对雌性动物施用核酸序列的制作方法

专利名称：对雌性动物施用核酸序列的制作方法
技术领域：
本发明一般涉及内分泌学、医学和细胞生物学。更具体而言，本发明涉及生长和表现的改善；在动物中刺激生长激素的生产，其比正常生长相关的水平更高；和利用在雌性动物中施用编码生长激素释放激素的DNA以增强生长。此外，本发明涉及将增强生长的核苷酸序列应用于肌肉组织，例如由肌肉特异性启动子调节的生长激素释放激素或类似物，特别是用电穿孔的技术。
背景技术：
生长激素(GH)生产途径包含一系列其产物是生长所必需的相互依赖的基因。该GH途径的基因包括(1)配体，如GH和胰岛素样生长因子-I(IGF-I)；(2)转录因子如pit-1的前体(prophet)或prop-1和pit-1；(3)激动剂和拮抗剂，分别如生长激素释放激素(GHRH)和促生长素抑制素；和(4)受体，如GHRH受体(GHRH-R)和GH受体(GH-R)。这些基因在不同器官和组织中表达，包括下丘脑、垂体、肝和骨骼。GH途径的有效和受调节的表达对于最佳线性生长以及糖类、蛋白质和脂肪代谢的稳态很关键。GH的合成和从垂体前叶分泌由GHRH刺激并由促生长素抑制素抑制，两者均为下丘脑激素。GH在控制人和其他脊椎动物的躯体生长中的中心作用，以及调节GH从垂体分泌的生理学相关途径是众所周知的。GH主要在肝中且也在其他目标器官中增加了IGF-I的生产。反过来，IGF-I和GH反馈到下丘脑和垂体以抑制GHRH和GH的释放。GH对外周组织具有直接和间接的两种作用，其直接作用主要由IGF-I介导。在儿童和成年人中均有广泛的临床状况谱，其中线性生长(青春期前的患者)或机体组分都受到损害，且这些状况响应GH或GHRH治疗。在一切情况下GHRH-GH-IGF-I轴都有功能，但由于各种可能的原因不必然以最适敏感性和反应性进行作用。儿童中GH缺乏的主要特征是身材矮小。由在GH轴的不同点的遗传缺陷可产生相似的表型(Parks等人，1995)，以及非GH缺乏的身材矮小。非GH缺乏具有不同的病因学，如(1)遗传疾病，特纳(Turner)综合症(Jacobs等人，1990；Skuse等人，1999)，软骨发育不良(Tanaka等人，1998；Key和Gross，1996)和克罗恩疾病(Savage等人，1999)；和(2)宫内生长阻滞(Albanese和Stanhope，1997；Azcona等人，1998)；和(3)慢性肾机能不全(Sohmiya等人，1998；Benfield和Kohaut，1997)。其中GH轴未受影响的病例(即具有正常激素、基因和受体的患者)占所有生长阻滞病例的超过50％。在这些病例中，已显示GHRH或GH治疗是有效的(Gesundheit和Alexander，1995)。从垂体前叶减少GH分泌导致从25岁到衰老过程中骨骼肌质量的损失。GHRH-GH-IGF-I轴在衰老过程中和在年长者中经历显著的变化(D’Costa等人，1993)随着降低的GH生产率和GH半衰期、IGF-I对GH和GHRH刺激降低的反应性导致骨骼肌质量的损失(sacropenia)、骨质疏松症和脂肪增加及瘦体重的降低(Bartke，1998)。前面的研究已显示在极大数目的正常年长者人中，血清中GH和IGFs的水平相对于他们青少年时的水平显著地减少了70-80％(Corpas等人，1993；Iranmanesh等人，1991)。已说明sacropenia的发展可由GH治疗来弥补。然而，因为其成本和频繁的副作用，这在年长者中仍然是有争议的治疗。重组蛋白质的生产提供了治疗这些状况的有用工具。尽管GH替换治疗广泛用于具有生长缺乏的患者并提供了满意的生长，且对治疗的儿童可能具有积极的心理学作用(Rosenbaum和Saigal，1996；，Erling，1999)，但是该治疗具有几个缺点，包括需要不切实际的频繁施用GH(Monti等人，1997；Heptulla等人，1997)和不合需要的次级效应(Blethen等人，1996；Watkins，1996；Shalet等人，1997；Allen等人，1997)。已经很好地确定，作为成熟的肽或截短的分子的头颅外分泌的GHRH(如与胰岛细胞瘤和定位于不同位置的类癌中所看到的)经常具有生物学活性并甚至可产生肢端巨大症(Esch等人，1982；Thorner等人，1984)。将重组的GHRH施用于GH-缺乏的儿童或成年人增加了IGF-I的水平、相对于GHRH的剂量按比例增加了GH的分泌，但仍然引起了对GHRH大剂量的反应(Bercu和Walker，1997)。因而，GHRH施用代表了增加低于正常的GH和IGF-I水平的另一种生理学选择(Corpas等人，1993)。尽管GHRH蛋白质治疗导致并刺激了正常的循环GH分泌而实际上无副作用，但体内GHRH短的半衰期需要频繁的(每天1-3次)静脉内、皮下或鼻内(需要高300-倍的剂量)的施用。因而，作为慢性治疗，GHRH施用不切实际。然而，头颅外分泌的GHRH，作为加工的蛋白质种类(Tyr1-40或Tyr1-Leu44)或甚至作为更短的截短分子，具有生物学活性(Thorner等人，1984)。重要的是，在血液供应中低水平的GHRH(100pg/ml)可刺激GH分泌(Corpas等人，1993)并使得GHRH成为基因治疗性表达的极好的候选物。目前直接质粒DNA基因转移是许多新兴基因治疗策略的基础，并且这样不需要病毒基因或脂质颗粒(Muramatsu等人，1998；Aihara和Miyazaki，1998)。骨骼肌是优选目标组织，因为肌纤维具有长的寿命且可由在免疫活性宿主中经年累月表达的环状DNA质粒转导(Davis等人，1993；Tripathy等人，1996)。前面的报道说明人GHRH cDNA在鼠中可通过注射型生肌表达载体而递送入肌肉，在那里它在2个星期的时期内将GH分泌短暂地刺激到适当的程度(Draghia-Akli等人，1997)。野生型GHRH在人(Frohman等人，1984)和农场动物两者的循环系统中均具有相对短的半衰期。在血浆中温育60分钟后，95％的GHRH(1-44)NH2被降解，而在相似条件下温育较短的(1-40)OH形式的激素时，60分钟的温育后显示只有77％的肽的降解(Frohman等人，1989)。在基因治疗载体中结合编码特殊蛋白酶-抗性GHRH类似物的cDNA导致具有更长的血清半衰期、增加效能的分子，并在质粒注射的动物中提供了更大的GH释放(Draghia-Akli等人，1999；此处引用作为参考)。经由对蛋白酶敏感性氨基酸的氨基酸替代的突变延长了hGHRH分子的血清半衰期。此外，GHRH生物学活性的增强通过使用超活性的类似物而达到，该类似物可增加其对特定受体的结合力(Draghia-Akli等人，1999)。已颁发的专利陈述了以增加生长激素释放为目的而施用新型GHRH类似物蛋白质(美国专利No.5,847,066；5,846,936；5,792,747；5,776,901；5,696,089；5,486,505；5,137,872；5,084,442；5,036,045；5,023,322；4,839,344；4,410,512；RE33,699)或合成的或天然存在的GHRH肽片段(美国专利No.4,833,166；4,228,158；4,228,156；4,226,857；4,224,316；4,223,021；4,223,020；4,223,019)。已报道了含有如下突变的GHRH类似物(美国专利No.5,846,936)位置1的Tyr变为His；位置2的Ala变为Val、Leu或其他；位置8的Asn变为Gln、Ser或Thr；位置15的Gly变为Ala或Leu；位置27的Met变为Nle或Leu；和位置28的Ser变为Asn。作为美国专利申请系列No.60/145,624的主题且在此处引用作为参考的GHRH类似物不含有在美国专利No.5,846,936中报道的活性所必需的所有氨基酸替代。美国专利申请序列No.60/145,624的发明与美国专利No.5,756,264在2个方面不同。首先，美国专利申请序列No.60/145,624的发明涉及一种生长激素释放激素的类似物，该类似物以显著的修饰而与野生型不同，这些修饰改善了其作为GH促分泌素的功能对蛋白酶的易感性降低和增加的稳定性，这将延长其起治疗作用的能力，并增加生物学活性，后者将增强起治疗作用的能力。美国专利申请系列No.60/145,624的类似物缺乏存在于美国专利No.5,756,264的GHRH类似物中位置8向Gln、Ser或Thr的替代。此外，在美国专利申请序列No.60/145,624的发明的一个方面，该发明利用编码结合唯一的合成启动子上的GHRH类似物的DNA，该启动子称为SPc5-12(Li等人，1999)，它含有来自骨骼α-肌动蛋白的近侧血清反应元件(SRE)、多重MEF-2位点、MEF-1位点和TEF-1结合位点，并大大地超过天然生肌启动子的转录能力。这样的合成启动子的唯一性是对已颁发的专利如涉及生肌启动子及其用途(例如美国专利No.5,374,544)或核酸序列的生肌表达系统(例如美国专利No.5,298,422)的显著改善。美国专利No.5,061,690通过向怀孕的雌性哺乳动物提供10-20天有效量的hGRF或其一种类似物而直接针对增加出生重量和乳汁生产。对类似物的应用贯穿于泌乳期。然而，介绍的是多重施用，且没有关于以DNA分子形式施用生长激素释放激素(或因子)的公开内容，如与基因治疗技术相关的。美国专利No.5,134,120和5,292,721相似地未提供关于以DNA形式施用生长激素释放激素的教导。此外，这些专利专门涉及在妊娠的最后2个星期和出生后的3个星期中多重施用重组蛋白质GH。同样，未提供关于任何非野生型的讨论，如在本发明中所提供的。向农场动物施用生长激素(GH)在增加了饲养效率同时增强了瘦肉组织积累和/或乳汁生产(Etherton等人，1986；Klindt等人，1998)。许多研究已显示GH显著地减少了畜体脂肪量；且随后产品的质量增加了。然而，慢性的GH施用具有实际的和生理学的局限而潜在地减弱其有用性和有效性(Chung等人，1985；Gopinath和Etherton，1989)。根据实验，将GH-释放激素(GHRH)用作另一种生理学选择。对于大的物种如猪或牛，GH的上游刺激物，GHRH的使用是另一种可选择的策略，该策略不仅可增加生长性能或乳汁生产，而且更重要的，可增加从实际和代谢角度来看的生产效率(Dubreuil等人，1990；Farmer等人，1992)。然而，目前重组肽的高成本和必需的施用频率限制了该治疗的广泛应用。这些主要的缺点可通过用一种针对GHRH异位生产的基因治疗方法来消除，只要其生产可长期维持。GHRH基因的下丘脑组织特异性表达不是其活性所必需的，这是因为头颅外分泌的GHRH可具有生物学活性(Faglia等人，1992；Melmed，1991)。一种递送GHRH的基因治疗方法因如下事实而得到支持，即基因、cDNA和天然的和几个突变的分子在猪、牛和许多其他物种中已有很好表征，且对治疗功效的确定简单而明确。骨骼肌肉组织是目标组织的理想候选物，因为肌内注射易于在工业设施中操作、肌纤维具有长的寿命且可由环状DNA质粒进行转导(Bettan等人，2000；Everett等人，2000)。因而，无需再次施用且转基因可经年累月在免疫活性宿主中有效地表达(Wolff等人，1992)。
发明概述在本发明的一个实施方案中，有一种改善或增强来自雌性动物的后代的生长的方法，该方法包括在怀有该后代之前或期间将有效量的载体引入到雌性动物的细胞内的步骤，其中该载体包含启动子、核苷酸序列和3’非翻译区，所处条件为其中的核苷酸序列表达且其中载体的引入和表达导致后代生长的改善或增强。在一个特定的实施方案中，该雌性动物的细胞包含二倍体细胞。在另一个特定的实施方案中，该雌性动物的细胞包含肌肉细胞。在另外一个特定的实施方案中，该核酸序列编码生长激素释放激素或其类似物。在进一步特定的实施方案中，该生长激素释放激素为SEQ ID NO1、SEQ ID NO8或其各自的类似物。在另外一个特定的实施方案中，该启动子包含合成的生肌启动子。在进一步特定的实施方案中，该3’非翻译区包含hGH 3’非翻译区。在另一个特定的实施方案中，该载体通过电穿孔、经过病毒载体、与载体结合或通过肠胃外途径而引入到该雌性动物的所述细胞中。在另外一个特定的实施方案中，该雌性动物是人、宠物动物、农场动物、食用动物或工作用动物。在进一步特定的实施方案中，该雌性动物是人、猪、母牛、绵羊、山羊或鸡。在另外一个特定的实施方案中，该载体选自质粒、病毒载体、脂质体和阳离子脂质。在另一个特定的实施方案中，该载体在一次施用中引入该雌性。在另外一个特定的实施方案中，该引入在怀有该后代的第3个3月期时发生。在另一个特定的实施方案中，该方法进一步包含向该雌性施用生长激素促分泌素受体的配体的步骤。在另一个特定的实施方案中，该配体经口施用。在本发明额外的一个实施方案中，有一种增加来自雌性动物的后代中生长激素水平的方法，该方法包括在怀有该后代之前或期间将有效量的载体引入到雌性动物的细胞内的步骤，其中该载体包含启动子、核苷酸序列和3’非翻译区，所处条件为其中的核苷酸序列表达且其中载体的引入和表达导致后代中生长激素水平增加。在一个特定的实施方案中，该雌性动物的细胞包含二倍体细胞。在另一个特定的实施方案中，该雌性动物的细胞包含肌肉细胞。在另外一个特定的实施方案中，该核酸序列编码生长激素释放激素或其类似物。在进一步特定的实施方案中，该生长激素释放激素为SEQ ID NO1、SEQID NO8或其各自的类似物。在另外一个特定的实施方案中，该启动子包含合成的生肌启动子。在进一步特定的实施方案中，该3’非翻译区包含hGH 3’非翻译区。在另一个特定的实施方案中，该载体通过电穿孔、经过病毒载体、与载体结合或通过肠胃外途径而引入到雌性动物的细胞中。在另外一个特定的实施方案中，该雌性动物是人、宠物动物、农场动物、食用动物或工作用动物。在进一步特定的实施方案中，该雌性动物是人、猪、母牛、绵羊、山羊或鸡。在另外一个特定的实施方案中，该载体选自质粒、病毒载体、脂质体和阳离子脂质。在另一个特定的实施方案中，该载体在一次施用中引入该雌性。在另外一个特定的实施方案中，该引入是在怀有该后代的第3个3月期时发生。在另一个特定的实施方案中，该方法进一步包含向该雌性施用生长激素促分泌素受体的配体的步骤。在另一个特定的实施方案中，该配体经口施用。在本发明的另一个实施方案中，有一种增加来自雌性动物的后代的瘦体重的方法，该方法包括在怀有该后代之前或期间将有效量的载体引入到雌性动物的细胞内的步骤，其中该载体包含启动子、核苷酸序列和3’非翻译区，所处条件为其中的核苷酸序列表达且其中载体的引入和表达导致后代中瘦体重增加。在一个特定的实施方案中，该雌性动物的细胞包含二倍体细胞。在另一个特定的实施方案中，该雌性动物的细胞包含肌肉细胞。在另外一个特定的实施方案中，该核酸序列编码生长激素释放激素或其类似物。在进一步特定的实施方案中，该生长激素释放激素为SEQ ID NO1、SEQ ID NO8或其各自的类似物。在另外一个特定的实施方案中，该启动子包含合成的生肌启动子。在进一步特定的实施方案中，该3’非翻译区包含hGH 3’非翻译区。在另一个特定的实施方案中，该载体通过电穿孔、经过病毒载体、与载体结合或通过肠胃外途径而引入到雌性动物的细胞中。在另外一个特定的实施方案中，该雌性动物是人、宠物动物、农场动物、食用动物或工作用动物。在进一步特定的实施方案中，该雌性动物是人、猪、母牛、绵羊、山羊或鸡。在另外一个特定的实施方案中，该载体选自质粒、病毒载体、脂质体和阳离子脂质。在另一个特定的实施方案中，该载体在一次施用中引入该雌性。在另外一个特定的实施方案中，该引入是在怀有该后代的第3个3月期时发生。在另一个特定的实施方案中，该方法进一步包含向该雌性施用生长激素促分泌素受体的配体的步骤。在另一个特定的实施方案中，该配体经口施用。在本发明的另一个实施方案中，有一种增加来自雌性动物的后代的IGF-I水平的方法，该方法包括在怀有该后代之前或期间将有效量的载体引入到雌性动物的细胞内的步骤，其中该载体包含启动子、核苷酸序列和3’非翻译区，所处条件为其中的核苷酸序列表达且其中载体的引入和表达导致后代中IGF-I水平增加。在一个特定的实施方案中，该雌性动物的细胞包含二倍体细胞。在另一个特定的实施方案中，该雌性动物的细胞包含肌肉细胞。在另外一个特定的实施方案中，该核酸序列编码生长激素释放激素或其类似物。在进一步特定的实施方案中，该生长激素释放激素为SEQ ID NO1、SEQID NO8或其各自的类似物。在另外一个特定的实施方案中，该启动子包含合成的生肌启动子。在进一步特定的实施方案中，该3’非翻译区包含hGH 3’非翻译区。在另一个特定的实施方案中，该载体是通过电穿孔、经过病毒载体、与载体结合或通过肠胃外途径而引入到雌性动物的细胞中的。在另外一个特定的实施方案中，该雌性动物是人、宠物动物、农场动物、食用动物或工作用动物。在进一步特定的实施方案中，该雌性动物是人、猪、母牛、绵羊、山羊或鸡。在另外一个特定的实施方案中，该载体选自质粒、病毒载体、脂质体和阳离子脂质。在另一个特定的实施方案中，该载体在一次施用中引入该雌性。在另外一个特定的实施方案中，该引入是在怀有该后代的第3个3月期时发生。在另一个特定的实施方案中，该方法进一步包含向该雌性施用生长激素促分泌素受体的配体的步骤。在另一个特定的实施方案中，该配体经口施用。在本发明额外的一个实施方案中，有一种增加来自雌性动物的后代的饲养效率的方法，该方法包括在怀有该后代之前或期间将有效量的载体引入到雌性动物的细胞内的步骤，其中该载体包含启动子、核苷酸序列和3’非翻译区，所处条件为其中的核苷酸序列表达且其中载体的引入和表达导致后代中饲养效率增加。