专利名称：从转基因抗菌肽蝇蛆中制备人用基因抗菌肽药品及其用途的制作方法
昆虫(家蝇)虽然没有完善的免疫防御体系，但却具有高效的无细胞免疫系统。抗菌肽是昆虫(家蝇)免疫后血淋巴中的一类抗菌多肽，它具有分子量小，热稳定，水溶性好，无免疫原性，抗菌谱广等特点。现在，它被认为是从细菌到高等哺乳动物普遍存在的一类防御性多肽，称之为“第二防御体系”。抗菌肽不仅抗菌谱广，而且可以抑杀某些真菌、病毒及原虫，并对多种癌细胞及动物实全瘤有明显的杀伤作用，而不破坏正常细胞。
抗菌肽即将成为一代新的抗菌、抗病素、抗癌药物。但天然抗菌肽的来源少，成本高，无法满足临床应用的需要。因此我们通过DNA重组技术实现转基因抗菌肽蝇蛆繁育家蝇收集蝇蛆获得大量抗菌肽已成为现实。
从转基因抗菌肽蝇蛆中提取、纯化出人用基因抗菌肽药物代替抗菌素对感染性疾的应用。其主要特点有一是抗菌谱广，对很多病菌均有作用，而且疗效确实；二是无抗药性，不存在用药不合理很快产生抗菌性；三是几乎无毒副作用，分子量小，无过敏原，不需做过敏性试验；四是小分子耐热，性能稳定，有效期长，易于贮存、保管；五是用量小，以微克计算，而且可作用于多种途径如静注、肌注、口服、喷雾、皮渗，栓剂等；六是对病毒性疾病也有很好的作用。
一、目前抗菌素存在的主要问题抗菌素是指由细菌、霉菌或其它微生物在生活过程中所产生的具有抗病原体或其它活性的一类物质。自1940年青霉素应用于临床到现在抗生素已达上千种。在临床上常用的亦有几百种。其主要是从微生物的培养液中提取的或者用合成、半合成方法制造。大致可分以下几类
1、B-内酰胺类青霉素和头孢菌素类的分子结构中含有B-内酰胺环。近年来又有较大发展，如硫酶素类(thienamycins)、单内酰环类(monobactams)，B-内酰酶抑制剂(B-lactamade inhibitors)等。
2、氨基糖甙类，包括在链霉素、庆大霉素、卡娜霉素、妥布霉素、丁胺卡那霉素、新霉素、核糖霉素等。
3、四不素类，包括四环素、土霉素、金霉素及强力霉素等。
4、氯霉素类，包括氯霉素、甲砚霉素等。
5、大环内脂类，临床常用的有红霉素、白霉素、无味红霉素、乙酰螺旋霉素、殚迪霉素、交沙霉素等。
6、作用于G+细菌的共它抗生素，如林可霉素、氯林可霉素、万古霉素、杆菌肽等。
7、作用于G菌的其它抗生素，如多粘菌素、磷霉素、卷霉素、环丝氨酸、利福平等。
8、抗真菌抗生素如灰黄霉素。
9、抗肿瘤抗生素如丝霉素、放线菌素D、博莱霉素、阿霉素等。
10、具有免疫抑制作用的抗生素如环孢霉素。
以上十类抗生素约几百种，给患者和临床医生眼花缭乱，如何合理选择实属难题。耐药细菌的急剧增长。一般来说，几乎所有临床医师都基本了解抗生素在应用过程中都可能出现的不良反应。这些不良反应在体内过程与疗效关系都难判定。如B-内酰胺类的致敏性；氨基糖甙类的耳毒性，五环内脂抗生素在临床上应用量大，面广、品种多、更新快、各类药品之间相互作用关系复杂，因此抗菌药物临床应用发生率及耐药性仍然逐年增加。这些问题的发生，主要由抗生素本身决定的。所有抗生素临床选用很难，急需用换代产品来替代抗生素的应用。药物的有效选择、合理应用理论讲是可行的，实际应用太难了。而合理使用抗生素需具体病人制定出个体化治疗方案。绝没有一个固定的方案可以在不同的情况下沿用。
二、基因人用抗菌肽药物的有效性和安全生1、抗菌肽的抗感染作用抗菌肽的主要作用和生物学效应在它的名称上已有体现，研究发现不同来源的抗菌肽均具有广谱抗菌作用。对革兰氏阳性菌和阴性菌均有杀伤作用。实验证实对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、念珠球菌、绿脓杆菌、结核杆菌、肺炎克雷氏菌、粘质沙雷氏菌、变形杆菌、痢疾杆菌、伤寒杆菌、粪链球菌都有很好的抗菌效果。对治疗创伤、烧伤等细菌感染和败血症休克有很好的治疗作用，对病毒、真菌、原虫也有杀伤和抑制作用。
2、抗菌肽遗传毒理学实验安全。
经用Ames试验、啮齿动物微核试验和睾丸细胞染色体畸变试验，证明抗菌肽的遗传毒理学效应安全可靠，测试抗菌肽对小鼠无蓄积毒性。
