用甲醇酵母(PichiaPastoris)生产神经营养素-3(NT-3)的方法及应用的制作方法

文档序号:1123951阅读:468来源:国知局
专利名称:用甲醇酵母(Pichia Pastoris)生产神经营养素-3(NT-3)的方法及应用的制作方法
技术领域
本发明属于基因工程药物领域,具体地说,涉及利用工程菌甲醇酵母(Pichia pastoris)生产制备神经营养素-3(NT-3),以及在制备治疗维持和促进多种神经元早期的增殖、分化、损伤的感觉和运动神经元、胆碱能神经元、多巴胺能神经元和听神经元和糖尿病所致外周神经炎和化疗引起的神经疾病等多种疾病药物中的应用。
从目前已有技术而言,虽然动物细胞表达系统得到的NT-3蛋白活性较高。但动物细胞培养条件要求高,成本高,表达量低,当前还主要处在实验室摸索阶段;大肠杆菌表达系统本身较成熟,易培养,对大规模生产更有利,但是仍然存在严重的缺陷,必须解决复性问题,而且产率也不高。
作为真核表达系统,甲醇酵母具有许多其它蛋白表达系统所不可比拟的优点。可概括如下(1)具有强有力的乙醇氧化酶基因(AOX1)启动子,可严格调控外源蛋白的表达;(2)作为真核表达系统,可对表达的蛋白进行翻译后的加工和修饰,从而使表达出的蛋白具有生物活性;(3)营养要求低,生长快,培养基廉价,便于工业化生产;(4)可高密度发酵培养,在发酵罐中细胞干重甚至可达130g/L以上;(5)表达量高,许多蛋白可达到每升克以上水平,如破伤风毒素C片段表达量高达12g/L;(6)在甲醇酵母(Pichia Pastoris)中表达的蛋白既可存在于胞内,又可分泌至胞外。Pichia自身分泌的蛋白(背景蛋白)非常少,十分有利于纯化。如表达的重组水蛭素(HIR),仅经过二步层析纯化,纯度就高达97%以上;(7)糖基化程度低。和酿酒酵母相比,甲醇酵母中加到翻译蛋白上的糖链长度平均每条侧链为8-14个甘露糖残基,较之酿酒酵母每条侧链平均50-150甘露糖残基短得多。
甲醇酵母系统是近年来发展起来的一种蛋白表达宿主。它兼顾了动物细胞表达系统和大肠杆菌表达系统的优点而克服了彼此的不足(动物细胞表达系统成本高、表达量低、培养条件高,难于工业化生产;大肠杆菌表达系统产率也不高,纯化繁琐,需要复杂的变性和复性才能恢复生物活性)。
目前,国内外还未见有NT-3和用作医药产品出售,美国Promega公司有分子生物学试剂级产品,NT-3为$240/5ug包装($4.8万/mg),抗体为$255/200ug包装。因为用大肠杆菌表达NT-3表达量低,纯化繁琐,需要复杂的变性、复性才能恢复生物活性,并且复性率也不高(成熟NT-3含三对二硫键,容易形成不正确的二硫键连接)。这些问题造成成本过高,价格如此昂贵也就不足为奇了。
发明人克隆NT-3基因于甲醇酵母分泌型表达载体pPIC9K,测序、转化、筛选,得到多拷贝转化子。然而转化子经甲醇诱导后,根本检测不到表达。通过检查NT-3基因全序列,发现了转录提前终止位点的存在,Northern杂交证实了诱导后的NT-3基因转录出的是截短而非全长mRNA。定点突变消除转录提前终止位点并克隆突变基因于载体pPIC9K,再一次原生质球转化甲醇酵母。选出的高拷贝转化子经甲醇诱导,得到了14kD的产物,表明NT-3在甲醇酵母中得到表达。表达产物能刺激培养的PC12细胞的分化,证明具有生物学活性。该工程菌已交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保存,登记入册编号为CGMCC NO.0549。
该方法包括以下步骤8. 基因组DNA的提取和纯化。2. NT-3基因的扩增,克隆和测序3. 重组表达载体的构建、转化、转化子的筛选4. NT-3的诱导表达5. NT-3高抗性转化子RNA提取和Northern杂交6. NT-3基因的定点突变及突变的NT-3基因的克隆7. 突变的NT-3基因的测序,转化,转化子的筛选及诱导表达8. 表达产物NT-3的生物学活性测定到目前为止,国内外有关NT-3在甲醇酵母中的还未见任何报道。本发明NT-3在甲醇酵母中的表达无论表达生物量以及提取制备步骤都优于其它表达体系,为NT-3药物的生产和应用成为现实。
以下的实施例可以使本专业技术领域的技术人员更全面地理解本发明,但不以任何方式限制本发明。