在一个特定的实施方案中，该雌性动物的细胞包含二倍体细胞。在另一个特定的实施方案中，该雌性动物的细胞包含肌肉细胞。在另外一个特定的实施方案中，该核酸序列编码生长激素释放激素或其类似物。在进一步特定的实施方案中，该生长激素释放激素为SEQ ID NO1、SEQ ID NO8或其各自的类似物。在另外一个特定的实施方案中，该启动子包含合成的生肌启动子。在进一步特定的实施方案中，该3’非翻译区包含hGH 3’非翻译区。在另一个特定的实施方案中，该载体通过电穿孔、经过病毒载体、与载体结合或通过肠胃外途径而引入到雌性动物的细胞中。在另外一个特定的实施方案中，该雌性动物是人、宠物动物、农场动物、食用动物或工作用动物。在进一步特定的实施方案中，该雌性动物是人、猪、母牛、绵羊、山羊或鸡。在另外一个特定的实施方案中，该载体选自质粒、病毒载体、脂质体和阳离子脂质。在另一个特定的实施方案中，该载体在一次施用中引入该雌性。在另外一个特定的实施方案中，该引入是在怀有该后代的第3个3月期时发生。在另一个特定的实施方案中，该方法进一步包含向该雌性施用生长激素促分泌素受体的配体的步骤。在另一个特定的实施方案中，该配体经口施用。在本发明的另一个实施方案中，有一种增加来自雌性动物的后代的生长速度的方法，该方法包括在怀有该后代之前或期间将有效量的载体引入到雌性动物的细胞内的步骤，其中该载体包含启动子、核苷酸序列和3’非翻译区，所处条件为其中的核苷酸序列表达且其中载体的引入和表达导致后代中生长速度增加。在一个特定的实施方案中，该雌性动物的细胞包含二倍体细胞。在另一个特定的实施方案中，该雌性动物的细胞包含肌肉细胞。在另外一个特定的实施方案中，该核酸序列编码生长激素释放激素或其类似物。在进一步特定的实施方案中，该生长激素释放激素为SEQ ID NO1、SEQ ID NO8或其各自的类似物。在另外一个特定的实施方案中，该启动子包含合成的生肌启动子。在进一步特定的实施方案中，该3’非翻译区包含hGH 3’非翻译区。在另一个特定的实施方案中，该载体通过电穿孔、经过病毒载体、与载体结合或通过肠胃外途径而引入到雌性动物的细胞中。在另外一个特定的实施方案中，该雌性动物是人、宠物动物、农场动物、食用动物或工作用动物。在进一步特定的实施方案中，该雌性动物是人、猪、母牛、绵羊、山羊或鸡。在另外一个特定的实施方案中，该载体选自质粒、病毒载体、脂质体和阳离子脂质。在另一个特定的实施方案中，该载体在一次施用中引入该雌性。在另外一个特定的实施方案中，该引入是在怀有该后代的第3个3月期时发生。在另一个特定的实施方案中，该方法进一步包含向该雌性施用生长激素促分泌素受体的配体的步骤。在另一个特定的实施方案中，该配体经口施用。在本发明额外的一个实施方案中，有一种增加来自雌性动物的后代的脑下垂体中促生长激素生产细胞对其他的激素生产细胞的比例的方法，该方法包括在怀有该后代之前或期间将有效量的载体引入到雌性动物的细胞内的步骤，其中该载体包含启动子、核苷酸序列和3’非翻译区，所处条件为其中的核苷酸序列表达且其中载体的引入和表达导致后代中促生长激素生产细胞对其他的激素生产细胞的比例增加。在一个特定的实施方案中，该雌性动物的细胞包含二倍体细胞。在另一个特定的实施方案中，该雌性动物的细胞包含肌肉细胞。在另外一个特定的实施方案中，该核酸序列编码生长激素释放激素或其类似物。在进一步特定的实施方案中，该生长激素释放激素为SEQID NO1、SEQ ID NO8或其各自的类似物。在另外一个特定的实施方案中，该启动子包含合成的生肌启动子。在进一步特定的实施方案中，该3’非翻译区包含hGH 3’非翻译区。在另一个特定的实施方案中，该载体通过电穿孔、经过病毒载体、与载体结合或通过肠胃外途径而引入到雌性动物的细胞中。在另外一个特定的实施方案中，该雌性动物是人、宠物动物、农场动物、食用动物或工作用动物。在进一步特定的实施方案中，该雌性动物是人、猪、母牛、绵羊、山羊或鸡。在另外一个特定的实施方案中，该载体选自质粒、病毒载体、脂质体和阳离子脂质。在另一个特定的实施方案中，该载体在一次施用中引入该雌性。在另外一个特定的实施方案中，该引入是在怀有该后代的第3个3月期时发生。在另一个特定的实施方案中，该方法进一步包含向该雌性施用生长激素促分泌素受体的配体的步骤。在另一个特定的实施方案中，该配体的经口施用。在一个特定的实施方案中，该激素生产细胞选自促肾上腺皮质激素细胞、催乳细胞和促性腺激素细胞。在本发明额外的一个实施方案中，有一种延迟来自雌性动物的后代出生的方法，该方法包括在怀有该后代之前或期间将有效量的载体引入到雌性动物的细胞内的步骤，其中该载体包含启动子、核苷酸序列和3’非翻译区，所处条件为其中的核苷酸序列表达且其中载体的引入和表达导致后代出生延迟。在一个特定的实施方案中，该雌性动物的细胞包含二倍体细胞。在另一个特定的实施方案中，该雌性动物的细胞包含肌肉细胞。在另外一个特定的实施方案中，该核酸序列编码生长激素释放激素或其类似物。在进一步特定的实施方案中，该生长激素释放激素为SEQ ID NO1、SEQ ID NO8或其各自的类似物。在另外一个特定的实施方案中，该启动子包含合成的生肌启动子。在进一步特定的实施方案中，该3’非翻译区包含hGH 3’非翻译区。在另一个特定的实施方案中，该载体通过电穿孔、经过病毒载体、与载体结合或通过肠胃外途径而引入到雌性动物的细胞中。在另外一个特定的实施方案中，该雌性动物是人、宠物动物、农场动物、食用动物或工作用动物。在进一步特定的实施方案中，该雌性动物是人、猪、母牛、绵羊、山羊或鸡。在另外一个特定的实施方案中，该载体选自质粒、病毒载体、脂质体和阳离子脂质。在另一个特定的实施方案中，该载体在一次施用中引入该雌性。在另外一个特定的实施方案中，该引入是在怀有该后代的第3个3月期时发生。在另一个特定的实施方案中，该方法进一步包含向该雌性施用生长激素促分泌素受体的配体的步骤。在另一个特定的实施方案中，该配体经口施用。在本发明额外的一个实施方案中，有一种增加动物的乳汁生产的方法，该方法包括将有效量的载体引入到该动物的细胞内的步骤，其中该载体包含启动子、核苷酸序列和3’非翻译区，所处条件为其中的核苷酸序列表达且其中载体的引入和表达导致动物乳汁生产增加。在一个特定的实施方案中，该雌性动物的细胞包含二倍体细胞。在另一个特定的实施方案中，该雌性动物的细胞包含肌肉细胞。在另外一个特定的实施方案中，该核酸序列编码生长激素释放激素或其类似物。在进一步特定的实施方案中，该生长激素释放激素为SEQID NO1、SEQ ID NO8或其各自的类似物。在另外一个特定的实施方案中，该启动子包含合成的生肌启动子。在进一步特定的实施方案中，该3’非翻译区包含hGH 3’非翻译区。在另一个特定的实施方案中，该载体通过电穿孔、经过病毒载体、与载体结合或通过肠胃外途径而引入到雌性动物的细胞中。在另外一个特定的实施方案中，该雌性动物是人、宠物动物、农场动物、食用动物或工作用动物。在进一步特定的实施方案中，该雌性动物是人、猪、母牛、绵羊、山羊或鸡。在另外一个特定的实施方案中，该载体选自质粒、病毒载体、脂质体和阳离子脂质。在另一个特定的实施方案中，该载体在一次施用中引入该雌性。在另外一个特定的实施方案中，该引入是在怀有该后代的第3个3月期时发生的。在另一个特定的实施方案中，该方法进一步包含向该雌性施用生长激素促分泌素受体的配体的步骤。在另一个特定的实施方案中，该配体经口施用。通过阅读下面的说明书并参考其中附随的附图部分或本发明目前为了公开的目的而给出的优选实施方案的任何实例，本发明其他的和进一步的目的、特征和优势将显而易见，并最终更易于理解。
附图描述

图1A到1C说明了GHRH超活性的类似物增加了GH促分泌素活性和稳定性。图1A是猪野生型(1-40)OH氨基酸序列和类似物HV-GHRH的比较。图1B表示不同GHRH种类在猪原代垂体前叶培养物中对猪GH释放的作用。图1C说明了在6小时的温育中发生于HV-GHRH和野生型猪GHRH的稳定性的改变。图2A到2E说明了在超活性类似物GHRH生肌表达载体的一次注射后2个月中GHRH、GH和IGF-I血清水平的增加。图2A描述了包含SPc5-12合成启动子和GH的3’UTR的构建体。作为突变蛋白质的模型，使用HV-GHRH构建体并用猪野生型作为正对照进行比较，而用β-半乳糖苷酶构建体作为负对照进行比较。图2B阐明了用pSP-GHRH注射的猪与用安慰剂注射的对照猪的血清GHRH的相对水平。图2C说明用重量/血体积增加校正后pSP-GHRH注射的猪与对照猪的血清GHRH的绝对水平。图2D表示在用pSP-HV-GHRH注射的猪中GH水平的变化。图2E表示在直接将pSP-GHRH构建体进行肌内注射后血浆中IGF-I的水平。图3A到3C说明生肌GHRH表达载体对猪生长的作用。图3A表示在2个月中用pSP-GHRH或pSP-HV-GHRH注射的猪中平均重量的变化。图3B表示用pSP-GHRH注射的猪与对照相比饲料转变效率的状况。图3C是注射后45天，用pSP-HV-GHRH注射的猪和用安慰剂注射的对照猪的比较。图4说明注射不同量的pSP-HV-GHRH对10日龄的小猪的作用。图5表示注射不同量的pSP-HV-GHRH对10日龄的小猪的IGF-I水平的作用。图6阐明了pSP-HV-GHRH注射小猪的时间过程。图7阐明了与外在卡钳电极(caliper electrode)的另一种实施方案相比本发明的注射型电极的优选实施方案。顶部是对具有2正方形平板/1.5cm面的外在卡钳电极的说明。底部是对存在于1cm直径的阵列中18-26g的长度为2cm针的6-针阵列仪器(固体针)的说明。左面的说明是侧视图而右面的说明是底视图。图8说明了对照和实验的小猪的出生重量。图9阐明了刚断奶的实验和对照小猪的重量。图10表示与注射的动物混养(cross-fostered)的对照与其同窝出生仔畜比较的重量。图11说明了来自与对照母猪混养的GHRH-处理的母猪的小猪的重量及与其同窝出生仔畜的比较。图12阐明了比对照在重量上总的增加(由对照母猪饲养)。图13表示实验和对照市场重量的比较。图14阐明了3个星期、10个星期和24个星期的后代的重量。图15表示在3周龄时每体重的肌肉重量。图16说明了每后代总重量的垂体重量。图17表示在后代中的GH、GHRH和PRL的RNA分析，阐明GHRH在宫内作为生长因子对垂体起作用。图18阐明了GH-分泌细胞的DAB染色。图19说明了3个星期、10个星期和6个月的后代中IGF-I的浓度。
发明详述对于本领域的技术人员来说，可在此处公开的本发明中进行各种替代和修饰而不背离本发明的范围和精神是显而易见的。在说明书中此处所用的“一个(a)”或“一个(an)”可指一个或多个。如此处在权利要求中所用的，当与“由…组成”结合使用时，“一个(a)”或“一个(an)”可指一个或多于一个。如在此处所用的“另一个”指至少第二个或更多。此处所用的术语“动物”指动物界中的任何物种。在优选实施方案中，它更特定地指人、野生状态的动物、用作宠物的动物(鸟、狗、猫、马)、用于工作的动物(马、母牛、狗)和生产食物的动物(鸡、母牛、鱼)、农场动物(猪、马、母牛、绵羊、鸡)或本身是食物的动物(青蛙、鸡、鱼、螃蟹、龙虾、小虾、贻贝、扇贝、山羊、公猪、母牛、羔羊、猪、鸵鸟、鸸鹋、鳗鲡)和其他本领域公知的动物。此处所用的术语“有效量”定义为需要在宿主中产生作用的组合物的量，其中的作用可用几个本领域技术人员所公知的边界点来监控。在一个特定的实施方案中，这些边界点是替代标记物。此处所用的术语“饲料转变效率”定义为与该动物获得的重量相对于该动物每天所吃的食料的量。此处所用的术语“效率”或“饲养效率”与“饲料转变效率”是可以互换的。此处所用的术语“生长缺乏”定义为其生长比正常的少的任何健康状况、医疗状况或疾病。该缺乏可为畸变的结果，该畸变直接影响生长激素途径(如GHRH-GH-IGF-I轴)、间接影响生长激素途径或根本不影响生长激素途径。此处所用的术语“生长激素”定义为涉及生长并充当化学信使而在目标细胞中发挥其作用的激素。此处所用的术语“生长激素释放激素”定义为促进或刺激生长激素释放的激素。此处所用的术语“生长激素释放激素的类似物”定义为在天然存在的氨基酸序列中含有氨基酸突变和/或缺失(无合成的右旋或环状氨基酸)但却并非GHRH分子中天然发生，且仍然保持其增强生长激素合成和分泌功能的蛋白质。此处所用的术语“生长激素促分泌素受体”(GHS-R)定义为小的合成化合物的受体，该化合物直接或间接地与生长激素从脑下垂体中释放相关。此处所用的术语“瘦体重”定义为动物归因于非脂肪组织如肌肉的体重。此处所用的术语“生长激素促分泌素受体的配体”定义为充当生长激素促分泌素受体的激动剂的化合物。该配体可为合成的或天然存在的。该配体可为肽、蛋白质、糖、碳水化合物、脂质、核酸或其组合。此处所用的术语“生肌的”特定地指肌肉组织。此处所用的术语“新生儿”指紧接在出生之后的动物及所有随后成熟或生长阶段。此处所用的术语“后代”指亲代的后裔，其中该后裔是未出生的胎儿或新生儿。此处所用的术语“肠胃外”指除经肠道之外将材料引入到动物内的机制。在特定的实施方案中，肠胃外包括皮下、肌内、静脉内、鞘内、腹膜内或其他。此处所用的术语“药物可接受的”指化合物，其中该化合物的施用可被受体哺乳动物耐受。此处所用的术语“促分泌素”指可增强下游调节的分子的合成和分泌的天然或合成的分子(如GHRH是GH的促分泌素)。此处所用的术语“促生长激素细胞”指生产生长激素的细胞。此处所用的术语“治疗有效量”指施用的化合物的量，其中该量在生理学上显著。一种药剂如果其存在导致受体动物的生理学发生技术的改变则为生理学上显著。例如，在治疗生长缺乏中，增加生长的组合物为治疗有效；在消耗疾病中可降低损失率或增加生长的组合物为治疗有效。此处所用的术语“载体(vector)”指任何可将核酸递送入细胞或生物体中的载体。例子包括质粒、病毒载体、脂质体或阳离子脂质。在一个特定的实施方案中，脂质体和阳离子脂质是可与其他的载体复合以增加目标细胞对质粒或病毒载体的摄取的佐剂(载体(carrier))。在一个优选的实施方案中，该载体包含启动子、核苷酸序列，优选地编码生长激素释放激素或其类似物，和3’非翻译区。在另一个优选实施方案中，该启动子、核苷酸序列和3’非翻译区可操作地相连接以在真核细胞中表达。此处所用的术语“萎缩症状”定义为与消耗或慢性萎缩病相关的症状或状况。本申请在主题上与于1999年7月26日提交的美国临时专利申请No.60/145,624和相应的于2000年7月24日提交的美国非临时专利申请No.09/624,268相关，此处将二者引用作为参考。为了估计生长激素释放激素(GHRH)基因治疗生肌载体的生长效果，对在妊娠的最后3个月的怀孕的母猪注射了10mg含野生型(pSP-wt-GHRH)或突变的(pSP-HV-GHRH)的GHRH cDNA的载体。在该注射之后进行电穿孔。将未注射/电穿孔的母猪用作对照。来自GHRH注射的母猪的小猪在出生时较大(平均为1.65±0.06kgHV-GHRH，p＜0.00002且1.46±0.05kg wt-GHRH，p＜0.0014，对于对照1.27±0.02kg)。进行混养研究。在断奶时，来自注射的母猪的小猪比对照大。由注射的母猪哺乳的混养对照显著地比其同窝出生仔畜大。该优点得以保持，且在出生后170天，注射的母猪的后代对于HV-GHRH和wt-GHRH分别为135.7kg和129.3kg，而对照重量平均为125.3kg。对小猪进行了多重生物化学的测量。在来自注射母猪的小猪中总蛋白质增加了，且在所有检验的时间点血液中尿素的水平降低，这两个常数都说明了改善的蛋白质代谢。肌酸酐浓度正常，显示正常的肾功能。葡萄糖和胰岛素的水平正常。因而，由用编码GHRH的质粒DNA构建体进行基因治疗处理的母猪生产的小猪在维持正常的原态稳定时，在至少出生后170天内显示比正常水平增加的生长模式且更瘦。该增加相等地应归于注射的母猪乳汁分泌的增加和后代中下丘脑-垂体轴的修饰。该主要实验的证据说明质粒介导的转移可用于在避免经典蛋白质治疗所相关连的次生效应的同时，贯穿世代地增强某些动物特征。在本发明的一个实施方案中，在本发明的方法中用到一个核酸序列，该序列在雌性的后代中增加生长、增强生长、增加饲料转变效率、增加瘦体重、增加IGF-I水平、增加生长速度、增加促生长激素细胞相对其他激素生产细胞的比例、延迟出生或增加乳汁生产。在特定的实施方案中，该核酸序列是生长激素释放激素、生长激素、IGF-I、催乳激素或其类似物。该雌性可为母亲、以前从未怀孕或生产的雌性，或者为替代母亲，如通过胎儿移植而受孕的。本发明的一个优选实施方案使用具有氨基酸序列SEQ IDNO1或SEQ ID NO8(wt GHRH)的生长激素释放激素类似物。如在此处所用的，术语“野生型”可为任何动物的GHRH的内源形式，或为该激素如猪GHRH的略微修饰的形式。技术人员知道内源GHRH具有44个氨基酸，且在末段具有一个酰胺基团，其正确的符号表示为(1-44)NH2-GHRH。在一个特定的实施方案中，使用仅有40个氨基酸(缺乏最后4个氨基酸)的形式，该形式也不含有酰胺基团，可标为(1-40)OH-GHRH。如在此处所用的该形式也称为野生型，因为它与野生型的序列相比不含有内部突变，这与在此处所描述的具有由定点突变而引入内部突变的其他形式(如HV)相反。技术人员知道1-40的形式和更短的形式(例如1-32或1-29)天然存在于人和其他哺乳动物中(甚至在不同类型的GHRH分泌肿瘤中)，且这些形式具有与天然(1-44)NH2相当的活性。在本发明的一个优选实施方案中，使用具有比野生型GHRH增加的稳定性的GHRH。在另一个实施方案中，不同种类的GHRH或GHRH的类似物在本发明的范围之内。