专利名称：表达热休克蛋白的溶瘤微生物及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物医学领域，具体地讲，本发明涉及肿瘤疫苗领域。本发明具体涉及可选择性地在肿瘤细胞中生长的微生物、含有所述该微生物的药物或药物组合物，以及使用该微生物杀死局部的及转移的肿瘤的方法。
背景技术：
目前，治疗肿瘤最常用的还是传统的肿瘤手术切除和放化疗疗法，它给患者带来很大的痛苦和负担。而且，对转移性肿瘤患者而言，一方面很难将肿瘤彻底手术切除或通过放化疗疗法彻底杀灭；另一方面，切除原位肿块，往往有引发肿瘤在身体其它部位生长的风险，结果反而加速了肿瘤的扩散。
通过改变遗传特性，人们创建了一些能够选择性地感染肿瘤细胞的病毒，例如单纯疱疹病毒(HSV-1)，腺病毒(ONYX-015)，新城疫病毒(NDV)，水泡性口炎病毒(VSV)1-3。虽然这其中的某些病毒具备很强的抗肿瘤活性，在临床试验中能够使肿瘤体积变小甚至完全消除3，但存在的问题是对于转移性肿瘤的抑制作用不强。原因在于虽然这种病毒通过裂解肿瘤细胞来使肿瘤消退，但实体瘤的病人体内缺乏肿瘤特异性的细胞毒性T淋巴细胞介导的免疫反应4。缺乏免疫反应的原因可能是大部分肿瘤抗原是在肿瘤细胞内，而并不是释放出来，发生坏死而释放肿瘤抗原的肿瘤细胞数量也很有限，抗原提呈细胞吸纳肿瘤抗原的几率极小。即使在病毒介导的肿瘤细胞裂解后通过增强肿瘤抗原的释放，呈递“危险信号”，来激发机体肿瘤特异性免疫反应，但由于只有很少的一部分肿瘤抗原能够被提呈，激发的免疫反应也非常有限，仍然需要特殊的机制来进一步增强抗肿瘤的免疫反应。
用癌症疫苗进行肿瘤免疫治疗的策略主要是将被杀死的肿瘤细胞或其裂解产物同时与佐剂或细胞因子共同使用。癌症疫苗免疫能通过在肿瘤原位进行接种从而激发机体的抗肿瘤免疫反应，这在肿瘤治疗研究中将是一个重大的进展。但是，在很多情况下，肿瘤抗原是弱免疫原，也即不能够引起机体足够的针对肿瘤抗原的免疫应答反应。现阶段利用癌症疫苗治疗肿瘤的方式主要为用分离的肿瘤特异性抗原进行免疫；或通过体外将肿瘤细胞与树突状细胞融合后对病人进行细胞治疗。但是，因为不同病人存在着肿瘤抗原的个体差异性；而且同一病人在肿瘤发展的不同阶段，肿瘤细胞所表达的特异性抗原也不相同；即使在同一病人的肿瘤的某一发展时期，其肿瘤细胞内也存在着多种肿瘤抗原。由于这种种限制，导致现阶段用癌症疫苗治疗肿瘤存在着许多缺点必须针对每个病人设计相应的肿瘤抗原，技术操作细节各不相同，操作环节多，每个环节的技术要求高，操作中容易造成污染；而且由于病人体内多种抗原的动态发展，使得这种体外操作技术不一定有效。在临床治疗实践中，必须针对每个病人制备独特的癌症疫苗，难度大，费用高，可行性差。
综上所述，传统的手术治疗和放化疗对机体本身造成伤害而且难以消除转移性肿瘤。现阶段用病毒等作为载体对肿瘤进行基因治疗也只能针对局部肿瘤，对转移性肿瘤也无能为力。用白介素，干扰素等细胞因子对肿瘤进行免疫治疗只能激发免疫调节反应和很少的CTL细胞介导的对肿瘤细胞的特异性杀伤效应。最近发展的“癌症疫苗”疗法非常昂贵且没有普遍适用性。因此，到目前为止，还缺乏一种高效低毒、给药方便的肿瘤治疗物质，该物质在被施用给肿瘤患者后能在体内诱导出有效的抗肿瘤免疫反应，从而将肿瘤，包括转移性肿瘤有效的杀灭。
发明概述本发明总的目的在于找到一种能在肿瘤患者体内诱导特异性抗肿瘤免疫反应的物质，并将该物质对肿瘤患者施用，从而不但将局部的肿瘤杀灭而且还可以将转移的肿瘤杀灭。具体来讲，本发明包括如下几个方面本发明的一个目的在于提供一种溶瘤微生物，其中该微生物表达能粘附肿瘤细胞抗原并被抗原提呈细胞所识别的蛋白，并且该微生物能选择性地在肿瘤细胞中生长以裂解肿瘤细胞。
本发明的再一目的在于提供一种治疗肿瘤的药物，其含有本发明的溶瘤微生物，其中该微生物表达能粘附肿瘤细胞抗原并被抗原提呈细胞所识别的蛋白，并且该微生物能选择性地在肿瘤细胞中生长以裂解肿瘤细胞。
本发明的又一目的在于提供一种药物组合物，其含有a)能选择性地在肿瘤细胞中生长的微生物；和b)能粘附肿瘤细胞抗原的并被抗原提呈细胞所识别的蛋白。
本发明的另一个目的在于提供一种治疗肿瘤、特别是恶性肿瘤的方法，该方法包括给肿瘤患者施用免疫有效量的本发明的药物或药物组合物。
在一个具体实施方案中，本发明提供了提供一种溶瘤微生物，其中该微生物表达能粘附肿瘤细胞抗原并被抗原提呈细胞所识别的蛋白，而且该微生物能选择性地在肿瘤细胞中生长以裂解肿瘤细胞。所述的能粘附肿瘤细胞抗原并被抗原提呈细胞所识别的蛋白优选是热休克蛋白。该微生物能选择性地在肿瘤细胞中生长，从而将肿瘤细胞杀死。所述的热休克蛋白能粘附肿瘤细胞溶解所释放的肿瘤抗原并与抗原提呈细胞结合，从而诱导患者的抗肿瘤免疫反应。所述微生物优选为选择性地在肿瘤细胞中复制的病毒或细菌。所述病毒实例是腺病毒、单纯疱疹病毒、水泡性口炎病毒、新城疫病毒、脊髓灰质炎病毒或其他能选择性地在肿瘤细胞中生长的病毒。所述细菌的实例包括伤寒沙门氏菌、双岐杆菌、志贺氏菌、李斯特菌和鼠疫杆菌以及其他能选择性地在肿瘤细胞中生长的细菌。所述的热休克蛋白来源于哺乳动物(包括但不限于人、非人灵长类动物和啮齿动物)和病原微生物，所述的病原微生物包括但不限于结核分支杆菌、麻风分支杆菌、克氏椎虫和恶性疟原虫。
在另一个具体实施方案中，本发明提供一种治疗肿瘤的药物，其含有本发明的溶瘤微生物，该微生物表达能粘附肿瘤细胞抗原并被抗原提呈细胞所识别的蛋白。该微生物可进一步含有编码免疫增强分子的DNA序列。所述的药物可进一步含有可药用载体。该发明的药物可以单独使用，也可以和其它形式的免疫治疗剂联合使用，包括细胞因子和传统中药。