取0.6g中国人胎儿脑组织,研磨后加入盛有5ml提取裂解液(3M异硫氰酸胍,0.01M醋酸钠)的离心管中,30℃摇床中温和振荡1h。用大口径吸管将脑组织裂解液加入盛有18ml乙醇的离心管液面以下,用玻棒缓慢搅拌至完全混匀。回收DNA,滴干乙醇后溶于2ml TE中,过DEAE微型柱纯化。引物根据Jones等报道的NT-3基因序列,设计了NT-3基因5’末端(引物I)和3’末端引物(引物II)。引物I5’-TCT AAG AGA GAG GCT GAG GCT TAC GCG GAG CAT AAG AGT CAC AGA G 划线处为5’末端非配对区,虚线为XhoI酶切位点。引物II5’-CAC TTA TCT TCC GAT CTT TCT GGA C-3’虚线为EcoRT位点。
此外为了消除基因内部转录提前终止位点,设计了引物III和引物IV,也在上海生工合成引物III5’-GAA GTA TTG CTT GAC GGG -3’引物IV 5’-TAC GAA ACG CGA TGT AAG -3’2. NT-3基因的扩增,克隆和测序以提取的DNA为模板,以引物I和引物II进行扩增。PCR条件为94℃ 40sec,60℃ 40sec,72℃ 60sec,反应30个循环,结束后72℃延伸10min。利用PCR产物两端的EcoRI和XhoI位点,将其克隆于载体SK。连接、转化均按分子克隆进行。重组表达载体pPIC9K-NT-3的构建如

图1所示。经序列测定,BDNF基因是由如序列表所示的357bp的核苷酸组成(见图2)。3. 重组表达载体的转化、转化子的筛选重组表达载体pPIC9K-NT-3用SacI酶切线性化,原生质球方法转化甲醇酵母。转化子长出后在含G418的抗性平板上筛选,并不断提高G418的浓度,以得到高抗性的转化子,抽提高抗性转化子DNA,用引物I和引物II PCR扩增,以确证NT-3基因的整合。4. 原生质球法转化甲醇酵母GS115方法试剂a)SOS1M山梨醇,0.3X YPD,10mmol/L CaCl2b)SE 1M山梨醇,25mmol/L EDTA(pH8.0)c)SCE1M山梨醇,10mmol/L柠檬酸钠缓冲液pH5.8d)CaS1M山梨醇,10mmol/L Tris-HCl(pH7.5),10mmol/L CaCl2e)CaT20mmol/L Tri-HCl(pH7.5),20mmol/L CaCl2原生质球的制备a)将甲醇酵母SMD1168接种YPD平板,30℃培养2-3天,挑取单一克隆并接种到盛有10ml YPD培养基的100ml摇瓶,30℃,300rpm培养过夜。b)接种10μl上述菌悬液到含200ml YPD的500ml摇瓶。30℃300rpm培养至OD600为0.2-0.3时,1500g离心5min,去掉上清。c)分别用20ml无菌水、20mlSED、20ml 1M山梨醇各洗涤细胞一次,每次洗完1500g离心5min,去上清。最后加20ml SCE重悬细胞。分成10ml的A、B两管。d)取19支无菌干净的1.5ml EP管,每管加800μl5% SDS,并分别标上0、2、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、28、30、32、35、38、40、45分别代表Zymolyase消化细胞壁的时间(min)。从上述A管中取200μl菌悬液加入后,放入冷冻中,作为Zymolyase消化分钟的对照管。加7.5μl Zymolyase(2.25 Units)到A管,轻轻混匀,根据管中标记的时间,每次从A管取200μl正在消化的细胞悬液至装有0.8ml 5%SDS的EP管中,并立即放置冰中,以终止酶反应。e)依下列公式计算每个时间点形成原生质球的百分比原生质球%=100-[(OD800(tmin)/OD800(0min))×1 00]并决定形成70%原生质球的反应时间。加7.5μl Zymolyase到B管,30℃保温,反应时间的长短依上述步骤确定(形成70%原生质球)。f)室温750g离心10min,去上清,分别用10ml 1M山梨醇、10ml CaS洗涤原生质球,去上清,最后用0.6ml CaS重悬原生质球,在30分钟之内用于转化。
