专利名称：一种预防或治疗艾滋病的药物及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于药物技术领域，具体地说，涉及一种预防或治疗艾滋病的药物及其制备方法和在制备预防和治疗艾滋病的药物中的应用。
背景技术：
艾滋病(Acquired Immunodeficiency Syndrome，AIDS)在全球广泛流行，亚洲继北美、非洲之后已成为全球HIV(Human Immunodeficiency Virus)感染上升最迅速、流行最严重的地区之一。我国AIDS也呈加速流行的趋势，截止2001年底，全国31个省市累计共报告HIV感染者30736名，其中AIDS病人1594名，死亡684人。据专家估计，全国实际感染HIV者已达85万人。如以目前的增长速度(30-40％)发展，到2010年，我国HIV感染者将超过1000万人。至今未研制出有确切效果的HIV疫苗，抗HIV药物仍是防治HIV感染的主要方式。药物临床治疗取得了前所未有的效果，尤其是高效抗逆转录病毒疗法(highly active antiretroviral therapy，HAART)延长了HIV感染者寿命，但仍然不能清除体内病毒，治愈病人。HIV抗药株的产生、特殊器官和细胞(淋巴结、脑及单核巨噬细胞等)中HIV的隐匿，药物的毒副反应及半衰期短等问题的出现，促使人们寻找更加有效而低毒的药物。迄今，现有技术中没有含有本发明式I化合物酒花查尔酮(xanthahumol)作为有效成分在治疗艾滋病方面的报道，也没有该化合物具有抗HIV-1活性的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供含有有效量式I化合物及药用载体和/或赋形剂所制成的药物。为了实现上述目的，本发明提供了如下的技术方案一种预防或治疗艾滋病的药物，其中含有预防或治疗艾滋病有效量的式I化合物酒花查尔酮及可药用载体和/或赋形剂。 本发明还提供了上述药物的制备方法，采集植物啤酒花(Humulus lupulus)室温下用70％乙醇浸泡3-5次，溶剂回收至小体积，分别用石油醚和乙酸乙酯萃取，回收溶剂后，乙酸乙酯部分用适量硅胶拌样，进行硅胶柱层析，用CHCl3-MeOH梯度洗脱，得含h4段，该馏段进一步进行硅胶柱层析，CHCl3-EtOAc梯度洗脱，得权利要求1所述的化合物酒花查尔酮，然后再按药物常规制备方法配制成所需剂型。
同时本发明提供了所述药物在制备预防或治疗艾滋病药物中的应用。
本发明化合物用作药物上时，可以直接使用，或者以药物组合物的形式使用。该药物组合物含有0.1～99％，优选为0.5～90％的本发明化合物，其余为药物学上可接受的，对人和动物无毒和惰性的可药用载体和/或赋形剂。
所述的药用载体或赋形剂是一种或多种选自固体、半固体和液体稀释剂、填料以及药物制品辅剂。将所述的药物组合物以单位体重服用量的形式使用。本发明的药物可经口服和注射(静注、肌注)两种形式给药。
口服可用其固体或液体制剂，如粉剂、片剂、糖衣剂、胶囊、溶液、糖浆、滴丸剂等。
注射可用其固体或液体制剂，如粉针剂、溶液形注射剂等。
为了更好地理解本发明的实质，下面将用本发明的式I化合物酒花查尔酮(xanthahumol)及其与药物载体或赋形剂组成的药物的生物活性结果来说明它在医药领域中的应用。
材料和方法一、试剂和溶液(1)试剂MTT(3，(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyl tetrazolium bromide)；SDS(Sodium Dodecyl Sulfate)；DMF(N，N’-Dimethyl formamine)。
(2)溶液RPMI-1640完全培养基，含有10％新生小牛血清(自制)，2m ML-Glutamine，10Mm HEPES free acid，50μM 2-Mercaptoethanol，100.000 IU Penicillin，100μg/ml Streptomycin sulfate.