在另一个具体实施方案中，本发明提供一种药物组合物，其含有a)能选择性地在肿瘤细胞中生长的微生物；和b)能粘附肿瘤细胞抗原并被抗原提呈细胞所识别的蛋白。所述微生物优选为选择性地在肿瘤细胞中复制的病毒或细菌。该病毒或细菌还优选进一步含有编码免疫增强分子的DNA序列。所述病毒的实例是腺病毒、单纯疱疹病毒、水泡性口炎病毒、新城疫病毒、脊髓灰质炎病毒或其他能选择性地在肿瘤细胞中生长的病毒。所述细菌的实例包括伤寒沙门氏菌、志贺氏菌、李斯特菌和鼠疫杆菌以及其他能选择性地在肿瘤细胞中生长的细菌。所述的能粘附肿瘤细胞抗原并被抗原提呈细胞所识别的蛋白例如是来源于哺乳动物(包括但不限于人、非人灵长类动物和啮齿动物)和病原微生物的热休克蛋白。所述的病原微生物包括但不限于结核分支杆菌、麻风分支杆菌、克氏椎虫和恶性疟原虫。该热休克蛋白能粘附肿瘤细胞溶解所释放的肿瘤抗原并与抗原提呈细胞结合，从而诱导患者的抗肿瘤免疫反应。本发明的药物组合物还可进一步含有可药用的载体。
在另一个具体实施方案中，本发明提供一种治疗肿瘤、特别是恶性肿瘤的方法，该方法包括给肿瘤患者施用免疫有效量的本发明的药物或药物组合物。可替代地，也可对肿瘤患者施用抗原提呈细胞，其中所述的细胞已与粘附有肿瘤抗原的并对抗原提呈细胞具有亲和性的蛋白接触。所述的粘附有肿瘤抗原的并对抗原提呈细胞具有亲和性的蛋白优选为热休克蛋白。该接触可通过两种途径实现其一是使本发明的表达热休克蛋白的能选择性地在肿瘤细胞中生长的微生物感染肿瘤细胞，然后将细胞裂解液与抗原提呈细胞接触；其二是将热休克蛋白和能选择性地在肿瘤细胞中生长的微生物同时注射到肿瘤中，然后分离、提取结合有热休克蛋白的抗原提呈细胞。
本发明通过溶瘤微生物将肿瘤细胞裂解，同时溶瘤病毒所表达的热休克蛋白对释放的肿瘤抗原进行吸附，并随后由树突状细胞将肿瘤抗原加工提呈，来激发机体本身的肿瘤特异性免疫反应；不但能够溶解局部肿瘤，还可以进一步抑制并杀灭转移肿瘤。与单独用溶瘤病毒进行肿瘤治疗相比，本发明突破原有技术只能治疗局部肿瘤的局限性，不但能够治疗局部肿瘤，对转移肿瘤同样有效。
本发明中溶瘤微生物所表达的能粘附肿瘤细胞抗原的蛋白，能够将患者自身肿瘤细胞裂解后释放的肿瘤特异性抗原实时提呈，并且不论肿瘤细胞所处的发展阶段以及肿瘤抗原的种类是否相同，都能激发机体针对自身特定的肿瘤抗原有效的免疫反应。本发明实现了在不同个体内利用个体自身的抗原提呈细胞在体内实时动态的将其自身特异性的肿瘤抗原进行加工和提呈，从而激发针对各自不同肿瘤抗原的特异性免疫反应，达到了既简单又有效的治疗效果。本发明克服了现有技术中的由于肿瘤抗原的个体差异性，用“癌症疫苗”进行治疗的主要缺陷例如，必须在得到病人自体的肿瘤细胞，并在体外进行培养及一系列的实验操作，以及随后的疫苗接种等种种缺陷。举例来说，本发明通过溶瘤微生物将肿瘤细胞裂解，同时由溶瘤微生物所表达的对抗原提呈细胞具有亲和性的蛋白或独立地加入的对抗原提呈细胞具有亲和性的蛋白对释放的肿瘤抗原进行吸附，并随后由抗原提呈细胞如树突状细胞将肿瘤抗原加工提呈，来激发机体本身的肿瘤特异性免疫反应；不但能够溶解局部肿瘤，还可以进一步抑制并杀灭转移肿瘤。
附图简述
图1是本发明所构建的表达热休克蛋白的重组HSV-1病毒质粒pHSV-HSP的图。质粒pHSV-HSP含有CMV启动子控制下的HSP70基因和SV40多聚腺苷酸序列(SV40poly(A))。该质粒还包括选择标记、E.coli的复制起点(ColEl ori)、HSV顺式调控序列，HSVψ(HSV切割和包装信号)和HSV ori(HSV的DNA复制起点)。
图2是显示重组病毒HSV-HSP的体外细胞毒性效果的图。其中将鼠肿瘤细胞CT26培养于24孔板(每孔1×105)并由HSV-HSP或HSV以不同的感染复数(0.01-10)感染。感染4天后用Promega试剂盒测定细胞毒性(％)。图2中当感染复数为1时，细胞毒性已达99％以上。
图3表示重组的HSV-HSP在原位肿瘤内注射后能抑制远端肿瘤的良好能力。在小鼠的肋部双侧对称接种CT26细胞。当肿瘤分别长到最大直径为0.5cm时，仅在鼠的右侧肿瘤瘤内注射接种HSV-HSP(1×106)(以实心方块表示)、HSV载体(1×106)(以实心菱形表示)或HSP70(以实心三角表示)作为对照(该日设为第0日)，过7天再进行第二次接种(每组6只)。与对照组相比，经瘤内注射接种HSV-HSP的肿瘤和其对侧未被接种的肿瘤在注入HSV-HSP后都会有显著的癌症生长减慢(p＜0.001，感染后25天，非配对的t检验)。HSV-HSP在抑制两侧的肿瘤生长显著优于HSV单独使用(p＜0.001，感染后25天，非配对t检验)图4是本发明所构建的表达热休克蛋白的重组pcDNA-HSP质粒图。将PCR扩增得到的HSP基因通过平端连接连到真核表达质粒pcDNA3.1上，重组质粒pcDNA-HSP含有CMV启动子控制下的HSP70基因和BGH多聚腺苷酸序列(BGHpolyA)，该质粒还包括选择标记以及复制起点SV40ori.。
图5表示表达热休克蛋白的沙门氏菌SL3261(pcDNA-HSP)在原位肿瘤内注射后能抑制远端肿瘤的良好能力。在小鼠的肋部双侧对称接种SMMC7721细胞。当肿瘤分别长到最大直径为0.5cm时，仅在鼠的右侧肿瘤瘤内注射接种含有质粒pcDNA-HSP的沙门氏菌(aroA-)(1×107)(以实心方块表示)、不含质粒的沙门氏菌(aroA-)(1×107)(以实心菱形表示)或HSP70(以实心三角表示)作为对照(该日设为第0日)，过7天再进行第二次接种(每组6只)。与对照组相比，在注入pcDNA-HSP的沙门氏菌(aroA-)后经瘤内注射接种含有质粒pcDNA-HSP的沙门氏菌(aroA-)的肿瘤和其对侧未被接种的肿瘤都会有显著的癌症生长减慢(p＜0.001，感染后25天，非配对的t检验)。HSV-HSP在抑制两侧的肿瘤生长显著优于HSV单独使用(p＜0.001，感染后25天，非配对t检验)。
