专利名称：胸腺功能的诊断指示指标的制作方法
技术领域：
本发明涉及免疫学领域。特别是，涉及到诊断通过抑制性类固醇对胸腺的作用而使胸腺重新激活的能力。
与本发明相关的背景技术可论证胸腺是免疫系统中的重要器官，因为它是产生T淋巴细胞的主要部位。它的功能是吸引适当来自血液中的骨髓来源的前体细胞，并诱导它们对T细胞谱系的支持(commitment)，包括产生针对抗原的T细胞受体(TCR)所必须的基因重排。与之相关的是显著的细胞分裂来增加T细胞的数量，并由此提高识别和清除所有外来抗原的能力。这种巨大的潜在多样性意味着对可能遇到的任何单一抗原，机体多个淋巴细胞能够以不同结合强度(亲和力)来识别它并发生不同程度的应答。
T细胞识别抗原的一个奇怪特点是，与B细胞不同，TCR仅识别与MHC分子物理结合的肽片段。通常这是自身MHC(即非外源MHC)并且在胸腺中选择出此能力。此过程称为正性选择，并且是皮质上皮细胞的专有特征。如果TCR不能和自身MHC/肽复合物结合，T细胞就会因为“忽略”而死亡。它需要某种程度的通过TCR的信号才能继续成熟。
经过了皮质中的选择作用，发育的胸腺细胞获得了功能上的成熟和迁移的能力，并外迁到血流中成为纯真T细胞(尚未接触抗原)。它们在淋巴和血中循环，搜寻抗原。如果3-4周后它们仍未被激活，则很易于从外周T细胞库中被其他新迁入外周循环的胸腺细胞(recent thymic emigrants)消除。这种由胸腺输出和外周T细胞替换的系统提供了持续的高质量的T细胞更新，使得这种内环境稳定保持在适当的水平。
虽然胸腺对保持有功能性的免疫系统很关键，每天释放约1％的T细胞容量到血液中，哺乳动物中一个明显违背常理的现象是由于性类固醇的产生该器官会发生严重的萎缩。这种情况甚至在年幼的儿童就发生了，但在青春期后更为显著。对于正常健康个体，这种产生和释放新的T细胞的减少并不是总有临床后果。实际上虽然成体的胸腺萎缩了，并仅是其幼年相对应的不到1％，它依然不断地释放很低水平的新的T细胞到血流中。
然而，这不足以维持外周T细胞亚群至最佳水平。但是这并不意味着胸腺完全休眠了，因此将它作为治疗的目标成为可能。随着衰老的进程，胸腺输出的减少意味着外周T细胞的状况在数量上和质量上都发生渐进性改变。一方面随着年龄增加，由于缺少激活，血液中T细胞的绝对数量逐渐减少。另一方面每一次与抗原接触，相应的抗原特异的纯真T细胞(尚未接触过抗原)激活并增殖。某一亚群会变为效应细胞并消除机体的病原体，但是它们最终通过抗原诱导的细胞死亡而死亡。另一亚群会转变为记忆细胞，并提供长期保护以对抗将来与该病原的接触。因此，纯真T细胞的水平下降，导致对抗原反应能力的降低。
年龄增加还导致Th细胞(以表达CD4为特征)对Tc细胞(表达CD8)的比例的选择性下降和Th1与Th2细胞间比例的失衡。这些现象不会在正常的年轻人中发生，因为如上所述，胸腺持续地输出新T细胞，从而持续地更新外周纯真T细胞库。
不仅年龄增加会导致T细胞丢失-类似情况还严重发生于HIV/AIDS等病例中和化疗或放疗后。此外，在具有活跃胸腺的年轻人中，免疫系统的恢复(通过恢复T细胞介导的免疫)发生得相对迅速(2-3月)，而青春期后，由于胸腺的萎缩，可能需要1-2年。
如下参数可以影响免疫反应的性质和范围抗原的水平和类型、接种疫苗的位置、适当的APC(抗原呈递细胞)的存在、个体的总体健康状况、以及T和B细胞库的状况。其中，T细胞最脆弱，因为青春期开始时明显的由性类固醇导致的胸腺输出的显著关闭。
任何接种疫苗程序都应依照下列逻辑实施，潜在的反应T细胞处于最佳水平，即不仅代表广泛的特异性库的纯真T细胞的水平而且Th1与Th2细胞和Th与Tc细胞处于正确的比例，都处于最佳水平。细胞因子的水平和种类也被调控至适于所需反应的程度。
通过抑制垂体的LHRH信号来重新激活萎缩的胸腺的能力提供了有效的方法，来产生具有不同的TCR库的新的纯真T细胞群。这个过程有效地逆转胸腺至其青春期前的状况，并通过正常调节分子和导致最佳胸腺生长的信号途径达到这一状况。
在很大程度上，胸腺可受其与神经内分泌系统的双向交流的影响(Kendall，1998)。垂体、肾上腺和性腺之间的相互作用对胸腺功能的影响尤为重要，包括营养性(trophic)作用的(TSH和GH)和促萎缩性作用的(LH，FSH和ACTH)(Kendall，1988；Homo-Delarche，1991.)。实际上胸腺的一个标志性生理特点就是在青春期前后循环中性类固醇增加时与之伴随的胸腺结构和功能的渐进性衰退(Hirokawa和Makinoda，1975；Tosi等，1982；和Hirokawa等，1994)。这些激素的确切作用靶位以及它们诱导胸腺萎缩的作用机制仍未确定。
由于胸腺是产生并保持外周T细胞库的主要部位，这种萎缩被广泛地假定为老年人中免疫紊乱事件增加的主要原因。特别是，以T-细胞依赖的免疫功能的下降，如细胞溶解性T-细胞活力和促有丝分裂反应等为代表的免疫系统缺陷，表现在人生晚期免疫缺陷、自身免疫以及肿瘤(tumor load)事件发生的增加(Hirokawa，1998)。
胸腺萎缩的影响反映在外周中，即胸腺对T细胞库的输入减少导致T细胞受体(TCR)库中多样性的减少。可观察到细胞因子的改变(profile)(Hobbs等，1993；Kurashima等，1995)、CD4+和CD8+亚群的改变、以及不利于纯真T细胞的向记忆细胞的偏移(Mackall等，1995)。此外，随年龄增加胸腺生长的效率受到损害，以致于T细胞消除后免疫系统再生出正常T细胞数量的能力最终丧失(Mackall等，1995)。
然而，Douek等(1998)的近期工作表明很可能在老年人中胸腺输出仍然发生。在感染HIV后的老年患者中，用TCR基因重排的切除的DNA产物来证明循环的、新纯真T细胞的生成。这种输出率和随之的外周T细胞库的再生需进一步阐明，因为经过化疗的青春期后的患者与青春期前的患者相比表现出明显的T细胞库再生率的下降，尤其是CD4+T细胞(Mackall等，1995)。这种情况在Timm和Thoman(1999)的近期工作中进一步被阐明，这些作者的工作表明虽然在经过BMT(骨髓移植)后的老小鼠中CD4+T细胞可以再生，但显示出易于转变为记忆细胞的倾向，这是由于老化的外周微环境作用，连同胸腺产生纯真T细胞的能力低下。
胸腺主要包括散布在多种基质细胞(主要是上皮细胞亚群)中的正在发育的胸腺细胞，这些基质细胞构成微环境并提供T细胞最佳发育所必需的生长因子和细胞间作用。胸腺细胞和上皮细胞亚群之间的共生发育关系(其控制它们的分化和成熟)(Boyd等，1993)，意味着在任何细胞类型的水平都会出现性类固醇抑制，一种类型细胞会影响另一种类型细胞的状态。胸腺细胞本身存在内在缺陷的可能性比较小，因为先前的运用辐射嵌合体进行的研究已表明骨髓(BM)干细胞不受年龄影响(Hirokawa，1998；Mackall和Gress，1997)并且具有与年轻的BM细胞相近似的胸腺再生(repopulation)的潜能。并且，在老年动物中的胸腺细胞至少部分保留了分化的能力(Mackall和Gress，1997；George和Ritter，1996；Hirokawa等，1994)。然而，Aspinall(1997)的近期工作发现，在前体CD3-CD4-CD8-三阴性(TN)群体中的缺陷发生于TCRγ链基因重排时期。
TCR库的发育倾向于或背离于特异抗原的偏移增强胸腺摄取造血前体细胞的能力意味着可以操作改变树突状细胞的性质和类型。例如，可以用特定基因转染前体细胞，并最终使该基因在胸腺(和机体其它部位)中的树突状细胞中表达。这类基因可以包括那些编码特定抗原的基因，而针对这些抗原的免疫反应是有害的，如自身免疫病、过敏症、和移植抗原。
这些基因还可以编码诱导人们期望的免疫反应的抗原(也可以是肽)，例如肿瘤细胞和侵入的微生物。在后一种情况中，肽的水平和亲和力应控制到低至不足以引发负性选择，但要足够高以促进正性选择。我们已证明正性选择可由多种类型细胞参与皮质上皮提供特异分化分子，而第三类细胞提供MHC/肽配体。
前体也可通过增加或删除基因来进行基因修饰，如那些编码可溶性调节分子的基因，例如趋化因子、细胞因子、和其它可影响胸腺生长和T细胞发育、活化、正性或负性选择、迁移、和一般状态的任一方面的分子。这种方法可以用来促进或延迟胸腺发育或T细胞应答。它可用来诱使T细胞库偏向特异抗原，以产生例如抗病毒和抗肿瘤的防御反应。该方法也可以用来调整胸腺微环境的性质、结构、和功能。
耐受的诱导最有效的诱导产生自身免疫耐受的方法是通过负性选择在胸腺内消除(或无反应性或诱导负调节细胞)那些潜在的自身反应细胞，这种负性选择最有效地通过胸腺内树突状细胞加以介导。作为必然结果，如果表达这种抗原的树突状细胞可并入胸腺，则可获得最佳的对外源或正常抗原的耐受性。这种形式的耐受还可以通过抑制性免疫调节细胞的参与而达到更好的效果。然而，对后者的发生、发展机制知之甚少，但也是在胸腺中发生并可能有树突状细胞参与。
至于对已知靶抗原过度反应的T细胞，可用编码特异抗原的基因转染造血干细胞。当这些细胞在胸腺内发育为树突状细胞后，它们会消除任何对此正常抗原有潜在反应活性的新生T细胞。
通过恢复胸腺功能而可以得到的巨大的临床益处，展示了治疗免疫缺陷(尤其是在老年人中、艾滋病患者和化疗后的患者)的一个重要策略。此外，携带有功能异常的T细胞的患者现在也可以经消除所有T细胞来治疗，从而终止这种疾病，然后可以通过抑制性类固醇的产生来重新激活胸腺功能，从而恢复他们正常的免疫力。至于疫苗接种程序，胸腺重新活化会显著改善T细胞的状态，因而改善免疫反应的性质、范围、和质量。此外，通过在再活化胸腺过程中提供供体细胞，可修饰T细胞群体从而产生对同种异体移植体和异种移植体的耐受。并且，再生的T细胞群体可以在胸腺再活化过程中经基因治疗而进行基因修饰。
发明简述本发明提供了一种诊断方法，以确定胸腺对抑制性类固醇产生而再生的敏感性。在优选的具体实施例中，该方法提供对这种敏感性的早期确定方法，在抑制起始后一周之内，较好在4到5天之内，更好在2-3天之内，最好在24小时之内。
在一个特定的具体实施例中，传向胸腺的性类固醇介导的信号的阻断是通过给予LHRH的激动剂或拮抗剂、抗雌激素抗体、抗雄激素抗体、被动(抗体)或主动(抗原)抗-LHRH接种疫苗(vaccinations)、或其组合(“阻断剂”)。
