专利名称：抗骨桥蛋白抗体类药物生产方法及用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物制药及防治血管再狭窄、动脉粥样硬化及骨质疏松症的药物技术领域。
本发明是这样实现的一种抗骨桥蛋白抗体类药物，其特征在于该药物为人源抗骨桥蛋白单链抗体、抗骨桥蛋白单克隆抗体或抗骨桥蛋白多克隆抗体，将其制成各种药物剂型。
本发明之二是一种抗骨桥蛋白抗体类药物的生产方法，其特征在于a、首先构建噬菌体人源抗体库，分离PTCA后患者外周血单核细胞，以大鼠OPN为抗原在体外致敏后，经EBV转化，富集分泌特异性抗体的B细胞，提供总RNA；将抗体重链、轻链可变区基因片断与编码十五肽(GIY4Ser)3的DNA接头经重组PCR组装在一起，构建噬菌体抗体库；b、以KOPNH从噬菌体抗体库中筛选抗OPN单链抗体，取硝酸纤维素膜浸泡于OPN溶液中，吹干，放入聚丙烯塑料皿内，取噬菌体悬液加入皿内，室温下轻摇，用PBS洗去未结合噬菌体，换用洗脱缓冲液，以洗脱与OPN结合的噬菌体，收集洗脱液，用中和缓冲液调节PH至7.0-8.0，所洗脱的噬菌体用以感染对数生长期的E.coli，对噬菌体进行扩增，即制得人源抗骨桥蛋白单链抗体。
本发明之三是一种上述的抗骨桥蛋白抗体类药物的用途，其特征在于用于防治血管再狭窄、动脉搏粥样硬化和骨质疏松症。
本发明是根据PTCA后再狭窄发生的病理机制研制的人源抗体OPN抗体或OPN拮抗剂，以细胞外基质为靶标不仅可抑制血管平滑肌细胞向内膜下迁移、增殖和基质重构，而且利用其抗粘附作用，还可有效阻止循环血中的单核细胞在损伤部位粘附、聚积，兼具有抗血栓作用。如果在支架植入术的同时，局部涂层药物支架联合静脉注射用药，可达到抑制再狭窄的治疗效果。骨质疏松是老年人的常见疾病，其发病率位居各病之首，目前尚无治疗该疾病的有效药物。鉴于OPN具有抑制钙盐沉积、促进溶骨的作用，应用OPN小分子拮抗剂中和内源性OPN，可作为骨质疏松的预防与治疗用药。本项目研制的OPN抑制剂系列药物是课题组在多年研究工作的基础上筛选出的一种基质蛋白。以此为基本原料，采用生物高科技手段研制而成，药物作用的靶标在细胞外基质，而作用的终端则是细胞，通过阻断内源性OPN活性，达到抑制细胞黏附、迁移与增殖的目的。其药理机制与临床现有同类药物不同，后者多以血管平滑肌细胞作为靶标。该类药物的研制成功与临床应用，从理论上开创了心血管病治疗的新途径。从药物研制的设计思路上，利用人、鼠OPN结构的高度同源性，以鼠OPN为抗原，激活致敏人单核细胞，进而构建噬菌体人源抗体库，并从中筛选出高活性与特异性的人源OPN单链抗体，简化了人源抗体的制备程序。
本发明药物新颖，可用生物工程方法生产，其工艺合理，用于防治血管再狭窄，动脉粥挥硬化和骨质症具有较好的疗效，且具有不易复发、安全可靠、无毒副作用的特点。
实施例1人源抗OPN单链抗体的生产。
1、噬菌体人源抗体库的构建分离PTCA后患者外周血单核细胞，以大鼠OPN为抗原在体外致敏后，经EBV转化，富集分泌特异性抗体的B细胞，提取总RNP。将抗体重链、轻链可变区基因片断与编码十五肽(Gly4Ser)3的DNA接头经重组PCR组装在一起，构建噬菌体抗体库。
2、用人OPN从噬菌体抗体库中筛选抗OPN单链抗体取硝酸纤维素膜浸泡于(70ug/ml)的人OPN溶液中，室温放置吹干，放入聚丙烯塑料平皿中，取2ml噬菌体悬液加入平皿内，室温下轻摇1～2小时，用PBS洗去未结合噬菌体，换用2ml洗脱缓冲液，在室温下温育10分钟，以洗脱与OPN结合的噬菌体。收集洗脱液，用中和缓冲液调节pH至7.0～8.0，重复洗脱，所洗脱的噬菌体用以感染对数生长期的E.coli，对噬菌体进行扩增，取上清液进行ELISA，检测淘选出的噬菌体展示单链抗体的活性和抗体的特异性。
3、链抗体的表达与鉴定噬菌体悬液感染E.coliHB2151，用含青霉素、葡萄糖的LB培养液扩大培养，以IPTG为诱导剂诱导单链抗体表达，提取周质蛋白，通过SephadexG-75进行纯化。用SDS-PAGE鉴定抗体的分子量。
4、短肽库中OPN拮抗剂的筛选与生物学活性的鉴定以固相化OPN淘筛噬菌体十二肽库，采用ELISA筛选阳性克隆，用细胞粘附与迁移抑制实验鉴定其活性，用竞争抑制实验鉴定其特异性和亲和力。