发明详述在本专利申请的上下文中，采用的术语具有本领域中所熟知的一般含义。为清楚起见，本专利申请中的下列术语具有如下所说明的含义“溶瘤微生物”这一术语在此定义为经过遗传改造的一类能够进入肿瘤细胞，并通过选择性地在肿瘤细胞内大量复制而导致肿瘤细胞裂解死亡的微生物。溶瘤微生物的实例包括如下定义的溶瘤病毒和溶瘤细菌。
“溶瘤病毒”这一术语在此定义为一种经过遗传改造的病毒，该病毒能够选择性地在肿瘤细胞内复制并杀死肿瘤细胞而不论肿瘤细胞的p53或其它蛋白是否突变。溶瘤病毒的实例包括单纯疱疹病毒(HSV-1)，腺病毒(ONYX-015)，新城疫病毒(NDV)，水泡性口炎病毒(VSV)等。
“溶瘤细菌”这一术语在此定义为一种经过遗传改造的细菌，该细菌能够在肿瘤细胞内复制并杀死肿瘤细胞。已知一些细菌的突变株可以作为肿瘤的基因治疗载体20。例如，沙门氏菌中编码嘌呤(pur)或芳香族氨基酸(aroA)的基因突变后，不能自己合成这些对其必不可少的营养物质。这些物质在正常细胞中并不存在，而肿瘤细胞由于遗传特性的改变可以提供这些营养物质。所以这些营养缺陷型细菌能够选择性地在肿瘤细胞内扩增而使其裂解，如Salmonellatyphimurium YS72(pur-)在荷瘤鼠腹膜接种2天后，可检测到在肿瘤细胞中与在正常肝细胞中的比例为9000∶120。将表达热休克蛋白的基因引入这些细菌突变株，再利用突变型细菌能够在肿瘤细胞中富集并使其裂解的这种特性，这些细菌完全可以作为本发明的溶瘤微生物使用。
“粘附肿瘤抗原的并被抗原提呈细胞所识别的蛋白”这一术语在此定义为一类蛋白，该蛋白能够通过吸附、粘附或结合等作用与肿瘤特异抗原多肽连接而形成蛋白-多肽复合物，并通过抗原肽伴侣转移作用将抗原提交给树突状细胞等抗原提呈细胞，抗原被加工提呈，激发机体免疫反应。这类蛋白的实例包括以热休克蛋白为主的分子伴侣蛋白。
“热休克蛋白”这一术语在此定义为一族高度保守具有ATP酶活性的分子，包括只是保守替换和/或修饰的热休克蛋白变体。热休克蛋白在所有的原核生物以及大多数真核细胞中都存在；无论是否存在外界压力，其在蛋白质代谢中都起着重要作用，包括在蛋白质从头合成途径中蛋白质的折叠和跨膜转运以及错误折叠后的蛋白的降解。所述热休克蛋白，包括从肿瘤细胞和细菌感染的细胞中得到的hsp70和grp94/gp96，他们都能够激发细胞性的免疫反应。“佐剂”是一类和抗原共同使用或其本身就能够充当抗原来能够增强免疫反应的物质。
“抗原”这一术语在此定义为能激发免疫应答的一种分子。免疫反应包括产生抗体，具备特异的免疫活性细胞的活化，或两者的组合。抗原可以产生于生物体、蛋白或抗原的亚单位、被杀死或被去活化的全细胞或裂解物。“癌症”这一术语在此定义为一种恶性的细胞性肿瘤并能够侵袭其它细胞。其实例包括但并不限于乳腺癌，前列腺癌，卵巢癌，子宫癌，皮肤癌，胰腺癌，结肠癌和肺癌。
“癌症疫苗”这一术语在此定义肿瘤特异性抗原分子或接触过肿瘤细胞的免疫细胞。肿瘤细胞所表达的，使肿瘤细胞具有免疫原性从而能被免疫系统识别的蛋白质为肿瘤特异性抗原，通过体外制备该抗原蛋白质或其具有免疫效应的抗原表位多肽；或通过体外免疫细胞与肿瘤细胞接触使免疫细胞能够识别该种抗原，上述蛋白或多肽或免疫细胞即可作为治疗性的癌症疫苗。“杀灭肿瘤”这一术语在此定义为能够有效地抑制肿瘤的扩增和浸润与转移以及使肿瘤消退或转化成良性。
“表达”这一术语在此定义为由其启动子启动的一段特定序列的转录和/或翻译。
“主要组织相容性复合物”或“MHC”这一术语在此定义为一簇特殊的基因，其中大部分编码在细胞表面进行抗原提呈的蛋白，其中对决定组织相容性最重要的包括I类组织相容性复合物，或MHCI，其功能主要是将抗原提呈给CD8T淋巴细胞；II类组织相容性复合物，或MHCII，其功能主要是将抗原提呈给CD4T淋巴细胞。
“启动子”这一术语在此定义为一段核酸序列，能够调控一段特殊的核酸序列的转录。启动子这一术语包括增强子、沉默子和其它顺式调控原件。“T淋巴细胞”在此定义为胸腺来源的能够参与一系列的细胞介导的免疫反应的一类细胞。
“抗原提呈细胞”在此定义为功能为加工提呈抗原给T细胞和B细胞的一类细胞，该类细胞包括树突状细胞，巨噬细胞和B细胞。
“免疫增强分子”在此定义能增强免疫作用的分子，包括IL-2、IL-12、TNF、IFN、GM-CSF、趋化因子等在内的细胞因子和免疫共刺激分子如免疫共刺激分子B7等。
“免疫有效量”这一术语在此定义为能够有效地激发机体产生抑制或杀死肿瘤细胞的免疫反应的剂量。
在本发明中，我们采用的策略是用表达能粘附肿瘤细胞抗原的并被抗原提呈细胞所识别的蛋白的溶瘤微生物感染局部肿瘤，该溶瘤微生物在肿瘤细胞中生长而在正常细胞中基本上不生长。溶瘤微生物在肿瘤细胞中生长的同时，表达能粘附肿瘤细胞抗原的并被抗原提呈细胞所识别的蛋白，而且由于溶瘤微生物在肿瘤细胞中的生长，肿瘤细胞裂解，释放出各种肿瘤细胞的抗原。这些抗原与溶瘤微生物所表达的能粘附肿瘤细胞抗原的并被抗原提呈细胞所识别的蛋白结合，形成抗原一蛋白复合物。该复合物进一步被抗原提呈细胞识别，经抗原提呈细胞加工后提呈给细胞毒性T淋巴细胞，从而对肿瘤细胞产生特异性的细胞免疫反应。在一个具体的实施方案中我们采用表达热休克蛋白的溶瘤微生物感染局部肿瘤。表达的热休克蛋白能够结合肿瘤抗原通过癌症疫苗免疫的方式起到免疫调节的作用。在本发明中，热休克蛋白在原位肿瘤的表达能够显著增强具备复制能力的溶瘤微生物对转移肿瘤的抗瘤活性。在本发明中，将表达热休克蛋白的溶瘤微生物给予患者后使原位肿瘤细胞裂解，从而使肿瘤相关抗原释放，我们在不需要体外制备肿瘤抗原以及预先知道患者的特异性肿瘤抗原的情况下，利用表达的热休克蛋白能够和释放的肿瘤抗原结合的特性，进一步引发或增强对肿瘤抗原的免疫反应。在存在或缺乏佐剂或抗原提呈细胞的情况下，都能通过给予患者表达热休克蛋白的溶瘤微生物来治疗肿瘤。所述溶瘤微生物优选为选择性地在肿瘤细胞中复制的病毒或细菌。所述病毒的实例是腺病毒如ONYX-015、单纯疱疹病毒如HSV-1、水泡性口炎病毒、新城疫病毒、脊髓灰质炎病毒或其他能选择性地在肿瘤细胞中生长的病毒。所述细菌的实例包括伤寒沙门氏菌、双岐杆菌、志贺氏菌、李斯特菌和鼠疫杆菌以及其他天然存在和经诱变筛选后能选择性地在肿瘤细胞中生长的细菌。