在优选的具体实施例中，通过给予LHRH的激动剂来产生抑制。优选地给予快反应的拮抗剂如阿巴瑞克(Abarelix)或西曲瑞克(Cetrorelix)。在另一个具体实施例中，可通过给予醋酸性瑞林(Zoladex)或醋酸亮丙瑞林(Leupron)等LHRH激动剂来产生抑制。
在优选的具体实施例中，阻断剂是通过肽缓释剂型(formulation)来给予。持续肽释放剂型的实例参见WO 98/08533，其全部内容结合于此作为参考。
在一个具体实施例中，通过检测患者抑制前后血样中胸腺诱导因子的含量来完成诊断。
而在另一个具体实施例中，本发明用以鉴定以前未知的胸腺因子。
在另一个具体实施例中，通过检测胸腺活力来完成诊断。除上所述，还可通过确定新生T细胞的水平来完成诊断，新生T细胞的鉴定是通过名为T细胞受体切除环(TREC’s)的小环状DNA在这些细胞中的出现而完成。这些TREC’s作为胸腺中发育的T细胞的正常部分而产生，特别是针对抗原的T细胞受体形成过程中基因重排造成的。T细胞总数量(通过CD3、CD4、和CD8的流式细胞染色而测量)的基础增加以及它们对刺激(具有抗CD3交联)的体外应答的改变也可用来监测胸腺功能，但这些改变可能需要几天或几周才能被观测到。
附图简要描述
图1A和B阉割前后胸腺细胞数量的变化。胸腺萎缩导致随年龄增长胸腺细胞数量显著减少。阉割后2周，细胞数量已增加到年轻成体的水平。阉割后3周，细胞数量又有显著增加，并在阉割后第4周达到稳定。***＝与年轻成体(2月龄)胸腺相比具有显著差异，p＜0.001。
图2A-C(A)脾细胞数目不受年龄和阉割的影响。外周B∶T细胞比例也保持恒定(B)，然而，随龄增长CD4∶CD8比例显著下降(p＜0.001)，并在阉割后4周恢复到正常年轻水平。
图3随年龄及阉割后CD4对CD8胸腺细胞群的荧光激活细胞分拣仪(FACS)谱。每一象限的百分比都于图上给出。胸腺细胞的亚群随年龄保持恒定并且胸腺细胞在阉割后同步增加。
图4胸腺细胞的增殖，如通过结合BrdU脉冲所探测的。正在增殖的胸腺细胞的比例不随年龄和阉割发生变化。
图5A-D年龄和阉割对胸腺细胞亚群增殖的影响。(A)构成总的增殖群的每个亚群的比例-CD8+T细胞在增殖群体中的比例显著增加。(B)每个正在增殖亚群的百分比-TN和CD8亚群在2年时与2月时相比增殖显著下降。阉割后2周，TN群体增殖力恢复到年轻正常水平，而CD8群体表现出增殖的显著增加。阉割后4周，该水平与正常年轻时的水平相似。(C)TN的总增殖不随年龄和阉割变化。然而(D)TN1亚群随年龄增长增殖显著下降，并且在阉割后4周都不能恢复到正常水平。***＝很显著，p＜0.001，**＝显著，p＜0.01。
图6小鼠胸腺内注射FITC。24小时后计数(calculated)外周中的FITC+细胞数目。虽然随年龄增长胸腺新转移细胞(RTE)的比例恒定在胸腺细胞数目的约1％，但是在阉割后2周明显减少，RTE细胞数目随年龄显著减少(p＜0.01)。阉割后，这些数值虽然有所上升但在阉割后两周仍显著低于年轻小鼠的水平。随年龄增长，可以看到CD4+与CD8+RTE的比例明显增加，在阉割后一周恢复正常。
图7A-C用化疗药物环磷酰胺治疗后胸腺(A)、脾(B)、和淋巴结(C)细胞数目的变化。注意在治疗后1周和2周，阉割组动物与未阉割组动物(仅采用环磷酰胺治疗)相比胸腺发生快速扩充。此外，与仅采用环磷酰胺治疗组相比，阉割组脾细胞和淋巴结细胞数目增长较快。到4周时，细胞数量达到正常。(每时间点各组样本数3-4)。
图8A-C手术阉割1周后及经辐照(625拉德)治疗后，胸腺(A)、脾(B)、和淋巴结(C)细胞数目的变化。注意在治疗后1周和2周，阉割组动物与未阉割组动物(仅采用放射治疗)相比胸腺发生快速扩充。(每时间点各组样本数3-4)。
图9A-C在同一天进行放射治疗和阉割后，胸腺(A)、脾(B)、和淋巴结(C)细胞数目的变化。注意在治疗后2周，阉割组动物与未阉割组动物相比胸腺发生快速扩充。然而，所观察到的差异不如在治疗前1周对小鼠进行阉割那样明显(图7)。(每时间点各组样本数3-4)。
图10在同一天进行手术或化学阉割和化疗药物环磷酰胺治疗后，胸腺(A)、脾(B)、和淋巴结(C)细胞数量的变化。注意在治疗后1周和2周，阉割组动物与未阉割组动物(仅采用环磷酰胺治疗)相比胸腺发生快速扩充。此外，与仅采用环磷酰胺治疗组相比，阉割组脾细胞和淋巴结细胞数量增长较快。(每时间点各组样本数3-4)。经环磷酰胺治疗后，化学阉割与手术阉割对免疫系统的再生作用相当。
图11用I型单纯性疱疹病毒(HSV-I)足跖免疫接种(foot-padimmunization)后的淋巴结细胞数量(cellularity)。注意与老年未阉割组相比老年阉割组的细胞数目增加。下面的图是经FACS针对CD25与CD8细胞筛选的总活化细胞数。
图12A-C接种HSV-1后，在活化的LN(淋巴结)中，Vβ10在CTL(细胞毒T淋巴细胞)上的表达。注意在老年小鼠中克隆反应的减少及阉割后所预期反应的恢复。
图13A-C阉割恢复对HSV-1免疫接种的应答。(a)与年轻小鼠和阉割后小鼠相比较老年小鼠在感染后淋巴结总细胞数量明显减少。(b)HSV-1感染小鼠的LN中活化细胞(CD8+CD25+)的典型的FACS图。活化CTL的比例不随年龄或阉割发生明显变化。(c)老年小鼠淋巴结内细胞数目的下降体现在活化CTL细胞数的显著下降。老年小鼠的阉割恢复其对HSV-1的免疫反应，并且CTL数与年轻小鼠的相当。结果以8-12只小鼠的平均值±1SD(标准偏差)表示。**＝p≤0.01，与年轻(2月龄)小鼠相比；^＝p≤0.01，与老年(未阉割)小鼠相比。
图14切下用HSV-1进行免疫的小鼠腘淋巴结，并培养3天。以未经免疫的小鼠作为对照以消除本底水平的裂解(lysis)(以51Cr释放测定)，进行CTL分析。结果以8只小鼠的平均值(三次测量值)±1SD表示。在10∶1和3∶1的E∶T比值下，老年小鼠表现出明显(p≤0.01，*)的CTL活力下降，这表明存在于淋巴结中的特异CTL百分比的下降。阉割使老年小鼠的CTL反应恢复到年轻成年的水平。
图15A和BCD4+T细胞的辅助作用和VβTCR对HSV-1感染的反应的分析。HSV-1感染5天后摘除腘淋巴结并于体外分析(a)CD25、CD8、和特异TCRVβ标记及(b)CD4/CD8 T细胞的表达。(a)表达Vβ10或Vβ8.1的活化的(CD25+)CD8+T细胞的百分比，以每组8只小鼠的平均值±1SD表示。没有观察到随年龄或阉割后的变化。(b)随年龄增长在静息的LN群体中可见CD4/CD8比例的下降。这种情况在阉割后可恢复。结果以每组8只小鼠的平均值±1SD表示。***＝p≤0.001，与年轻的和阉割的小鼠相比。
图16A-DLy5同类(congenic)小鼠骨髓移植后，胸腺(A)、脾(B)、淋巴结(C)、和骨髓(D)细胞数的变化。注意在治疗后所有时间点阉割后的动物与未阉割组相比较胸腺快速扩充。此外，与环磷酰胺单独治疗组相比，阉割组的脾和淋巴结的细胞数有显著增加。(n＝3-4每处理组及时间点)。与未阉割动物相比，阉割小鼠具有明显增加的同类(Ly5.2)细胞(数据未给出)。
图17A和B在胎儿肝脏重建之后阉割和未阉割小鼠中胸腺细胞数目的变化。(每一实验组n＝3-4)。(A)在两周时，阉割小鼠的胸腺细胞数处于正常水平并明显高于未阉割小鼠(*p≤0.05)。小鼠阉割4周后可观察到胸腺肥大。未阉割的细胞数保持在对照水平以下。(B)CD45.2+细胞-CD45.2+是供体来源的标记。重建后两周，供体来源细胞即在阉割和未阉割小鼠中均存在。在治疗后4周阉割胸腺中的细胞约85％是供体来源的。在未阉割胸腺中无供体来源细胞。
图18在致死辐照和胎儿肝脏重建、以及其后的手术阉割后，来源于供体的胸腺细胞群的CD4对CD8的FACS图。每个象限的百分比在图的右边给出。年龄匹配的对照图是8个月大的Ly5.1同类小鼠胸腺。阉割和未阉割小鼠用CD45.2+细胞门化，该标记仅出现在供体来源的细胞。重建后两周，在阉割与未阉割小鼠间胸腺细胞亚群无差异。
图19A和B致死剂量辐照、胎儿肝脏重建、和阉割后，骨髓性和淋巴树突状细胞(DC)的数目。(每实验组小鼠n＝3-4)。下面图中的对照(在其上标斜线)条图是基于未治疗的年龄匹配的小鼠中发现的树突状细胞的正常数量。(A)供体来源的骨髓性树突状细胞-重建两周后在未阉割小鼠中DC达到正常水平。阉割小鼠在同一时间点具有明显更多的DC数目(*p≤0.05)。在4周时在阉割小鼠中DC数目依旧保持高于对照的水平。(B)供体来源的淋巴树突状细胞-重建后两周阉割小鼠中DC数目是未阉割小鼠的2倍。治疗后4周，DC数目依旧保持高于对照的水平。
图20A和B在胎儿肝脏重建后，阉割和未阉割小鼠中总骨髓细胞数量和CD45.2+骨髓细胞数量的变化。每一实验组n＝3-4只小鼠。(A)总细胞数-重建后两周骨髓细胞数恢复正常，并且阉割和未阉割小鼠之间的细胞数量没有明显差异。重建后4周阉割和未阉割小鼠之间的细胞数目存在显著差异。(*p≤0.05)。(B)CD45.2+细胞数目。重建后2周在阉割与未阉割小鼠的骨髓中的CD45.2+细胞数目之间没有明显差异。在四周时，阉割小鼠中的CD45.2+细胞数量仍然较高。在同一时间点，在未阉割小鼠中没有供体来源的细胞。
图21A-C胎儿肝脏重建后，阉割和未阉割小鼠骨髓中T细胞、骨髓和淋巴来源的树突状细胞(DC)的变化。(每一实验组小鼠n＝3-4)。图中对照(在其上标斜线)条图是基于在未治疗的年龄匹配的小鼠中发现的T细胞和DC的正常数量。(A)T细胞数目-在重建后两周和4周，阉割和未阉割小鼠的细胞数目都减少。(B)供体来源的骨髓性树突状细胞-重建后两周，DC数目在阉割和未阉割小鼠中都正常。在此时间点，阉割与未阉割小鼠的细胞数目无显著差异。(C)供体来源的淋巴样树突状细胞-数目于重建后两周和4周均处于正常水平。在两周时，在阉割与未阉割小鼠的细胞数量之间无显著差异。
图22A和B在胎儿肝脏重建后，在阉割和未阉割小鼠中总的和供体(CD45.2+)脾细胞数量的变化。(每一实验组小鼠n＝3-4)。(A)总细胞数-重建后两周，细胞数目降低并且在阉割和未阉割小鼠的细胞数量之间无显著差异。重建后4周，阉割小鼠的细胞数目接近正常水平。(B)CD45.2+细胞数目-重建后两周，就脾中CD45.2+细胞数目而言，阉割和未阉割小鼠间无显著差异。在4周时，CD45.2+细胞数目在阉割小鼠中仍然较高。在同一时间点，在未阉割小鼠体内无供体来源细胞。