在本发明的一个目的中，已知核酸施用的特性时，由DNA编码的残基不进行翻译后修饰。下面的种类在本发明的范围之内。美国专利No.4,223,019公开了具有氨基酸序列NH2-Y-Z-E-G-J-COOH的五肽，其中Y选自D-赖氨酸和D-精氨酸；Z和J独立地选自酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸；且E和G独立地选自D-酪氨酸、D-色氨酸和D-苯丙氨酸。美国专利No.4,223,020公开了具有下面氨基酸序列NH2-Y-Z-E-G-COOH的四肽，其中Y和G独立地选自酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸；且Z和E独立地选自D-酪氨酸、D-色氨酸和D-苯丙氨酸。美国专利No.4,223,021公开了具有下面氨基酸序列NH2-Y-Z-E-G-J-COOH的五肽，其中Y和G独立地选自酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸；Z选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸和甲硫氨酸；E和J独立地选自D-酪氨酸、D-色氨酸和D-苯丙氨酸。美国专利No.4,224,316公开了具有下面氨基酸序列NH2-Y-Z-E-G-J-COOH的新型的五肽，其中Y和E独立地选自D-酪氨酸、D-色氨酸和D-苯丙氨酸；Z和G独立地选自酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸；且J选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、精氨酸和赖氨酸。美国专利No.4,226,857公开了具有下面氨基酸序列NH2-Y-Z-E-G-J-COOH的五肽，其中Y和G独立地选自酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸；Z和J独立地选自D-酪氨酸、D-色氨酸和D-苯丙氨酸；且E选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和组氨酸。美国专利No.4,228,155公开了具有下面氨基酸序列NH2-Y-Z-E-G-J-COOH的五肽，其中Y选自酪氨酸、D-酪氨酸、色氨酸、D-色氨酸、苯丙氨酸和D-苯丙氨酸；Z和E独立地选自D-酪氨酸、D-色氨酸和D-苯丙氨酸；G选自赖氨酸和精氨酸；且J选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸和甲硫氨酸。美国专利No.4,228,156公开了具有下面氨基酸序列NH2-Y-Z-E-COOH的三肽，其中Y和Z独立地选自D-酪氨酸、D-色氨酸和D-苯丙氨酸；且E选自酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸。美国专利No.4,228,158公开了具有下面氨基酸序列NH2-Y-Z-E-G-J-COOH的五肽，其中Y和G独立地选自酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸；Z和E独立地选自D-酪氨酸、D-色氨酸和D-苯丙氨酸；且J选自天然氨基酸和其D-构型。美国专利No.4,833,166公开了具有分子式H-Asp-Pro-Val-Asn-Ile-Arg-Ala-Phe-Asp-Asp-Val-Leu-Y的合成肽，其中Y是OH或NH2或其无毒性盐，和具有分子式H-Val-Glu-Pro-Gly-Ser-Leu-Phe-Leu-Val-Pro-Leu-Pro-Leu-Leu-Pro-Val-His-Asp-Phe-Val-Gln-Gln-Phe-Ala-Gly-Ile-Y的合成肽，其中Y是OH或NH2或其无毒性盐。Draghia-Akli等人(1997)使用编码31个氨基酸的信号肽的228-bp的hGHRH片段和最初由Mayo等人(1995)描述的完整成熟肽人GHRH(1-44)OH(Tyr1Leu44)。Guillemin等人(1982)也确定了人胰腺生长激素释放因子(hpGRF)的序列。本发明额外的实施方案包括(1)改善后代生长性能的方法；(2)刺激后代中以比与正常生长相关的水平更高的水平生产生长激素的方法；和(3)增强后代生长的方法。所有这些方法包括将质粒载体在怀有该后代期间或之前的怀孕期间引入到该后代的母亲中的步骤，其中该载体包含启动子、核苷酸序列如编码SEQ ID NO1或SEQ ID NO8的核苷酸序列和可操作地在适当距离顺序连接的以进行功能性表达的3’非翻译区。在一个额外的特定实施方案中，有一种刺激后代以比正常生长相关的水平更高的水平生产生长激素的方法，该方法包含在怀有该后代期间向该后代的母亲引入有效量的载体，该载体包含启动子、编码SEQ ID NO1或SEQ ID NO8的核苷酸序列和可操作地在适当距离顺序连接的以进行功能性表达的3’非翻译区。比正常生长相关的水平更高的水平包括具有生长相关的缺乏的动物或具有与群体中其他类似动物类似的生长水平的动物，包括那些无生长相关的缺乏的动物的基本的、固有的生长。在一个优选实施方案中，有一种增强动物生长的方法，该方法包含向该动物引入有效量的载体，该载体包含启动子、编码SEQ ID NO1或SEQ ID NO8的核苷酸序列和可操作地在适当距离顺序连接的以进行功能性表达的3’非翻译区。其生长增强的动物可具有或不具有生长缺乏。本发明的一个目的是增加动物的生长和/或生长速度，其优选为来自母亲的后代。在一个优选实施方案中，动物的生长和/或生长速度受到了长期的影响，如大于几个星期或大于几个月。在一个特定的实施方案中，这通过将生长激素释放激素施用于后代的母亲而达到，优选以核酸的形式。在一个优选实施方案中，该GHRH核酸作为肌肉细胞的附加体而被维持。在一个特定的实施方案中，GHRH的增加通过增加生长激素生产细胞的数目而影响脑下垂体，并因而改变了其细胞谱系。在一个特定的实施方案中，促生长激素细胞(生长激素生产细胞)的比例相对于垂体内其他的激素生产细胞如促肾上腺皮质激素细胞、催乳细胞和促性腺激素细胞等而增加。在一个特定的实施方案中，与生长激素生产细胞数目的增加相关的生长激素的增加反映于IGF-I水平的增加。在另一个特定的实施方案中，生长激素水平的增加与后代瘦体重的增加和生长速度的增加相关。在另一个特定的实施方案中，瘦体重的增加与线性骨骼生长的增加相关。在另外一个特定的实施方案中，后代的饲料转变效率增加。在另一个特定的实施方案中，后代的出生延迟，且在一个优选实施方案中，这与胎儿生长速度改善或增加相关。在一个优选实施方案中，该启动子是合成的生肌启动子，且hGH 3’非翻译区位于3’非翻译区。然而，该3’非翻译区可来自任何天然或合成的基因。在本发明的一个特定的实施方案中，使用合成的启动子，称为SPc5-12(Li等人，1999)(SEQ ID NO6)，它含有来自骨骼α-肌动蛋白的近侧血清反应元件(SRE)、多重MEF-2位点、MEF-1位点和TEF-1结合位点，并大大地超过天然生肌启动子的转录能力。在一个优选实施方案中，本发明所用的启动子并不由内源的细胞装置或因子显著地关掉或减少其活性。其他的元件，包括反式作用因子结合位点和增强子可根据本发明的实施方案而使用。在另一个实施方案中，使用天然的生肌启动子，且技术人员知道如何从数据库中获得这样的启动子序列，该数据库包括国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)(NCBI)GenBank数据库或NCBI PubMed站点。技术人员知道这些国际互联网(world wide web)站点可用于获得与本发明相关的序列或相关文献。在一个特定的实施方案中，在核酸载体如质粒中使用hGH3’非翻译区(SEQ ID NO7)。在特定的实施方案中，该载体选自质粒、病毒载体、脂质体或阳离子脂质。在进一步特定的实施方案中，该载体引入到生肌细胞或肌肉组织内。在进一步特定的实施方案中，该动物是人、宠物动物、工作用动物或食用动物。除将该构建体通过质粒载体引入到动物中的特定实施方案之外，也可使用本领域中公知的将核酸转染入动物或其细胞的递送系统。例如，可使用其他非病毒的或病毒的方法。技术人员认识到DNA或RNA非病毒形式的目标系统需要4个成分1)目的DNA或RNA；2)识别并结合到细胞表面受体或抗原的部分；3)DNA结合部分；和4)使得复合物能够从细胞表面转运到胞质中的裂解部分。进一步地，脂质体和阳离子脂质可用于递送治疗基因组合以达到相同的作用。潜在的病毒载体包括衍生自如腺病毒(adenovirus)、痘苗病毒(vaccinia virus)、疱疹病毒(herpes virus)和牛乳头状瘤病毒(bovine papilloma virus)等病毒的表达载体。此外，可采用附加体载体。其他DNA载体和转运蛋白系统为本领域公知。本领域的技术人员认识到衍生自各种细菌质粒、反转录病毒、腺病毒、疱疹或来自痘苗病毒的表达载体可用于向目标器官、组织或细胞群体递送核苷酸序列。本领域技术人员所公知的方法可用于构建将表达编码生长激素释放激素类似物基因的重组载体。暂时的表达用非复制型的载体可持续1个月或更长，且如果适当的复制元件是载体系统的一部分时甚至可更长。本发明的一个目的为生长激素释放激素的一次施用足够对于多次妊娠时期有效，且提供了增强小猪对市场重量性能的治疗，如增加的生长和改变的身体组成。
核酸1.载体术语“载体”用于指载体核酸分子，在其中可插入核酸序列以引入到细胞中，在那里该载体可复制且该核酸序列可表达。该核酸序列可为“外源的”，这意味着它对于向其中引入载体的细胞是外源的，或者该序列与细胞内的一个序列同源但在宿主核酸中位于通常不发现该序列的位置上。载体包括质粒、粘粒、病毒(噬菌体、动物病毒和植物病毒)和人工染色体(例如YACs)。本领域的技术人员可很好地训练以通过标准的重组技术而构建载体，该重组技术描述于Maniatis等人，1988和Ausubel等人，1994，此处将两者引用作为参考。术语“表达载体”指含有编码至少部分的能够转录的基因产物的核酸序列的载体。在一个特定的实施方案中，该核酸序列编码部分或全部的GHRH。在一些情况下，RNA分子然后翻译为蛋白质、多肽或肽。在其他的情况下，这些序列不翻译，如在反义分子或核酶的生产中。表达载体可含有各种“控制序列”，这指在特殊的宿主生物中可操作地连接的编码序列的转录和可能的翻译所必需的核酸序列。除支配转录和翻译的控制序列之外，载体和表达载体可含有也提供其他功能并在下文描述的核酸序列。在一个优选实施方案中，本发明的载体是包含合成的生肌(肌肉特异性的)启动子、编码生长激素释放激素或其类似物的核苷酸序列和3’非翻译区的质粒。在另一个实施方案中，该载体是病毒载体，如腺病毒相关病毒、腺病毒或反转录病毒。在另一个实施方案中，可使用骨骼α-肌动蛋白启动子、肌球蛋白轻链启动子、巨细胞病毒启动子或SV40启动子。在其他另外的实施方案中，在载体中使用人生长激素、牛生长激素、SV40或骨骼α-肌动蛋白3’非翻译区。
a.启动子和增强子“启动子”是控制序列，它是核酸序列上的控制转录的起始和速度的一个区域。它可含有在其上调节蛋白质和分子如RNA聚合酶和其他转录因子可结合的遗传元件。短语“可操作地定位的”、“可操作地连接的”、“在控制下”和“在转录控制下”指启动子位于相对核酸序列的正确功能位置和/或方向以控制该序列转录的起始和/或表达。启动子可与或不与“增强子”结合使用，后者指涉及核酸序列的转录激活的反式作用调节序列。启动子可为位于编码区段和/或外显子上游的天然编码序列(naturally-coding sequences)之一。这样的启动子可称为“内源的”。类似地，增强子可为天然地与核酸序列相关且位于该序列下游或上游的序列。或者，使编码的核酸区段在重组的或异源的启动子控制之下可获得某些益处，该启动子指不是在其天然环境中与核酸序列正常相关的启动子。重组的或异源的启动子也指不是在其天然环境中与核酸序列正常相关的增强子。这样的增强子或增强子可包括其他基因的启动子或增强子和从任何其他原核的、病毒的或真核的细胞分离的启动子或增强子，以及不是“天然存在”的启动子或增强子，即含有改变表达的不同转录调节区域的不同元件和/或突变。除合成地生产启动子或增强子的核酸序列之外，该序列也可以用重组克隆和/或核酸扩增技术包括PCRTM连同在此处公开的组合物(参见美国专利4,683,202，美国专利5,928,906，它们各自在此处引用作为参考)来生产。此外，思考也可采用在非核的细胞器如线粒体、叶绿体等中指导序列转录和/或表达的控制序列。天然地，采用在所选用于表达的细胞类型、细胞器和生物中可有效地指导DNA区段表达的启动子和/或增强子是重要的。那些分子生物学领域的技术人员一般知道用于蛋白质表达的启动子、增强子和细胞类型组合的用途，如参见Sambrook等人(1989)，在此处引用作为参考。所采用的启动子可为组成型、组织特异性的、诱导型和/或在适当条件下用于指导已引入的DNA区段高水平表达的，如在重组蛋白质和/或肽的大规模生产中有利的。该启动子可为异源的或内源的。在一个特定的实施方案中，该启动子是合成的生肌启动子，如由Li等人(1999)所描述的。对组织特异性启动子或元件的鉴定及其活性表征的测定为本领域技术人员所公知。这些区域的例子包括人LIMK2基因(Nomoto等人，1999)、促生长激素细胞受体2基因(Kraus等人，1998)、鼠附睾视黄酸结合基因(Lareyre等人，1999)、人CD4(Zhao-Emonet等人，1998)、小鼠α2(XI)胶原蛋白(Tsumaki等人，1998)、D1A多巴胺受体基因(Lee等人，1997)胰岛素样生长因子II(Wu等人，1997)、人血小板内皮细胞粘着分子-1(Almendro等人，1996)。
b.起始信号和内部核糖体结合位点特定的起始信号对于编码序列的有效表达也是必需的。这些信号包括ATG起始密码子或临近的序列。可能需要提供外源的翻译控制信号，包括ATG起始密码子。本领域的一般技术人员易于能够确定该情况并提供必需的信号。众所周知，起始密码子必须与所需编码序列的可读框“同框(in frame)”以保证整个插入物的翻译。外源的翻译控制信号和起始密码子可为天然的或合成的。表达的效率可通过包含适当的转录增强子元件而增强。在本发明的某些实施方案中，内部核糖体进入位点(IRES)元件的用途被用于产生多基因，或多顺反子，信息。IRES元件能够忽略5’甲基化帽子依赖性翻译的核糖体扫描模型并在内部位点起始翻译(Pelletier和Sonenberg，1988)。已描述了来自细小核糖核酸病毒(picornavirus)家族的2个成员(polio和脑心肌炎)的IRES元件(Pelletier和Sonenberg，1988)以及来自哺乳动物信息的IRES(Macejak和Sarnow，1991)。IRES元件可与异源的可读框连接。多个可读框可一起转录而生成多顺反子信息，各自由一个IRES分隔。利用IRES元件的优点，每一可读框都可接近核糖体以进行有效翻译。多基因可用单个启动子/增强子有效表达以转录为单一的信息(参见美国专利5,925,565和5,935,819，此处引用作为参考)。
c.多克隆位点载体可包括多克隆位点(MCS)，该位点是含有多个限制性内切酶酶切位点的核酸区域，其中的每一个都可与标准重组技术结合使用以消化载体。(参见Carbonelli等人，1999，Levenson等人，1998和Cocea，1997，此处引用作为参考。)“限制性内切酶消化”指用仅在核酸分子的特定位置发挥功能的酶催化切割核酸分子。许多限制性内切酶都有商品。这样的酶的用途为本领域技术人员广泛理解。经常地，将载体用在MCS内切割的限制性内切酶进行线性化或片段化以使得外源序列能够连接载体。“连接”指在2个核酸分子片段之间形成磷酸二酯键的过程，该片段彼此可相邻接或不相邻接。包括限制性内切酶和连接反应的技术为重组技术领域的技术人员所公知。
d.剪接位点许多转录的真核RNA分子将进行RNA剪接以从初级转录物中去除内含子。含有基因组真核序列的载体可需要供体和/或受体剪接位点以保证用于蛋白质表达的转录物的正确加工。(参见Chandler等人，1997，此处引用作为参考。)e.聚腺苷酸化信号在表达中，一般将包括聚腺苷酸化信号以使转录物正确地进行聚腺苷酸化。不认为聚腺苷酸化信号的特性对于本发明的成功实践是关键的和/或可采用任何这样的序列。优选实施方案包括SV40聚腺苷酸化信号和/或牛或人生长激素聚腺苷酸化信号，这些信号是方便的和/或已知在各种目标细胞中发挥很好的功能。也思考作为表达盒的一个元件是转录终止位点。这些元件适合于增强信息水平和/或使从该盒到其他序列的连读最小化。
f.复制的起点为了在宿主中扩增载体，它可含有一个或多个复制起点位点(通常称为“ori”)，该位点是在该处起始复制的特定核酸序列。或者，如果宿主细胞是酵母时可采用自主复制序列(ARS)。
g.选择性和筛选性标记在本发明某些实施方案中，细胞含有本发明的核酸构建体，该细胞可通过在表达载体中包括标记而体外或体内被鉴定。这样的标记可赋予细胞可鉴定的改变以使得含有该表达载体的细胞易于鉴定。通常地，选择性标记为赋予允许选择的性质的标记。正选择性标记为当其存在时允许其选择的标记，而负选择性标记为当其存在时防止其选择的标记。正选择性标记的一个例子为药物抗性标记。通常包含药物选择性标记可有助于转化体的克隆和鉴定，例如，赋予对新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、DHFR、GPT、zeocin和组氨醇抗性的基因是有用的选择性标记。除赋予允许基于实施条件而区别转化体的表型的标记之外，也思考其他类型的标记，包括筛选性标记如GFP，其基础为比色分析。另外，可使用筛选性酶如单纯疱疹病毒胸苷激酶(tk)或氯霉素乙酰转移酶(CAT)。本领域的技术人员也知道如何采用免疫学标记，可能与FACS分析结合。不认为所用标记是重要的，只要其能够与编码基因产物的核酸同时表达。选择性和筛选性标记的进一步的实例为本领域技术人员所公知。