本发明中溶瘤微生物所表达的一类蛋白为能够粘附肿瘤抗原并对抗原提呈细胞有亲和性的蛋白，这类蛋白能够结合肿瘤特异抗原多肽形成蛋白-多肽复合物，并通过抗原肽伴侣转移作用将抗原提交给树突状细胞等抗原提呈细胞，抗原被加工提呈，激发机体特异性CTL免疫反应。这类蛋白的实例包括以热休克蛋白为主的分子伴侣蛋白。热休克蛋白(Heat Shock Proteins，HSP)是一类高度保守并具有ATP酶活性的蛋白家族，在所有的原核生物以及大多数真核细胞中都存在。无论是否存在外界压力，热休克蛋白在蛋白质代谢中都起着重要作用，包括在蛋白质从头合成途径中蛋白质的折叠和跨膜转运以及错误折叠后的降解5。热休克蛋白，包括从肿瘤细胞和细菌感染的细胞中得到的hsp70和grp94/gp96，都能够激发细胞性的免疫反应6-7。热休克蛋白的免疫原性主要是由结合到其分子上的多肽所产生8。产生的热休克蛋白-抗原多肽通过一种不表达内生性抗原的特异性细胞将抗原呈递给T淋巴细胞后，从而激活免疫系统。这些结果表明热休克蛋白作为分子伴侣能够将抗原性的多肽呈递给抗原提呈细胞，可能是通过使这些多肽与MHCI和MHCII分子结合而进入MHCI和MHCII呈递抗原途径；这些抗原多肽会进一步被提呈给CD8+细胞毒性T细胞和CD4+辅助性T细胞。
各种热休克蛋白、其片断或各种修饰(包括但不限于一个或多个氨基酸地添加、缺失和/或替换等)变体均可用于本发明，只要该热休克蛋白、片段或变体保持与肿瘤细胞抗原多肽结合的能力即可。同理，本发明的溶瘤微生物也包括各种变体，只要该微生物具有选择性地在肿瘤细胞中复制和生长从而将肿瘤细胞裂解的能力即可。因此，本领域的普通技术人员可以认识到，将编码能粘附肿瘤抗原的并被抗原提呈细胞所识别的蛋白如热休克蛋白的基因引入溶瘤微生物的基因组或表达质粒中，只要保证所述的基因与调控序列如启动子和终止子有效地连接，所述的溶瘤微生物如HSV-1或ONYX-015就可以表达能粘附肿瘤抗原的并被抗原提呈细胞所识别的蛋白如热休克蛋白。在不背离本发明的范围和精神情况下，可对本发明申请中各种实例进行不同改变或修改，这一点对于本领域的技术人员是很显而易见的。
在本发明的一个更为具体的实施方案中，本发明公开了能够表达热休克蛋白的溶瘤病毒，其能够杀死局部肿瘤并通过释放肿瘤抗原来激发机体的抗肿瘤免疫反应。编码热休克蛋白HSP70的基因被置于启动子CMV启动子的控制之下。在所有的应用中，“溶瘤病毒”这一术语是指能够在肿瘤细胞内复制并将其杀死的任何病毒，例如单纯疱疹病毒(HSV-1)，腺病毒(ONYX-015)，新城疫病毒(NDV)，水泡性口炎病毒(VSV)1-3。其中的一个例子ONYX-015为一种能够选择性的在p53功能缺陷的肿瘤细胞内复制的减毒腺病毒9-14。在临床试验中，这种病毒表现非常强的抗肿瘤活性，能够有效的使肿瘤体积减小甚至消除。
在一个具体的实施例中，采用的溶瘤病毒是单纯疱疹病毒。一种具备复制能力的单纯疱疹病毒的突变株经过大量的不同种的动物模型试验发现为非病原性的16并被用于人的原发性脑部肿瘤治疗的临床试验。这种单纯疱疹病毒突变株在分裂细胞内的复制能够导致细胞死亡，其在非分裂细胞内的复制能力则非常弱16。这种单纯疱疹病毒突变株在接种到荷瘤鼠后能够选择性的在肿瘤内复制，从而抑制原位肿瘤的生长并延长荷瘤鼠的生存期15-17。这种病毒突变株能够携带编码热休克蛋白HSP70的扩增质粒。
应用于单纯疱疹病毒表达热休克蛋白增强免疫反应的热休克蛋白是来源于人的，包括人的HSP70和HSP96。可以替代的热休克蛋白也可以来源于病原微生物，包括结核分支杆菌(M.tuberculosis)，麻风分支杆菌(M.leprae)，克氏锥虫(Trypanoma cruzi)，恶性疟原虫(Plasmodium falcipaum)；以及其它物种如灵长类，鼠等哺乳动物。在本发明的一个具体实施例中，使用HSP70。HSP70的cDNA是从人的cDNA文库中通过PCR扩增得到并进行了DNA序列测定。用Klenow酶补平上述PCR产物的DNA片段两端，然后平末端插入连接于质粒pHSV中的SpeI位点，得到质粒pHSV-HSP。
在另一个具体的实施例中，采用的溶瘤病毒是腺病毒。所采用的腺病毒突变株能够选择性的在肿瘤细胞中复制而使细胞裂解死亡，其在正常细胞内的复制能力则非常弱10。这种腺病毒突变株在接种到荷瘤鼠后能够选择性的在肿瘤内复制，从而抑制原位肿瘤的生长并延长荷瘤鼠的生存期9-11。这种病毒突变株能够携带编码热休克蛋白HSP70的扩增质粒。应用于腺病毒表达热休克蛋白增强免疫反应的热休克蛋白是来源于人的，包括人的HSP70和HSP96。可以替代的热休克蛋白也可以来源于病原微生物，包括结核分支杆菌(M.tuberculosis)，麻风分支杆菌(M.leprae)，克氏锥虫(Trypanomacruzi)，恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)；以及其它物种如灵长类，鼠等哺乳动物。在本发明的具体实施例中，使用HSP70。HSP70的cDNA是从人的cDNA文库中通过PCR扩增得到。用XhoI，SalI和EcoRV限制性内切酶切割质粒pAdIR-BG，琼脂糖电泳分离酶切片段，回收5.3kb大片段，用Klenow酶补平片段两端，此为片段pAd-RSV。用Klenow酶补平PCR产物的DNA片段两端，与片段pAd-RSV正向平端连接，得到质粒pAd-RSV-HSP70。
