶，其中加入了槟榔坚果的碎屑；根据个人的口味使用调味品，如椰子刮屑、丁香、小豆蔻、茴香、磨成粉末的干草、肉豆蔻、还有烟草。在有些地方，制备的盘上覆盖着银箔或金箔。作为咀嚼剂，它有很多特性受到称赞它是芳香的、易消化的、刺激性的和排气的。
医药方面它可用于鼻粘膜和肺部感染，它也用于膏药。咀嚼带有槟榔坚果和其它附属物的萎叶的效果是刺激唾液腺和刺激口腔粘膜。由于槟榔果中的色素产生红的着色，这表明其自身正经历碱和儿茶的作用。产生温和程度的刺激，除了释放出令人愉悦的香味还导致温暖和健康的感觉。决定叶子芳香值的最重要因素是香精油的量以及特别是香精油的性质。不同地区产的萎叶在气味和味道上有所不同。最刺鼻的是Sanchi型，而最温和和最甜的来自Madras。萎叶含有香精油，依据叶子的不同种类油的含量在0.7-2.6％间变化。该油含有酚和萜类。苯酚油含量越高则质量越好。称作萎叶酚的丁香酚的异构体(β-苯酚；4-烯丙基-2-羟基-1-甲氧基苯)被认为是萎叶油的特征性成分。然而在印度样品中缺乏此物质。印度类型的萎叶油含有占优势的苯酚组分。萎叶油已用于治疗各种呼吸道粘膜炎，在白喉中以漱口剂或吸入剂局部施用。它具有开胃顺气(carminative)的特性。它对动物中枢神经系统显示不同的作用；致死剂量产生深度昏迷，几小时后导致死亡。其香精油和叶提取物具有抵抗一些革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的活性，例如生脓微球菌(Micrococcus pyogenes var.Albus)，枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，巨大芽孢杆菌(B.megaterium)，肺炎双球菌(Diplococcuspneumoniae)，生脓链球菌(Sreptococcus pyogenes)，大肠杆菌，typhosa沙门氏菌(Salmonella typhosa)，弧形弧菌(Vibrio comma)，痢疾志贺菌(Shigella dysenteriae)，普通变形菌(Proteus vulgaris)，青枯假单胞菌(Pseudomonas solanacaerum)，藤黄八叠球菌(Sarcina lutea)和胡萝卜欧氏杆菌(Erwinia carotorora)。香精油和叶提取物还显示出抗真菌的活性，这些真菌包括黑曲霉(Aspergillus niger)和米曲霉(A.oryzae)，新月形变孢霉菌(Curvularia lunata)和尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)。发现该油在约5分钟内能使原生动物有尾草履虫(Paramaeceum caudatum)致死(Wealthof India，第8卷，84-94页)。它抑制霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、肠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhosum)、弗氏志贺菌(Shigella flexneri)和大肠杆菌。叶子的蒸馏物显示抵抗结核分枝杆菌的活性。
髓性白血病通常再分为两组急性髓性白血病(AML)和慢性髓性白血病(CML)。AML的特征是骨髓中的髓性细胞数量增加和其成熟停滞，常常导致造血不足。在美国，AML每年的发病率约为每10万人中2.4人发病，并随着年龄增加而逐渐增加，达到每10万成人12.6人发病的峰值(65岁或以上)。尽管改进了治疗方法，全球AML的预后仍非常差。即使在美国，65岁以下患者的五年存活率低于40％。在过去十年中此值是15％。类似地，尽管临床医学取得了进步CML的预后也是很差。
发明内容
本发明的主要目的是使用萎叶的叶提取物治疗包括人在内的动物的髓性白血病。
本发明的另一个目的是提供一种组合物，该组合物含有用于治疗髓性白血病的萎叶的叶提取物。
发明概述为了满足上述目的，本发明提供了具有抗单核细胞活性的萎叶的叶提取物以及使用该活性治疗包括人在内的动物的髓性白血病。
发明详述因此，本发明提供了萎叶的叶提取物的一种新用途，即抗单核细胞活性。将萎叶提取物的该抗单核细胞活性用于治疗包括人在内的动物的髓性白血病。
在一个实施例中，提供了一种用于治疗髓性白血病的药物组合物，所述组合物含有有效量的萎叶的叶提取物以及或与之联用的药学上可接受的添加剂。