2.宿主细胞如在此处所用的，术语“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用。所有这些术语也包括其后裔，这可为任何或所有后继世代。可理解所有后裔由于有意的或无意的突变而可能不相同。在表达异源核酸序列的情况下，缩主细胞”指原核或真核细胞，且其包括任何能够复制载体和/或表达由载体编码的异源基因的可转化生物体。宿主细胞可且已经用作载体的受体。宿主细胞可被“转染”或“转化”，这指外源核酸转移或引入宿主细胞的过程。转化的细胞包括原代接受实验的细胞及其后裔。宿主细胞可衍生自原核生物或真核生物，这依赖于所需结果是复制载体还是表达部分或全部载体编码的核酸序列。许多细胞系和培养物可用作宿主细胞，且可通过美国模式培养物保藏所(ATCC)获得，该保藏所是作为活体培养物和遗传材料的档案的组织(www.atcc.org)。适当的宿主可由本领域的技术人员基于载体的主链和所需结果来确定。例如，可将质粒或粘粒引入到原核生物宿主细胞中以复制许多载体。用作宿主细胞以进行载体复制和/或表达的细菌细胞包括DH5α、JM109和KC8，以及许多商品细菌宿主如SURECompetent Cells和SOLOPACK Gold Cells(STRATAGENE，LaJolla)。另外，细菌细胞如大肠杆菌(E.coli)LE392可用作噬菌体病毒的宿主细胞。用作载体复制和/或表达的真核宿主细胞例子包括HeLa、NIH3T3、Jurkat、293、Cos、CHO、Saos和PC12。许多来自各种细胞类型和生物体的宿主细胞可用且为本领域技术人员所公知。相似地，病毒载体可与真核或原核宿主细胞结合使用，特别是那些允许载体复制或表达的。一些载体可采用允许其在原核和真核细胞两者中复制和/或表达的控制序列。本领域的技术人员进一步可理解将所有上述宿主细胞温育以维持该宿主并允许载体复制的条件。同样理解和知道允许大规模生产载体以及由载体编码的核酸和其相关的多肽、蛋白质或肽的技术和条件。
3.表达系统有许多包含至少部分或全部上述组合物的表达系统。基于原核生物和/或真核生物的系统可用于本发明以生产核酸序列或其相关的多肽、蛋白质或肽。许多这样的系统是商品且广泛可用。昆虫细胞/杆状病毒(baculovirus)系统可产生异源核酸片段的高水平蛋白质表达，如在美国专利No.5,871,986，4,879,236中所述，此处将两者引用作为参考，且该系统可以购得，例如为来自INVITROGEN的MAXBAC2.0和来自CLONTECH的BACPACKTMBACULOVIRUS EXPRESSION SYSTEM。其他表达系统的例子包括STRATAGENE的COMPLETECONTROL诱导型哺乳动物表达系统，该系统包括合成的蜕皮激素诱导受体，或其pET表达系统，即一种大肠杆菌表达系统。该诱导型表达系统的另一个例子可得自INVITROGEN，它含有T-REXTM(四环素调节的表达)系统，即一种使用全长CMV启动子的诱导型哺乳动物表达系统。INVITROGEN也提供了一种称为Pichia methanolicaExpression System的酵母表达系统，该系统设计为在甲基营养酵母Pichia methanolica中高水平生产重组蛋白质。本领域的技术人员可知道如何表达载体如表达构建体以生产核酸序列和其相关的多肽、蛋白质或肽。
突变在使用时，突变通过各种标准的突变程序来实现。突变是借此在生物的量和结构中发生变化的过程。突变可涉及修饰单一基因、一批基因或整个染色体的核苷酸序列。单一基因中的变化可为点突变的结果，该点突变包括DNA序列中去除、添加或替代单个核苷酸碱基，或者该变化可为包括大量核苷酸的插入或删除的改变的结果。突变可作为如DNA复制忠实性中的错误或转座遗传因子(转座子)在基因组中运动的事件的结果而自然地发生。它们也可在暴露于化学或物理突变剂后而被诱导。这样的突变诱导剂包括电离辐射、紫外线和多种化学药剂如烷化剂和多环芳香烃，所有这些都能够直接或间接地(一般是伴随于一些代谢生物转化之后)与核酸相互作用。由这样的环境药剂诱导的DNA损害在受影响的DNA进行复制或修复时可导致碱基序列的修饰，并因而导致突变。突变也可通过使用特殊的寻靶方法而为定点进行。
定点突变结构引导的位点特异性突变代表了进行蛋白质-配体相互作用的剖析和操纵的有力工具(Wells等人，1996，Braisted等人，1996)。该技术通过向所选DNA中引入一或多种核苷酸序列而提供了对序列变体的制备和检验。位点特异性突变使用编码所需突变的DNA序列的特定寡核苷酸序列以及足够数目邻接的未修饰核苷酸。在该途径中，提供了具有足够大小和复杂性的引物序列以在横跨的缺失接点的两侧形成稳定的双链体。长度约为17到25个核苷酸的引物为优选，该引物在被改变的序列的接点两侧各有约5到10个残基。该技术一般采用以单链和双链形式存在的噬菌体载体。在定点突变中有用的载体包括如M13噬菌体的载体。这些噬菌体载体有商品出售，且其用途对于本领域的技术人员一般是公知的。双链的质粒也常规地用于定点突变中，它省去了将目的基因从噬菌体转移到质粒中的步骤。通常，首先要获得单链的载体，或者将双链载体的两条链熔解，该载体在其序列中包含编码所需蛋白质或遗传因子的DNA序列。然后将合成制备的具有所需突变序列的寡核苷酸引物与单链DNA制备物退火，在选择杂交条件时考虑错配的程度。将杂交的产物用DNA聚合酶如大肠杆菌聚合酶I(Klenow片段)处理以完成具有突变的链的合成。因而，形成了异源双链，其中一条链编码原来无突变的序列，而第二条链具有所需突变。然后将该异源双链载体用于转化适当的宿主细胞如大肠杆菌细胞，并选择那些包括具有突变序列排列的重组载体的克隆。对给定蛋白质残基的功能重要性和信息含量的全面信息最好可通过饱和突变而获得，其中对所有的19个氨基酸替代都进行了检查。该方法的缺点是多残基饱和突变的后勤工作是令人沮丧的(Warren等人，1996，Brown等人，1996；Zeng等人，1996；Burton和Barbas，1994；Yelton等人，1995；Jackson等人，1995；Short等人，1995；Wong等人，1996；Hilton等人，1996)。必须研究数百甚至可能数千位点特异性突变。然而，改善的技术使得突变的产生和快速筛选更加简单。也参见美国专利5,798,208和5,830,650对“预排(walk-through)”突变的描述。其他定点突变的方法公开于美国专利5,220,007；5,284,760；5,354,670；5,366,878；5,389,514；5,635,377和5,789,166。
剂量和制剂本发明的组合物(活性成分；此处为包含启动子、编码SEQ ID NO1或SEQ ID NO8的核苷酸序列和可操作地在适当距离顺序连续以进行功能性表达的3’非翻译区)可被制备并施用以通过任何方法而对各种生长缺乏状态发生作用，其中的方法使活性成分与动物体内的药剂作用位点产生接触。本发明的该组合物定义为含有编码本发明的化合物的核苷酸序列的载体，它是此处描述的氨基酸序列类似物。该组合物是以足够的量施用以生成该化合物的治疗有效量。本领域的技术人员认识到术语“施用”和“引入”可互换使用。它们作为单独的治疗有效成分或者与治疗有效成分组合，可通过可与药物结合使用的任何常规方法施用。在一个优选实施方案中活性成分单独或者在如PBS的缓冲液中施用，但可与基于所选施用途径和标准用药实践而选择的药物载体一起施用。这样的药物组合物可用于人和兽医两者的临床医学中治疗或诊断的目的。例如，它们用于对生长相关病症的治疗中，如由生长激素生产异常而导致的垂体侏儒症。此外，它们也可用于刺激用于肉类生产的蓄养动物的生长或增强其饲料转变效率、增强乳汁的生产和刺激蛋类的生产。施用的剂量将为活性成分的治疗有效量，并当然将依赖于已知的因素而变化，该因子为如特定活性成分的药物动力学特征及其施用的模式和途径、动物类型、受者的年龄、受者的性别、受者的生殖状况、受者的健康、受者的重量、症状的性质和程度、共存的治疗的类型、治疗的频率和所需效果。本发明要施用的载体的适当剂量将依赖于个别被试者和其他的参数而有些改变。熟练的从业者将能够基于已知的与正常生长相关的生长激素循环水平和载体的生长激素释放活性而确定适当的剂量。如本领域所公知的，对雌性或母亲的治疗以生产更大的动物将必须在个体间变化剂量，该剂量依赖于必需的生长激素增加水平的程度。因而，根据本发明提供了一种增加后代生长的方法，该方法包括对该后代的雌性或母亲施用一定量本发明的类似物，该量足够使生长激素增加到比与正常生长相关的水平更高的水平。正常的生长激素水平在个体间有相当大的变化，且对于任何给定的个体，循环的生长激素的水平在一天的过程中有相当大的变化。也提供了一种通过施用一定量的本发明的GHRH类似物来增加动物生长速度的方法，其中的量足够刺激生长激素以比与正常生长相关水平更高的水平生产。
基因治疗施用在适当之处，基因治疗载体可用本领域公知的途径根据各自的施用途径配制为固体、半固体、液体或气体形式的制剂。本领域公知的方法可用于预防组合物的释放和吸收，直到其到达目标器官或者保证组合物的定时释放。可采用药物可接受的形式，该形式不使本发明的组合物无效。在药物剂量形式中，该组合物可单独使用或与其他药物活性化合物适当地联合及组合使用。因此，本发明的药物组合物可经由各种途径递送并到达动物身体的各个位点以实现特殊的作用(参见如Rosenfeld等人(1991)；Rosenfeld等人(1991a)；Jaffe等人，1992)。本领域的技术人员将认识到尽管有多于一种的途径可进行施用，但特定途径可比其他的途径提供更直接和更有效的反应。局部或全身递送可通过包含将制剂应用或滴入体腔、吸入或吹入气溶胶施用，或者通过包含肌内、静脉内、腹膜的、皮下、皮内的肠胃外引入以及局部施用而实现。本领域的技术人员认识到不同的递送方法可用于将载体施用于细胞。例子包括(1)利用物理手段的方法，如电穿孔(电学)、基因枪(物理的力)或应用大量的液体(压力)；和(2)其中该载体与其他实体如脂质体或转运蛋白分子复合的方法。因此，本发明提供将治疗基因转移入宿主的方法，该方法包含用任何前述的施用途径或本领域技术人员公知且适合于特殊应用的其他施用途径，施用本发明的载体，优选作为组合物的部分。根据本发明载体向宿主的有效基因转移可根据治疗效果来监控(如与被治疗的特殊疾病相关的一些症状的减轻)，或者进一步地通过转移的基因或该基因在宿主中表达的证据来监控(如用聚合酶链反应与测序、Northern或Southern杂交或者转录测定以在宿主细胞中探测核酸，或者用免疫印迹分析、抗体介导的探测、mRNA或蛋白质半衰期研究或特别指出的测定以探测由转移的核酸编码的或由于这样的转移而引起的水平和功能受影响的蛋白质或多肽)。此处描述的这些方法并不全备，且适合于特定应用的进一步的方法对一般的技术人员而言显而易见。此外，该组合物的有效量可进一步通过与已知可发挥所需作用的组合物类比而估计。此外，实际的剂量和时间表可依赖于该组合物否是与其他的药物组合物组合施用，或依赖于药代动力学、药物积累(disposition)和代谢的个体间差异而有变化。类似地，该量可依赖于所使用的特殊细胞系(如基于存在于细胞表面的载体受体的数目，或所采用的进行基因转移以在该细胞系中进行复制的特殊载体的能力)而在体外应用中有所变化。此外，每细胞要添加的载体的量很可能根据插入到载体中的治疗基因的长度和稳定性以及该序列的特性而有变化，该量是一个需要根据实验进行确定的特殊的参数，且可以由于本发明的方法所非固有的因素而改变(如与合成有关的成本)。本领域的技术人员易于根据特殊情况的迫切需要而做任何必需的调整。下面的实施例是以实例的方式提供，且不意谓着以任何方式限制本发明的范围。
实施例1GHRH超活性类似物增加GH促分泌素的活性和稳定性GHRH在人(Frohman等人，1984)和猪两者的循环系统中具有相对短的约12分钟的半衰期。通过采用延长其生物学半衰期和/或改善其GH促分泌素活性的GHRH类似物，实现增强GH分泌。GHRH突变型通过定点突变来生成。将Gly15替代为Ala15以增加α-螺旋构象和两亲性结构以减少被胰蛋白酶样酶的切割(Su等人，1991)。具有Ala15替代的GHRH类似物显示对GHRH受体的4-5倍高的亲和力(Campbell等人，1991)。为了用具有自由COOH-末端的分子的稍微更稳定的形式中减少由于Met的氧化而导致的生物学活性的丧失(Kubiak等人，1989)，进行了Met27和Ser28到Leu27和Ash28的替代。因而，形成了表示为GHRH-15/27/28的三氨基酸替代突变型。二肽基肽酶IV是主要的血清GHRH降解酶(Walter等人，1980；Martin等人，1993)。更差的二肽酶底物通过采用GHRH15/27/28并然后将Ile2替代为Ala2(GHRH-TI)或Val2(GHRH-TV)，或通过将Tyr1和Ala2转变为His1和Val2[GHRH-HV(图1A)；H1V2A15L27N28]而产生。
实施例2DNA构建体在一个特定的实施方案中，在本发明中使用SEQ IDNO9(pSPc5-12-HV-GHRH)的质粒。在另一个特定的实施方案中，使用了一个质粒载体，其中该质粒包含pVC0289主链(SEQ ID NO10)、启动子如SEQ ID NO6、GHRH cDNA如猪HV-GHRH(突变型HV-GHRH cDNA)和3’UTR如来自人GH(SEQ ID NO7)的。为了检验突变的猪GHRH cDNA序列的生物学效能，将质粒载体重组为其能够通过新描述的合成的肌肉启动子来指导骨骼肌特异性基因表达，该启动子为SPc5-12，它含有来自骨骼α-肌动蛋白的近侧血清反应元件(SRE)、多重MEF-2位点、多重MEF-1位点和TEF-1结合位点(Li等人，1999)。在人GH cDNA 3’非翻译区之后，将228-bp的猪GHRH片段通过本领域公知的方法结合入生肌GHRH表达载体中，其中的猪GHRH片段编码31个氨基酸的信号肽和完整的成熟肽猪GHRH(Tyr1-Gly40)和或GHRH突变型。质粒pSPc5-12在pSK-GHRH主链的Sac I/BamH I位点(Draghia-Akli等人，1997)包含SPc5-12合成启动子的360bp的Sac I/BamH I片段(Li等人，1999)。野生型和突变的猪GHRH cDNAs通过用试剂盒改变的位点II体外突变系统(Altered Sites II in vitro MutagenesisSystem)(Promega；Madison，WI)对人GHRH cDNA进行定点突变而获得。将人GHRH cDNA作为BamH I-Hind III片段亚克隆入pALTERPromega载体的相应位点上，且根据生产商的说明书进行突变。猪野生型cDNA是从人cDNA通过用引物SEQ ID NO25’-AGGCAGCAGGGAGAGAGGAACCAAGAGCAAGGAGCATAATGACTGC-AG-3’来改变人氨基酸34和38而获得的。猪HV突变是用引物SEQ ID NO35’-ACCCTCAGGATGCGGCGGCACGTAGATGCCATCTTCACCAAC-3’来制得。猪15Ala突变是用引物SEQ ID NO45’-CGGAAGGTGCTGGCCCAGCTGTCCGCC-3’来制得。猪27Leu28Asn突变是用引物SEQ ID NO55’-CTGCTCCAGGACATCCTGAACAGGCAGCAGGGAGAG-3’来制得。在突变后，将结果所得的克隆进行测序以证实其正确性，并随后通过本领域技术人员公知的方法亚克隆入在本实施例中描述的pSK-GHRH的BamH I/HindIII位点。
实施例3细胞培养和转染实验同样成功地在猪垂体前叶培养物和原代鸡成肌细胞培养物中进行。然而，图示说明了猪垂体前叶培养物生成的数据。原代鸡成肌细胞培养物按如下所述获得。将鸡胚胎组织收获，解剖而去除皮肤和软骨并机械地解离。使细胞悬浮液通过一种粗棉布和擦镜纸，然后以1×108到2×108/100mm塑料培养皿的密度进行平板培养。将仍然存在于悬浮液的细胞群体以2×106到3×106个细胞/胶原蛋白覆盖的100mm塑料培养皿的密度进行平板培养并在5％的CO2环境中于37℃进行温育。然后在转染前使细胞以1.5×106/100mm平板的密度在最小基本培养基(Minimal Essential Medium)(MEM)中平板培养，该培养基中补充了10％的热失活的马血清(Heat Inactivated Horse Serum)(HIHS)、5％的鸡胚胎提取物(CEE)(Gibco BRL；Grand Island，NY)和庆大霉素。进一步详情参见Draghia-Akli等人，1997和Bergsma等人，1986。猪垂体前叶培养物基本如所述获得(Tanner等人，1990)。简要地，垂体组织酶条件下解离，并在塑料皿上平板培养足够的时间以允许附着。然后在实验前将该细胞漂洗并暴露于温育培养基中。详情参见Tanner等人(1990)。根据生产商的说明书用脂质转染胺(lipofectamine)以每100mm平板4μg质粒来转染细胞。转染后，将培养基变为含有2％的HIHS和2％的CEE的MEM以允许细胞分化。在分化后72小时收获培养基和细胞。转染的效率通过对照平板的β-半乳糖甘酶组织化学估计为10％。在收获的前一天，将细胞在汉克氏平衡盐溶液(HBSS)中洗涤两次且将培养基变为MEM、0.1％的牛血清白蛋白。条件培养基通过添加0.25体积的1％三氟乙酸和1mM苯甲基磺酰氟，于-80℃冷冻，冻干，在C-18 Sep-Columns(Peninsulalaboratories，Belmont，CA)上纯化，再冻干并用于放射性免疫测定或重悬于原代猪垂体前叶培养物的条件培养基中。