图23A-C胎儿肝脏重建后的脾T细胞以及骨髓和淋巴来源的树突状细胞(DC)。(每一实验组小鼠n＝3-4)。图中对照(标斜线)条图是基于在未治疗的年龄匹配的小鼠中发现的T细胞和树突状细胞的正常数量。(A)T细胞数目-在重建后两周和4周，阉割和未阉割小鼠的细胞数目都减少。(B)供体来源的(CD45.2+)骨髓性树突状细胞-重建后两周和4周DC数目在阉割和未阉割小鼠中都正常。在两周时，在阉割和未阉割小鼠的细胞数目之间无显著差异。(C)供体来源的(CD45.2+)淋巴样树突状细胞-数目于重建后两周和4周均处于正常水平。在两周时在阉割和未阉割小鼠的细胞数之间无显著差异。
图24A和B胎儿肝脏重建后，阉割和未阉割小鼠中总的和供体(CD45.2+)淋巴结细胞数量的变化。(每一实验组小鼠n＝3-4)。(A)细胞总数-重建后两周，细胞数量处于正常水平并且在阉割和未阉割小鼠之间没有显著差异。重建后4周，阉割小鼠中细胞数目处于正常水平。(B)CD45.2+细胞数量-在重建后两周，就淋巴结中供体CD45.2+细胞数目而言，阉割和未阉割小鼠间无显著差异。在4周时阉割小鼠中的CD45.2+细胞数目依旧较高。在同一时间点在未阉割小鼠体内无供体来源细胞。
图25A-C胎儿肝脏重建后，在阉割和未阉割小鼠肠系膜淋巴结中，T细胞、和骨髓及淋巴来源的树突状细胞数目的变化(每一实验组小鼠n＝3-4)。对照(标斜线)条图是在未处理的年龄匹配的小鼠中发现的T细胞和树突状细胞的数目。(A)在重建后2周和4周，阉割和未阉割小鼠的T细胞数目都减少。(B)在阉割和未阉割小鼠中供体来源的骨髓性树突状细胞数目都处于正常水平。在4周时，它们都减少。在2周时，在阉割和未阉割小鼠的细胞数目之间无显著差异。(C)供体来源的淋巴样树突状细胞-重建后2周和4周，细胞数目处于正常水平。在2周时，在阉割和未阉割小鼠的细胞数目之间无显著差异。
图26经LHRH激动剂治疗前列腺癌后，分析了患者(＞60岁)外周血中淋巴细胞的表型组成。于LHRH激动剂治疗前和治疗后4个月分析患者的样本。所有患者的样本在治疗前其血液中每毫升的淋巴细胞总数处于对照值的低限附近。经过治疗，6/9的患者表现出显著的总淋巴细胞计数的增加(在某些病例中观察到数目的加倍)。与此相应的是6/9患者的T细胞总数增加。在CD4+亚群中，这种增加更为显著，8/9的患者表现出CD4 T细胞水平的升高。而在CD8+亚群中，趋势不是很明显，在4/9的患者中表现出细胞数目水平的增高，虽然总的来说其程度低于CD4+T细胞。
图27分析患者经LHRH激动剂治疗前后血样，结果显示T细胞、CD4或CD8 T细胞的总比例没有显著改变，而治疗后CD4∶CD8比值有不定的变化。这表明治疗虽然使T细胞总数明显增加，但对T细胞亚群的内环境稳定的维持具有最小的治疗作用。所有的值均与对照值比较。
图28分析经LHRH激动剂治疗的患者外周血中B细胞和骨髓性细胞(NK、NKT、和巨噬细胞)所占比例，表明这些亚群有不同程度的改变。虽然治疗后NK、NKT、和巨噬细胞的比例保持相对恒定，但4/9的患者中B细胞的比例则下降。
图29分析治疗后患者的外周血中的B细胞和骨髓性细胞的总数，分析结果清楚地表明治疗后细胞数水平的增加，包括NK(5/9患者)、NKT(4/9患者)、和巨噬细胞(3/9)。B细胞数目并未显示出明确的趋势2/9患者水平升高，4/9患者无变化，3/9患者水平降低。
图30A和BLHRH激动剂治疗后所观察到的主要变化是在外周血的T细胞群体内。特别是纯真(CD45RA+)CD4+细胞比例的选择性升高，同时6/9患者中，CD4+T细胞亚群中纯真(CD45RA+)T细胞与记忆细胞(CD45RO+)的比例增高。
图31用不同的激光脉冲能量降低皮肤的阻抗。用低至10mJ能量照射皮肤，皮肤阻抗则下降，利用拟合曲线来内推数值。
图32药物通过皮肤的渗透。以胰岛素作为测试药物，经激光照射后皮肤的渗透性大大提高。
图33给皮肤施加5-氨基乙酰丙酸(ALA)和单次脉冲瞬态后，皮肤荧光随时间的变化。强度的峰值位于约640nm处，并在治疗后210分钟(虚线)达到最高。
图34不加脉冲瞬态，只施加5-氨基乙酰丙酸(ALA)后，皮肤荧光随时间的变化。在不同的时间点强度几乎无变化。
图35给皮肤施加5-氨基乙酰丙酸(ALA)和在不同峰值应力(peak stress)下的单次脉冲瞬态后，皮肤荧光变化的比较。皮肤角质层的渗透程度取决于峰值应力。
发明详述胸腺功能的一个独有特征是虽然它对建立和保持免疫系统很重要，并因此抵御感染和疾病，它却特有地经历明显的随年龄功能下降直至其最大能力的5％以下。这种情况在青春期后更为明显，这提示性类固醇可能对此有作用。
抑制性类固醇直接或间接导致胸腺功能的显著的再活化，有效地逆转了萎缩。然而，鉴于患者年龄、疾病及治疗范围的广泛性，可以预期到很多患者会对该治疗反应不尽相同，包括一部分反应很差。因此需要建立新的确定胸腺在缺乏性类固醇时活化反应的早期诊断指标，以指导对T细胞失常的常规临床处置。
因为胸腺是内分泌器官，胸腺功能的再活化不仅会使它在2-4周后释放新的T细胞至血流中，而且在此之前，甚至在再活化数小时内，胸腺也会释放更高水平(invreased levels)的细胞因子。这些可以在血液或血浆中检测到。本发明利用这些释放的细胞和分子来检测患者的胸腺对性类固醇抑制的反应程度。本文提供的是一组用来进行这种测定的诊断技术。
切断传向胸腺的性类固醇信号容易理解，传向胸腺的性类固醇信号可用多种方式切断，这些方式为本专业技术人员所熟知，本文描述其中的一些方式。例如，抑制性类固醇的产生或在胸腺中阻断一种或多种性类固醇受体，会完成所希望的切断，如给予性类固醇激动剂、或拮抗剂、或者主动(抗原)或被动(抗体)的抗性类固醇接种疫苗可完成接种。还可以通过给予一种或多种性类固醇类似物来抑制性类固醇的产生。在某些临床病例中，通过物理阉割永久切除性腺可能是适合的。
在优选的具体实施例中，传向胸腺的性类固醇信号是通过给予性类固醇的类似物而阻断，优选促黄体激素释放激素(LHRH)的类似物。性类固醇类似物以及它们在治疗和化学阉割中的应用已广为人知。这些类似物包括但不限于阿巴瑞克(Abarelix)(美国专利第6,197,337号)、西曲瑞克(Cetrorelix)、地洛瑞林(Deslorelin)(参见美国专利第4,218,439号)、氟他胺(Eulexin)(见FR7923545、WO 86/01105、和PT 100899)、戈舍瑞林(Goserelin)(参见美国专利第4,100,274号、美国专利第4,128,638号、GB 9112859、和GB 9112825)、亮丙立德(Leuprolide)(参见美国专利第4,490,291号、美国专利第3,972,859号、美国专利第4,008,209号、美国专利第4,005,063号、DE 2509783、和美国专利第4,992,421号)、Dioxalan衍生物(如在EP 413209中所描述的)、曲普瑞林(Triptorelin)(参见美国专利第4,010,125号、美国专利第4,018,726号、美国专利第4,024,121号、EP 364819、和美国专利第5,258,492号)、美替瑞林(见EP 23904)、布舍瑞林(参见美国专利第4,003,884号、美国专利第4,118,483号、和美国专利第4,275,001号)、组氨瑞林(参见EP 217659)、那法瑞林(参见美国专利第4,234,571号、WO93/15722、和EP 52510)、黄体瑞林(参见美国专利第4,089,946号)、亮丙瑞林(参见Plosker等)、以及LHRH类似物如描述于下述文献中的类似物EP 181236、美国专利第4,608,251号、美国专利第4,656,247号、美国专利第4,642,332号、美国专利第4,010,149号、美国专利第3,992,365号、和美国专利第4,010,149号。上述文献所披露的内容结合于此作为参考。
虽然刺激胸腺再生主要基于抑制性类固醇的作用和/或LHRH类似物直接作用，其它辅助物质也是必要的，其可协同作用以增强胸腺效果(thymic effect)。这类化合物可包括但不限于白介素7、内皮生长因子、成纤维细胞生长因子家族成员，以及角质细胞生长因子。可以设想这些辅助的化合物仅在LHRH类似物初次应用时给药一次。此外，也可开发并使用可特异地作用于胸腺的类固醇受体的调节剂。
用于化学阉割的制剂给药可通过多种本专业技术人员熟知的方法完成本发明的化合物的给药。给予化学抑制剂来抑制传向胸腺的性类固醇信号的一个标准步骤是，一次性给予LHRH激动剂，其疗效可维持3个月。对此，简单的一次性静脉注射或肌肉注射不能满足需要，因为该激动剂会在3个月结束前就会从患者体内被清除掉。作为替代，可采用长效制剂注射或移植片，或采用其它缓释此抑制剂的给药方式。同样，可采用延长抑制剂在体内的半衰期的方法，例如通过对化合物进行修饰而同时保持此处所需的功能。
更有效的给药机制的例子包括但不限于激光辐照皮肤、以及在皮肤上产生高压脉冲瞬态(也称为应力波或脉冲瞬态)，在每种方法实施的同时或在其实施之后，在同样的皮肤区域放置带有或不带有载体的化合物。优选的放置方法是在贴片中，在治疗期间其放置并保持于皮肤上。
给药的一种方式是采用激光束(特殊聚焦并在合适的波长产生激光)，以在患者的皮肤上产生小的穿孔或蚀变(alteration)。参见美国专利第4,775,361号、美国专利第5,643,252号、美国专利第5,839,446号、和美国专利第6,056,738号，所有这些结合于此作为参考文献。在优选的具体实施例中，激光束的波长是在0.2至10微米之间。更好地，波长是在约1.5至3.0微米之间。最好地，波长为大约2.94微米。在一个具体实施例中，激光束以透镜聚集，从而穿过表皮在皮肤上产生辐照斑。在另一个具体实施例中，对激光束进行聚焦，从而仅穿过皮肤的角质层产生辐照斑。
应考虑限定激光束的多种参数，包括波长、能注量、脉冲时间宽度(pulse temporal width)、和辐照斑大小。在优选的具体实施例中，能注量的范围是0.03-100,000J/cm2。更优选地，能注量的范围是0.03-9.6J/cm2。光束波长部分取决于激光材料，如ErYAG。脉冲时间宽度是脉冲宽度的结果，该脉冲宽度由例如电容组、闪光灯、及激光棒材料所产生。脉冲宽度最好在1fs(尘秒)和1,000μs之间。
依照此方法，由激光产生的穿孔或蚀变不必由来自激光的单脉冲实现。在优选的具体实施例中，透过角质层的穿孔或蚀变是由多个激光脉冲而产生，每个脉冲只穿孔或蚀变靶组织深度的一部分。