在本发明中，编码热休克蛋白70的序列受溶瘤病毒HSV的启动子的转录调控。“启动子”是指能被细胞自体的或引入的转录复合物所识别的DNA序列，其对于一个基因地转录起始是必须的。对于启动子是如何组织的，人们通过分析多种不同病毒如CMV(巨细胞病毒)，HSV胸苷激酶(tk)和SV40的启动子来进行研究。近来的研究表明，启动子由不连续的功能调控元件组成，每个约7-20bpDNA，并且包括一个或更多的由转录活化或抑制蛋白的识别位点。其它类型的启动子例如增强子能够调控转录起始的频率。典型的启动子序列都是位于起始位点上游30-110bp处，尽管现在表明有包含在起始位点下游的调控元件的启动子。启动子各元件之间的距离通常是可改变的，所以当某些元件被插入或移去时仍能保持启动子的正常功能。在tk启动子中，在保持活性的前提下，启动子各元件之间的距离最多可以增加到50bp。根据各启动子类型不同，各元件可互相协同或独立的活化转录反应。
一个启动子可以是一个基因或一段序列自身的，即从编码区和/或外显子的上游5’端非编码序列得到。这样的启动子为“内源性”启动子。我们同样可以得到这个基因或这段序列上游或下游的增强子。可替代的，将并非基因或序列自身的启动子也即重组或异源启动子置于编码序列的上游进行转录调控会有特殊优势。重组或异源的启动子包括并非在自然环境中与基因或序列相关的增强子。这种启动子和增强子可包括其它基因的启动子和增强子，以及从原核生物，病毒或真核细胞中分离的启动子和增强子，或者并非“天然存在”的启动子和增强子，例如不同转录调控区的不同调控元件的组合，和/或引入能够影响功能的突变。而且在合成启动子或增强子序列时，还可以使用重组克隆和/或包括PCR在内的核酸扩增技术。而且，也可以使用其它细胞器如线粒体，叶绿体的能够调控转录和/或表达的序列。
在实施例中所采用的为巨细胞病毒(CMV)的前早期启动子序列。这个启动子属于组成型的强启动子能够启动其下游序列的高水平表达。同时，也可使用其它组成型的启动子猴病毒SV40前早期启动子，小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)启动子，人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复序列(LTR)启动子，鼠病毒启动子，鸟白血病病毒启动子，EB病毒前早期启动子，劳氏肉瘤病毒启动子，以及人类基因启动子，例如(但不限于)肌动蛋白启动子，肌球蛋白启动子，血红蛋白启动子，肌酸启动子。而且本发明并不仅限于用组成型启动子，也可以选用诱导型启动子。本发明中诱导型启动子的使用提供了在需要时能打开其相连的下游核酸序列表达的分子开关，并在不需要其表达时将其关闭。诱导型启动子包括但并不局限于金属硫蛋白启动子，糖皮质激素启动子，孕酮启动子，四环素启动子。而且，本发明还包括使用组织特异性启动子，其转录活化只能在特定组织内进行。组织特异性启动子包括但不限于现在已知的如HER-2启动子，PSA相关启动子序列。
对于热休克蛋白的表达，需要一个典型的多聚腺苷酸信号来完成转录的正确多聚腺苷酸加尾反应。多聚腺苷酸的性质对于成功的实施本发明并不是至关重要的，任何类型的中止序列都可以使用。优选的实施例包括SV40多聚腺苷酸信号，LTR多聚腺苷酸信号和/或牛生长激素多聚腺苷酸信号，对于不同的靶向细胞应以方便原则和/或已知能在其中正确行施功能的原则选择多聚腺苷酸信号。也可以选用转录中止位点来中止转录。这些元件应能够增强转录的翻译中止水平和/或避免通读到其它序列。重要的一点是，本发明中溶瘤病毒正确进行蛋白表达并不需要病毒整合到受体细胞的基因组中。病毒载体可以以游离体状态存在于靶细胞中。例如，在某些类型的细胞中病毒载体表达目标蛋白并不需要病毒的复制。这些细胞例如肌肉细胞通常是不能正常复制的，被导入非分裂细胞的表达载体在载体本身不复制的情况下能够表达目的蛋白。
本发明的一个应用是将表达人热休克蛋白的疱疹病毒或腺病毒直接加入到瘤内，从而引发机体针对肿瘤抗原的特异性免疫反应，杀死局部肿瘤和转移的肿瘤。给予表达热休克蛋白的疱疹病毒或腺病毒进行治疗可以单独使用，也可以和其它形式的免疫治疗剂联合使用，包括细胞因子和传统中药。在许多实际应用中，免疫调节剂如佐剂或称为免疫刺激剂被用来增强免疫反应。杀死局部肿瘤并诱发免疫反应包括将表达HSP的溶瘤病毒直接或间接的给予到机体的肿瘤内。大量研究表明，同时给予细胞因子或表达细胞因子的质粒能够增强抗肿瘤的免疫活性。一个本领域的技术人员很容易认识到可以将细胞因子的核酸序列和HSP的核酸序列放入同一载体来共同应用，这样就避免使用两个表达载体。本研究领域的技术人员从本发明中可以认识到溶瘤病毒可以应用于肿瘤的治疗。对于肿瘤治疗来说，一个技术人员能认识到溶瘤病毒必须携带热休克蛋白的基因并且基因与启动子是有效的连接的。另外，一个本领域的技术人员很容易认识到，为了提高热休克蛋白在肿瘤细胞中的表达量可以将多个拷贝的HSP基因引入同一载体中。
在另一个具体实施例中，采用能够特异性的在肿瘤细胞内复制的细菌作为表达热休克蛋白的载体，因为所用的沙门氏菌为aroA缺陷型19，其所需要的营养只能由肿瘤细胞提供，在正常细胞中不能够复制生长。所以该突变株能够选择性的在肿瘤细胞内复制并通过其增殖使肿瘤细胞裂解死亡。沙门氏菌表达的热休克蛋白能够结合肿瘤细胞裂解所释放的抗原并将其传送给抗原提呈细胞，从而激发了CTL介导的能够特异性杀死肿瘤细胞的免疫反应，从而抑制了肿瘤的生长，延长了荷瘤鼠的生存期。
在适当的情况下，重组病毒或细菌可根据其给予的途径不同被加工成固体，半固体，液体或气雾剂形式。可以利用已知的方法来阻止组合物在到达靶器官前被释放和吸收。本发明中可采用任何一个可以接受的药剂形式保证本发明组分的有效性。在制剂时，本发明中的微生物可以单独使用，也可和其它的药学上活性组分以适当的比例结合/配合使用。应保证在给药时有足够多量的含有表达能粘附肿瘤抗原的并被抗原提呈细胞所识别的蛋白如热休克蛋白的核酸序列的溶瘤微生物如溶瘤病毒或溶瘤细菌，从而其基因产物能提供药学上有效的剂量。表达热休克蛋白的溶瘤病毒或溶瘤细菌可以单独使用也可以和不同的佐剂共同配制。