关于生产抗OPN单克隆抗体、抗OPN多克隆抗体方法均为常规方法。
通过动物试验和药理试验，本发明具有确切的疗效。①已构建成功的人OPNcDNA高效真核表达载体，并证实可在CHO细胞中稳定表达和分泌，从无血清培养三天的培养基中可回收OPN产物量达2mg/ml，经DEAE-cellulose柱层析纯化，毛细管电泳鉴定纯度达98％，SDS-PAGE显示纯化OPN的分子量为66kDa，高效液相色谱分析其氨基酸组成与标准OPN一致，同时，从培养的人和大鼠血管平滑肌细胞培养液也同样可获取高产量OPN(1.6g/ml)，并建立了可提高OPN分泌量、杂蛋白少的细胞培养条件。②OPN对细胞粘附的影响利用96孔板进行细胞粘附试验，观察OPN对细胞粘附能力的影响。结果表明，在一定范围内，血管平滑肌细胞的粘附率随着OPN浓度的增加及作用时间的延长而升高，具有明显的量一效和时一效关系；当加入抗OPN抗体封闭其活性位点后，细胞粘附率下降，提示OPN是促细胞粘附的活性因子。③OPN对细胞迁移的影响用32ug/ml的OPN刺激平滑肌细胞24小时，细胞可发生平面迁移，所迁移的距离是未刺激组的2.1倍。④OPN的化学趋化作用用Boyden小室检测证实，OPN的化学趋化作用在一定条件下呈现量一效依赖关系。⑤已构建成功全人源噬菌体初级抗体库。用纯化的人源OPN经过3次亲和淘筛，回收的特异噬菌体通过ELISA鉴定筛选的克隆，，以读取的A405数值3倍于阴性对照为阳性标准。从中挑选出5株阳性噬菌体克隆；其中有2个克隆对OPN是特异的，其余3个克隆对其他基质成分均有反应，PCR鉴定掺入噬菌体的的抗体基因片段长度为全长ScFV基因(～800bp)。⑥利用被鼠源OPN致敏的人B淋巴细胞构建了人抗体库。⑦用杂交瘤技术已建立了5株阳性克隆。⑧动物模型的建立与药效观察，用球囊内皮剥脱术建立血管再狭窄模型，术后立即静脉注射抗OPN单抗，隔日一次，治疗30天，处死动物，病理切片证实，与对照相比较，用药组血管内膜增生不明显，治疗有效率达80％，治愈率20％。⑨正常人和肿瘤患者血浆OPN水平测试，取20名健康成人和消化系肿瘤患者40人(胃癌10人，直肠癌8人，结肠癌7人，食管癌10人，肝癌5人)，抽取静脉血，用抗OPN单抗检测血浆OPN水平，结果为正常人血中检测不到OPN，肿瘤病人血OPN水平为12～48nmol/L，伴有肿瘤转移者则OPN水平升高更明显。⑩体内外试验证实，抗OPN抗体可以抑制破骨细胞的功能，防治骨质疏松症。
注OPN骨桥蛋白CHO中国仓鼠卵巢细胞SCFV单链杭体PBS磷酸盐缓冲液PCR聚合酶链反应
权利要求
1.一种抗骨桥蛋白抗体类药物，其特征在于该药物为人源抗体骨桥蛋白单链抗体、抗骨桥蛋白单克隆抗体或抗骨桥蛋白多克隆抗体，将其制成各种药物剂型。
2.一种抗骨桥蛋白抗体类药物的生产方法，其特征在于a、首先构建噬菌体人源抗体库，分离PCTA后患者外周血单核细胞，以大鼠OPN为抗原在体外致敏后，经EBV转化，富集分泌特异性抗体的B细胞，提供总RNA；将抗体重链、轻链可变区基因片断与编码十五肽(GIY4Ser)的DNA接头经重组PCR组装在一起，构建噬菌体抗体库；b、以KOPN从菌体抗体库中筛选抗OPN单链抗体，取硝酸纤维素膜浸泡于OPN溶液中，吹干，放入聚丙烯塑料皿中，取噬菌体悬液加入皿内，室温下轻摇，用PBS洗去未结合噬菌体，换用洗脱缓冲液，以洗脱与OPN结合的噬菌体，收集洗脱液，用中和缓冲液调节PH至7.8-8.0，所洗脱的噬菌体用以感染对数生长期的E.coli，对噬菌体进行扩增，即制得人源抗骨桥蛋白单连抗体。
3.一种根据权利要求1所述的抗骨桥蛋白抗体类药物的用途，其特征在于用于防治血管再狭窄、动脉粥样硬化和骨质疏松症。
全文摘要
本发明涉及生物制度技术领域。它是用生物工程法生产人源抗骨桥蛋白单链抗体,抗骨桥蛋白单克隆抗体和抗骨桥蛋白多克隆抗体,将其制成各种药物剂型,用于防治血管再狭窄、动脉粥样硬化和骨质疏松症。具有物质新颖,生产方法独特合理,疗效较高,不易复发、安全可靠、无毒副作用的特点,市场应用前景广阔。
文档编号A61K39/395GK1351888SQ0114053
公开日2002年6月5日 申请日期2001年11月10日 优先权日2001年11月10日
发明者韩梅, 温进坤 申请人:河北医科大学