为此，用单脉冲的能量除以所希望的脉冲数，就能粗略估计用多个脉冲在角质层上形成穿孔或蚀变所需要的能量。例如，如果特定大小的斑需要1J的能量来产生穿过整个角质层的穿孔或蚀变，那么可用10个脉冲来产生定性上相似的穿孔或蚀变，每个脉冲的能量为1/10。因为最好患者在辐照期间不要移动靶组织(人的反应时间是100ms左右)，并且希望每个脉冲期间产生的热量不会显著扩散，在优选的具体实施例中，来自激光器的脉冲重复率需满足在100ms内产生完全的穿孔。可替换地，靶组织和激光器的定位可机械地固定，从而在更长的辐照时间内，不会发生靶位置的改变。
为了穿透皮肤而不产生或少产生流血，应该经外表面对皮肤进行穿孔或蚀变，如角质层，但不深及毛细血管层。激光束精确聚集于皮肤，在皮肤上产生直径约为0.5μm-5.0cm的光斑。可选择地，光斑可以是狭缝形状，宽约0.05-0.5mm，长度可达2.5mm。宽度可为任何大小，依下列情况而定辐照区域的解剖结构和所需要的有待被移除液体或将要施予的药物的渗透速率。聚焦透镜的焦距可为任意长度，但在一个具体实施例中为30mm。
通过改变波长、脉冲宽度、能注量(其是激光能量输出(以焦耳计)和焦点光斑大小(cm2)的函数)、和辐照斑大小，可改变对角质层的作用处在消融(穿孔)和非消融改变(蚀变)之间。角质层的消融和非消融蚀变均可增加随后应用的药物的渗透性。
例如，通过降低脉冲能量而保持其它变量恒定，就可以在消融和非消融组织效应之间进行改变。利用脉冲宽度约300μs的ErYAG激光器，采用单脉冲或辐射能并在皮肤上辐照2mm大的斑点，超过约100mJ的脉冲能量会在角质层产生部分或完全消融，而任何低于约100mJ的脉冲能量会在角质层产生部分融性或非消融性蚀变。可选地，运用多个脉冲，增强体液渗透或药物传送所必需的阈脉冲能量则降低，降低的系数约等于脉冲数目。
可替换地，通过减小光斑尺寸同时保持其它变量恒定，也可在消融和非消融组织效应之间进行改变。例如，减半光斑面积将导致产生同样效应所需的能量减半。例如，小至0.5微米的辐照可通过，例如，将激光器的辐射输出偶联于显微镜物镜(例如，可购自Nikon公司，Melville，纽约)的多个物镜中而获得。在此种情况下，激光束聚焦形成的光斑可能会小至显微镜的分辨率限制的数量级，后者可能大约为0.5微米的数量级。实际上，如光束呈高斯分布，有效的辐照区域尺寸可以比测量的光束尺寸小，并可以超过显微镜的成像分辨率。在这种情况下，为非消融性地蚀变组织，采用3.2J/cm2的能注量可能比较合适，其对于半微米大的光斑将需要约5nJ的脉冲能量。如此低的脉冲能量很容易由二极管激光器得到，也可获自例如，经吸收滤光器(如玻璃)衰减的ErYAG激光器。
可选地，通过改变辐射能的波长同时保持其它变量恒定，就可以在消融和非消融组织效应之间进行改变。例如，用HoYAG(钬YAG；2.127微米)替代ErYAG(铒YAG；2.94微米)激光器，将导致组织对能量吸收的减少，从而产生程度较轻的穿孔或蚀变。
激光器产生的皮秒和尘秒脉冲也可用来在皮肤上产生蚀变或消融。这可用调制二极管或相关的微片激光器来完成，其输出时间宽度(temporal widths)在1尘秒至1ms之间的单脉冲。(见D.Stern等，“用在532和625nm处的纳秒、皮秒、和尘秒激光进行角膜消融”，角膜激光消融，107卷，587-592页(1989)，(“Corneal Abltionby Nanosecond，Picosecond，and Femtosecond Lasers at 532 and625nm，”Corneal Laser Ablation，Vol.107，pp.587-592(1989)，其结合于此作为参考文献，该参考文献披露了低至1尘秒的脉冲宽度的应用)。
另一种给药方法是利用皮肤上的高压脉冲瞬态产生渗透性。见美国专利第5,614,502号和美国专利第5,658,892号，两者结合于此作为参考文献。高压脉冲瞬态，例如，应力波(例如，由激光产生时的激光应力波(LSW)，具有特定上升时间和峰值应力(或压力)，可以安全有效地影响化合物的转运，如本文披露的化合物，使其通过上皮组织层，如角质层和粘膜。这些方法可用来传递很大尺寸范围的化合物，与其净电荷无关。此外，本方法采用的脉冲瞬态可避免组织损伤。
暴露于脉冲瞬态前，上皮组织层，如角质层，很可能对外源化合物是不能渗透的；这阻碍了化合物扩散至上皮层下的细胞。上皮层暴露于脉冲瞬态使得化合物可通过上皮层扩散。扩散速率，总的来说，由脉冲瞬态的性质和传递的化合物的大小决定。
穿过特定上皮组织层(如皮肤角质层)的穿透速率，还取决于其它几种因素，包括pH、皮肤基底组织的代谢，角质层内外区域的压力差、以及解剖学部位和皮肤的生理条件。而皮肤的生理条件取决于健康状况、年龄、性别、种族、皮肤保养和病史。例如，先前接触有机溶剂或表面活性剂可以影响皮肤的生理状况。
经上皮组织层传递的化合物的量也取决于上皮层保持通透的时间长短，以及已通透的上皮层表面积的大小。脉冲瞬态的性质和特征是通过用以产生它们的能源来控制。见WO 98/23325，其结合于此作为参考文献。然而，它们的特性被它们在其中扩散的偶联介质的线性和非线性特性所调节。偶联介质所引起的线性衰减主要衰减脉冲瞬态的高频成分。这使得带宽随着脉冲瞬态相应的上升时间的增加而减少。另一方面，偶联介质的非线性特性，导致上升时间减少。上升时间的减少是声音和粒子速度对应力(压力)依赖的结果。随应力增加，声音和粒子速度也增加。这导致脉冲瞬态的前沿变得更陡。线性衰减、非线性系数、和峰值应力的相对强度决定了波需传播多远，才能使上升时间的陡度增加变得显著。
选择上升时间、强度以及脉冲瞬时的持续时间，以产生非破坏性(即非休克波)脉冲瞬态从而暂时提高上皮组织层的渗透力。一般来说上升时间至少为1ns，更优选大约10ns。
脉冲瞬态的峰值应力或压力随不同上皮组织或细胞层而有所不同。例如，为通过角质层运输化合物，脉冲瞬态的峰值应力或压力应设置于至少400巴(bar)，优选至少1,000巴，但不高于2,000巴。
对上皮粘膜层来说，峰值压力应设置于300巴至800巴之间，优选300巴至600巴。
优选地，脉冲瞬态的持续时间为几十ns，因此仅与上皮组织相互作用很短时间。
与脉冲瞬态相互作用后，上皮组织并未受到永久损伤，但在近3分钟内保持可渗透。
此外，该新方法涉及仅给患者施用数个离散的高强脉冲。施于患者的脉冲瞬态的数量一般少于100，更好少于50，优选少于10。当运用多个光脉冲以产生脉冲瞬态时，相邻脉冲之间的时间间隔为10至120秒，此间隔足够长，从而不对上皮组织造成永久损伤。
可用本领域的标准方法对脉冲瞬态的特性进行测量。例如，峰值应力或压力、和上升时间可用聚偏氟乙烯(PVDF)传感器的方法(描述于Doukas等，超声波生物医学(Ultrasound Med.Biol.)，21961(1995))进行测量。
可用多种能源产生脉冲瞬态。能够产生脉冲瞬态的物理现象一般来自三种不同的机制(1)热弹性产生；(2)光学击穿；或(3)消融。
例如，通过采用高能激光源来消融靶材料，可激发脉冲瞬态，然后通过偶联介质将脉冲瞬态偶联于上皮组织或细胞层。该偶联介质可以是，例如，液体或凝胶，只要它是非线性的。因此，水、油(如蓖麻油)、等渗介质(如磷酸缓冲盐水(PBS))、或凝胶(如胶原凝胶)，都可用作偶联介质。
此外，该偶联介质可包括能增强转运的表面活性剂，例如，在脉冲瞬态发生之后，通过延长角质层对化合物保持通透的时间。该表面活性剂可以是，例如，离子型去污剂或非离子型去污剂，因此可包括，例如，月桂基硫酸钠、(sodium lauryl sulfate)十六烷基三甲基溴化铵、(cetyl trimethyl ammonium bromide)和N，N-二甲基-N-十二烷胺氧化物(laury dimethyl amine oxide)。
吸收靶材料担当光学触发换能器的角色。随着对光的吸收，靶材料经历快速热膨胀或消融，从而发射脉冲瞬态。一般来说，金属和聚合物膜在可见光和紫外光谱区具有高吸收系数。
许多类型的材料可与激光束一起用作靶材料，只要它们在所用激光的波长可以完全吸收光。靶材料可以是金属(如铝或铜)；塑料(如聚苯乙烯，例如黑色聚苯乙烯)；陶瓷；或高浓度染料溶液。靶材料的大小必须大于所应用的激光能量的截面积。此外，靶材料必须厚于光穿透深度以保证光不会达到皮肤表面。靶材料还必须足够厚以提供机械支撑。当靶材料是由金属制成时，典型的厚度为1/32英寸(0.79375mm)至1/16英寸(1.5875mm)。对塑料靶材料来说，厚度为1/16英寸(1.5875mm)至1/8英寸(3.175mm)。
也可利用限制性消融来增强脉冲瞬态。在限制性消融中，激光束透明材料，如石英光学窗，被放置在紧密接触靶材料的位置。等离子体的限制(利用透明材料使靶材料消融而产生)在数量级上提高了偶联系数(Fabro等，应用物理学杂志(J.Appl.Phys)，68775，1990)。该透明材料可为石英、玻璃、或透明塑料。
因为靶材料和限制性透明材料之间的空隙允许等离子体进行膨胀，因此降低了传给靶的动量(momentum)，所以透明材料优选采用起初为液态的粘合剂(比如含碳的环氧物)来粘结于靶材料，以预防这类空隙。
激光束可用业内熟知的标准光调制技术来产生，如使用Q开关或锁模激光器，利用例如电光装置或声光装置。标准的商业上可购的能够在红外线、可见光、和/或红外线光谱采用脉冲形式的激光器包括NdYAG激光器、NdYLF激光器、CO2激光器、激基分子激光器、染料激光器、Ti蓝宝石激光器、二极管激光器、钬(和其它稀土材料)激光器、以及金属蒸气激光器。这些光源的脉冲宽度是可调节的，并且可在数十皮秒(ps)到数百微秒之间变化。在本发明的应用中，光脉冲宽度的变化范围是100ps至约200ns，优选大约500ps至40ns。
也可由体外碎石机产生脉冲瞬态(一个例子可见Coleman等，超声生物医学(Coleman et al.，Ultrasound Med.Biol.，)，15213-227，1989)。这些脉冲瞬态的上升时间为30至450ns，其比激光生成的脉冲瞬态长。为了形成具有合适的上升时间的脉冲瞬态(对利用体外碎石器的新方法而言)，让脉冲瞬态在非线性偶联介质(如，水)中传播一定的距离(用前述方程(1)计算而得)。例如，当利用碎石机产生具有100ns上升时间和500巴峰值压力的脉冲瞬态时，在与上皮细胞层接触之前，脉冲瞬态应该在偶联介质中穿行的距离大约为5mm。
