专利名称：抗肝素肽的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子式为Z-Bm-(AXA)x-Bn-(AXA)y-Bo-(AXA)z-Bp的具有抗肝素活性的化合物，涉及含有它的诊断试剂，以及涉及所述的化合物在体外诊断试验中或用于产生一种抗肝素用药品中的用途。
未分馏的肝素(UFH)是粘多糖家族的一个天然硫酸化多糖。它主要是从猪或牛的肠粘膜中提取的。
该产品因其糖单位的组成而是不均匀的产物；其结果，分子的离子电荷也是不均匀的葡糖胺硫酸盐单位的硫酸化程度不同，和在艾杜糖醛酸和葡糖醛酸单位中羧基功能团数目不同[1，2]。
肝素的基本物理学特征是其多阴离子性和其高电荷密度。特别地，每个双糖携带3至4个负电荷(磷酸盐和羧酸盐)。
肝素不同单位的特殊排列通过序列的全长中可重复形成五糖。此五糖已知是肝素的抗凝血酶III识别位点，在这两部分之间形成了高亲合力并因此产生高抗凝活性[3]。不含五糖的分子链实际上缺乏抗凝活性(仅1/3的肝素分子对ATIII具有此亲合力)[4]。
未分馏的肝素(UFH)是一个多分散的大分子商业上的以UFH为基础的制剂的分子量在12000和18000Da之间。这些制剂主要用于血栓形成的预防和治疗作用。
有可能按分子大小分馏UFH(化学处理后)，它产生了LMWHs家族(低分子肝素)[5]。UHF对IIa和Xa因子具有相等的活性。另外一方面，LMWHs保留了高的抗Xa活性而抗IIa活性随LMWH分子的大小而下降。由于高的抗IIa活性可能有出血的副作用，因此LMWHs可以有利地代替UFHs用作抗凝剂。
然而，在治疗中使用UFH或LMWH肝素可能需要给予能中和其对循环系统抗凝作用的化合物，特别是在干预的末期，比如体外循环。此外，在某些体外诊断试验中，样本中肝素的存在可能引起对结果的错误解释。因此证明，有必要获得用于诊断的具有抗肝素特性的化合物。
硫酸鱼精蛋白是唯一已知能够在体内中和肝素抗凝作用的化合物。鱼精蛋白属于富含精氨酸残基的碱性蛋白家族，从鲑鱼精液中纯化[6-7]并因其正电荷中和肝素[8-10]。
但是，鱼精蛋白引起血液动力学和血液学副作用如低血压、心动过缓、血小板减少和白细胞减少[11-15]。尤其是，已经证明鱼精蛋白上的正电荷与肝素的中和作用和效力直接成比例，但也与分子的毒性成比例[16]。
多聚(L)赖氨酸和聚凝胺是已知中和肝素的其它化合物。但这些多聚阳离子对于临床应用也显示毒性太大。
Wakefield等人(WO 95/13083)描述了被认为毒性较小的鱼精蛋白变异体。它们是具有20至40个氨基酸序列并带有+14和+18之间正电荷的肽，其结构相当于点缀着中性氨基酸的正性残基簇。Harris等人(EP 999219)描述了含有一连串精氨酸和丙氨酸簇的线性或支化的抗肝素肽。
但是，上面提到的资料不包括任何有关在诊断中需要有抗肝素药物的讲授。
本发明的主题是一个新合成的被用作肝素中和试剂的分子。
本发明分子的特性已经在体外诊断试剂中被特别地研究。除了它们能够对受检血液样本中可能存在的肝素的作用不敏感以外，这些诊断试剂中的某些还可能必须具有低的浊度。该特性对于测定Quick时间的含凝血活素的试剂是特别重要的，特别是在用光学检测的自动化设备上。
具有下面说明的通式I的分子有可能满足这两个标准。由此证明它们在中和在诊断和治疗目的中由于存在肝素可能伴随的干扰中是特别有用的。
因此，本发明涉及具有抗肝素活性的化合物，其通式I如下Z-Bm-(AXA)x-Bn-(AXA)y-Bo-(AXA)z-Bp其中*Z的通式是
其中Cy＝-共价键-CH2--CO--CO-S--(CH2)n-X-其中1≤n≤2，X＝O-，S-， 其中Cx＝-共价键-(CH2)n-，1≤n≤5或 其中R1＝-OH，-NH2*B代表一个碱性氨基酸并可以有利地选自赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、组氨酸、高赖氨酸和高精氨酸；m，n，o和p彼此独立地代表2和4之间的一个整数。