通常，可将本发明的溶瘤微生物以免疫有效量通过本领域已知的各种常规的和可接受的方式单独或与其它治疗剂一起联合给药。免疫有效量将根据疾病的严重程度、个体的年龄和相对健康状况、所用微生物的效力以及其它因素有很大变化。通常，本领域普通技术人员可以根据个人知识以及本申请所公开的内容确定出用于治疗给定肿瘤时的本发明的微生物的免疫有效量。可以和本发明的微生物共同使用的佐剂包括(但不限于)弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、氢氧化铝、卡介苗(BCG)、脂多糖(LPS)、脂质A类似物、胞壁酰二肽(MDP)及其类似物、内毒素(LT)和霍乱毒素(CT)。
本发明的微生物可以以药物组合物的形式通过下列途径之一给药瘤内注射、口服、全身性给药(例如，经皮、鼻内或通过栓剂给药)或胃肠外给药(例如，肌肉内、静脉内或皮下)。组合物可以是片剂、丸剂、胶囊、半固体、散剂、缓释制剂、溶液剂、混悬剂、气雾剂的形式或是任何其它适宜的组合物，并且通常由本发明溶瘤微生物以及至少一种可药用赋形剂组成。可药用赋形剂是无毒的、对所述微生物的活性没有实质性损害的、有助于给药的并且不会对其他活性成分的免疫或治疗效果产生不利影响物质。所述赋形剂可以是任何固体、液体、半固体，或者在气雾剂组合物的情况下，可以是气体赋形剂。这些赋形剂是本领域技术人员易于得到的。
固体药物赋形剂包括淀粉、纤维素、滑石、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸镁、硬脂酸钠、甘油单硬脂酸酯、氯化钠、脱脂奶粉等。液体和半固体赋形剂可以选自水、乙醇、甘油、丙二醇和各种油，包括来源于石油、动物、植物或合成的油(例如，花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等)。优选的液体载体，特别是用于可注射溶液的液体载体包括水、盐水、葡萄糖水溶液和二甘醇。
组合物中本发明微生物的量可以根据制剂的种类、单位剂量的大小、赋形剂的种类以及药学领域技术人员已知的其它因素有很大变化。而且，实际的剂量和治疗方案会根据其它因素如该发明的组分是否和其它治疗组分结合，个体的药物动力学，药物分布和代谢等各不相同而有所变化。而且，加入细胞的病毒量也随着插入载体的治疗基因的长度、稳定性，和序列的性质而不同，是一个由经验决定的变量，很可能被非本发明中方法之外的其它因素所改变。一个本领域的技术人员可以根据具体情况的出现很容易的进行调整。
虽然以上说明书是以表达能粘附肿瘤抗原的并被抗原提呈细胞所识别的蛋白的重组溶瘤微生物来进行说明的。本领域的技术人员完全可以认识到，也可以将溶瘤微生物与粘附肿瘤抗原的并被抗原提呈细胞所识别的蛋白如热休克蛋白组合在一起使用，而不需对溶瘤微生物进行进一步的遗传改造。下面以实施例的方式具体描述本发明。以下的实施例是举例性的，因此不能将这些实施例看成是对本发明的限制。
实验实施例实施例1人热休克蛋白(HSP70)基因的扩增及克隆利用PCR方法从人肿瘤细胞系SKOV3细胞的cDNA中扩增HSP70基因。上游引物序列为GGT ATG GAA GAT CCC TCG AGA TC，下游引物序列为TACTA ATC TAC CTC CTC AAT GGT GGG.使用PE公司的PCR仪，反应条件是每个反应的引物终浓度是30pM，dNTP为100mM，模板DNA为100ng，Taq DNA聚合酶为2.5个单位。其他反应条件依照GeneAmp DNA扩增试剂盒中的使用说明进行，每个反应总体积为100微升。每份反应混合物上覆盖以75微升矿物油。扩增共进行30个循环，每一循环包括变性步骤92℃1分钟，退火步骤50℃1分钟，延长步骤72℃2分钟。反应结束后，使用Qiagen公司的PCR产物纯化试剂盒纯化所得产物。
溶瘤病毒-单纯疱疹病毒的构建我们采用的是具备复制能力的、突变型I型单纯疱疹病毒(HSV-1)15-18。其中γ34.5基因被缺失。HSV突变株在分裂型细胞中的复制会导致细胞死亡；其在非分裂型细胞中的生长能力显著减弱16。这种单纯疱疹病毒突变株在接种到荷瘤鼠后能够选择性的在肿瘤内复制，从而抑制原位肿瘤的生长并延长荷瘤鼠的生存期16。HSV被用来在肿瘤内投递热休克蛋白。HSV病毒包含编码HSP70的质粒和HSV辅助病毒17。因为病毒基因组DNA(～153KB)被包装的，每个病毒颗粒包含15个HSP70基因的拷贝，并且能够高效的转染分裂和非分裂的细胞。病毒DNA并不整合到被感染的细胞的基因组中，有CMV启动子调控HSP70蛋白的表达，属于瞬时高表达。鼠HSP70的cDNA是从人的cDNA文库中通过PCR扩增得到并进行了DNA序列测定。用Klenow酶补平上述PCR产物的DNA片段两端，然后平末端插入连接于质粒pHSV中的SpeI位点。使用这个质粒DNA和单纯疱疹病毒辅助病毒DNA共转染疱疹病毒宿主细胞，在HSV辅助病毒存在的条件下，通过同源重组，HSP70基因插入到单纯疱疹病毒的基因组中，并被包装于单纯疱疹病毒的外壳中，这样就产生了带有HSP70基因的重组单纯疱疹病毒(如图1所示)。γ34.5基因被缺失的HSV-1突变株，作为辅助病毒来生产重组病毒HSV-HSP。对HSV-HSP进行了序列测定，其序列列于序列表中。
单纯疱疹病毒的滴度测定用脂质体lipofectAMINE(Life Technologies产品)将纯化的扩增质粒DNA(pHSP70)和HSV病毒共转染Vero细胞，然后在34.5℃温育培养，直到细胞表现出完全的细胞病变效应。从Vero细胞中收获重组病毒并按1∶5比例稀释培养，直到观察到辅助病毒的复制被抑制。含有pHSP70质粒的HSV被命名为HSV-HSP。经过冻融和超声以及低速离心(2000×g，4℃10分钟)去除细胞碎片，测定重组病毒的滴度。病毒滴度以病毒在34.5℃培养的Vero细胞中形成的溶斑形成单位(PFUs)来表示。对于HSV-HSP来说，其滴度决定着HSP70的表达量，以及最高的培养水平。HSV-HSP的病毒滴度为5×107PFU/ml。同样，测定HSV-1的滴度，其制值为6×107PFU/ml。