对由碎石器产生的脉冲瞬态进行修整(shaping)的另一个好处是，作为在非线性偶联介质中传播的结果，波的拉伸分量(tensilecomponent)将变宽并衰减。这个传播距离应该进行调整来产生这样的脉冲瞬态，其拉伸分量的压力仅为波的压缩分量的峰值压力的5％至10％左右。这样，修整过的脉冲瞬态不会损伤组织。
所用的碎石机类型并不重要，可采用电动液压的、电磁的、或压电的碎石机。
脉冲瞬态也可由换能器产生，如压电换能器。优选地，该换能器直接与偶联连介质接触，并在施加光场、热场、或电场后迅速位移，从而产生脉冲瞬态。例如，可采用电介体击穿，并通常采用高压电火花或压电传导器(与某些体外碎石机中用到的类似，Coleman等，超声波生物医学(Coleman et al.，Ultrasound Med.Biol.，)，15213-227，1989)进行诱发。在使用压电换能器的情况下，该换能器在施加电场后经受快速膨胀，从而在偶联介质中引起快速位移。
此外，产生脉冲瞬态也可得益于纤维光学。光纤传输系统非常易于操作，并可用以辐照相邻于上皮组织层的靶材料，从而在不易到达的位置产生脉冲瞬态。当光学上与激光器联用时，这些类型的传输系统是优选的，因为它们可以结合于导管及相应的柔软设备中，并用于辐照人体内大多数器官。另外，为了能发射具有预期的上升时间和峰值应力的脉冲瞬态，光源的波长可以容易地适合于在特定靶材料中产生适当的吸收。
可替换地，响应爆炸脉冲(detonating impulse)，高能材料可产生脉冲瞬态。引爆剂可通过产生放电或电火花来引爆高能材料。
可将流体静压力与脉冲瞬态联用以增强穿过内皮组织层的化合物转运。由于脉冲瞬态导致的效用持续数分钟，通过脉冲瞬态之后在上皮组织层(例如，皮肤角质层)表面施加流体静压，药物顺应其浓度梯度穿过上皮细胞层的转运速度可以加快。
胸腺功能的诊断指标A.已知标记某些标记与胸腺活化相关。通过跟踪任一种、或这些标记的任何组合的浓度，可以检测胸腺活化的水平。可利用生物信息学检查胸腺功能活化前和活化后这些标记分子的水平改变。例如，对患者性类固醇抑制前后的血浆(即，通过离心去除所有细胞的血液)样本进行2维凝胶电泳。记录凝胶上差示表达的斑点(differentiallyexpressed“dots”)并用计算机进行分析。
1.白介素-7(IL-7)由胸腺皮质上皮细胞产生的主要的淋巴细胞生成和胸腺生成(thymopoietic)细胞因子IL-7对未成熟的胸腺细胞的增殖和分化非常重要(von Freeden-Jeffry等，1995；Komschlies等，1995；Peschon等，1994)。三阴性细胞的发育需要与IL-7的相互作用(Oosterwegel等，1997；Moore等，1993)，它主要通过诱导bcl-2表达并抑制未成熟胸腺细胞的程序性细胞死亡而起作用(Akashi等，1997；Maraskovsky等，1997)。已证实，在老年小鼠中，单独以IL-7治疗即可在CD44+CD25+(TN2)和CD44-CD25+(TN3)亚群中逆转细胞凋亡的增加和胸腺生成的下降，对应于TCRβ链重排的位置(location)(Andrew和Aspinall，2001)。
已有报道，通过给予IL-7，可增强消除T细胞的骨髓移植后小鼠的免疫恢复，这提示IL-7的产生可能是骨髓移植后调节T细胞重新生成的机制之一(Bolotin等，1996)。用ELISA对骨髓移植前后患者血清中IL-7水平的分析揭示了它与绝对淋巴细胞计数成反比(inverse relationship)(Bolotin等，1999)。测量HIV感染的儿科和成人患者的IL-7水平的研究也表明在IL-7和绝对CD4计数之间具有强的负相关性，而与CD3和CD8计数具有较弱但依旧显著的负相关性(Fry等，2001)。
循环的IL-7增加的机理仍不清楚，但有假设认为T细胞数目的减少导致IL-7受体可获量的减少，从而在IL-7产生不变的情况下增加游离IL-7的水平。也就是，与表达IL-7受体的淋巴细胞的结合(Bolotin等，1999)内环境稳定地(homeostatically)调节循环IL-7的水平。另一可能机制是通过T细胞和可产生IL-7的细胞的相互作用(通过可溶性介体(soluble mediator))或通过在淋巴微环境内直接接触，直接上调节IL-7以应答淋巴细胞减少症(“lymphopenia”)(Fry等，2001)。
正常IL-7水平在6月至5.5年龄的儿童中，IL-7的正常平均浓度为10.7±3.9pg/ml。在22.2至53.5年龄的成人中该平均值显著降低，为3.1±2.5pg/ml。因此有假设认为IL-7水平可由年龄决定，因为IL-7水平在不到1岁的婴儿中最高，在儿童和成人中则较低(Bolotin等，1999)。这也许支持以前的研究结果，即始于青春期的化疗和骨髓移植患者的胸腺生成(thymopoietic)能力随龄下降(Mackall等，1995；Weinberg等，1995)。并且，对老年小鼠骨髓基质的研究表明IL-7的分泌随龄下降(Stephan等，1998)。
根据本发明的具体实施例，在给予药剂(其阻断传向胸腺的性类固醇介导的信号)前后监测患者血或血清中的IL-7浓度。在给予药剂的2-3天内，较好24小时内，更好2-3小时内，IL-7浓度的升高表明胸腺正对性类固醇活性的阻断发生反应。定时检测IL-7浓度以确定胸腺随时间的激活水平。
2.血清胸腺因子(Facteur Thymique Serique(FTS))现已基本明确免疫系统和神经内分泌系统通过利用类似的配体和受体进行信号互相传递(cross-talk)。胸腺-下丘脑/垂体轴构成双向回路，其中向上反馈环是通过上皮源(epithelial origin)的胸腺因子起作用。除了调节肽激素和神经肽的释放，胸腺激素主要促进来自骨髓的祖细胞的表型成熟和调节成熟T细胞的功能(Ritter和Crispe，1992)。因此胸腺激素可能在很大范围的病理情况下发挥重要作用，包括免疫缺陷和神经内分泌疾病等。
FTS或胸腺肽是九肽类激素(nonapeptide hormone)，仅由胸腺被膜下(subcapsular)细胞和骨髓细胞(medullaru cells)分泌(Ritter和Crispe，1992)。不仅对早期和晚期T细胞分化和T细胞功能非常重要，FTS还诱导若干T细胞标记的表达，并促进T细胞功能，如同种异体细胞毒性、抑制性作用、和IL-2的产生(Ritter和Crispe，1992)。
儿童的FTS滴度(titers)随年龄逐渐上升，从几日龄的2.69±1.10到出生后数年的4.77±0.44，然后逐渐下降，于36岁时至0.66±0.26直到老年(Consolini等，2000)。由于胸腺受神经内分泌的生理调控，肽类激素和神经肽影响年龄相关的FTS水平的波动。前以提及，已知激素活力的破坏与年龄相关的胸腺萎缩相关(Consoloni等，2000)。特别是，青春期后随血清性类固醇水平的升高胸腺萎缩最为明显(Fabris等，1997)。此外生长激素可增强胸腺上皮细胞分泌FTS(Mocchegiani等，1990)。
已证明锌对细胞免疫非常重要(Prasad等，1998)，这不足为奇，因为FTS在与一分子锌结合(Zn-FTS)后而得到生物活化(Bach，1983)。由于随年龄增长锌更新(turnover)通常下降(Panerai和Sacerdote，1997)，因此可以设想老年时的低FTS水平可能与锌缺乏相关(Mocchegiani和Fabris，1995)。实际上，已发现对老年患者进行锌治疗可以恢复胸腺的分泌活力(Morcchegiani等，1990)。然而，体外研究中，向成年患者的血浆添加锌离子并没有恢复FTS的生物活力，这表明成年时FTS水平的下降更可能与胸腺活力的下降有关，而不是与锌缺乏有关(Consolini等，2000)。
在本发明的具体实施例中，在给予药剂(其阻断传向胸腺的性类固醇介导的信号)前后监测患者血或血清中的FTS浓度。在给予药剂的2-3天内，较好24小时内，更好2-3小时内，FTS浓度的升高表明胸腺正对性类固醇活性的阻断发生反应。定时检测FTS浓度以确定胸腺随时间的激活水平。
3.胸腺素和胸腺生成素与FTS在人类20岁后开始下降不同，胸腺素α-1和胸腺生成素的血清水平似乎早在10岁时就下降了(见综述，Bodey等，1997)。与在雄性大鼠中所观察到的结果类似，阉割看来可以增加胸腺素α-1和胸腺素β-4的血清水平(Windmill和Lee，1999)。
在本发明的具体实施例中，在给予药剂(其阻断传向胸腺的性类固醇介导的信号)前后，测量胸腺生成素、胸腺素α-1、胸腺素β-4、或其组合的浓度。在给予药剂的2-3天内，较好24小时内，更好2-3小时内，这些化合物的任何一种或其组合的浓度的升高表明胸腺正对性类固醇活性的阻断发生反应。定时检测这些化合物的任何一种或其组合的浓度以确定胸腺随时间的激活水平。
B.新鉴定的标记(identified markers)除了已知的胸腺激活的标记之外，基于本发明的方法，还鉴定和使用了几种其他的标记。
获得这些标记的步骤与其他已知的鉴定标记相类似。例如，可采用2D凝胶电泳并随不同时间监测不同斑点(spots)的强度(intensity)。通常该斑点对应于单一的蛋白，虽然偶尔会有两种或更多的不同蛋白的重叠或同时出现在一处。这些分子的鉴定是通过固相氨基酸测序而揭示。如此通过表达改变(增加或减少)(胸腺激活的结果)而鉴定的新的分子，可构成胸腺对降低性类固醇的反应的新的诊断试验(test)的基础。
T细胞分析监测T细胞的产生是可用来确定胸腺活化的另一种方法。很多技术，如外周全血的流式细胞分析、通过监测标记Ki67来探测增殖细胞、以及TREC分析，都是本领域技术人员已知的用于此类监测的方法。在本发明的具体实施例中，在给予药剂(其阻断传向胸腺的性类固醇介导的信号)前后，测定T细胞以及增殖T细胞的数目。在给予药剂的2-3天内，较好24小时内，更好2-3小时内，这些T细胞的任何一种或其组合的数目的升高表明胸腺正对性类固醇活性的阻断发生反应。定时监测这些T细胞的任何一种或其组合的浓度以确定胸腺随时间的激活水平。
小动物研究材料和方法动物CBA/CAH和C57B16/J雄性小鼠来源于Monash大学动物服务中心，并于常规条件下饲养。年龄为4-6周龄至26月龄，并在相关处标明。