三、抗菌肽的作用机理抗菌肽具有广谱杀菌作用，包括对革兰氏阴性细菌和革兰低阳性细菌，尤其对耐药菌株有明显抑杀作用。另外，对某些真菌如粗糙链孢霉、绿色木霉、大刀镰孢等有显著效果。关于抗菌肽的杀菌机制。Christensen等以脂双层为模型详细描述了抗菌肽作用于膜的过程。首先是抗菌肽通过静电作用被吸引到膜表面，在后疏水尾巴插入细胞膜中的疏水区域，通过改变膜的构象，多个抗菌肽聚合在膜上形成了离子通道，造成物质泄露和细菌死亡。1996年，Lockey利用电子显微镜和免疫胶体金技术观察到天蚕素(cecropin(A结合到大肠杆菌(r.)膜上，形成一个9.6nm直径的病灶，形成的孔洞直径4.2nm，也洞导致细胞内容物外泄，细菌死亡。Juvvadi通过对天蚕素A和蜂素素(melittin)杂合体的抗菌作用研究，推测抗菌肽的抗菌作用的第一步是抗菌肽的阳离子与膜上磷脂基团的阴离子之间的相互作用，接着是与膜上碳氢化合物的相互相作用，然后肽分子的疏水，螺旋插入膜上，聚合形成孔道，导致内容物外泄，细菌死亡。1997年，Silvestro研究发现天蚕素A在低浓度时可改变脂质体的膜电化学离子梯度，同样浓度下也可改变革兰氏阴性菌的膜离子梯度，但在更高浓度下才会引起细胞内容物的释放。所以天蚕素A是通过改变膜离子梯度来杀死细菌的。而1998年，Park却发现蛙的一种抗菌肽BuforinⅡ与昆虫抗菌肽的抗菌机理不同，没有裂解细胞膜，而是穿过膜，结合到DNA、RNA上，快速导致细菌死亡。目前，化学合成的抗真菌药物副作用较大，而抗菌肽的毒副作用小，且具有热稳定、抗菌谱广等特点。但目前抗菌肽抑杀真菌的作用机理研究较少。Cavallarin发现位于Cecropin衍生物N末端，螺旋区域的11个氨基酸顺序与抗真菌活力有关。1998年，Lee用激光共聚焦显微镜观察真菌受抗菌肽作用后，细胞膜上也有洞形成，用流式细胞仪检测，对荧光敏感性增强。
四、人用基因抗菌肽药物的质量指标要求除含有特定抗菌肽免疫活性物质含量外，以下项目指标必须符合基因生物药品规定的质量要求，保证药物安全性、有效性、稳定性和时效必的统一。Lowos检测蛋白含量 1.65 外观检查微色液体SDS-PAGE电泳纯度测定＞95 PH值6.55HPLC纯度测定100 无菌试验合格SDS-PAGE电脉分子量测定 3300 热原质检定(家免法) 合格等电聚焦电泳等电点测定 5.5 内毒素试验(鱼试剂法)＜kc/n特异性及纯度检测(免疫印迹法)阳性 安全试验合格残余DNA检测 ＜10pg/mg 稳定性试验 合格宿主蛋白含量测定＜510pg/mg全自动紫外全波段扫描276.9效价测定4.72肽图谱测定 合格N端氨基酸序列 与理酸一致(N端不含氨基酸)生物活性测定50ug/ml五、人用基因抗菌肽的使用方式注射用基因人抗菌肽系采用转基因蝇蛆工程技术生产，结构与天然抗菌肽一致、高纯度的液体制品，具有显著广谱抗菌作用，同时还有抗病毒，抗真菌和抗肿瘤等功能。
适应症本品主要用于治疗各类感染性疾病，对革兰氏细菌和金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌结核菌等有很好的治疗作用。也可用病毒和真菌感染，对肿瘤也有一定的治疗作用。
用法和用量供皮下或肌肉注射。每天一次，每次50ug/ml，肿瘤用100ug/ml。剂量和治疗时间也可视具体情况在医生的指导下适当调整。
不良反应患者注射本品一般无不良反应，个别可能出现注射部位轻微疼痛。
注意事项1、本品溶解时如有浑浊沉淀、包装瓶如有损坏以及过期失效者不得使用。2、用药谨遵医嘱，不得擅自使用。
规格本品为水剂，每包装含基因人抗菌肽500ug/ml、100ug/ml。
有效期本品自生产之日起四年内有效。
储存自然温度避光保存。
权利要求
1.从转基因抗菌肽蝇蛆中制备人用基因抗菌肽药品，是从转基因抗菌肽蝇蛆中提取的基因抗菌肽，具备Lowos检测蛋白含量 1.65 外观检查 微色液体SDS-PAGE电泳纯度测定 ＞95 PH值 6.55HPLC纯度测定 100无菌试验 合格SDS-PAGE电脉分子量测定3300 热原质检定(家免法)合格等电聚焦电泳等电点测定5.5内毒素试验(鱼试剂法) ＜kc/n特异性及纯度检测(免疫印迹法) 阳性 安全试验 合格残余DNA检测 ＜10pg/mg 稳定性试验合格宿主蛋白含量测定 ＜510pg/mg全自动紫外全波段扫描 276.9效价测定 4.72肽图谱测定合格N端氨基酸序列 与理酸一致(N端不含氨基酸)生物活性测定 50ug/ml
2.从转基因抗菌肽蝇蛆中制备人用基因抗菌肽药品，一种抗革兰氏细菌药，含从转基因抗菌肽蝇蛆中制备人用基因抗菌肽和制药可接受的载体。
全文摘要
从转基因抗菌肽蝇蛆中制备人用基因抗菌肽药品,是从转基因抗菌肽蝇蛆中提取的基因抗菌肽,含从转基因抗菌肽蝇蛆中制备人用基因抗菌肽和制药可接受的载体。取代抗菌素对感染性疾病的应用,有着广泛的前景。它不但抗菌谱广,疗效确实,无抗药性和无毒副作用,而且分子量小,无过能原,能耐热,性能稳定,易于贮藏,用量小,以微克计算,可作用于多种途径,如静注、肌注、口服、喷雾等。
文档编号A61P31/00GK1312293SQ0110619
公开日2001年9月12日 申请日期2001年2月23日 优先权日2001年2月23日
发明者苟仕金, 苟鸿鹰, 王成余 申请人:辽宁天成生物制药研究所