在本发明优选的化合物中，m、n和o等于4且p等于2的化合物是更特别被注意的。
*AXA代表一个相当于下面分子式的烃基链-NH-(CH2)n-CO-，n是2和6之间的一个整数；x，y和z彼此独立地代表1和6之间的一个整数。
z有利地选自下列化合物 优选地，Z是焦谷氨酸(PGlu)。
在本发明优选的化合物中，AHA相当于NH-(CH2)5-CO-的化合物，即x等于2、y和z等于1的氨基己酸是更特别被注意的。有利地，本发明涉及相当于下面分子式的化合物PGlu-K4-(AHA)2-K4-AHA-K4-AHA-K2。
上面描述的化合物具有抗肝素能力，这是由肝素化血浆与非肝素化血浆相比，Δ相对凝血时间小于10％而确定的，优选小于5％。
因此，本发明的主题还是在体外诊断试剂中应用相当于上面说明的分子式1的化合物，特别是计算血液样本凝血时间的试剂，或检测或分析凝血级联各种成分的试剂，而与该样本中是否存在肝素无关。
所述的试剂，特别是PT(凝血酶原时间)型试剂，有利地具有以630nm处OD值测定的浊度低于0.5，优选低于0.1。
根据另一个方面，本发明涉及体外诊断试剂，包括上面通式I限定的化合物，优选地是其中AXA相当于NH-(CH2)5-CO-的化合物，即x等于2、y和z等于1的己胺酸，更优选是下面分子式的化合物PGlu-K4-(AHA)2-K4-AHA-K4-AHA-K2。
这样一种诊断试剂因此可能在血液样本中进行检测或分析，而与该样本中是否存在肝素无关。
按照本发明的试剂有利地相当于传统的凝血试验，即测定血液样本凝血时间试验，或检测或分析凝血级联各种成分的试验，例如分析VIIa因子、血纤维蛋白原、和蛋白C和S、PT试验。这些试验是本领域技术人员常用的。
根据本发明，一个优选的体外诊断试剂是包括凝血活素的试剂，以进行PT(凝血酶原时间或Quick时间)试验。
按照本发明上面限定的化合物在这种试剂中的终浓度有利地在2和10μg/ml间。优选地，此浓度是5μg/ml。
本发明还涉及使用上面限定的通式I的化合物作为一个抗肝素剂，以制备一种药物。
实施例1:合成本发明优选的化合物的方法
图1的一览表总结了合成的各种步骤。
采用适合的自动化装置(Applied Biosystems 433A)，通过固体支持化学合成结构链。
为补足合成产量，通过双偶联加入疏水的间隔臂(AXA)。所用的树脂是MBHA(甲基苄基氢胺)树脂，以在从树脂分解后回收一个中性酰胺C末端结构。这里所用的化学是Fmoc化学，应用哌啶在每个步骤去保护。侧链用Boc基团保护。合成器的合成规模是0.1nmole，产生大约100mg粗产物。通过用TFA(55％三氟乙酸)处理，此产物从树脂上被分解并在侧链上去保护。在分解溶液的体积浓缩2/3后，此产物从乙醚中沉淀。粗产物随后被冻干，然后通过反相HPLC，采用5μm Kromasil C18柱(20mm×250mm)，以水/乙腈0.1％TFA的梯度(从0至60％乙腈，以15ml/分钟进行30分钟)纯化。在214nm处进行检测并手工收集馏分。回收的纯化产物的量是50mg。
在用6N HCl 120℃水解24h后，通过序列分析确证终产物的结构；然后在用PITC(苯硫异氰酸盐)衍生后，通过反相HPLC(Kromasil C18柱，5μm，250mm×4.6mm)分析水解物。
实施例2在PT试验中检测本发明抗肝素剂目的是分析合并进Diagnostica Stago凝血活素试剂中的抗肝素剂的性能(抗肝素能力和浊度)。
抗肝素能力的分析是抗肝素剂的能力使试剂对血液样本中含有的肝素不敏感检测样本由可能过载或不过载肝素(用1 IU/ml UFH(Calciparine25000 IU/ml，Sanofi)肝素化的血浆)的正常血浆池制备。
注释用作阴性对照的试剂，即没有抗肝素剂者，对于验证血浆的肝素化是有用的。
为测定Quick时间，自动化装置(STA Diagnostica Stago-欧洲专利0325874)移出50μl血浆样本，令其在一个含有珠子的杯形器中37℃孵育240秒；然后将杯形器转移进检测区内并在样本中添加100μl凝血活素试剂。