HSV-HSP的体外溶瘤活性HSV-1能够在很多类型的肿瘤细胞中都能够复制。人们发现鼠的结肠癌细胞系CT26易受HSV感染的影响。这种细胞系免疫原性很弱并且不能激发可检测到的肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。CT26型肿瘤经细胞因子治疗后仍然容易复发。现已证明CT26的MHC-I限制性优势免疫抗原是一个九肽，来源于内生性亲嗜性鼠白血病前病毒的膜蛋白(gp70)。研究已证实了诱导产生的肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)对皮下接种的CT26肿瘤的抗瘤效果。其中将鼠肿瘤细胞CT26培养于24孔板(每孔1×105)并由HSV-HSP或HSV以不同的感染复数(0.01-10)感染。在感染复数(MOI)0.1时，用HSV-HSP或HSV对CT26细胞感染，感染4天后导致70％的肿瘤细胞的死亡。在感染复数(MOI)为1时，用HSV-HSP或HSV对CT26细胞感染，感染4天后导致99％的肿瘤细胞的死亡(如图2所示)。感染的肿瘤细胞经培养后，用放射性标记及免疫沉淀/SDS-PAGE可以检测到HSP70的表达。这些数据表明插入的HSP70并没有降低HSV的复制能力和细胞毒性。
HSV-HSP抑制远端肿瘤的生长同系的BALB/c小鼠上进一步评价HSV-HSP对CT26肿瘤的治疗效果。BALB/c来自于Charles River(Wilmington，MA，USA)。所有动物实验都经动物关心和使用委员会(Animal Care and Use Committee)批准。将动物分成3组，第一和第二组作为实验组，第三组作为对照组。将小鼠用CT26肿瘤细胞(1×105)在小鼠肋部对称部位分别进行皮下注射。将这些小鼠作为患有转移性肿瘤的动物的模型。当皮下注射的肿瘤迅速生长(最大直径达到5毫米)时，将第一组每只动物非对称(右面)的瘤内接种HSV-HSP(1×106PFU)，并于第一次接种7天后进行第二次接种。将第二组每只动物非对称(右面)的瘤内接种HSV-1(1×106PFU，并于第一次接种7天后进行第二次接种。HSV-1作为接种HSV-HSP的对照以评价病毒因素的影响。将第三组小鼠每只动物非对称(右面)的瘤内接种热休克蛋白HSP70，并于第一次接种7天后进行第二次接种，来评价热休克蛋白本身的作用。肿瘤体积用卡尺测量，体积的计算公式(V＝h×w×d)。如果小鼠垂死或其肿瘤直径超过18毫米，将被处死，并记录下日期来研究其存活率。用非配对法t检验进行方差统计，软件为StaView4.5(Abacus Concepts，Berkeley，CA)。用HSV-HSP接种能引起非常显著的抗肿瘤效果，无论是被注射一侧的肿瘤，还是同只动物身体上未经注射的对称端的肿瘤的生长都明显受到抑制(如图3所示)。经注射HSV-HSP的小鼠身上的肿瘤无论在注射侧还是在非注射侧都已经消退得无法检测到。而注射HSV-1只能引起经过注射的肿瘤生长的抑制，对于未被注射的对侧肿瘤仅有一定的影响(如图3所示)。仅注射HSP70的对照组显示出在对注射侧和非注射侧的肿瘤都没有影响。这些结果表明重组的HSV通过表达HSP70能够激发强的免疫应答从而抑制了远端肿瘤的生长。
实施例2带有HSP70基因的重组腺病毒9-14的构建用XhoI，SalI，和EcoRV限制性内切酶切割质粒pAdIR-BG，琼脂糖电泳分离酶切片段，回收5.3kb大片段，用Klenow酶补平片段两端，此为片段pAd-RSV。采用实施例1中所述的用Klenow酶补平的PCR产物的DNA片段两端，与片段pAd-RSV正向平端连接。得到质粒pAd-RSV-HSP70。用10微克质粒pAd-RSV-HSP70和14微克质粒pBHG10共转染单层培养于直径10厘米培养皿中的293细胞，并覆盖琼脂糖培养基，静置培养于37℃，5％二氧化碳培养箱中。9天后出现噬斑，挑取单个噬斑，感染293细胞扩增重组腺病毒，HindIII内切酶分析重组腺病毒DNA，得到正确的重组腺病毒Ad-HSP70。
体外溶瘤活性和肿瘤抑制能力采用与实施例1相似的步骤，进行体外溶瘤试验和在动物模型上的抑瘤试验，取得了相似的试验结果。重组腺病毒通过表达HSP70能够激发潜在的免疫应答从而抑制了远端肿瘤的生长。
实施例3表达热休克蛋白的沙门氏菌的构建我们采用鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)SL3261，其中芳香族氨基酸aroA突变，其所需要的营养物质只有肿瘤细胞才能够提供，所以突变株能够选择性的侵袭肿瘤细胞，在肿瘤细胞中复制并导致肿瘤细胞裂解死亡；而在正常细胞中SL3261则不能够生存。通过将HSP70序列插入到pcDNA3.1质粒中构建得到重组质粒pcDNA-HSP质粒，如图4所示。由CMV启动子调控HSP70蛋白的表达，属于瞬时高表达。