在本发明另一个实施例中，选择的添加剂具有不干扰萎叶的叶提取物活性的特点。
在本发明的另一个实施例中，添加剂选自如下营养物质蛋白质、碳水化合物、糖、滑石粉、硬脂酸镁、纤维素、碳酸钙、淀粉-明胶糊剂和/或药学上可接受的载体、赋形剂、稀释剂或溶剂。
本发明的另一个实施例中，萎叶的叶提取物或含有萎叶的叶提取物的组合物口服或肌肉内方式给予。
本发明的另一个实施例中，萎叶的叶提取物配制成用于口服给予的胶囊、糖浆、浓缩物、粉剂或颗粒。
本发明的另一个实施例中，萎叶的叶提取物与添加剂的比在10-1的范围内。
本发明的另一个实施例中，萎叶的叶提取物或组合物以5-20mg/kg体重的剂量水平给予。
本发明的另一个实施例中，萎叶的叶提取物或含有提取物的组合物隔天给予至少三周，较佳的一个月。
本发明的另一个实施例中，萎叶的叶提取物或组合物减少了80％的单核细胞量。
本发明的另一个实施例中，萎叶的叶提取物或组合物用于治疗髓性白血病。
本发明的另一个实施例中，萎叶的叶提取物与药学上可接受的添加剂一起给予或与药学上可接受的添加剂联合给予。
本发明的另一个实施例中，选择的添加剂具有不干扰萎叶的叶提取物活性的特点。
本发明的另一个实施例中，添加剂选自如下营养物质蛋白质、碳水化合物、糖、滑石粉、硬脂酸镁、纤维素、碳酸钙、淀粉-明胶糊剂和/或药学上可接受的载体。
本发明的另一个实施例中，萎叶的叶提取物或组合物以口服或肌肉内方式给予。
本发明的另一个实施例中，萎叶的叶提取物配制成用于口服给予的胶囊、糖浆、浓缩物、粉剂或颗粒。
本发明的另一个实施例中，萎叶的叶提取物与添加剂的比在10-1的范围内。
本发明的另一个实施例中，萎叶的叶提取物或组合物以5-20mg/kg体重的剂量水平给予。
本发明的另一个实施例中，萎叶的叶提取物或含有该提取物的组合物隔天给予至少三周，较佳的一个月。
本发明的另一个实施例中，萎叶的叶提取物或组合物减少了80％的单核细胞的含量。
本发明的另一个实施例中，通过粉碎萎叶或者用水或如乙醇、四氯化碳、氯仿和丙酮等有机溶剂抽提粉碎的萎叶获得萎叶的叶提取物。
再一个本发明的实施例提供了萎叶的叶提取物的制备方法，该方法包括如下步骤1)洗涤萎叶(Piper betle)的新鲜叶子，并在混合物搅拌器中匀浆化；2)在一个超声浴锅中进行超声处理，每15分钟2-3次脉冲并过滤抽提物，如果需要，重复抽提至少一次并烘干；3)冻干提取物得到半固体物质。
本发明的另一个实施例中，萎叶(Piper betle)选自如下类型，即野生型、攀缘植物类型、Bangla类型和Sweet类型。
附图的简要描述
图1显示了与萎叶的叶提取物一起培育后，人PBMC单核细胞遭破坏。
以下给出的实施例仅仅用于解释和说明，这些实施例不以任何方式构成对本发明范围的限制。
实施例1将34.14克的萎叶的新鲜叶子用无菌水彻底洗涤，与100ml的玻璃蒸馏水在混合搅拌器中匀浆化。然后在超声浴锅中每15分钟脉冲3次进行超声处理。用Whatman No.1滤纸过滤抽提物并收集滤液。该抽提过程重复3次。将混合的提取物冻干产生重量为1.17克的半固体物质。然后测定该物质的生物活性。
实施例2将21.68克的萎叶的新鲜叶子在混合搅拌器中与60ml的蒸馏水匀浆化，然后在超声浴锅中每15分钟脉冲2次进行超声处理。使之过夜抽提或抽提16小时。用Whatman No.1滤纸过滤分离水中的提取物。重复3次该提取处理方式。在45℃减压条件下将混合的提取物置于闪蒸器中蒸发至干燥，然后在高真空干燥器中干燥残余物质，得到0.59克的半-固体物质用于生物活性测定。
提取物的特性从实施例1和2获得的生物活性物质具有如下特性1)如上述制备的干燥半固体是一种深色物质，溶于水和二甲基亚砜。
2)活性物质的薄层层析显示，在比例为9∶5∶7的n-丁醇、乙酸和水的溶剂系统中具有RfO.75、0.64、0.50、0.40和0.33的五个斑点。
3)使用Intersil ODS-3(4.6×250mm)分析柱进行该活性物质的HPLC分析，溶剂系统的甲醇和水之比为4∶1，流速为1.0ml/min时，在217nm处检测，该物质被分为11个峰，其保留时间为2.69、4.27、5.95、6.97、7.49、9.39、11.20、12.40、15.53、18.90和21.49分钟。
实施例3人外周血单核细胞(PBMC)的制备肝素化的全血(从正常的个体收集)用Ficoll Hypaque密度梯度离心。用磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗涤界面内的细胞2次，然后在补充有10％胎牛血清的RPMI-1640培养液中重悬浮细胞。