实施例4
GHRH超活性类似物增加GH促分泌素活性和稳定性成骨骼肌细胞(skeletal myoblast)如实施例3那样用各个构建体进行转染，且对从条件培养的培养基细胞中纯化的GHRH部分在猪垂体前叶细胞培养物中测定生长激素释放。如图1B所示，在24小时后收集并用猪特异性GH-放射性免疫测定定量的培养基显示对于修饰的GHRH种类(GH15/27/28；GHRH-TI；GHRH-TV)比野生型猪GHRH在GH分泌的适当增加总计为20％到50％。4个突变型中只有1个即GHRH-HV在促分泌素活性中具有真正的增加，其中猪GH水平从基线值200ng/ml增加到1600ng/ml(图1B)。
实施例5HV-GHRH分子的血浆温育从对照猪中收集集中的猪血浆贮存于-80℃。化学合成的HV-GHRH通过肽合成制备。将猪血浆解冻并离心，置于37℃以允许平衡。将GHRH突变型溶解于血浆样品中达到100μg/ml的终浓度。紧接在添加GHRH突变型之后，和15、30、60、120和240分钟之后，取1ml的血浆并用1ml的1M TFA进行酸化。酸化的血浆在C18亲和SEP-Pak柱上纯化，冻干并用Walters 600多系统递送系统、Walters智能样品处理器、717型和Walters光谱监控器(spectromonitor)490(Walters Associates，MilliporeCorp.，Milford，MA)通过HPLC进行分析。该探测在214nm进行。在这些时间点降解的肽的百分数通过整合的峰测量法(integratedpeak measurements)测量。然后野生型GHRH和其类似物GHRH-HV的稳定性在猪血浆中通过GHRH肽的温育，并随后固相提取和HPLC分析来检验。如图1C所示，95％的野生型GHRH(1-44)NH2在血浆中温育60分钟内降解。相反，GHRH-HV在猪血浆中的温育显示在温育4到6小时期间至少75％的多肽受到了对酶切割的防护。因而，在相同的条件下，GHRH-HV的主要部分仍然完整，而野生型GHRH则完全降解了，显示GHRH-HV对血浆蛋白酶稳定性的相当高的增加(图1C)。
实施例6动物研究在GHRH研究中使用了3组，每组5个3-4周龄杂交母猪(barrow)(Yorkshire，Landrace，Hampshire和Duroc)。该动物可无限制地接近水和6％的其体重膳食(24％的蛋白质猪食，Producers Cooperative Association，Bryan，TX)而单独圈养。每隔一天于上午830将动物称重，并随后加入饲料。该动物根据NIH指南、USDA和Animal Welfare Act指南来维持。
实施例7给猪肌内注射质粒DNA将无内毒素的质粒(Qiagen Inc.，Chatsworth，CA)制剂pSPc5-12-HV-GHRH、pSPc5-12-wt-GHRH和pSPc5-12bgal在PBS(pH7)中稀释到1mg/ml。使动物相等地分配一次治疗。用异氟烷(isoflurane)(浓度2-6％用于诱导而1-3％用于维持)麻醉猪。通过手术程序将颈静脉导管植入动物中以在注射后3、7、14、21、28、45、和65日取血。当麻醉时，将10mg质粒直接注射入猪的半腱肌肌肉中。注射后2分钟，将注射的肌肉置于一套卡钳之间并用最适的条件为200V/cm以60毫秒的4个脉冲进行电穿孔(Aihara等人，1998)。在注射后65日，处死动物并将内部器官和注射的肌肉收集，称重，于液氮中冷冻并贮存于-80℃。将畜体称重并用中子活化法进行分析。测量了背部的脂肪。
实施例8pSP-HV-GHRH的肌肉注射在2个月内增加猪GHRH、GH和IGF-I的血浆水平有最适蛋白酶抗性的pSP-HV-GHRH载体促进GHRH长时间表达和刺激GH和IGF-I分泌水平的能力被确定。pSP-HV-GHRH以及作为野生型对照的野生型构建体pSP-wt-GHRH和作为安慰剂对照的合成的生肌启动子大肠杆菌β-半乳糖甘酶表达载体，pSP-βgal的示意图在图2A中表示。将3周龄阉割的公猪麻醉，并将颈静脉导管插入以在不使动物不安的情况下收集血样。质粒表达载体DNA(10mg的pSP-HV-GHRH、pSP-wt-GHRH或pSP-βgal的DNA)直接注射入半腱肌肌肉，然后对肌肉进行电穿孔(参见实施例7)。
实施例9猪GHRH、GH和IGF-I测量猪GHRH用异源的人测定系统(PeninsulaLaboratories，Belmont，CA)进行测量。该测定的灵敏度为1pg/管。血浆中的猪GHRH用特定的双抗体程序RIA(The PennsylvaniaState University)进行测量。该测定的灵敏度为4ng/管。猪IGF-I用异源的人测定(Diagnostic System Lab.，Webster，TX)进行测量。数据用Microsoft Excel统计分析包进行分析。在图中显示的值为平均数±s.e.m。特定的p值通过用Studentst检验进行比较而获得。设置p＜0.05作为统计显著的水平。在半腱肌肌肉内注射了pSP-HV-GHRH的猪体内，GHRH水平在注射后7日增加(图2B)，且在14日为对照水平的150％(652.4±77pg/ml对419.6±13pg/ml)。pSP-HV-GHRH表达活性在60日达到了稳定水平，该水平约比注射了安慰剂的对照值水平高2~3倍。由pSP-HV-GHRH注射的猪分泌的血清GHRH的绝对量比注射了安慰剂的对照值(1426.49±10.47ng对266.84±25.45ng)高3倍(图2C)，其中该绝对量对在0日和60日之间增加的体重进行了校正(血液体积占总体重的8％)。野生型pSP-GHRH注射的动物，注射在半腱肌肌肉内，仅在注射后45日开始显示GHRH水平的适当增加，但在注射后60日有2倍的增加(779.36ng)，其水平足够引起生物学效应。年轻动物具有随年龄逐渐降低的高水平GH。对最初注射后7和14天于24小时的期间内每隔15分钟所取的血样进行了pGH水平的测定，并将该水平外推到pGH含量的总变化。pSP-HV-GHRH注射的猪(图2D)在注射后7日(δ变差HV＝+1.52，wt＝-0.73对对照＝-3.2ng/ml)和注射后14日(6变差HV＝+1.09，wt＝-4.42对对照＝-6.88ng/ml)显示其GH含量明显的增加。增加的全身GH水平的另一个指示为IGF-I水平的增加。猪血清IGF-I水平在pSP-HV-GHRH注射的猪中在注射后约3日开始增加(图2E)。在21日，这些动物的血清IGF-I水平平均增加约3倍，该水平维持到60日(p＜0.03)。作为比较地，用野生型pSP-GHRH表达载体注射的猪仅在其循环IGF-I水平中具有40％的增加(p＝0.39)，如图2E所示。
实施例10生肌GHRH表达载体增强猪的生长在肌内注射生肌pSP-GHRH表达载体后分泌入全身循环的猪GH将阉割的年轻公猪的生长增加了65天。身体组成测量在注射后30和65日于体内进行(光密度测定法，K40)或者在死后进行(器官、畜体、身体脂肪，直接解剖并随后进行中子活化室)。野生型pSP-GHRH注射的动物平均比安慰剂对照重21.5％(37.125kg对29.375kg)，而pSP-HV-GHRH注射的猪增重37.8％(41.775kg；p＝0.014)，如图3A中所示。当与对照比较时，用GHRH构建体注射的猪的饲料转变效率也改进了20％(每公斤重量增加对于在pSP-HV-GHRH为0.267kg食物/天，在pSP-wt-GHRH中为0.274kg，对在pSP-βgal注射的猪中为0.334kg)(图3B)。通过光密度测定法，K40钾室和中子活化室进行的身体组成研究显示在GHRH注射的动物中所有身体成分成比例的增加，而没有脏器肿大(organomegaly)、身体脂肪相关比例和有关的病理学的迹象。安慰剂注射的对照猪和pSP-HV-GHRH注射的猪在45天后的照片如图3C所示。在表I中所示的pSP-HV-GHRH注射的猪的代谢概况意味着pSP-GHRH和pSP-HV-GHRH各自的血清尿素水平的显著降低(对照中为9±0.9mg/dl，注射的猪中为8.3±1mg/dl和6.875±0.5mg/dl)(p＝0.006)，显示降低的氨基酸代谢。血清葡萄糖水平在对照和质粒GHRH注射的猪之间是相似的(对照猪中为99.2±4.8mg/dl，pSP-HV-GHRH注射的猪中为104.8±6.9mg/dl，且在野生型pSP-GHRH注射的猪中为97.5±8mg/dl)(p＜0.27)。未发现其他的代谢变化。
表IGHRH注射的猪和对照的代谢概况(值为mg/ml)。
葡萄糖 尿素肌酸酐 总蛋白质对照 99.2±4.8 9±0.9 0.82±0.06 4.6±0.22pSP-wt-GHRH 97.5±8 8.3±1 0.83±0.056 4.76±0.35pSP-HV-GHRH 104.8±6.9 6.875±0.5 0.78±0.04 4.88±0.23实施例11不同水平pSP-HV-GHRH的实验为了进一步研究pSP-HV-GHRH对小猪生长的作用，将2个小猪的组在出生后10日用新的注射型六针阵列电极(six needle-array electrode)进行pSP-HV-GHRH的注射(3mg、1mg、100微克)。这些电极预先进行了检验，且比本领域公知的卡钳电极效率高10倍。因此，针电极优选用于本发明的方法中。如图4所示，用100微克质粒注射的组显示了最好的生长曲线，在50日龄后与对照相比具有显著的统计学差异。在用3mg注射的组中的一个动物发展了抗体并显示了显著降低的生长模式。同样地，将2个小猪的组在出生后10日用指定的pSP-HV-GHRH剂量进行了注射。IGF-I值在注射后10日开始增加，且在注射后35日用100微克质粒注射的猪的IGF-I平均比对照高10.62倍。用1mg注射的猪比对照平均高7.94倍，且用3mg注射的猪比对照值平均高1.16倍。因而，在一个特定的实施方案中，注射了较低剂量的pSP-HV-GHRH。在一个特定的实施方案中使用了约100微克(.1毫克)的质粒。在另一个特定的实施方案中注射了约200-300微克。在另外一个实施方案中施用了50-100微克。
实施例12pSP-HV-GHRH的年龄比较为了使用于pSP-HV-GHRH注射的小猪的年龄最优化，将2个小猪的组在出生后开始用2mg的pSP-HV-GHRH进行注射。如图6所示，在出生后14日注射的组显示了最好的生长曲线，该曲线在每一个时间点上都与对照比较具有显著的统计学差异。在21日注射的组中的一个动物发展了抗体并显示了显著降低的生长模式。如果处理太早可能有胰岛素抗性(即＜约10-14日龄)。在一个特定的实施方案中，该治疗在天然GH和IGF-I水平为最低时最有效(约为生活10-14日)，且当GHRH水平为正常高度时可能达不到设想的目标。在一个特定的实施方案中，假设免疫监视系统在怀孕期间减少时，与未怀孕的动物相比，则在怀孕的动物中对于修饰的GHRH而生产的抗体数目的降低。
实施例13特定的实施方案总之，用于注射的最适时间点为出生后14日(在注射后40日平均比对照重8磅(p＜0.04))。用于注射的优选剂量为2-5ml体积中100微克质粒(在注射后40日平均比对照重6磅(p＜0.02))。在母猪1(时间进程)和母猪3(剂量曲线)的后代中激素和生物化学常数正常且与重量增加相关(IGF-I、IGF-BP3、胰岛素、尿素、葡萄糖、总蛋白质、肌酸酐)，而无有害的副作用。前述实验的身体组成研究显示HV-GHRH确定了所有身体部分的一致增加(身体组成与对照相似但更大)，而wt-GHRH确定了瘦体重的增加和脂肪的降低。假设生长激素的增加可导致体温的增加，在一个优选实施方案中，母猪在温度为约62°F约80°F的条件下注射的。
实施例14在第一窝仔之前将Ghrh生肌载体注射给怀孕的母猪为了测定GHRH生肌载体的生长作用，将怀孕的母猪在妊娠的最后3个月用10mg含有GHRH的载体进行注射。在本特定的实施例中，将母猪(～800磅)用10mg的pSP-HV-GHRH载体在其第一次怀孕的妊娠的90日进行注射。递送方法可为任何本领域中公知的任意一种。在一个特定的实施方案中，除了使用用于电穿孔的卡钳电极之外，该质粒递送如实施例7(图7)。该电极有6个针22g，这些针长度为2cm且位于直径1cm的圆形塑料支持体上。表2说明了在妊娠90日通过电穿孔用pSP-HV-GHRH(p2)进行注射的母猪生产的小猪在时间上的重量(kg)。表3说明了在相同日期未注射的母猪(p3)生产的对照动物的重量(kg)。表4表示pSP-HV-GHRH注射的母猪和未注射的母猪的小猪的身体组成数据(脂肪％/体重(BW)/d平均数)。该表代表脂肪对体重的相对比例并显示注射的母猪的小猪每单位重量的脂肪减少了18.5％。在获得身体组成数据之前将猪p1/2和p2/6处死。小猪的生物化学数据与该母猪的第二次怀孕所说明的相似(参见实施例15)。P值在所有时间点上都非常显著。这些表明显地显示在其妊娠期用pSP-HV-GHRH进行注射的母猪生产的小猪显著地比对照母猪生产的小猪更重。在不限制本发明的范围和不给本发明的界限和范围加以约束的情况下，本申请猜测注射入肌肉细胞的GHRH被分泌并通过胎盘。作为GHRH对垂体的过度生长和增生作用的结果，释放GH的垂体细胞的数目有增加。
实施例15注射的母猪的第二窝仔表5说明了母猪的第二窝仔的重量数据，该母猪在其第一次怀孕时用pSP-HV-GHRH进行注射。
表5小猪身体组成随时间的变化4月27日 5月1日 5/4/2000 5/8/2000 5/11/2000 5/16/2000 5/18/200 5/23/2000 7/13/2000母猪2 第1天第5天 第7天 第11天第14天 第19天 第21天第26天 第77天猪1 2.0973.264.22 5.627 6.505 8.49.1 10.75 36.32猪2 2.2643.512 4.46 5.882 6.799 8.79.4 11.25 37.228猪3 1.7582.783.68 4.817 5.77.58.25 10.25 35.866猪4 1.8952.843 3.62 4.733 5.714 7.17.6 8.932.234猪5 2.3973.458 4.24 5.704 6.692 8.85 9.6 11.35 39.498猪7 2.4573.599 4.68 6.132 7.05 8.99.65 11.55 37.682猪8 1.9072.882 3.58 4.767 5.593 6.95 7.55 9.65 36.32猪9 2.3813.524.23 5.635 6.45 8.25 8.9 10.65 34.504猪10 2.4733.655 4.57 5.935 6.87 8.69.25 10.7 39.952平均 2.1813.2787 4.14222 5.47022 6.374788.138898.81111 10.56111 36.62267STDEV 0.2733 0.3509 0.41817 0.54711 0.559860.757780.81616 0.853222.3808SE0.1933 0.2481 0.29569 0.38686 0.395880.535830.57711 0.603321.68348增长 01.0977 1.96122 3.28922 4.193785.957896.63011 8.3801134.44167总计(kg)19.629 29.509 37.28 49.23257.373 73.25 79.3 95.05 329.604磅 43.183 64.919 82.016108.3104 126.2206 161.15 174.46209.11 725.1288平均日增长 0.322310.44729在第二窝仔的妊娠期间或之后没有进行GHRH施用。自出生时第二窝仔就较大(在相似的环境下饲养的其他母猪的小猪在出生时的平均重量为1.71kg；而这些小猪在出生时平均为2.181kg)。在21日，所有特征为该品种和平均水平的窝仔的小猪的重量总计为～130磅(～59kg)，而以前用pSP-HV-GHRH注射的母猪的小猪总计为174磅(～79kg)。该优势得以维持，且在出生后77日该重量与本领域所公知的该品种中最佳情况相比平均大11-15磅(5.5-6kg)/猪。在出生后169日，注射的动物平均比对照大22磅(10kg)，p＜0.0007。母猪仅在注射/电穿孔程序中进行麻醉，且对它们使用了2.2mg/kg剂量的TELAZOL(环噻乙胺氢氧化物和唑氟氮氢氧化物的混合物)。对于小猪，在估计身体组成时使用了氯胺酮/甲苯噻嗪HCl的组合以进行麻醉，那时小猪必须在二重X-射线光密度测定仪(Dual X-ray Densitometry)(DEXA)机器上静仰卧约15分钟。具体地，使用氯胺酮20mg/kg+甲苯噻嗪1mg/kg(正规的甲苯噻嗪剂量为2mg/kg)。在另一个特定的实施方案中，施用本领域公知的其他麻醉剂，如氯胺酮15mg/kg+乙酰丙嗪0.4mg/kg。在另外一个特定的实施方案中无需对小猪进行麻醉即可采血、注射等。假设猪和一些其他的动物通常对不同类型的麻醉剂敏感且可通过其温度调节过程的主要改变而在麻醉后死亡(低体温或体温过高，后者更经常)，有时则施用阿托品。阿托品是抗胆碱能药物，它通常在麻醉前使用并认为它可促进分泌物的干燥和减少必需的麻醉剂的量、在该程序中防止心率紊乱并在麻醉恢复中增加动物的舒适程度，也降低了不利的异常热发作的频率。在特定的实施方案中用0.05mg/kg subq(皮下的)阿托品进行预处理。其他本领域公知的类似药物可用作阿托品的替换物。对小猪进行了多重的生物化学测量。表6到12提供了涉及这些测量的数据。胰岛素实验(表6)在5-25-00进行测量。所有前面检验的对照组的平均数为6.8μU/ml，且实验小猪的平均数为4.785μU/ml，无统计学显著性(p＝0.07)。