阉割动物麻醉是通过腹腔注射0.3ml的0.3mg甲苯噻嗪(盐酸赛拉嗪，Bayer Australia公司，Botany NSW，澳大利亚)和溶于盐水的1.5mg盐酸氯胺酮(氯胺酮针剂；Parke-Dais公司，Caringbah，NSW，澳大利亚)。手术阉割经下述操作完成，阴囊切开、暴露睾丸、用缝线系住睾丸、然后随同包围的脂肪组织一同切除。
溴脱氧尿苷(BrdU)掺入小鼠接受腹腔注射BrdU(Sigma Chemical公司，St.Louis，密苏里州)(100mg/kg体重，于100μl PBS中)两次，期间间隔4小时。对照小鼠仅注射赋形剂。第二次注射后一小时，切下胸腺，或制备细胞悬液用于FACS分析，或立刻包埋于Tissue Tek(O.C.T.化合物，Miles公司，印第安纳)，在液氮中速冻，贮存于-70℃直至使用。
流式细胞计分析以CO2窒息处死小鼠，取下胸腺、脾和肠系膜淋巴结。器官在冷PBS/1％FCS/0.02％叠氮化物中以200μm轻轻过筛，离心(650g，5分钟，4℃)，重悬于任一PBS/FCS/叠氮化物中。脾细胞在红细胞裂解缓冲液(8.9g/升氯化铵)中4℃孵育10分钟，冲洗，重悬于PBS/FCS/叠氮化物中。细胞浓度和存活度用血球计数仪和溴乙锭/吖啶橙测定二次，并于荧光显微镜下观察(Axioskop公司，Carl Zeiss，Oberkochen，德国)。
为进行三色免疫荧光检测，将胸腺细胞用抗αβTCR-FITC或抗γδTCR-FITC、抗CD4-PE、和抗CD8-APC(均来自Pharmingen公司，圣地亚哥，加利福尼亚)进行常规标记，然后进行流式细胞仪分析。脾和淋巴结悬液用αβTCR-FITC/CD4-PE/CD8-APC或B220-B(Sigma公司) 连同CD4-PE和CD8-APC标记。B220-B用抗生蛋白链菌素三色共轭物(streptavidin-Tri_color conjugate)显色(购自Caltag实验室公司，Burlingame，加利福尼亚)。
为检测BrdU，细胞用CD4-PE和CD8-APC进行表面标记，随后进行固定和通透性处理，如先前所述(Carayon和Bord，1989)。简而言之，染色的细胞用1％PFA/0.01％吐温-20在4℃固定O/N。洗过的细胞37℃下在500μlDNA酶中孵育(100孔尼兹单位，Boehringer Mannheim公司，西德)30分钟，使DNA变性。最后，细胞用抗BrdU-FITC(Becton-Dickinson公司)孵育。
为进行4色免疫荧光检测，将胸腺细胞用CD-3、CD4、CD8、B22O、和Mac-1标记，用抗大鼠Ig-Cy5(Amersham公司，英国)共同检测，门化的负性细胞(TN)用以分析。对这些细胞继而用CD25-PE(Pharmingen公司)和CD44-B(Pharmingen公司)染色，接着用抗生蛋白链菌素三色共轭物(Caltag公司，加利福尼亚)显色，如前所述(Godfrey和Zlotnik，1993)。然后如前述方法检测BrdU。
样品用FacsCalibur(Becton-Dickinson公司)进行分析。存活的淋巴细胞根据0°和90°光散射图进行门化，并用细胞quest软件(Becton-Dickinson公司)分析数据。
免疫组化冰冻胸腺切片(4μm)用冷冻箱(Leica)切片，并迅速用100％丙酮固定。
为进行双色免疫荧光检测，切片用本实验室生产的一组单克隆抗体进行双标记MTS6、10、12、15、16、20、24、32、33、35、和44(Godfrey等，1990，表1)，并用多价兔抗细胞角蛋白抗体(Dako公司，Carpinteria，加利福尼亚)评估上皮细胞决定子(determinants)的共表达。结合的mAb用FITC偶联的绵羊抗大鼠Ig(Silenus实验室)显示，而抗细胞角蛋白用TRITC偶联的山羊抗兔Ig(Silenus实验室)显示。
为进行BrdU检测，将切片用抗细胞角蛋白继而用抗兔-TRITC或用特异的mAb染色，然后用抗大鼠Ig-Cγ3(Amersham公司)显示。BrdU检测如前述方法进行(Penit等，1996)。简而言之，切片用70％乙醇固定30分钟。半干切片孵育于4M盐酸中，在硼酸缓冲液(Sigma公司)中冲洗以中和，然后用PBS洗两次。用抗BrdU-FITC(Becton-Cickinson公司)检测BrdU。
为进行三色免疫荧光检测，切片用特异的MTS mAb和抗细胞角蛋白一起标记。BrdU检测如前述方法进行。
切片用莱卡(Leica)荧光显微镜和尼康(Nikon)共焦显微镜分析。
迁移研究动物麻醉是通过腹腔注射0.3ml含0.3mg甲苯噻嗪(盐酸赛拉嗪，Bayer Australia公司，Botany NSW，澳大利亚)和1.5mg盐酸氯胺酮(氯胺酮针剂；Parke-Dais公司，Caringbah，NSW，澳大利亚)于生理盐水。
FITC标记胸腺细胞的技术细节与其它地方描述的类似(Scollay等，1980；Berzins等，1998)。简而言之，暴露胸腺叶，并将每叶注射约10μm的350μg/ml FITC(在PBS中)。伤口用手术针缝合，保温小鼠直到从麻醉中完全苏醒。注射后约24h，小鼠以CO2窒息处死，取下淋巴器官用于分析。
细胞计数后，样品用抗CD4-PE和抗CD8-APC染色，然后用流式细胞计分析。迁移的细胞被认为是表达CD4或CD8的活的门化的(live-gated)FITC+细胞(以排除自身荧光细胞和双联体(doublets))。加入FITC+CD4和CD8细胞的百分率，分别得到淋巴结和脾的总迁移率。每日输出率用Berzins等(1998)的方法计算。
数据采用不配对t检验或非参数的曼-惠特尼检验进行分析，并用来确定对照和实验检验结果之间的统计显著性，实验至少重复3次。实验数值与对照数值差异的显著性表示如下*p≤0.05，**p≤0.01，***p≤0.001。
结果年龄对胸腺细胞群体的影响(i)胸腺重量和胸腺细胞数目随年龄增长，胸腺重量(图1A)和总胸腺细胞数目(图1B)都显著降低(p≤0.0001)。年轻成体的相对胸腺重量(mg胸腺/g体重)平均值为3.34，18-24月龄时则降至0.66(由于脂肪沉积无法精确计算)。胸腺重量的下降可归因于胸腺细胞总数的降低1-2月的胸腺含有约6.7×107胸腺细胞，而到24月时细胞数则降至约4.5×106。阉割使得性类固醇对胸腺的作用消除，于是胸腺再生，阉割4周后，胸腺在重量和细胞数量上都与年轻成体的胸腺相当(图1A和1B)。有趣的是，阉割后2周胸腺细胞数(约1.2×108)有明显的升高(p≤0.001)，并于阉割后4周回复到正常年轻体的水平(图1B)。
胸腺产生T细胞数目的下降并不反映在外周，其中脾细胞数目随年龄变化保持恒定(图2A)。外周的内环境稳定机制是很明显的，因为不论年龄改变还是随之而来的到达外周的T细胞数目下降，脾和淋巴结中的B细胞与T细胞的比例都不受影响(图2B)。然而，CD4+对CD8+T细胞的比例随年龄增长显著降低(p≤0.001)，该比例在2月龄时为2∶1，而在2岁时该比例为1∶1(图2C)。阉割和随之到达外周的T细胞数目增加后，未见外周T细胞数目的改变脾T细胞数和脾、淋巴结中B∶T细胞比例都没有因阉割而改变(图2A和B)。阉割后2周，随年龄增长导致的外周中CD4对CD8比例的降低依然明显，但阉割后4周被完全逆转(图2C)。
(ii)αβTCR、γδTCR、CD4和CD8表达为确定随年龄增长胸腺细胞数目的下降是否是特定的细胞群体减少所产生的效果，将胸腺细胞用特定标记物进行标记，以对不同的亚群进行分析。而且，这样也可以研究阉割后胸腺重驻的动力学。将主要胸腺细胞亚群的比例与正常年轻胸腺进行比较(图3)，发现其随年龄增长保持恒定。此外，将胸腺细胞按表达αβTCR和γδTCR进行细分，这些群体的比率随年龄并无变化(数据未显示)。阉割后2周和4周时，胸腺细胞亚群依旧保持同样的比例，由于阉割后胸腺细胞数目增加至100倍，这表明所有胸腺细胞亚群的同步扩大，而并非进化式的逐步扩增。
因此这种老年动物胸腺中细胞数目的减少看来是所有细胞表型均衡减少的结果，而未见T细胞群体的显著改变。胸腺以同步方式再生，同时补充所有T细胞亚群，而不是依次地补充。
胸腺细胞的增殖如图4所示，在4-6周龄时，15-20％的胸腺细胞正在增殖。大部分(约80％)是DP，其次是TN(约6％)(图5A)。相应地，通过免疫组化(immunohistology)，大多数细胞分裂见于被膜下和皮质(数据未显示)。用FACS分析可在髓质区见到一些细胞分裂，显示部分SP细胞(9％的CD4T细胞，25％的CD8T细胞)分裂(图5B)。
虽然在老年的胸腺中细胞数目显著下降，胸腺细胞依旧保存持续增殖，在2岁时降至12-15％(图4)，同时增殖群体的表型与2月龄时的胸腺相类似(图5A)。免疫组化表明1岁时的细胞分裂反映年轻成体的情况；而在2岁时，增殖主要见于外层皮质和维管结构周围(数据未显示)。阉割后2周，虽然胸腺细胞数目显著升高，增殖的胸腺细胞的比例无变化，再次表明细胞的同步扩增(图4)。免疫组织学显示阉割后2周胸腺细胞增殖的定位和分裂细胞的范围与2月龄胸腺的情况类似(数据未显示)。分析代表增殖群体的每一亚群的比例时，增殖群体中的CD8T细胞百分比有显著的升高(p＜0.01)(2月龄和2岁时1％，阉割后2周升至约6％)(图5A)。
图5B表示年轻、老年、和阉割小鼠中各亚群的增殖范围。DN亚群的增殖有显著(p≤0.001)的衰退(2月龄时的35％降至2岁时的4％)。CD8+T细胞的增殖也显著下降(p≤0.001)，反映了免疫组化的结果(数据未显示)，即在老年胸腺的髓质中未见明显细胞分裂。阉割后4周，DN增殖的下降未恢复到正常年轻水平。然而，阉割后2周CD8+T细胞亚群的增殖显著升高(p≤0.001)，并于阉割后4周恢复到正常年轻水平。
用CD44和CD25标记进一步对DN亚群中的增殖下降进行分析。DN亚群中除已含胸腺细胞前体外还包含αβTCR+CD4-CD8胸腺细胞，后者被认为下调向SP细胞转换的两种共同受体(co-receptor)(Godfrey和Zlotnik，1993)。通过对这些成熟细胞进行门化(gating)，便可以分析真正的TN区室(compartment)(CD3-CD4-CD8-)，这些随年龄或阉割在增殖率上没有表现出差别(图5C)。然而，对表达CD44和CD25的亚群进行分析，表明TN1亚群(CD44+CD25-)的增殖明显下降(p＜0.001)，从正常年轻时的20％降至18月龄时的约6％(图5D)，其在阉割后4周恢复。TN1亚群增殖的下降被TN2亚群(CD44+CD25+)增殖的显著升高(p≤0.001)所补偿，后者在阉割后2周恢复到正常年轻水平(图5D)。