抑瘤活性在同系的BALB/c小鼠上评价表达热休克蛋白的鼠伤寒沙门氏菌SL3261对肿瘤的治疗效果。将动物分成3组，第一和第二组作为实验组，第三组作为对照组。用SMMC7721肿瘤细胞(1×105)在小鼠肩部对称部位分别进行皮下注射。将这些小鼠作为患有转移性肿瘤的动物的模型。当皮下注射的肿瘤迅速生长(最大直径达到5毫米)时，将第一组每只动物非对称(右面)的瘤内接种携带表达质粒pcDNA-HSP的SL3261(1×107PFU)，并于第一次接种7天后进行第二次接种。将第二组每只动物非对称(右面)的瘤内接种SL3261(1×106PFU)，并于第一次接种7天后进行第二次接种，作为对照以评价细菌本身因素的影响。将第三组小鼠每只动物非对称(右面)的瘤内接种热休克蛋白HSP70，并于第一次接种7天后进行第二次接种，来评价热休克蛋白本身的作用。肿瘤体积用卡尺测量，体积的计算公式(V＝h×w×d)。如果小鼠垂死或其肿瘤直径超过18毫米，将被处死，并记录下日期来研究其存活率。用非配对法t检验进行方差统计，软件为StaView4.5(Abacus Concepts，Berkeley，CA)。用表达热休克蛋白的鼠伤寒沙门氏菌SL3261接种能引起非常显著的抗肿瘤效果，无论是被注射的一侧肿瘤，还是同只动物身体上未经注射的对称端的肿瘤的生长都明显收到抑制(如图5所示)。而注射鼠伤寒沙门氏菌SL3261只能引起经过注射的肿瘤生长的抑制，对于未被注射的对侧肿瘤的影响甚微(如图5所示)。这些结果表明伤寒沙门氏菌SL3261也能够通过表达HSP70能够激发潜在的免疫应答从而抑制了远端肿瘤的生长。
本专利申请将下列文献以其全文引入作为参考。
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1.一种溶瘤微生物，其中该微生物表达能粘附肿瘤细胞抗原的并被抗原提呈细胞所识别的蛋白，并且该微生物能选择性地在肿瘤细胞中生长以裂解肿瘤细胞。
2.如权利要求1所述的微生物，其中所述的能粘附肿瘤细胞抗原的蛋白是热休克蛋白。
3.如权利要求2所述的溶瘤微生物，其中所述的热休克蛋白来源于哺乳动物或病原微生物。
4.如权利要求3所述的微生物，其中所述的哺乳动物是人。
5.如权利要求4所述的溶瘤微生物，其中所述的热休克蛋白为来源于人的热休克蛋白Hsp70、Hsp96、Hsp90或其他的热休克蛋白。
6.如权利要求2所述的溶瘤微生物，其中所述的热休克蛋白来源于病原微生物，所述的病原微生物包括结核分支杆菌、麻风分支杆菌、克氏椎虫和恶性疟原虫。
7.如权利要求1所述的溶瘤微生物，其中所述的微生物是病毒。
8.如权利要求7所述的溶瘤微生物，其中所述的病毒包括腺病毒、单纯疱疹病毒、水泡性口炎病毒、新城疫病毒、脊髓灰质炎病毒、EB病毒以及其他能选择性地在肿瘤细胞中生长的病毒。
9.如权利要求8所述的溶瘤微生物，其中所述的病毒为腺病毒。
10.如权利要求9所述的溶瘤微生物，其中所述的热休克蛋白为来源于人的热休克蛋白Hsp70、Hsp96、Hsp90或其他的热休克蛋白。
11.如权利要求8所述的溶瘤微生物，其中所述的病毒为单纯疱疹病毒。
12.如权利要求11所述的溶瘤微生物，其中所述的热休克蛋白为来源于人的热休克蛋白Hsp70、Hsp96、Hsp90或其他的热休克蛋白。
13.如权利要求1所述的溶瘤微生物，其中所述的微生物是细菌。
14.如权利要求13所述的溶瘤微生物，其中所述的细菌包括伤寒沙门氏菌、双歧杆菌、志贺氏菌、李斯特菌和鼠疫杆菌以及其他能选择性地在肿瘤细胞中生长的细菌。
15.如权利要求1-14中任一项所述的溶瘤微生物，其中所述的微生物进一步含有编码免疫增强分子的DNA序列。
16.一种治疗肿瘤的药物，其含有权利要求1-14中任一项所述的微生物。
17.权利要求16所述的药物，其中所述的微生物进一步含有编码免疫增强分子的DNA序列。
18.权利要求16或17所述的药物，其进一步含有可药用载体。
19.一种药物组合物，其含有a.能选择性地在肿瘤细胞中生长的微生物；和b.能粘附肿瘤细胞抗原的并被抗原提呈细胞所识别的蛋白。
20.权利要求19所述的药物组合物，其中所述的微生物是腺病毒、单纯疱疹病毒、水泡性口炎病毒、新城疫病毒或其他能选择性地在肿瘤细胞中生长的病毒。
21.权利要求19所述的药物组合物，其中所述的微生物是伤寒沙门氏菌、双歧杆菌、志贺氏菌、李斯特菌、鼠疫杆菌或其他能选择性地在肿瘤细胞中生长的细菌。
22.权利要求19-21中任一项所述的药物组合物，其中所述的能粘附肿瘤细胞抗原的并被抗原提呈细胞所识别的蛋白是来源于哺乳动物或病原微生物的热休克蛋白。
23.如权利要求22所述的药物组合物，其中所述的哺乳动物是人。
24.如权利要求23所述的药物组合物，其中所述的热休克蛋白为来源于人的热休克蛋白Hsp70、Hsp96、Hsp90或其他的热休克蛋白。
25.如权利要求22所述的药物组合物，其中所述的热休克蛋白来源于病原微生物，所述的病原微生物包括结核分支杆菌、麻风分支杆菌、克氏椎虫和恶性疟原虫。
26.一种治疗肿瘤的方法，包括给肿瘤患者施用一种免疫有效量的权利要求16-18中任一项所述的药物。
27.一种治疗肿瘤的方法，包括给肿瘤患者施用一种免疫有效量的权利要求19-25中任一项所述的药物组合物。
28.权利要求26或27所述的治疗肿瘤的方法，其中所述的肿瘤包括良性肿瘤和恶性肿瘤。
29.权利要求28所述的治疗肿瘤的方法，其中所述的恶性肿瘤包括黑素瘤、乳腺癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、鼻咽癌、结肠癌、卵巢癌、宫颈癌和白血病。
30.权利要求26或27所述的治疗肿瘤的方法，其中所述的施用是通过肿瘤内注射、肌肉内注射、口服、粘膜内给药、腹膜内给药、静脉内给药、直肠内给药方式完成的。
全文摘要
本发明提供了表达热休克蛋白的溶瘤微生物、含有该微生物的药物或药物组合物，以及使用该微生物杀死局部的及转移的肿瘤的方法。所述的溶瘤微生物包括能选择性地在肿瘤细胞中生长从而将肿瘤细胞溶解的病毒和细菌。给肿瘤患者施用本发明的微生物后，所述微生物在溶解肿瘤细胞的同时还表达热休克蛋白。所表达的热休克蛋白与肿瘤细胞溶解所释放的肿瘤抗原粘附，并与抗原提呈细胞结合，诱发肿瘤细胞特异性的免疫反应，从而杀死转移的肿瘤。
文档编号A61K35/76GK1412295SQ0114169
公开日2003年4月23日 申请日期2001年10月9日 优先权日2001年10月9日
发明者陈思毅, 胡放 申请人:杭州康科生物技术有限公司