表6小猪的胰岛素浓度第25天猪14.3827猪24.131猪34.8176猪45.7899猪54.4267猪74.3076猪84.1648猪96.0921猪10 4.9527平均 4.78501STDEV 0.71397SE 0.23799IGF-I测定在5-25-00进行(参见表7)。实验组的平均数为145.509ng/ml，且所有前面检验的对照组的平均数为53.08ng/ml。因此，p值非常显著(p＜0.0001)。假设GH刺激了IGF-I的生产和释放，则该IGF-I测定GHRH水平增加的指示且在本领域中通常这样使用。
表7小猪的IGF-I浓度第1天 第10天 第18天 第25天猪1 290.46 118.63 185.01 356.02猪2 265.7 115.62 117.99 172.28猪3 109.27 77.389 200.75 109.99猪4 94.689 36.746 93.795 65.113猪5 155.98 95.946 138.24 179.3猪7 171.41 19.463 213.29 226.43猪8 178.3 101.55 98.478 165.88猪9 104.86 78.872 84.777.214猪10 262.4 131.36 206.23 138.99平均 181.452186.17511148.7203165.6908STDEV74.9141537.6133752.6717587.96496SE 24.9713812.5377917.5572529.32165对于表8，IGF-BP3(IGF-结合蛋白质3)免疫放射分析(IRMA)在5-25-00检验。IRMA采用了二位点的免疫放射分析(参见Miles LEM，Lipschitz DA，Bieber CP和Cook JD通过二位点的免疫放射分析对血清铁蛋白的测量。Analyt Biochem 61209-224，1974)IRMA是非竞争性测定，在其中要测量的分析物是在两个抗体间“被夹合的(sandwiched)”。第一个抗体固定于试管的内壁。另一个抗体进行了放射性标记以进行探测。存在于未知的、标准的和对照的样品中的分析物由两种抗体结合以形成“三明治(sandwich)”复合物。未结合的材料通过对试管的倾析和洗涤而除去。表8中的测量包含校正因子x50。表8说明了实验组的平均数为238.88，而所有前面检验的对照组的平均数为205.44ng/ml。有p＜0.048的统计学显著性。
表8小猪的IGF-BP3浓度第1天第10天 第18天 第25天 第1天 第10天第18天第25天猪1 7.9841 3.9177.1657 3.5957 399.205 195.85358.285 179.785猪2 7.5463 3.4327 3.3382 4.4706 377.315 171.635 166.91223.53猪3 3.4187 4.9039 6.7961 6.3021 170.935 245.195 339.805 315.105猪4 5.6354 4.2184 3.8551 1.9101 281.77210.92192.755 95.505猪5 4.2824.5592 5.2783 3.8224 214.1 227.96263.915 191.12猪7 3.7328 4.4454 2.9426 4.8232 186.64222.27147.13241.16猪8 5.4265 3.3285 4.1714 7.1258 271.325 166.425 208.57356.29猪9 3.7912 5.6354 3.9117 6.7643 189.56281.77195.585 338.215猪104.7668 5.6099 5.24 3.8474 238.34280.495 262 192.37平均5.17598 4.45004 4.74434 4.74018 258.7989 222.5022 237.2172 237.0089STDEV 1.6520.83658 1.48489 1.70536 82.6 41.8289 74.24472 85.2679SE 0.55067 0.27886 0.49496 0.56845 27.53333 13.94297 24.74824 28.42263表9说明了总蛋白质的浓度(g/dl)。实验组的平均数为5.3g/dl，而所有前面检验的对照组的平均数为4.02g/dl。有p＜0.0001的非常高的统计学显著性。
表9小猪的总蛋白质浓度第1天第10天 第18天 第25天猪15.7 5.9G.H. 5.5猪25.3 5.6 5.5 5猪35.2 5.3 5.3 5.4猪45.3 5.5 4.9 5.4猪55.8 5.3 55.4猪75.6 5.4 5.3 5.2猪84.5 5G.H. 4猪95.3 5.1 5.3 5.2猪10 6.3 55.2 5.5平均 5.44444 5.34444 5.21429 5.17778STDEV 0.49526 0.29627 0.20354 0.47111SE 0.16509 0.09876 0.06795 0.15704表10说明了肌酸酐的浓度(mg/dl)。实验组的平均数为0.936mg/dl，而所有前面检验的对照组的平均数为0.982mg/dl。无统计学显著性(p＜0.34)，这是正常肾功能的指示。
表10小猪的肌酸酐浓度第1天第10天 第18天 第25天猪10.75 0.96G.H. 1.14猪20.73 1.03 0.98 1.46猪30.69 0.92 0.95 1.1猪40.65 0.94 1.18 1.18猪50.64 0.8 0.91 0.92猪70.72 0.93 1.02 1.12猪80.68 0.9 0.83 1.2猪90.68 0.87 11.07猪10 0.74 1.02 1.02 1.03平均 0.69778 0.93 0.98625 1.13556STDEV 0.0393 0.07124 0.10113 0.14783SE 0.0131 0.02375 0.03371 0.04928表11说明了BUN(血液尿素水平)(mg/dl)。实验组的平均数为3.88mg/dl，而所有前面检验的对照组的平均数为8.119mg/dl。有p＜0.0012的显著的统计学显著性。
表11小猪的BUN浓度第1天 第10天第18天 第25天猪1 4 3 5 4猪2 4 3 3 6猪3 6 6 5 7猪4 5 3 4 5猪5 3 2 3 3猪7 3 3 3 3猪8 2 3 5 7猪9 3 3 4 4猪103 3 3 4平均3.666673.22222 3.888894.77778STDEV 1.224741.09291 0.927961.56347SE 0.408250.36430.309320.52116表12表示葡萄糖的浓度(mg/dl)。实验组的平均数为123.23mg/dl，而所有前面检验的对照组的平均数为122.8mg/dl。无统计学显著性(p＜0.67)，术语G.H.代表总血细胞溶解；在这些实施例中对生物化学常数的确定是不可能的。
表12小猪的葡萄糖浓度第1天 第10天 第18天 第25天猪1117115G.H. 115猪2112137130119猪3133138143115猪412512713290猪5115123133120猪7114120123115猪8126123G.H. 116猪9118129124119猪10 142134136112平均 122.4444 127.3333 131.5714 113.4444STDEV 9.988887.889876.900669.15302SE 3.329632.629962.300223.05101如这些表所说明的，IGF、IGF-BP3增加了(作为对GH轴刺激的结果)，尿素和总蛋白质分别降低和增加(这是改善的蛋白质代谢的信号)，然而胰岛素和葡萄糖则维持正常。胰岛素和葡萄糖的正常水平是本发明的一个优点，因为经典的GH治疗产生了具有高血糖的“糖尿病”样状况。在本实验中正常的肌酸酐是用于测量肾功能的参数，在动物中有时在不适当的代谢条件下肾功能被削弱。因而，在一个特定的实施方案中，由在其中最初用pSP-HV-GHRH注射的母猪怀孕之后的多次怀孕中生产的小猪显示了比正常水平或未用编码任何形式的GHRH的DNA注射的母猪所生产的动物增加的生长。猪的怀孕持续约114天，且容许的哺乳时间允许不多于2次怀孕/年。在一个特定的实施方案中，将编码GHRH的核酸序列施用于雌性或母亲与GH生产细胞约25-50％的增加有关。在另一个实施方案中，非怀孕的母猪在怀孕前进行注射。在另一个实施方案中，代替本发明pSP-HV-GHRH载体的施用，可使用本领域所公知的其他生长激素释放激素类似物。例如，使用野生型的GHRH。该实验以类似于此处提供的教导来进行。在另一个实施方案中，来自小猪的垂体是在处死小猪时收集的并测定垂体含量的变化。即，在小猪达到市场重量(～100kg)时将其处死并收集垂体。该测定包括不同类型激素分泌细胞的垂体相对含量(分泌生长激素、催乳素、促卵泡激素(FSH)等的细胞的相对比例)。
实施例16额外的实验在一个特定的实施方案中，将更多的母猪如约20只用与实施例14和15中提供的相同或相似的处理来进行注射。对多种的质粒量进行检验，如从100微克到10毫克，且每一处理使用5只猪的组。将死者与未注射的母猪的后代进行比较。在一个特定的实施方案中，这些实验在农场中进行，因此该数据可以文献记录标准化。
实施例17最优化实验为了在第一次怀孕时确定最适的注射次数，使用了怀孕的大鼠。大鼠的妊娠持续约21天。怀孕的大鼠在妊娠的5日和18日开始进行注射，且其后代在出生后不同的时间点进行检验。特定的实验包括重量、身体组成和不同类型激素分泌细胞的垂体相对含量(分泌生长激素、催乳素、FSH等的细胞的相对比例)。
实施例18增加乳汁生产的方法在本发明的一个实施方案中，有一种增加乳汁生产的方法(也称为哺乳)，该方法包括在如下条件下将有效量的载体引入动物细胞的步骤，其中编码生长激素释放激素的核苷酸序列得以表达且其中该载体包含启动子、编码该生长激素释放激素的核苷酸序列和可操作地连接以使得该核苷酸序列进行功能性表达的3’非翻译区，且其中该载体的引入和表达导致动物中乳汁生产的增加。在一个特定的实施方案中，该动物为人、母牛、猪、山羊或绵羊。通过在此处描述的方法将包含GHRH的载体引入到动物中增加动物乳汁的生产。在一个特定的实施方案中，该动物是雌性或母亲或怀孕的雌性。在进一步特定的实施方案中，该雌性或母亲的后代由于雌性或母亲的乳汁生产的增加而在约最初的2个星期内生长较快。如在此处所讨论的，乳汁生产的增加是在将编码GHRH的核酸一次注射动物时发生。技术人员知道如何测量乳汁生产的增加，如在美国专利No.5,061,690；5,134,120和5,292,721或者在Peel等人，J.Nutr.，1981，1111662中的方法。乳汁样品是在产小猪(初乳)时和哺乳的13日和20日人工表达的。施用了40IU催产素的肌内注射(除初乳收集之外)且尽可能快地对每只母猪的两个腺挤奶直到没有更多的乳汁。将来自两个腺的样品充分混合且等分试样与防腐剂如重铬酸钾一起存放于2个小瓶中。将小瓶冷冻直到进行分析。乳汁脂肪、干物质和蛋白质根据本领域的标准程序如A.O.A.C.(1980)程序来确定。在一个特定的实施方案中，乳汁乳糖用半自动化的(27型工业分析仪，YellowSprings Instrument Co.，Inc.，Yellow Springs，Ohio)酶程序(操作程序号OP-025，Monsanto Co.，St.Louis，Mo.)进行分析。在一个特定的实施方案中，每只母猪乳汁的产量在13日和20日通过在如Lewis等人(1978)和Mahan等人(1971)描述的哺育前后以小时间隔称量猪而确定。需注意在此时防止或考虑尿和排泄损失。在一个特定的实施方案中，最初2个哺育期用于使母猪和窝仔适应且不包括于每日乳汁产量的计算中。乳汁产量通过将在随后的6小时内获得的产量乘以4而计算。
实施例19其他的实施方案在本发明的另一个实施方案中，生长激素促分泌素受体(GHS-R)的配体与GHRH核酸的递送得到相似的结果。技术人员知道许多本领域公知的不同GHS-R配体结构类型，它们均通过GHS-R发挥作用。例子包括来自Merck的MK-0677(Whitehouse Station，NJ)、GHRP-6(综述参见Bowers，1998)和内源配体ghrelin(Kojima等人，1999；Dieguez和Casanueva，2000)。其他包括hexarelin(Europeptides)、L-692，943(Merck & Co.；Whitehouse Station，NJ)、NN703(Novo Nordisk；Bagsvaerd，丹麦)或任何充当GHS-R受体的拮抗剂的化合物，它们都为技术人员所熟知(参见如Pong等人(1996)；Howard等人(1996)或Smith等人(1997))。技术人员知道GHS-R在GHRH的上游并增加GHRH从脑下垂体中的释放。在一个特定的实施方案中，GHS-R配体经口施用(如通过添加入饲料和饮用水中)，这将放大GHRH导致GH自脑下垂体释放的作用。在本实施方案中，本发明的GHRH核酸递送可得到更多的增强。在不限制本发明范围的情况下，本发明者提出很可能的作用机制为额外的GHRH增加pit-1(一种涉及在胚胎发生过程中垂体前叶GH生产细胞、促生长激素细胞发育中的转录因子)表达。GHS-R的活化也增加pit-1的表达。pit-1的表达也由cAMP增加，且GHS-R配体增加响应于GHRH而产生的cAMP的量。因此，很可能猪在出生时具有增加的促生长激素细胞浓度。因此，猪生产更多的GH。因此，在一个特定的实施方案中，本发明GHRH核酸的递送与至少一种GHS-R配体联合施用。GHS-R配体以药物可接受的组合物施用。在说明书中提到的所有专利和出版物都是本发明相关领域技术人员的水平的指示。所有专利和出版物在此处都引用作为参考，如特定或单独地引用每个单独的出版物作为参考。
实施例20施用GHRH对母猪和后代的多重作用在本发明的一个目的中，在怀孕的动物中异位生产的GHRH例如通过胎盘而传给后代并在后裔中增强GH的生产，其后代然后显示增加的生长和改变的身体组成。同时，受注射的母猪显著生产更多的乳汁。为估计GHRH生肌载体注射大哺乳动物对后代生长的作用和GHRH递送对母猪哺乳的作用，将6头怀孕的母猪在妊娠95日用10mg质粒DNA pSP-HV-GHRH(n＝4)或pSP-wt-GHRH(n＝2)进行注射。最近，在啮齿类和大哺乳动物两者中，利用电穿孔技术以增强质粒的体内摄入在将肌肉用于异位基因表达中取得了显著的进展(Bettan等人，2000；Draghia-Akli等人，1999；Mir等人，1999)。在这种情况下，质粒注射之后用6-针阵列电极进行电穿孔，且条件如在此处和(Draghia-Akli等人，1999)所描述。将6头相匹配的母猪用作对照。该动物在24小时内相继生产。在随后的研究中总共分析了132只小猪。已知在分娩前2星期用以注射给药的重组GHRH进行的处理在13日和刚断奶时增加了猪的重量并改善了猪的成活率(Etienne等人，1992)。在这种情况下，GHRH注射的母猪的小猪在出生时显著较大(平均为1.65±0.06kg HV-GHRH，p＜0.00002和1.46±0.05kg wt-GHRH，p＜0.0014，而对对照1.27±0.02kg)(图8)。小猪在21日断奶，并在出生后170日分析屠宰重量。注射的母猪的小猪在刚断奶时平均增重18％(图9)。将每一窝仔的一半与对照母猪(来自注射的母猪的小猪)或注射的母猪(来自对照母猪的小猪)混养。有趣的是，与注射的动物混养的对照显著比其同窝出生仔畜大(达12.2％)，p＜0.02(图10)。在由GHRH处理的动物混养的对照动物中重量的改变指示注射的母猪显著增加的乳汁生产。然而，来自GHRH-处理的母猪且由对照母猪混养的小猪倾向于比其同窝出生仔畜小(达5.8％)(图11)，但该值统计学不显著，这说明GHRH处理的动物的后代在其下丘脑-垂体轴具有内源变化和增加的生长。与对照(用对照母猪饲养)相比总的增加如图12所示。该优点可维持到市场重量；在170日该重量对于HV-GHRH和wt-GHRH分别平均为135.7±1.89kg和129.3±2.17kg，而对照重量平均为125.3±1.74kg(图13)。该重量差异在任何时间点都统计学显著，p值在0.05和10-5之间。进行了多重生物化学测量(表13a和13b)。作为增加的合成代谢的信号，总蛋白质和白蛋白浓度(g/dl)在实验组中显示增加。总蛋白质增加了8％，而白蛋白增加了7.5％，且在测验的时间点有微小差异(在出生后的50和170日)(表13a和13b)。
表13a