年龄对胸腺微环境的影响用免疫荧光法检测胸腺微环境髓龄变化，采用MTS系列的很大范围的Mabs，用抗细胞角质素多克隆抗体双标记。
被这些单克隆抗体(MAbs)识别的抗原可分为3组胸腺上皮亚群，血管相关抗原，和在基质细胞和胸腺细胞上都存在的抗原。
(i)上皮细胞抗原2岁小鼠胸腺的抗角蛋白染色(泛内皮)，表明总体胸腺结构的丧失，伴随严重的上皮细胞无序化和明显的皮质-髓质连接的缺少。进一步用单克隆抗体MTS10(髓质)和MTS44(皮质)进行分析，表明皮质大小随年龄显著减少，而髓质上皮则不呈此显著减少(数据未显示)。无上皮细胞区域，或角蛋白阴性区域(KNA’S，vanEwijk等，1980；Godfrey等，1990；Bruijntjes等，1993)在老年胸腺中更为明显，并增大，如抗细胞角蛋白标记所见。在老年胸腺中亦见胸腺上皮“囊样”结构，尤其在髓质区更明显(数据未显示)。通过抗细胞角蛋白染色，明确表明脂肪沉积、胸腺体积的严重缩小以及皮质-髓质连接完整性的下降(数据未显示)。阉割后2周胸腺开始再生。这表现在胸腺叶的大小、皮质上皮用MTS44显示的增多、以及髓质上皮的定位。髓质上皮用MTS10检测，在2周时，仍有用MTS10染色的副囊(subpockets)，分散于皮质中。阉割后4周，便有清楚的髓质、皮质、和可分辨的皮质-髓质连接(数据未显示)。
标记MTS20和24被认为可用来检测原生上皮细胞(primordialepithelial cells)(Godfrey，等，1990)，并进一步显示了老年胸腺的退化。这些分子在E14大量存在，在4-6周时检测到孤立的髓质上皮细胞群，但在老年胸腺中密度再次增加(数据未显示)。阉割后，所有这些抗原都以相当于年轻成体胸腺的水平表达(数据未显示)，并且MTS20和MTS24恢复到位于皮质-髓质连接区的分散的副囊(subpockets)中。
(ii)血管相关抗原血-胸腺屏障被认为负责T细胞前体向胸腺的迁移，以及成熟T细胞从胸腺向外周的迁移。
MAb MTS15是胸腺血管内皮特异的，呈现出颗粒状、弥散的染色图像(Godfrey等，1990)。在老年胸腺中，MTS15的表达显著升高，反映出血管和血管周围间隙的增多和体积的增大(数据未显示)。
胸腺胞外基质包含重要的结构和细胞黏附分子，例如胶原蛋白、层黏连蛋白、和血纤蛋白原，可用mAb MTS16检测。MTS16表达在正常年轻胸腺中较分散，而在老年胸腺中变得更为扩散并彼此相连。在阉割后2周MTS16的表达进一步升高，而在阉割后4周这种表达反映的状况类似于2月龄胸腺(数据未显示)。
(iii)共有抗原用MAb MTS6检测的正常年轻胸腺中的MHC II表达在皮质上皮中呈强阳性(颗粒)(Godfrey等，1990)，髓质上皮则染色较弱。老年胸腺显示MHC II表达的降低，而在阉割后2周表达明显升高。阉割后4周，表达再次下降并似乎与2月龄胸腺类似(数据未显示)。
胸腺细胞迁出在年轻小鼠中每天约有1％的T细胞迁出胸腺(Scollay等，1980)。我们发现14月龄的正常年轻小鼠和甚至2岁的小鼠，其迁移细胞的比例与正常年轻小鼠相当(图5)，虽然数目显著下降(p≤0.0001)。新近迁出的胸腺细胞中CD4∶CD8比例有所升高，从2个月时的约3∶1升到26个月时的约7∶1。阉割后1周，迁移至外周的细胞数目显著增加，而总迁移率仍保持1-1.5％。
实施例实施例1T细胞消除为消除异常T细胞，对患者实施T细胞消除。这一步的常规步骤如下患者接受抗T细胞抗体注射，每日15mg/kg抗胸腺细胞丙种(Atgam)(异种抗T细胞球蛋白，Pharmcia Upjohn公司)10天，与T细胞活化抑制剂环孢素A(3mg/kg)联合用药，连续输液3-4周，之后(如果需要的话)以每日9mg/kg的剂量服用片剂。这种治疗不影响患者胸腺中的早期T细胞发育，因为由于人类胸腺的大小和结构，不能给予具有此种效果所需的抗体剂量。这种治疗维持约4-6周，以使性类固醇丧失并随后再生胸腺。T细胞反应活性的抑制可与第二水平信号抑制剂(如白介素或细胞黏附分子)一起施用，以增强T细胞消融。
因为在很多情况下，不可能仅减少导致疾病的抗原特异的T细胞，所以要去除整个T细胞群体，包括病理性T细胞。这种外周T细胞的消除显著延缓了疾病。然而，与此同时，由于缺少T细胞，这将诱导全身性(generalized)免疫缺陷状态，这意味着患者对感染、尤其是病毒感染高度敏感。在缺乏适当的T细胞帮助的条件下，甚至B细胞应答也不能正常进行。
实施例2性类固醇消融治疗采用对患者施用LHRH激动剂的方式进行性类固醇消融治疗。以Leucrin(长效制剂注射；22.5mg或醋酸性瑞林(内植体，10.8mg)的形式给药，任何一种单剂药效持续3个月。这可有效降低性类固醇的水平，从而足以重新激活胸腺。在某些情况下，也需要在整个性类固醇消融治疗过程中施用抑制肾上腺产生性类固醇的抑制剂，如每天服用一片Cosudex(5mg/天)。肾上腺产生的性类固醇占人体类固醇的约10-15％。
将血中性类固醇降至最低值约需要1-3周，与之相对应的是胸腺的重新激活。在某些情况下，需要延长治疗至第二个3个月的注射/内植体疗程。
实施例3其他给药方式可采用其它方法来替代3个月的长效制剂注射或灌输LHRH激动剂的给药方法。在一个实施例中，患者的皮肤可用激光器(如铒钇铝石榴石激光器)进行辐照，来消融或蚀变皮肤，从而减少角质层的阻碍效应(impeding effect)。
A.激光消融或蚀变红外激光辐射脉冲是由固态的、脉冲铒钇铝石榴石激光器产生，该激光器由如下部分组成两个平面共振腔反射镜(flat resonator mirrors)、作为激活介质的铒钇铝石榴石晶体、电源、和聚焦激光束的方式。激光束的波长为2.94微米。采用单脉冲。
操作参数如下每个脉冲能量为40、80、或120mJ，焦点的光束大小为2mm，产生的能注量为1.27、2.55、或3.82J/cm2。脉冲时间宽度为300μs，产生的能注量率(energy fluence rate)为0.42、0.85、或1.27×104W/cm2。
然后，一定量的LHRH激动剂敷于皮肤并分散于辐照部位。该LHRH激动剂的形式可以是药膏，这样它能够保持在辐照部位。可选地，封闭贴片(occlusive patch)可置于激动剂上，从而使其保持于辐照部位上。
可选地，使用分束器，来分裂激光束，从而产生多个部位的消融或蚀变。这使得LHRH激动剂经皮肤进入血流的速度更快。可预先确定部位的数目，以使患者体内的激动剂能保持所需要的时间。
B.压力波一定剂量的LHRH激动剂被置于适合的容器(如可变形的塑料垫圈(washer)(直径大约1英寸(25.4mm)，厚度大约1/16英寸(1.5875mm))内，并放于要产生压力波的皮肤处。该部位的皮肤用靶材料(如大约1mm厚的黑色聚苯乙烯片)覆盖。用Q开关固态红宝石激光器(脉冲持续20ns，每个脉冲产能达2焦耳)来产生激光束，后者击中靶材料而产生单脉冲瞬态。黑色聚苯乙烯靶材料完全吸收激光辐射，所以皮肤仅暴露于脉冲瞬态，而不会暴露于激光辐射。此过程不会引起疼痛。这种操作可每天重复，或按需要掌握频度，以保持循环血中激动剂的浓度。
实施例4样品采集在给予所选患者LHRH类似物(以抑制性类固醇产生)之前立即采集血样，并在给予LHRH类似物之后的短时间间隔(一般在开始的24-72小时内)采集血样。离心(750gav)血液以沉淀细胞，并收集血清。通过分析特定胸腺标记分子的浓度来比较血清样本。
实施例5外周全血的流式细胞仪分析将20μl适当抗体混合物加入200μl全血中，并室温避光孵育30分钟。为除去RBC(红细胞)，每管加入2ml FACS裂解缓冲液(Becton-Dickinson公司，美国)，涡旋振荡，并室温避光孵育10分钟。样品以600gmax离心，弃上清，用FACS缓冲液洗细胞两次。最后，细胞重悬于1％PFA中供FACS分析。
实施例6Ki67分析为检测增殖中的细胞，裂解后的样品于500μl的1×FACS渗透液(Becton-Dickinson公司，美国)中避光室温孵育20分钟。洗过的样品用抗Ki67-PE或抗Ki67-FITC(或适当的同型对照物)避光室温孵育30分钟。然后冲洗样品并重悬于1％PFA中以供分析。
抗体混合液1.CD27/CD45RA/CD45RO/CD4或CD82.CD62L/CD45RA/CD45RO/CD4或CD83.γδTCR/αβTCR/CD28/CD4或CD84.CD69/CD25/CD152/CD35.CD11b/CD11c/CD56/CD36.CD19/CD117/CD34/CD37.CD3/CD4/CD8/HLA-DR
8.为Ki67使用a)CD4或CD8/CD45RO/CD27续以Ki67-PE或IgG1-PEb)αβTCR/CD8a/CD8b续以Ki67-FITC或IgG1-PE实施例7胞内细胞因子的检测用可溶的纯化抗CD3(5μg/ml)和抗CD28(10μg/ml)对200μl全血刺激6小时，37℃，5％CO2。最后的4小时中加入布雷菲德菌素A(终浓度10μg/ml)以限制活化细胞的细胞因子分泌。刺激后，样品用20μl的20mM EDTA(在PBS中)室温孵育15分钟。样品随后用抗CD4-FITC和抗CD8-CyChrome进行表面染色。经过裂解和透化，细胞用抗IL-4-PE和抗IFN γ-APC或适当的同型对照物进行染色。未刺激细胞用作活化的对照。
实施例8PBMC的制备纯的淋巴细胞用于T细胞刺激测定和TREC分析。10-50ml外周血用RPMI-肝素以1∶1稀释。将稀释后的血小心地铺于聚蔗糖-海帕克(ficoll-hypaque)上，血聚蔗糖的比例为2∶1。试管于室温下离心(800gmax)25分钟。离心后，移去血浆层并贮存于-20℃以供分析性类固醇水平。血沉棕黄层移出后，以RPMI-肝素稀释。试管于25℃离心(600gmax)15分钟，然后在400gmax第二次冲洗10分钟。弃上清，用血球计数器进行细胞计数两次。不用于刺激测定的细胞重悬于冻存液，-70℃放置过夜，然后转入液氮用于后面的TREC分析。在分析性类固醇水平之前，把聚蔗糖纯化后收集的血浆贮存于-20℃。