转化a)将10μg线性化的pPIC9K-NT-3载体与100μl刚制备的原生质球轻轻混合,室温放置10min。b)加1ml新配制的PEG/CaT(1∶1)溶液,轻轻混合,室温再放置10min。c)750g离心10min,尽可能吸去上清,用150μl SOS重悬细胞并静置20min,加850μl 1M山梨醇。d)每150μl已转化的原生质球与10ml熔化的RD琼脂糖培养基混合,并铺在RDB平板上层,28-30℃,培养4-6天并观察结果。5. NT-3的诱导表达高拷贝转化子接种于BMGY培养基,30℃摇瓶培养约24h后,离心,弃上清,用BMMY培养基悬浮酵母菌体,摇床培养,每隔24h加一次甲醇,并且每隔24h取2ml发酵液,离心去菌体。用0.1%SDS-12%PAGE和Western Blotting分析上清。6.NT-3高抗性转化子RNA提取和Northern杂交同时提取NT-3高抗性转化子和分泌表达的BDNF重组菌株的RNA,在同一块胶上(2%甲醛变性琼脂糖凝胶)电泳。电泳完毕后把凝胶一分为二,一块含NT-3转化子RNA,另一块含BDNF重组菌株RNA,将两者分别转移至NC膜上。以pUC-BDNF和pUC-NT-3质粒为模板,α-32P-dCTP为同位素,随机引物标记法分别制备BDNF基因探针和NT-3基因探针。制备好的探针分别与对应的NC膜上的RNA杂交(见图3)。7.NT-3基因的定点突变及突变的NT-3基因的克隆以pUC-NT-3质粒为模板,以引物I和引物III为一对引物,引物II和引物IV为另一对引物,分别PCR扩增,得到的产物分别命名为片段A和片段B。(见图4)PCR条件为94℃ 40 sec,55℃ 40 sec,72℃ 60sec,反应30个循环,结束后72℃延伸10min。片段A、B回收后,T4 DNA聚合酶削平片段A、B 3’末端。XhoI酶切片段A,EcoRI酶切片段B,两者分别回收。回收后的片段A、B经T4多核苷激酶处理后,直接连接过夜,连接产物和XhoI,EcoRI双切的载体pPIC9K再一次连接(见图5)。转化,Amp筛选。转化子XhoI,EcoRI双酶切鉴定。8. 突变的NT-3基因的测序,转化,转化子的筛选及诱导表达见上面(图6、7、8)。9. 表达产物的纯化发酵培养液离心去除菌体,上清加硫酸铵至80%饱和度,4℃下沉淀6小时。离心得沉淀。沉淀溶解后,对25mM硼酸钠,pH9.0溶液长时间透析。透析好的样品上DEAE-Sephadex阴离子交换柱(2.5×12cm,已用25mM,pH9.0硼酸钠溶液平衡)。用0.1-1.0M NaCl(溶于平衡缓冲液中)梯度分部洗脱。合并有ELISA反应的分管,浓缩后对25mM磷酸缓冲液(PBS)、pH7.0溶液透析。透析好的样品上S-sepharose柱(2.5×20cm,预先用25mM PBS,pH7.0溶液平衡),用0.1-0.5M NaCl溶液洗脱。收集有ELISA反应的部分,电泳分析。10 表达产物NT-3的生物学活性测定甲醇酵母表达产物NT-3经小型离子交换柱纯化后(纯度达95%以上),采用微量考马氏亮蓝CBBG-250染料结合法测其蛋白含量。37℃,5%CO2培养箱中培养的PC12细胞传3-4代后,调整细胞悬液至浓度为0.8×105-1×105个/mL,加入24孔培养板(已用多聚赖氨酸液包被),每孔1mL,培养箱中培养1天。待细胞贴壁后,吸去培养液,加入1ml新鲜培养基,并加入不同浓度的纯化的NT-3样品(1至100ng范围内),以不加样品的培养孔为阴性对照,以NGF为阳性对照,继续培养2-4天。相差倒置显微镜下进行观察、计数(见图9-13)。结果重复三次,计数结果取平均值。
下面结合附图对本发明作进一步详细发明。
权利要求
1,一种用甲醇酵母(Pichia pastoris)工程菌生产人神经营养素NT-3的方法,其特征包括以下步骤人脑基因组DNA的提取和纯化;NT-3基因的扩增,克隆和测定;NT-3重组表达载体的构建;NT-3基因的定点突变;含有NT-3重组表达载体的甲醇酵母(Pichia pastoris)工程菌的构建NT-3在甲醇酵母(Pichia pastoris)工程菌中的诱导表达。
2,根据权利要求1所述的人脑基因组DNA的提取和纯化方法,是以胎儿脑组织为原料提取和纯化脑组织总的DNA。