表13b 肌酸酐浓度(mg/dl)正常(0.936mg/dl相对对照0.982mg/dl，p＜.34)，这是正常肾功能的指示。葡萄糖浓度在所有检验的时间点都正常(表14a和14b)。
表14a
表14b 胰岛素水平正常。胰岛素和葡萄糖的正常水平是优势，因为经典的GH治疗产生高血糖的“糖尿病”样的状况(Pursel等人，1990)。在整个研究中的成活率在受处理的母猪的后代中显著较高(表15)。在处理的组中发病率显著降低。
表15 与用猪重组促生长素(rpST)的注射不同，该注射可导致出血性溃疡、肝脏和肾脏的空泡形成或甚至母猪的死亡(Smith等人，1991)，GHRH基因治疗可很好的被耐受，且在动物中未看到副作用。也注意到该增加的生长在受处理的动物的后代中获得，而在那里不存在GHRH质粒。调节的组织/纤维类型特异性的含hGH的质粒以前通过转基因、成肌细胞转移或脂质体介导的静脉内注射而用于在牲畜和GH-缺陷的宿主中进行GH的递送和稳定生产(Dahler等人，1994；Pursel等人，1990；Barr和Leiden，1991)。然而，这些技术具有显著的缺点使其排除于大规模操作和/或食用动物之外1)与脂质体递送有关的可能的毒性或免疫反应；2)在转染成肌细胞方法中需要广泛的离体操作；和/或3)在转基因中重要副作用或无效率的危险(Mililer等人，1989；Dhawan等人，1991)。与这些技术相比，质粒DNA注射简单且有效，且无相关于递送系统或过度表达的并发症。此处提供的数据显示增强的生物学效能在GHRH质粒注射的大哺乳动物的后代中实现，该效能增加GH生产和分泌的生理水平、降低死亡率和发病率。受处理的母猪显示显著更高的乳汁生产。后代小猪未经历任何治疗副作用且具有正常的生物化学概况，也没有有关的病理或脏器肿大。在生长的显著增强显示生肌GHRH载体的异位表达将很可能替代经典的治疗方式并可以生理上更适当的方式来剌激GH轴。在猪中显示高度稳定性和GH分泌活性的HV-GHRH分子也可用于其他哺乳动物，因为降解GHRH的血清蛋白酶在大多数动物中相似。下面的段落描述了本实施例的材料与方法。DNA构建体。质粒pSPc5-12包含位于pSK-GHRH主链SacI/BamH I位点的360bp的SPc5-12合成启动子的Sac I/BamH I片段(Draghia-Akli等人，1997)。野生型猪GHRH通过对人GHRHcDNA(1-40)OH在位置34Ser变为Arg，38Arg变为Glu进行定点突变而获得；突变的猪HV-GHRH DNA通过对人GHRH cDNA(1-40)OH在位置1Tyr变为His，2Ala变为Val，15Gly变为Ala，27Met变为Leu，28Ser变为Asn，34Ser变为Arg，38Arg变为Glu进行定点突变而获得(改变位点II体外突变系统(AlteredSites II in vitro Mutagenesis System)，Promega，Madison，WI)，并克隆入pSP-GHRH的BamH I/Hind III位点。该GHRH cDNA之后为人生长激素的3’非翻译区，并生成pSPc5-12-wt-GHRH和pSPc5-12-HV-GHRH。对照质粒含有在相同的合成启动子控制之下的大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因以生产pSP-bgal。动物研究。将重量为约365kg的PIC品系22第一窝仔母猪用于这些GHRH研究。该动物在妊娠87日带到农场研究室，且单独置于单独产小猪的畜栏中，在那里它们无限制地可接近水和食物而持续到25天哺乳期的末尾。实验开始于三月，且第一窝仔在4月出生并一直分析到10月中旬。该农场建筑物装备了冷却系统，这使得能够在炎热天气中能使最高温度比外面的温度低2-5℃。7月、8月和9月的平均最高温度分别为40.6℃、41.6℃和36.6℃。该动物根据NIH指南、USDA和Animal Welfare Act指南来维持。猪中质粒DNA的肌内注射。将无内毒素的质粒制备物pSPc5-12-HV-GHRH和pSPc5-12-wt-GHRH(Qiagen Inc.，Chatsworth，CA，美国)在PBS pH＝7.4中稀释到1mg/ml。每一只母猪分配一次治疗。4只母猪用pSPc5-12-HV-GHRH进行注射，2只母猪用pSPc5-12-wt-GHRH进行注射且6只母猪用作对照。在妊娠95日，将动物用2.2mg/kg的telazol进行轻微的麻醉。将总计10mg质粒直接注射入猪的左侧半腱肌肌肉中。注射后2分钟，将注射的肌肉用直径为1cm、22规格且长度为2cm的6-针阵列的注射型电极进行电穿孔，采用如下条件6脉冲、针间交流电场、200V/cm、60毫秒/脉冲，如所述(Draghia-Akli等人，1999；Aihara和Miyazai，1998)。混养研究。紧接在出生之后将每一窝仔分为2组。使每一窝仔的一半仍然由其母亲哺育，而该窝仔的另一半则与不同的组混养(如对照小猪与HV-或wt-注射的动物混养，HV或wt出生的小猪与对照动物混养)。每星期记录重量。膳食。在21日刚断奶时，用具有1.012％赖氨酸的Nutrena 18％ Medicated Pig Starter(Cargill，Minneapolis，MN)饲养小猪60天。随后，用具有1.4％赖氨酸Custom Mix PigStarter 24％蛋白质饲养猪45天，用具有1.4％赖氨酸Custom Mix22.7％蛋白质饲养猪45天，然后用具有1.2％赖氨酸和20％蛋白质的Custom Mix(Cargill，Minneapolis，MN)维持猪以进行剩下的研究。生物化学。在出生后50日和170日收集血清，并由独立的实验室(Antech Diagnostics，Irvine，CA)进行分析。猪IGF-I RIA。猪的IGF-I由异源的人IGF-I测定进行测量(Diagnostic System Lab.，Webster，TX)。猪胰岛素RIA。猪的胰岛素由异源的人测定进行测量(Linco Research Inc.；St.Charles，Missouri)。测定的灵敏度为2微U/ml。身体组成数据。在整个研究过程中每星期2次以相同的校准比例(鉴定为具有±.2kg的精确性和0.3％的变化系数)测量重量。统计学。数据用Microsoft Excel统计分析包进行分析。在图中显示的值为平均数±s.e.m。特定的p值通过用Studentst检验进行比较而获得。设置p＜.05作为统计显著的水平。
实施例21对用GHRH处理的大鼠的多重作用生长激素(GH)的分泌由天然的GH促分泌素生长激素释放激素(GHRH)刺激，并由促生长素抑制素(stomatostatin)(SS)抑制，两者均为下丘脑激素(Thorner等人，1995)。GH脉冲是与促生长素抑制素分泌的减少或取消有关的GHRH分泌的结果。此外，脉冲生成器的机制看来由GH-负反馈来控时。另外，已认识到最初分离自大鼠胃的新肽ghrelin是GH分泌和能量稳态的重要调节物。Ghrelin是生长激素促分泌素受体的内源配体且其体内GH-释放活性依赖于GHRH(Hataya等人，2001)。在健康成年哺乳动物中，GH以高度调节的独特的脉动模式进行释放，这在24小时内发生4-8次且对其生物学活性极度重要(Argente等人，1996)。分泌的阵发模式涉及在外周水平对生理学作用的最适的诱导(Veldurs，1998)。GH同种型的表达、加工和/或释放及它们之间的相对比例在生长和发育过程中处于不同的控制之下(Araburo，等人，2000)。促生长激素细胞的调节和分化也依赖于在垂体本身内部的旁分泌过程且涉及生长因子和几种神经肽，如血管活性肠肽(Rawlings等人，1995)、血管紧张肽2、内皮缩血管肽(Tomic等人，1999)和活化素(Billesbup等人，1990)。GH和胰岛素样生长因子I(IGF-I)途径的有效和受调节的表达对于最适的线性生长及糖类、蛋白质和脂肪代谢的稳态，以及对于提供正氮平衡是关键的(Murray和Shalet，2000)。GHRH、GH、ghrelin、催乳素(PRL)和IGF-I在生理以及病理状况下对体液和细胞免疫反应的调节中发挥重要作用(Geffner等人呢，1997；Hattori等人，2001)。GHRH基因的下丘脑组织特异性表达并不为活性所必需的，这是因为头颅外分泌的GHRH可具有生物学活性(Faglia等人，1992；Melmed，1991)。GH活性的病理性GHRH刺激(不论其来源，从转基因模型到胰腺肿瘤)可导致腺垂体细胞的增殖、增生和腺瘤(Asa等人，1992；Sano等人，1988)。然而，对接受治疗的动物的后代持续的GHRH处理的长期效作仍然未知。前面已显示由合成的肌肉特异性启动子控制的表达质粒指导的新的血清蛋白酶抗性的猪GHRH的异位表达在经肌内注射和体内电穿孔递送后可在猪体内引起高的GH和IGF-I水平(Lopez-Calderon等人，1999)。本实施例中描述的实验目的为估计GHRH，其由质粒DNA基因治疗递送以在妊娠最后3个月中处理的动物的后代中增强生长和改变身体组成。在一个特定的实施方案中，在怀孕的动物中异位生产的GHRH通过胎盘而传给后代，在后裔中确定了垂体的增生并增强了长时间GH生产，这然后将显示增加的生长和改变的身体组成。为了估计GHRH生肌载体注射哺乳动物对后代的生长作用，将怀孕的大鼠于妊娠16日用30μg的质粒DNA pSP-HV-GHRH或pSP-βgal进行注射。在该注射后进行电穿孔以增强质粒摄取。所有的动物在妊娠20-22日生产。各组间窝仔的平均后代数目相似(处理的(T)，n＝10.8个幼仔/窝；对照(C)n＝11.75个幼仔/窝)。使各母亲间的幼畜数目均等化为10个幼畜/母亲。在出生后2个星期，处理组的窝仔的平均重量增加了9％T＝31.47±0.52g对于C＝28.86±0.75g，p＜0.014。在刚断奶时，在T后代中重量显著增加T雌性(TF)平均为51.97±0.83g对于对照雌性(CF)47.07±4.4g，p＜0.043，且处理的雄性平均为60.89±1.02g对于对照雄性(CM)49.85±4.9g，p＜0.001(图14)。该优势维持到10周龄，且重量差异在24周变得不显著。两个性别在3周龄时均具有肌肉的过度生长，并在腓肠肌(G)和胫骨前肌(TA)肌肉/重量上具有显著差异(图15)。TF在整个研究期间维持肌肉的过度生长，而雄性在10周龄后不显示肌肉过度生长的迹象。该变化可能归因于雄性成熟时性类固醇的变化，其减弱了生理增加的GH对骨骼肌的作用。在死后的第一分钟进行解剖并称重脑下垂体。主要在IF中垂体重量对总体重的比例在出生后达12个星期显著地增加(图16)。该垂体重量的增加最可能归因于促生长激素细胞增生，因为已知GHRH能够刺激GH从垂体前叶合成和分泌并对促生长激素细胞具有特定的过度生长作用(Morel等人，1999；Murray等人，2000)。这得到了激素的(图17)和组织学(图18)证据的支持。对来自注射的动物的垂体的Northern印迹分析显示GH和PRL mRNA水平的显著增加，并结合内源大鼠GHRH mRNA水平的减少。利用组织学技术，特定的抗大鼠抗体阐明了促生长激素细胞数目的增加。增加的全身GHRH和GH水平的指示是血清IGF-I浓度的增加。血清大鼠IGF-I在pSP-HV-GHRH注射的大鼠后代出生后达24个星期内都显著较高，在所有检验的时间点都具有p＜0.05(图19)。将器官(肺、心、肝、肾、胃、肠、肾上腺、生殖腺、脑)收集并称重。在任何动物中没有观察到相关病理。在体内基因转移的非病毒技术中，直接将质粒DNA注射入肌肉是简单、便宜和安全的，但该方法学的应用受到了转移的DNA表达载体相对低的表达水平的限制。在一个特定的实施方案中，为了获得基因治疗对生长和身体组成的调节，必须利用创新的方法，其中目标动物不直接处理，但由于对怀孕的母亲的处理而具有增强的生物学特征。如在此处所描述的，质粒载体另一个显著的改善是应用编码更稳定的GHRH类似物HV-GHRH的基因(Draghia-Akli等人，1999)。电基因(electrogene)治疗转移使得基因能够在所需器官或组织中有效地转移和表达，且能够在单一施用后提供长时间的表达。该方法可代表一种不需要病毒基因或颗粒的高效核酸转移的新方法。对于大的物种如猪或牛，GH上游刺激物，GHRH的使用是一种可选择的策略，该策略不仅可增加生长性能或乳汁生产，而且更重要的是，从实际和代谢的观点看可增加生产效率(Dubreuil等人，1990)。然而，重组肽的高成本和必需的施用频率目前限制了该处理的广泛应用。这些主要的缺点可通过使用核酸转移方法以指导GHRH的异位生产而消除，特别是当其生产长期维持时。因而，在将表达突变的生长激素释放激素(GHRH)cDNA的质粒经单一的电穿孔注射成年怀孕大鼠的胫骨前肌肌肉中之后，在后代中发生了增强的动物生长。新生的大鼠(F1)在出生时显著更大。纵向的重量和身体组成研究显示了两个性别间随年龄的差异。激素的和生物化学的测量与生长模式一致。F1具有更大的脑下垂体、促生长激素细胞增生和增加的GH含量。F1血浆IGF-I水平显著升高。总之，这些新发现说明GHRH可用于在基于质粒的基因治疗之后在世代间增强某些动物特征。下面的段落描述了本实施例中进行的实验。DNA构建体。质粒pSPc5-12包含位于pSK-GHRH主链SacI/BamH I位点的360bp SPc5-12合成启动子(Li等人，1999)的Sac I/BamH I片段(Draghia-Akli等人，1997)。突变的猪GHRHcDNA通过对人GHRH cDNA进行定点突变而获得(改变位点II体外突变系统(Altered Sites II in vitro Mutagenesis System)，Promega，Madison，WI)。编码31个氨基酸的信号肽和突变的猪GHRH(1-40)OH的突变的猪GHRH的228-bp片段(外显子2部分，全部外显子3和外显子4的部分)特征在于下面的氨基酸替代Gly15变为Ala，Met27变为Leu和Ser28变为Asn以及Tyr1到His和Ala2到Val的转变。将该片段克隆pSK-GHRH的BamH I/Hind III位点。hGH pA是来自人GH基因的3’非翻译区和聚腺苷酸信号。质粒在大肠杆菌DH5α中生长(Gibco BRL，Carlsbad，CA)。将无内毒素的质粒(Qiagen Inc.，Chatsworth，CA美国)制备物在PBS，pH7.4中稀释到1mg/ml。质粒的肌内注射和电穿孔。将记时怀孕的成年Wistar雌性大鼠在Baylor College of Medicine，Houston，TX的动物研究室中保存并抚养。动物根据NIH指南、USDA和Animal Welfare Act指南在10小时光照/14小时黑暗的环境条件下维持，且该规程得到了Instutional Animal Care and Use Committee的批准。将实验重复2次。在妊娠的16日，将动物(n＝20组)称重并将42.8mg/ml的氯胺酮、8.2mg/ml的甲苯噻嗪和0.7mg/ml的乙酰丙嗪的组合以0.5-0.7ml/kg的剂量i.m.施用而麻醉。将大鼠的左胫骨前肌肌肉用100ml PBS中的30mg的pSP-HV-GHRH用0.3cc胰岛素注射器(Becton-Dickinson，Franklin Lakes，NJ)进行注射。对照动物用PBS注射。对于两个组，该注射之后如所述(Draghia-Akli等人，1999)进行卡钳电穿孔。简要地，在注射后2分钟，将大鼠腿置于2个长度为1cm、26规格且针之间为1cm的针电极(Genetronics，San Diego，CA)之间且将电脉冲应用于该区域。在一个方向于100V/cm的电压应用了3个60-ms的脉冲，然后使电场反转，并在相反的方向应用另外3个脉冲。该脉冲由T-820 ElectroSquare Porator(Genetronics，San Diego，CA)生成。后代研究。所有注射的大鼠在妊娠20-22日生产。对第一个研究中240个后代和第二个研究中60个后代从出生到5月龄(出生、出生后2、3、6、8、12、16、22周)进行了分析。体重用相同的校正的天平在这些时间点进行记录。在实验的末尾，在死后研究了身体组成。收集血液、立即于0℃离心并在分析前贮存于-80℃。将器官(来自注射的和对照动物的心、肝、脾、肾、垂体、脑、肾上腺、骨骼肌--胫骨前肌(TA)、腓肠肌(G)、比目鱼肌(S)和趾长伸肌(EDL)、畜体、脂肪)去除，在分析天平上称重并在液氮中速冻。测量并记录了胫骨长度。垂体的Northern印迹分析。将垂体速冻并在溶液D中匀浆，然后抽提。将20mg总RNA用DNase I处理、在1.5％琼脂糖-甲醛凝胶上分离大小并转移到尼龙膜上。该膜用特定的由随机引发而32P-标记的GHRH cDNA探针进行杂交。大鼠IGF-I放射性免疫测定。大鼠IGF-I通过特定的放射性免疫测定(Diagnostic System Laboratories，Webster，Texas)进行测量。该测定的灵敏度为0.8ng/ml；测定内和测定间的变化分别为2.4％和4.1％。统计学。在图中显示的值为平均数±s.e.m。特定的p值通过用Students t检验或ANOVA分析进行比较而获得。设置p＜0.05作为统计显著的水平。
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序列表<110>Schwartz，Robert A.
Draghia-Akli，RuxandraSmith，Roy G.
Carpenter，Robert H.
Kern，Douglas R.