用萎叶的叶提取物培养hPBMC37℃，5％CO2条件下，在总体积为2.0ml RPMI+10％FBS的24孔平板中(存在或不存在萎叶的叶提取物(最终浓度为12.5-mg/ml))，培育PBMC(5.0×106)过夜(18小时)。在培育期结束时，用PBS洗涤PMBC两次，用流式细胞仪检测单核细胞的破坏。
通过流式细胞仪监测由淋巴细胞和单核细胞诱导的光散射将与萎叶的叶提取物一起培育的hPBMC用PBS洗涤一次，然后在含有1％多聚甲醛的PBS中重悬浮。在流式细胞仪(FACS Calibur，Becton Dickinson)中分析细胞。
结果如图1a中所示，外周血液单核细胞具有预期的单核细胞(R1)和淋巴细胞(R2)比例。相反，用萎叶的叶提取物(野生型)一起培育过夜的hPBMC，其淋巴细胞未受影响(图1b，R2)，而单核细胞几乎全部消失(图1b，R1)。它显示萎叶至少降低了80％的单核细胞的活力。
讨论因此，我们的结果说明萎叶的叶提取物的抗单核细胞特性可以用来治疗髓性白血病。
权利要求
1.用于治疗包括人在内的动物的髓性白血病的萎叶的叶提取物的用途，其特征在于，所述用途包括给予包括人在内的动物药物有效量的萎叶的叶提取物、冻干的该提取物或含有萎叶的叶提取物的组合物。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述萎叶的叶提取物或含有萎叶的叶提取物的组合物与药学上可接受的添加剂一同给药或联合给药。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所选的添加剂不干扰萎叶的叶提取物的活性。
4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述添加剂选自如下营养物质蛋白质、碳水化合物、糖、滑石粉、硬脂酸镁、纤维素、碳酸钙、淀粉-明胶糊剂和/或药学上可接受的载体。
5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述萎叶的叶提取物或含有萎叶提取物的组合物以口服或肌肉内方式给予。
6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述萎叶的叶提取物配制成用于口服给予的胶囊、糖浆、浓缩物、粉剂或颗粒。
7.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述萎叶的叶提取物与添加剂的比在1-10∶10-1的范围间。
8.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述萎叶的叶提取物或组合物以5-20mg/kg体重的剂量水平给予。
9.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述萎叶的叶提取物或含有该提取物的组合物隔天给予至少三周，较佳的一个月。
10.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述萎叶的叶提取物或组合物降低了80％的单核细胞活力。
11.如权利要求1所述的用途，其特征在于，含有所述萎叶的叶提取物的组合物在血液细胞中提供抗单核细胞的活性。
12.如权利要求1所述的用途，其特征在于，使用的所述萎叶的叶提取物具有如下特性(i)干燥样品是一种深色物质，溶于水和二甲基亚砜，(ii)活性物质的薄层层析显示，在比例为9∶5∶7的n-丁醇、乙酸和水的溶剂系统中具有Rf0.75、0.64、0.50、0.40和0.33的五个斑点，(iii)使用Intersil ODS-3(4.6×250mm)分析柱进行活性物质的HPLC分析，溶剂系统的甲醇和水之比为4∶1，流速为1.0ml/min时，在217nm处检测，该物质被分为11个峰，其保留时间为2.69、4.27、5.95、6.97、7.49、9.39、11.20、12.40、15.53、18.90和21.49分钟。
13.一种用于治疗包括人在内的动物的髓性白血病的药物组合物，其特征在于，所述组合物含有有效量的萎叶的叶提取物或冻干的该提取物以及或与之联用的药学上可接受的添加剂。
14.如权利要求13所述的组合物，其特征在于，所选的添加剂不干扰萎叶的叶提取物的活性。