凝血时间用下面的方法测定在固定的粘度下，杯形器中珠子的振动幅度(用一个电磁场保持振动)是固定的。当粘度升高时(凝固表现)，珠子的振动幅度下降。
用此幅度变化计算来决定凝血时间。
抗肝素能力用下面的方法计算测定肝素化和非肝素化血浆间的Δ相对时间，即[{CT(肝素化血浆)-CT(非肝素化血浆)}/CT(非肝素化血浆)×100]其中CT＝凝血时间当此Δ时间小于10％时，根据本发明的化合物的抗肝素能力被评估为是显著的。浊度分析对于在诊断中，特别是在凝血活素试验(PT)中的应用，浊度应当尽可能低。
此浊度通过在分光光度计(Uvikon 940，Kontron)上检测630nm处的OD值而测定。
注释用作阴性对照的试剂，即没有抗肝素剂者，对于检测此抗肝素剂对试剂浊度的影响是有用的。
实施例3引进疑血活素型试剂中的、根据本发明的各种抗肝素剂的性能(抗肝素能力和浊度)分析(与没有抗肝素剂的对照(C)比较的结果)5μg/ml抗肝素剂抗UFH能力浊度Δ时间0/1 IU/ml OD 630(％) nmC 99.20.0471415-5 PGlu-K4-(AHA)2-K4-AHA-K4-AHA-K24.5 0.0691415-4 THC-K4-(AHA)2-K4-AHA-K4-AHA-K25.9 0.1481415-3 Hyp-K4-(AHA)2-K4-AHA-K4-AHA-K23.4 0.1341415-2 Thi-K4-(AHA)2-K4-AHA-K4-AHA-K25.7 0.1041394 Pro-K4-AHA-K4-APA-K3-APA-K26.4 0.3991401 Pro-K4-AHA-K4-APA-K4-APA-K28.1 0.4881403P Pro-K2-AHA-K4-APA-K4-APA-K27.1 0.2051403PK Pro-K3-AHA-K4-APA-K4-APA-K28.7 0.2831404 Pro-K4-AHA-K3-APA-K3-APA-K27.6 0.1471405 Pro-K4-(AHA)2-K4-AHA-K4-AHA-K24.2 0.3231408-2 Pro-K4-AHA-K3-APA-K4-APA-K26.9 0.0401411 Pro-K4-(AHA)2-K4-APA-K3-APA-K26.5 0.086其中APA相当于分子式为-(CH2)2-CO-的氨基丙酸参考文献1.Casu，B.(1985)Adv.Carbohydr.Chem.4351-1342.Constanta，等人.(1993)Angewandte Chemie，Vol.32，No.12，1671-18183.Lormeau，H.，等人.(1995)Thromb.Haemostasis 741474-14774.Mayo，K.M.，等人.(1995)Biochem.J.312357-3655.Mardiguian，J.(1992)主编.Doutremepuich ch.Marcel Dekker inc.7-126.McKay，D.J.，等人.(1986)Eur.，J.Biochem.158361-2667.Kurt，F.(1973)Protamines，Institut für Vegetative Physiologie，Frankfurt，Germany8.Jacques，L.B.(1973)Can.Med.Assoc.J.1081291-12979.Cundall，R.B.，等人.(1979)J.Chem.Soc.Perkins Trans.II87910.Racanelli，A.，等人.(1985)Semin.Thromb.Hemostasis 11176-18911.Horrow，J.C.(1985)Anesth.Analg.64348-36112.Cook，J.J.，等人.(1992)Circulation 851102-110913.Weller J.M.，等人.(1985)J.Allergy.Clin.Immunol.75297-30314.Wakefield T.W，等人.(1990)Ann.Surg.212387-39515.Telen A.N.，等人.(1977)Thromb.Res.10，399-410Delucia，A.，等人.(1993)J.Vasc.Surg.1049-58