<120>对雌性动物施用核酸序列以增强后代生长<130>HO-P02021WO0/10021476/OTA 00-91<140>TBA<141>2001-12-12<150>60/255,021<151>2000-12-12<160>11<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>40<212>PRT<213>猪<400>1Tyr Ala Asp Ala Ile Phe Thr Asn Ser Tyr Arg Lys Val Leu Gly Gln1 5 10 15Leu Ser Ala Arg Lys Leu Leu Gln Asp Ile Met Ser Arg Gln Gln Gly20 25 30Glu Arg Asn Gln Glu Gln Gly Ala35 40<210>2<211>48<212>DNA<213>合成的<400>2aggcagcagg gagagaggaa ccaagagcaa ggagcataat gactgcag 48<210>3<211>42<212>DNA<213>合成的<400>3accctcagga tgcggcggca cgtagatgcc atcttcacca ac 42<210>4
<211>27<212>DNA<213>合成的<400>4cggaaggtgc tggcccagct gtccgcc 27<210>5<211>36<212>DNA<2l3>合成的<400>5ctgctccagg acatcctgaa caggcagcag ggagag36<210>6<211>358<212>DNA<213>合成的<400>6gagctccacc gcggtggcgg ccgtccgccc tcggcaccat cctcacgaca cccaaatatg 60gcgacgggtg aggaatggtg gggagttatt tttagagcgg tgaggaaggt gggcaggcag120caggtgttgg cgctctaaaa ataactcccg ggagttattt ttagagcgga ggaatggtgg180acacccaaat atggcgacgg ttcctcaccc gtcgccatat ttgggtgtcc gccctcggcc240ggggccgcat tcctgggggc cgggcggtgc tcccgcccgc ctcgataaaa ggctccgggg300ccggcggcgg cccacgagct acccggagga gcgggaggcg ccaagctcta gaactagt 358<210>7<211>623<212>DNA<213>人<400>7gggtggcatc cctgtgaccc ctccccagtg cctctcctgg ccctggaagt tgccactcca 60gtgcccacca gccttgtcct aataaaatta agttgcatca ttttgtctga ctaggtgtcc120ttctataata ttatggggtg gaggggggtg gtatggagca aggggcaagt tgggaagaca180acctgtaggg cctgcggggt ctattgggaa ccaagctgga gtgcagtggc acaatcttgg240ctcactgcaa tctccgcctc ctgggttcaa gcgattctcc tgcctcagcc tcccgagttg300ttgggattcc aggcatgcat gaccaggctc agctaatttt tgtttttttg gtagagacgg360ggtttcacca tattggccag gctggtctcc aactcctaat ctcaggtgat ctacccacct420tggcctccca aattgctggg attacaggcg tgaaccactg ctcccttccc tgtccttctg480attttaaaat aactatacca gcaggaggac gtccagacac agcataggct acctggccat540gcccaaccgg tgggacattt gagttgcttg cttggcactg tcctctcatg cgttgggtcc600
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权利要求
1.改善或增强雌性动物后代生长的方法，该方法包括在怀有该后代之前或期间将有效量的载体引入到该雌性动物细胞内的步骤，其中该载体包含启动子、核苷酸序列和3’非翻译区，所处条件为其中核苷酸序列表达且其中该载体的引入和表达导致该后代生长的改善或增强。
2.权利要求1的方法，其中该雌性动物的细胞包含二倍体细胞。
3.权利要求1的方法，其中该雌性动物的细胞包含肌细胞。
4.权利要求1的方法，其中该核酸序列编码生长激素释放激素或其类似物。
5.权利要求4的方法，其中该生长激素释放激素为SEQ IDNO1、SEQ ID NO8或其各自的类似物。
6.权利要求1的方法，其中该启动子包含合成的生肌启动子。
7.权利要求1的方法，其中该3’非翻译区包含hGH 3’非翻译区。
8.权利要求1的方法，其中该载体通过电穿孔、经过病毒载体、与载体(carrier)结合、通过肠胃外途径或者其组合而引入到该雌性动物的该细胞中。
9.权利要求1的方法，其中该雌性动物是人、宠物动物、农场动物、食用动物或工作用动物。
10.权利要求1的方法，其中该雌性动物是人、猪、母牛、绵羊、山羊或鸡。
11.权利要求1的方法，其中该载体是质粒、病毒载体、脂质体、阳离子脂质或其组合。
12.权利要求1的方法，其中该载体在单次施用中引入该雌性中。
13.权利要求1的方法，其中该引入在怀有该后代的第3个3月期时发生。
14.权利要求1的方法，其进一步包含向该雌性施用生长激素促分泌素受体的配体的步骤。
15.权利要求14的方法，其中该配体经口施用。
16.增加雌性动物后代体内生长激素水平的方法，该方法包括在怀有该后代之前或期间将有效量的载体引入到该雌性动物的细胞内的步骤，其中该载体包含启动子、核苷酸序列和3’非翻译区，所处条件为其中核苷酸序列表达且其中该载体的引入和表达导致后代体内生长激素水平增加。
17.权利要求16的方法，其中该雌性动物的细胞包含二倍体细胞。
18.权利要求16的方法，其中该雌性动物的细胞包含肌细胞。
19.权利要求16的方法，其中该核酸序列编码生长激素释放激素或其类似物。
20.权利要求19的方法，其中该生长激素释放激素为SEQ IDNO1、SEQ ID NO8或其各自的类似物。
21.权利要求16的方法，其中该启动子包含合成的生肌启动子。
22.权利要求16的方法，其中该3’非翻译区包含hGH 3’非翻译区。
23.权利要求16的方法，其中该载体通过电穿孔、经过病毒载体、与载体结合、通过肠胃外途径或者其组合而引入到该雌性动物的该细胞中。
24.权利要求16的方法，其中该雌性动物是人、宠物动物、农场动物、食用动物或工作用动物。
25.权利要求16的方法，其中该雌性动物是人、猪、母牛、绵羊、山羊或鸡。
26.权利要求16的方法，其中该载体是质粒、病毒载体、脂质体、阳离子脂质或其组合。
27.权利要求16的方法，其中该载体在单次施用中引入该雌性中。
28.权利要求16的方法，其中该引入在怀有该后代的第3个3月期时发生。
29.权利要求16的方法，其进一步包含向该雌性施用生长激素促分泌素受体的配体的步骤。
30.权利要求29的方法，其中该配体经口施用。
31.增加雌性动物后代的瘦体重的方法，该方法包括在怀有该后代之前或期间将有效量的载体引入到该雌性动物的细胞内的步骤，其中该载体包含启动子、核苷酸序列和3’非翻译区，所处条件为其中核苷酸序列表达且其中载体的引入和表达导致后代瘦体重增加。
32.权利要求31的方法，其中该雌性动物的细胞包含二倍体细胞。
33.权利要求31的方法，其中该雌性动物的细胞包含肌细胞。
34.权利要求31的方法，其中该核酸序列编码生长激素释放激素或其类似物。
35.权利要求34的方法，其中该生长激素释放激素为SEQ IDNO1、SEQ ID NO8或其各自的类似物。
36.权利要求31的方法，其中该启动子包含合成的生肌启动子。
37.权利要求31的方法，其中该3’非翻译区包含hGH 3’非翻译区。
38.权利要求31的方法，其中该载体通过电穿孔、经过病毒载体、与载体结合、通过肠胃外途径或者其组合而引入到该雌性动物的该细胞中。
39.权利要求31的方法，其中该雌性动物是人、宠物动物、农场动物、食用动物或工作用动物。
40.权利要求31的方法，其中该雌性动物是人、猪、母牛、绵羊、山羊或鸡。
41.权利要求31的方法，其中该载体是质粒、病毒载体、脂质体、阳离子脂质或其组合。
42.权利要求31的方法，其中该载体在单次施用中引入该雌性中。
43.权利要求31的方法，其中该引入在怀有该后代的第3个3月期时发生。
44.权利要求31的方法，其进一步包含向该雌性施用生长激素促分泌素受体的配体的步骤。
45.权利要求44的方法，其中该配体经口施用。
46.增加雌性动物后代的IGF-I水平的方法，该方法包括在怀有该后代之前或期间将有效量的载体引入到该雌性动物的细胞内的步骤，其中该载体包含启动子、核苷酸序列和3’非翻译区，所处条件为其中核苷酸序列表达且其中载体的引入和表达导致后代IGF-I水平增加。
47.权利要求46的方法，其中该雌性动物的细胞包含二倍体细胞。
48.权利要求46的方法，其中该雌性动物的细胞包含肌细胞。
49.权利要求46的方法，其中该核酸序列编码生长激素释放激素或其类似物。
50.权利要求49的方法，其中该生长激素释放激素为SEQ IDNO1、SEQ ID NO8或其各自的类似物。
51.权利要求46的方法，其中该启动子包含合成的生肌启动子。
52.权利要求46的方法，其中该3’非翻译区包含hGH 3’非翻译区。
53.权利要求46的方法，其中该载体通过电穿孔、经过病毒载体、与载体结合、通过肠胃外途径或者其组合而引入到该雌性动物的该细胞中。
54.权利要求46的方法，其中该雌性动物是人、宠物动物、农场动物、食用动物或工作用动物。
55.权利要求46的方法，其中该雌性动物是人、猪、母牛、绵羊、山羊或鸡。
56.权利要求46的方法，其中该载体是质粒、病毒载体、脂质体、阳离子脂质或其组合。
57.权利要求46的方法，其中该载体在单次施用中引入该雌性中。
58.权利要求46的方法，其中该引入在怀有该后代的第3个3月期时发生。
59.权利要求46的方法，其进一步包含向该雌性施用生长激素促分泌素受体的配体的步骤。
60.权利要求59的方法，其中该配体经口施用。
61.增加雌性动物后代饲养效率的方法，该方法包括在怀有该后代之前或期间将有效量的载体引入到该雌性动物的细胞内的步骤，其中该载体包含启动子、核苷酸序列和3’非翻译区，所处条件为其中核苷酸序列表达且其中载体的引入和表达导致后代饲养效率增加。
62.权利要求61的方法，其中该雌性动物的细胞包含二倍体细胞。
63.权利要求61的方法，其中该雌性动物的细胞包含肌细胞。
64.权利要求61的方法，其中该核酸序列编码生长激素释放激素或其类似物。
65.权利要求64的方法，其中该生长激素释放激素为SEQ IDNO1、SEQ ID NO8或其各自的类似物。
66.权利要求61的方法，其中该启动子包含合成的生肌启动子。
67.权利要求61的方法，其中该3’非翻译区包含hGH 3’非翻译区。
68.权利要求61的方法，其中该载体通过电穿孔、经过病毒载体、与载体结合、通过肠胃外途径或者其组合而引入到该雌性动物的该细胞中。
69.权利要求61的方法，其中该雌性动物是人、宠物动物、农场动物、食用动物或工作用动物。
70.权利要求61的方法，其中该雌性动物是人、猪、母牛、绵羊、山羊或鸡。
71.权利要求61的方法，其中该载体是质粒、病毒载体、脂质体、阳离子脂质或其组合。
72.权利要求61的方法，其中该载体在单次施用中引入该雌性中。
73.权利要求61的方法，其中该引入在怀有该后代的第3个3月期时发生。
74.权利要求61的方法，其进一步包含向该雌性施用生长激素促分泌素受体的配体的步骤。
75.权利要求74的方法，其中该配体经口施用。
76.增加雌性动物后代生长速度的方法，该方法包括在怀有该后代之前或期间将有效量的载体引入到该雌性动物的细胞内的步骤，其中该载体包含启动子、核苷酸序列和3’非翻译区，所处条件为其中核苷酸序列表达且其中载体的引入和表达导致后代生长速度增加。
77.权利要求76的方法，其中该雌性动物的细胞包含二倍体细胞。
78.权利要求76的方法，其中该雌性动物的细胞包含肌细胞。
79.权利要求76的方法，其中该核酸序列编码生长激素释放激素或其类似物。
80.权利要求79的方法，其中该生长激素释放激素为SEQ IDNO1、SEQ ID NO8或其各自的类似物。
81.权利要求76的方法，其中该启动子包含合成的生肌启动子。
82.权利要求76的方法，其中该3’非翻译区包含hGH 3’非翻译区。
83.权利要求76的方法，其中该载体通过电穿孔、经过病毒载体、与载体结合、通过肠胃外途径或者其组合而引入到该雌性动物的该细胞中。
84.权利要求76的方法，其中该雌性动物是人、宠物动物、农场动物、食用动物或工作用动物。
85.权利要求76的方法，其中该雌性动物是人、猪、母牛、绵羊、山羊或鸡。
86.权利要求76的方法，其中该载体是质粒、病毒载体、脂质体、阳离子脂质或其组合。
87.权利要求76的方法，其中该载体在单次施用中引入该雌性中。
88.权利要求76的方法，其中该引入在怀有该后代的第3个3月期时发生。
89.权利要求76的方法，其进一步包含向该雌性施用生长激素促分泌素受体的配体的步骤。
90.权利要求89的方法，其中该配体经口施用。
91.增加雌性动物后代的脑下垂体中促生长激素细胞相对其他的激素生产细胞的比例的方法，该方法包括在怀有该后代之前或期间将有效量的载体引入到该雌性动物的细胞内的步骤，其中该载体包含启动子、核苷酸序列和3’非翻译区，所处条件为其中核苷酸序列表达且其中载体的引入和表达导致后代促生长激素细胞相对其他激素生产细胞的比例增加。
92.权利要求91的方法，其中该雌性动物的细胞包含二倍体细胞。
93.权利要求91的方法，其中该雌性动物的细胞包含肌细胞。
94.权利要求91的方法，其中该核酸序列编码生长激素释放激素或其类似物。
95.权利要求94的方法，其中该生长激素释放激素为SEQ IDNO1、SEQ ID NO8或其各自的类似物。
96.权利要求91的方法，其中该启动子包含合成的生肌启动子。
97.权利要求91的方法，其中该3’非翻译区包含hGH 3’非翻译区。
98.权利要求91的方法，其中该载体通过电穿孔、经过病毒载体、与载体结合、通过肠胃外途径或者其组合而引入到该雌性动物的该细胞中。
99.权利要求91的方法，其中该雌性动物是人、宠物动物、农场动物、食用动物或工作用动物。
100.权利要求91的方法，其中该雌性动物是人、猪、母牛、绵羊、山羊或鸡。
101.权利要求91的方法，其中该载体是质粒、病毒载体、脂质体、阳离子脂质或其组合。
102.权利要求91的方法，其中该载体在单次施用中引入该雌性中。
103.权利要求91的方法，其中该引入在怀有该后代的第3个3月期时发生。
104.权利要求91的方法，其进一步包含向该雌性施用生长激素促分泌素受体的配体的步骤。
105.权利要求104的方法，其中该配体经口施用。
106.权利要求91的方法，其中所述激素生产细胞选自促肾上腺皮质激素细胞、催乳细胞和促性腺激素细胞。
107.延迟雌性动物后代出生的方法，该方法包括在怀有该后代之前或期间将有效量的载体引入到该雌性动物的细胞内的步骤，其中该载体包含启动子、核苷酸序列和3’非翻译区，所处条件为其中核苷酸序列表达且其中载体的引入和表达导致后代出生延迟。
108.权利要求107的方法，其中该雌性动物的细胞包含二倍体细胞。
109.权利要求107的方法，其中该雌性动物的细胞包含肌细胞。
110.权利要求107的方法，其中该核酸序列编码生长激素释放激素或其类似物。
111.权利要求110的方法，其中该生长激素释放激素为SEQ IDNO1、SEQ ID NO8或其各自的类似物。
112.权利要求107的方法，其中该启动子包含合成的生肌启动子。
113.权利要求107的方法，其中该3’非翻译区包含hGH 3’非翻译区。
114.权利要求107的方法，其中该载体通过电穿孔、经过病毒载体、与载体结合、通过肠胃外途径或者其组合而引入到该雌性动物的该细胞中。
115.权利要求107的方法，其中该雌性动物是人、宠物动物、农场动物、食用动物或工作用动物。
116.权利要求107的方法，其中该雌性动物是人、猪、母牛、绵羊、山羊或鸡。
117.权利要求107的方法，其中该载体是质粒、病毒载体、脂质体、阳离子脂质或其组合。
118.权利要求107的方法，其中该载体在单次施用中引入该雌性中。
119.权利要求107的方法，其中该引入在怀有该后代的第3个3月期时发生。
120.权利要求107的方法，该方法进一步包含向该雌性施用生长激素促分泌素受体的配体的步骤。
121.权利要求120的方法，其中该配体经口施用。
122.增加动物乳汁生产的方法，包括将有效量的载体引入到该动物的细胞内的步骤，其中该载体包含启动子、核苷酸序列和3’非翻译区，所处条件为其中核苷酸序列表达且其中载体的引入和表达导致动物乳汁生产增加。
123.权利要求122的方法，其中该雌性动物的细胞包含二倍体细胞。
124.权利要求122的方法，其中该雌性动物的细胞包含肌肉细胞。
125.权利要求122的方法，其中该核酸序列编码生长激素释放激素或其类似物。
126.权利要求125的方法，其中该生长激素释放激素为SEQ IDNO1、SEQ ID NO8或其各自的类似物。
127.权利要求122的方法，其中该启动子包含合成的生肌启动子。
128.权利要求122的方法，其中该3’非翻译区包含hGH 3’非翻译区。
129.权利要求122的方法，其中该载体通过电穿孔、经过病毒载体、与载体结合、通过肠胃外途径或者其组合而引入到该雌性动物的该细胞中。
130.权利要求122的方法，其中该雌性动物是人、宠物动物、农场动物、食用动物或工作用动物。
131.权利要求122的方法，其中该雌性动物是人、猪、母牛、绵羊、山羊或鸡。
132.权利要求122的方法，其中该载体是质粒、病毒载体、脂质体、阳离子脂质或其组合。
133.权利要求122的方法，其中该载体在单次施用中引入该雌性中。
134.权利要求122的方法，其中该引入在怀有该后代的第3个3月期时发生。
135.权利要求122的方法，其进一步包含向该雌性施用生长激素促分泌素受体的配体的步骤。
136.权利要求135的方法，其中该配体经口施用。
全文摘要
通过用增强生长的有力方法对雌性动物施用核酸序列，如GHRH或类似物来改善生长，优选通过肠胃外途径的施用。由用编码GHRH的DNA注射的母猪生产的小猪更大，且该作用在随后的妊娠中得到说明而无需额外施用载体。
文档编号A61K38/18GK1575301SQ01822008
公开日2005年2月2日 申请日期2001年12月12日 优先权日2000年12月12日
发明者R·J·施瓦茨, R·H·卡彭特, R·德勒吉亚－阿克里, D·R·克恩, R·G·史密斯 申请人:贝勒医学院, 阿德维希斯公司