实施例9T淋巴细胞激活分析为进行有丝分裂原(mitogen)刺激研究，PBMC以1×105/孔(在100μl的RPMI-FCS中)的密度接种至96孔圆底培养板。细胞用剂量为1-10μg/ml的PHA孵育，条件为37℃，5％CO2。为研究TCR特异的激活，细胞孵育于预先包被了纯抗CD3(1-10μg/ml)和抗CD28(10μg/ml)抗体的平板上48小时。空斑(plaque)形成(48-72小时)后，每孔加入1μCi的3H胸苷，平板再孵育16-24小时。滤网(filter mats)收集后，用β计数仪(Packard-coulter公司，美国)上液体闪烁计数确定掺入的3H胸苷。
实施例10TREC分析TRECs的检测是通过纯化新的辅助T细胞(Th；例如，CD4+、CD45RA+CD27+)和细胞毒T细胞(Tc；例如，CD8+、CD45RA+CD27+)(借助流式细胞仪)来进行，然后用特异的DNA探针和RT-PCR分析TREC。
A.细胞分拣冻存的样本快速解冻，以含有1mM EDTA和1％人血清的FACS缓冲液洗后离心(600gmax，15分钟，4℃)。细胞用抗CD4-FITC、抗CD3-APC、和抗CD45RA-PE室温孵育30分钟，洗后通过滴加1ml的3％甲醛水(在PBS中)进行固定。样品再孵育30分钟，洗后重悬于500μl FACS缓冲液中用以分拣。得到4个群体CD3+CD4+CD45RA+；CD3+CD4+CD45RA-；CD3+CD4-CD45RA+；和CD3+CD4-CD45RA-。
B.DNA分离把细胞直接分到PCR级的0.5ml eppendorfs管中，离心(8分钟，2500gmax)，然后重悬于蛋白酶K(PK)消化缓冲液中(2×105细胞/20μl的0.8mg/mL溶液)。蛋白酶K(PK)在用前才加入PCR消化缓冲液中。样品于56℃孵育1小时，然后于95℃孵育10分钟，以灭活蛋白酶。裂解样本在RT-PCR之前贮存于-70℃。
C.利用分子信标(Molecular Beacons)进行实时PCRZhang等(1999)对该技术进行了描述。信号连结TRECs的引物为5-AAAGAGGGCAGCCCTCTCCAAGGCAAA-3’(SEQ IDNO1)和5’-AGGCTGATCTTGTCTGACATTTGCTCCG-3’(SEQ ID NO2)。编码连接TRECs的引物为5-CCTGTTTGTTAGGGCACATTAGAATCTCTCACTG-3’(SEQ IDNO3)和5’-CTAATAATAAGATCCTCAAGGGTCGAGACTGTC-3’(SEQ ID NO4)。用蛋白酶K消化从细胞中提取DNA。PCR条件为95℃，5分钟，然后是每个循环90℃、60℃、和72℃，各30s，30或35个循环如具体所示。每个PCR反应在50μl铂Taq缓冲液中包括1单位铂(platinum)Taq聚合酶、1.8mM MgCl2、0.2mM dNTPs、各种引物12.5μM、和1.7nmol(5μCi)32P-标记的dCTP。
实施例11放射免疫测定运用125I-睾酮放射免疫测定(RIA)检测患者血清(聚蔗糖-海帕克离心后冻存)中的性类固醇水平。测定前，所有试剂、样品、和对照物都放至室温。对照试管仅加缓冲液-非特异结合(NSB)管或为0ng/ml睾酮标准样(B0)。只有缓冲液、标准样(0-10ng/ml睾酮)、或测试样品加到各自的试管中，然后添加性结合球蛋白抑制剂(SGBI)以限制放射标记睾酮的非特异结合。每管中加入125I-睾酮后，加入抗睾酮抗体(NSB管除外)。然后将试管于37℃孵育2h。之后，在所有试管中添加二抗，试管经涡旋振荡后再孵育60分钟。试管离心(1000gmax)15分钟，弃上清，沉淀物在PackardCobra自动-γ计数仪上计数。3次cpm(每分钟计数)结果取平均值，并用结合睾酮百分率(B/B0)的计算式建立标准曲线 样品＝特定测试样品的平均cpmNSB＝非特异结合管的平均cpmB0＝0ng/ml标准样(总结合管)的平均cpm每个测试样品的睾酮水平由标准曲线确定。血清进行蛋白分析，用2D凝胶电泳后用计算机为基础的生物信息学来确定胸腺功能指示物的存在。
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权利要求
1.确定患者胸腺对通过阻断传向所述胸腺的性类固醇信号而活化的敏感性的方法。
2.根据权利要求1所述的方法，其中阻断传向所述胸腺的所述性类固醇信号的所述方法是通过手术阉割以切除所述患者的性腺。
3.根据权利要求1所述的方法，其中阻断传向所述胸腺的所述性类固醇信号的所述方法是通过给予一种或多种药物。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述药物是选自由LHRH类似物、抗LHRH受体抗体、抗LHRH疫苗、及其组合组成的组。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述LHRH类似物是选自LHRH激动剂和LHRH拮抗剂。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述LHRH类似物是选自由氟他胺、戈舍瑞林、亮丙立德、Dioxalan衍生物、曲普瑞林、美替瑞林、布舍瑞林、组氨瑞林、那法瑞林、黄体瑞林、亮丙瑞林、地洛瑞林、阿巴瑞克、西曲瑞克、醋酸性瑞林、和醋酸亮丙瑞林组成的组。
7.根据权利要求3所述的方法，其中所述患者的胸腺已至少部分失活。
8.根据权利要求3所述的方法，其中所述患者是青春期后的。
9.根据权利要求5所述的方法，其中所述LHRH拮抗剂是快速反应LHRH拮抗剂。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述LHRH拮抗剂是选自由阿巴瑞克和西曲瑞克组成的组。
11.根据权利要求4所述的方法，其中所述降低是通过给予一种或多种LHRH激动剂和一种或多种LHRH拮抗剂而诱导的。
12.根据权利要求1所述的方法，包括监测所述患者血和/或血浆中一种或多种胸腺生成细胞因子浓度的步骤。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述细胞因子是白介素-7。
14.根据权利要求12所述的方法，包括以下步骤a.在所述阻断之前从患者获得血样；b.在所述阻断之后从患者至少获得一个血样；c.测量每一样品中胸腺生成细胞因子的含量；以及d.相互比较在所述样品中胸腺生成细胞因子的含量，以致在阻断后在所述患者中胸腺生成细胞因子的早期增加表明所述患者胸腺的活化。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述增加发生在阻断后约1周内。
16.根据权利要求14所述的方法，其中所述增加发生在阻断后约4至5天内。
17.根据权利要求14所述的方法，其中所述增加发生在阻断后约2至3天内。
18.根据权利要求14所述的方法，其中所述增加发生在阻断后约24小时内。
19.根据权利要求1所述的方法，包括监测所述患者血和/或血浆中一种或多种胸腺生成激素浓度的步骤。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述激素是选自由胸腺素、胸腺肽、和FTS组成的组。
21.根据权利要求19所述的方法，包括以下步骤a.在所述阻断之前从患者获得血样；b.在所述阻断之后从患者至少获得一个血样；c.测量每一样品中胸腺生成激素的含量；以及d.相互比较在所述样品中胸腺生成激素的含量，在阻断后在所述患者中胸腺生成激素的增加表明所述患者胸腺的活化。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述增加发生在阻断后约1周内。
23.根据权利要求21所述的方法，其中所述增加发生在阻断后约4至5天内。
24.根据权利要求21所述的方法，其中所述增加发生在阻断后约2至3天内。
25.根据权利要求21所述的方法，其中所述增加发生在阻断后约24小时内。
26.鉴定胸腺因子的方法，包括以下步骤a)从患者获得血样；b)阻断传向所述患者胸腺的性类固醇介导的信号；c)在阻断之后从所述患者至少获得一个血样；d)对每个样品进行蛋白分析；e)鉴定新的蛋白，所述新的蛋白出现在阻断之后所采集的样品中而在阻断之前所采集的样品中浓度很小或不存在。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述血样经处理以分离血浆，并对所述血浆样本进行分析。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述血浆样本要进行两维凝胶电泳。
29.根据权利要求1所述的方法，包括监测所述患者血中新T细胞产生的步骤。
30.根据权利要求29所述的方法，其中新T细胞的所述产生是通过检测在这些细胞中TRECs的存在加以监测。
31.根据权利要求30所述的方法，包括以下步骤a)在抑制前后采集所述患者的血样；b)分拣样本中的细胞以获得T细胞的放大群体；c)分离所述样本中所述细胞的DNA；以及d)用TRECs特异的引物对所述分离的DNA进行PCR。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述PCR引物是选自由DNA SEQ ID NO1、DNA SEQ ID NO2、DNA SEQ ID NO3、和DNA SEQ ID NO4组成的组。
33.根据权利要求31所述的方法，其中在抑制后TRECs的增加表明胸腺活化。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述增加发生在阻断后约1周内。
35.根据权利要求33所述的方法，其中所述增加发生在阻断后约4至5天内。
36.根据权利要求33所述的方法，其中所述增加发生在阻断后约2至3天内。
37.根据权利要求33所述的方法，其中所述增加发生在阻断后约24小时内。
全文摘要
本发明提供确定是否可以通过激活胸腺功能来改变患者免疫系统的方法。在优选的具体实施例中，患者的性类固醇被消除，并且监测由此导致的胸腺因子的产生。特别是对患者血流中这些因子的水平进行观察。在另一个具体实施例中，对新生T细胞水平进行监测。早期反应，例如发生在消除后几小时或几天之内，表明患者的胸腺有因性类固醇消除而再生的倾向。
文档编号A61K38/24GK1516597SQ01820151
公开日2004年7月28日 申请日期2001年10月12日 优先权日2000年10月13日
发明者理查德·博伊德, 理查德 博伊德 申请人:莫纳什大学