15.如权利要求13所述的组合物，其特征在于，所述添加剂选自如下营养物质蛋白质、碳水化合物、糖、滑石粉、硬脂酸镁、纤维素、碳酸钙、淀粉-明胶糊剂和/或药学上可接受的载体。
16.如权利要求13所述的组合物，其特征在于，所述组合物口服或肌肉内给予。
17.如权利要求13所述的组合物，其特征在于，所述萎叶的叶提取物配制成胶囊、糖浆、浓缩物、粉剂或颗粒给予。
18.如权利要求13所述的组合物，其特征在于，所述萎叶的叶提取物与添加剂的比在1-10∶10-1的范围间。
19.如权利要求13所述的组合物，其特征在于，所述萎叶的叶提取物或组合物以5-20mg/kg体重的剂量水平给予。
20.如权利要求13所述的组合物，其特征在于，所述萎叶的叶提取物或含有该提取物的组合物隔天给予至少三周，较佳的一个月。
21.如权利要求13所述的组合物，其特征在于，所述萎叶的叶提取物或组合物降低了80％的单核细胞量。
22.如权利要求13所述的组合物，其特征在于，所述萎叶的叶提取物具有如下特性(iv)干燥样品是一种深色物质，溶于水和二甲基亚砜，(v)活性物质的薄层层析显示，在比例为9∶5∶7的n-丁醇、乙酸和水的溶剂系统中具有Rf0.75、0.64、0.50、0.40和0.33的五个斑点，和(vi)使用Intersil ODS-3(4.6×250mm)分析柱进行活性物质的HPLC分析，溶剂系统的甲醇和水之比为4∶1，流速为1.0ml/min时，在217nm处检测，该物质被分为11个峰，其保留时间为2.69、4.27、5.95、6.97、7.49、9.39、11.20、12.40、15.53、18.90和21.49分钟。
23.一种用萎叶的叶提取物、冻干的该提取物或含有萎叶的叶提取物的组合物治疗包括人在内的动物的髓性白血病的方法，其特征在于，所述方法包括给予患有髓性白血病的包括人在内的动物药物有效量的萎叶的叶提取物、冻干的该提取物或含有萎叶的叶提取物的组合物。
24.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述的萎叶的叶提取物与药学上可接受的添加剂联用或合用。
25.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所选的添加剂不干扰萎叶的叶提取物的活性。
26.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述添加剂选自如下营养物质蛋白质、碳水化合物、糖、滑石粉、硬脂酸镁、纤维素、碳酸钙、淀粉-明胶糊剂和/或药学上可接受的载体、赋形剂、稀释剂或溶剂。
27.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述萎叶的叶提取物或组合物以口服或肌肉内方式给予。
28.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述口服途径是以胶囊、糖浆、浓缩物、粉剂或颗粒的方式服用。
29.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述萎叶的叶提取物与添加剂的比在1-10∶10-1的范围间。
30.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述萎叶的叶提取物是通过粉碎萎叶或者用水或如乙醇、四氯化碳、氯仿和丙酮等有机溶剂抽提粉碎的萎叶获得的。
30.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述萎叶的叶提取物或组合物以5-20mg/kg体重的剂量水平隔天给予至少三周，较佳的一个月。
31.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述组合物降低了80％的单核细胞活力。
全文摘要
本发明涉及萎叶的叶提取物在包括人在内的动物中抗单核细胞活性的用途，所述用途包括给予药物有效量的萎叶的叶提取物，它与药学上可接受的添加剂联用或合用。
文档编号A61K36/18GK1479623SQ00819934
公开日2004年3月3日 申请日期2000年12月4日 优先权日2000年12月4日
发明者S·班迪奥帕迪亚雅, B·帕尔, S·巴登察里亚, M·雷, K·C·罗依, S 班迪奥帕迪亚雅, 罗依, 遣炖镅 申请人:科学工业研究委员会