权利要求
1.一种具有抗肝素活性的化合物，其通式I为Z-Bm-(AXA)x-Bn-(AXA)y-Bo-(AXA)z-Bp其中*Z的通式是 其中Cy＝-共价键-CH2--CO--CO-S--(CH2)n-X-其中1≤n≤2，并且X＝O-，S-， 其中Cx＝-共价键-(CH2)n-，1≤n≤5或 其中R1＝-OH，-NH2*B代表一个碱性氨基酸；m，n，o和p彼此独立地代表2和4之间的整数。*AXA代表一个相当于下面分子式的烃基链-NH-(CH2)n-CO-，n是2和6之间的整数；x，y和z彼此独立地代表1和6之间的整数。
2.根据权利要求1所述的化合物，特征性在于Z选自下列化合物-4-氨基吡咯烷-2-羧酸-氮杂环丁烷-2-羧酸-2-羧基吗啉酸-1，3-二氢-2H-异吲哚羧酸-4-羟基吡咯烷-2-羧酸-吲哚基-2-羧酸-异哌啶甲酸-焦谷氨酸-甲基哌啶-2-羧酸-吡咯烷-2-羧酸-2-氧噻唑烷-4-羧酸-噻唑烷羧酸-四氢异喹啉-2-羧酸
3.根据权利要求1和2任一项所述的化合物，其特征在于Z是焦谷氨酸(PGlu)，其分子式是
4.根据权利要求1至3任一项所述的化合物，其特征在于B选自赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、组氨酸、高赖氨酸和高精氨酸。
5.根据权利要求1至4任一项所述的化合物，其特征在于B是赖氨酸。
6.根据权利要求1至5任一项所述的化合物，其特征在于m、n和o等于4，p等于2。
7.根据权利要求1至6任一项所述的化合物，其特征在于AXA相当于分子式NH-(CH2)5-CO-(氨基己酸)。
8.根据权利要求1至7任一项所述的化合物，其特征在于x等于2，y和z等于1。
9.根据权利要求1至8任一项所述的化合物，其特征在于所述的化合物相当于分子式PGlu-K4-(AHA)2-K4-AHA-K4-AHA-K2。
10.根据权利要求1至9任一项所述的化合物，其特征在于它具有抗肝素能力，其是在凝固试验中，由肝素化血浆与非肝素化血浆之间Δ相对凝血时间小于10％而测定的，优选小于5％。
11.一种体外诊断试剂，含有根据权利要求1至10任一项所述的化合物。
12.根据权利要求11所述的试剂，用于计算血液样本的凝血时间，而与该样本中是否存在肝素无关。
13.根据权利要求11所述的试剂，用于检测或分析凝血级联的各种成分，而与该样本中是否存在肝素无关。
14.根据权利要求11所述的试剂，其特征在于所述的试剂是PT试剂。
15.根据权利要求11所述的试剂，其特征在于它含有下面分子式的化合物PGlu-K4-(AHA)2-K4-AHA-K4-AHA-K2。
16.根据权利要求11所述的试剂，其特征在于在630nm处OD值测定的浊度低于0.5，优选低于0.1。
17.根据权利要求11所述的试剂，包括终浓度在2和10μg/ml之间的通式I的化合物。
18.根据权利要求11所述的试剂，其特征在于在所述的试剂中化合物的终浓度是5μg/ml。
19.在体外诊断试剂中根据权利要求1至10任一项所述的化合物用于计算血液样本的凝血时间，或检测或分析血液样本中凝血级联的各种成分中的用途，该计算或测试或分析与该样本中是否存在肝素无关。
20.根据权利要求1至10任一项所述的化合物作为抗肝素剂在制备药物中的用途。
全文摘要
本发明涉及分子式为Z－B
文档编号A61P7/02GK1447818SQ01814258
公开日2003年10月8日 申请日期2001年8月14日 优先权日2000年8月17日
发明者G·康坦, F·洛尔 申请人:斯塔戈诊断公司