3,根据权利要求1所述的NT-3基因的扩增,克隆和测定的方法,是用如下所示的引物I和引物II,以纯化的脑组织总DNA为模板,扩增NT-3基因。引物I5’-TCT AAG AGA GAG GCT GAG GCT TAC GCG GAG CAT AAG AGT 划线处为5’末端非配对区,虚线为XhoI酶切位点,引物II5’-CAC TTA TCT TCC GAT CTT TCT GGA C-3’虚线为EcoRI位点。
4,根据权利要求1所述的NT-3基因的扩增,克隆和测定的方法,NT-3基因由357个核苷酸组成,其序列如下所示TACGCGGAGCATAAGAGTCACCGAGGGGAGTACTCGGTATGTGACAGTGAGAGTCTGTGGGTGACCGACAAGTCATCGGCCATCGACATTCGGGGACACCAGGTCACGGTGCTGGGGGAGATCAAAACGGGCAACTCTCCCGTCAAACAATATTTTTATGAAACGCGATGTAAGGAAGCCAGGCCGGTCAAAAACGGTTGCAGGGGTATTGATGATAAACACTGGAACTCTCAGTGCAAAACATCCCAAACCTACGTCCGAGCACTGACTTCAGAGAACAATAAACTCGTGGGCTGGCGGTGGATACGGATAGACACGTCCTGTGTGTGTGCCTTGTCGAGAAAAATCGGAAGAACA
5,一种NT-3重组载体的构建,是NT-3基因与载体SK连接,重组载体为SK-NT-3。
6,根据权利要求1所述的重组表达载体的构建,是利用SK-NT-3重组载体与表达载体pPIC9K酶切,连接,转化,构建为NT-3重组表达载体pPIC9K-NT-3。
7,根据权利要求1所述的NT-3基因的定点突变,是在不改变编码氨基酸的前提下,对原NT-3基因序列中的转录提起终止位点突变。突变后的基因序列如下所示TACGCGGAGCATAAGAGTCACCGAGGGGAGTACTCGGTATGTGACAGTGAGAGTCTGTGGGTGACCGACAAGTCATCGGCCATCGACATTCGGGGACACCAGGTCACGGTGCTGGGGGAGATCAAAACGGGCAACTCTCCCGTCAAGCAATACTTCTACGAAACGCGATGTAAGGAAGCCAGGCCGGTCAAAAACGGTTGCAGGGGTATTGATGATAAACACTGGAACTCTCAGTGCAAAACATCCCAAACCTACGTCCGAGCACTGACTTCAGAGAACAATAAACTCGTGGGCTGGCGGTGGATACGGATAGACACGTCCTGTGTGTGTGCCTTGTCGAGAAAAATCGGAAGAACA
8,根据权利要1的所示NT-3重组甲醇酵母(Pichia pastoris)工程菌的构建,重组表达载体pPIC9K-NT-3利用原生质球方法转化甲醇酵母(Pichia pastoris),得到重组含有NT-3表达载体的重组甲醇酵母转化子CGMCC,NO.0549。
9,根据权利要求4或5或6或7或8,其中任选一项,在生产制备人神经营养素NT-3药物,或制备,治疗,维持和促进外周神经嵴和基板来源的多种感觉神经元的发育、生长和分化,神经中枢的基底前脑、胆碱能神经元、GABA能神经元、中脑黑质多巴胺能神经元和早老性痴呆、帕金森病、外周神经损伤神经性疾病药物中的应用。
全文摘要
本发明属于基因工程药物领域,具体地说,涉及利用工程菌甲醇酵母(Pichia pastoris)生产制备神经营养素-3(NT-3),以及在制备治疗维持和促进多种神经元早期的增殖、分化、损伤的感觉和运动神经元、胆碱能神经元、多巴胺能神经元和听神经元和糖尿病所致外周神经炎和化疗引起的神经疾病等多种疾病药物中的应用。
文档编号A61P25/00GK1394960SQ0112021
公开日2003年2月5日 申请日期2001年7月6日 优先权日2001年7月6日
发明者康良仪, 杨希才, 彭毅 申请人:中国科学院微生物研究所
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