二、检测化合物酒花查尔酮(xanthahumol)溶于DMSO中，4℃保存，贮存液浓度为25mg/ml。
三、细胞和病毒C8166和HIV-1IIIB/H9均由英国Medical Resaerch Council，AIDS ReagentProject惠赠。按常规方法制备HIV-1IIIB，滴定并计算出病毒的TCID50。病毒贮存液分装后，置-70℃保存。细胞和病毒均按常规方法冻存和复苏。
四、化合物酒花查尔酮(xanthahumol)对C8166的细胞毒性检测3×105/ml C8166细胞悬液100ul与不同浓度的化合物溶液混合，同时设置不含化合物的对照孔，37℃，5％CO2培养三天，采用MTT法检测细胞毒性。490nmELx800 ELISA Reader测定OD值。计算化合物对细胞的CC50(50％CytotoxjcConcentration)，即引起50％细胞死亡的化合物浓度。
五、化合物酒花查尔酮(xanthahumol)对HIV-1诱导C8166病变的抑制试验将6×105/ml C8166细胞50ul与100ul不同浓度的化合物溶液混合，加入50μl HIV-I稀释上清，M.O.I.为0.0089，同时设置不含化合物的对照孔，37℃，5％CO2培养三天，倒置显微镜下(100×)计数合胞体(五个视野)。计算化合物的EC50(50％Effective Concentration)，即化合物抑制50％合胞体形成的浓度。计算化合物的TI(Therapeutic Index)，即选择指数，其值等于CC50/EC50。
六、化合物酒花查尔酮(xanthahumol)对HIV-1 p24的抑制将6×105/ml C8166细胞250ul与500ul不同浓度的化合物溶液混合，加入250μl HIV-1稀释上清，M.O.I.为0.0089，同时设置不含化合物的对照孔，37℃，5％CO2培养三天，ELISA法检测培养上清中HIV-1 p24的含量。计算化合物的EC50(50％Effective Concentration)，即化合物使HIV-1 p24表达减少50％的浓度。计算化合物的TI(Therapeutic Index)，即选择指数，其值等于CC50/EC50。
结果酒花查尔酮(xanthahumol)的细胞毒性作用表1列出了酒花查尔酮(xanthahumol)的CC50。本发明的附图1显示了不同浓度的酒花查尔酮(xanthahumol)对C8166的毒性作用。
表1.酒花查尔酮(xanthahumol)的CC50CC50(μg/ml)第一次 4.32第二次 1.69第三次 19.18第四次 6.20
2、酒花查尔酮(xanthahumol)对HIV-1诱导C8166合胞体形成的抑制作用表2列出了酒花查尔酮(xanthahumol)HIV-1诱导抑制HIV-1诱导C8166合胞体形成的EC50。本发明的附图2显示了不同浓度的酒花查尔酮(xanthahumol)对HIV-1诱导C8166合胞体形成的抑制作用。表2.酒花查尔酮(xanthahumol)抑制HIV-1诱导C8166合胞体形成的EC50EC50(μg/ml)第一次 0.69第二次 0.823、酒花查尔酮(xanthahumol)对HIV-1 p24抗原表达的抑制作用酒花查尔酮(xanthahumol)对HIV-1 p24抗原表达的抑制作用EC50为0.65(μg/ml)。本发明的附图3显示了不同浓度的H-4对HIV-1 p24抗原表达的抑制作用。
同样的，为了进一步理解本发明的实质，下面将用本发明的式I化合物酒花查尔酮(xanthahumol)及其与药物载体或赋形剂组成的药物的急性毒性结果来说明它在医药领域中的应用。
酒花查尔酮(xanthahumol)小鼠腹腔给药急性毒性试验一.材料1.样品酒花查尔酮(xanthahumol)，呈黄色粉末状。二甲基亚砜(DMSO)加少量PEG-400和吐温-80溶解后加生理盐水配制为所需浓度备用；2.动物健康ICR小鼠，II级清洁级，18~22g，雌雄各半，由昆明医学院省天然药物药理重点实验室动物室提供。合格证号滇实动证第9806号。
二.方法健康ICR小鼠16只，分为1000mg/kg和1500mg/kg两个剂量组，8只/组，雌雄各半，按0.1ml/10g的给药体积腹腔注射相应剂量的H4，给药后观察动物的反应和死亡情况，观察时间为12天。
三.结果1.1500mg/kg剂量组动物在给药4h后开始死亡，48h死亡达高峰，72h受试动物全部死亡。死亡前动物出现呼吸急促、抽搐；2.1000mg/kg剂量组动物在给药后未观察到明显的毒性反应，至给药后的第12天亦未出现动物死亡。
四.结论从本试验结果可以推测化合物H4在小鼠经腹腔给药的半数致死剂量(LD50)在1000mg/kg和1500mg/kg之间。
图1是本发明化合物酒花查尔酮对C8166的毒性作用图；图2是本发明化合物酒花查尔酮对HIV-1诱导的合胞体形成的抑制作用图；图3是本发明化合物酒花查尔酮对HIV-1 p24的抑制作用作用图。
具体实施例方式下面结合实施例进一步对本发明的实质内容进行说明，但本发明的内容并不局限于此。
实施例110kg植物啤酒花(Humulus lupulus)(粒状)室温下用70％乙醇浸泡五次，溶剂回收至小体积，分别用石油醚和乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯部分回收溶剂后，称重得539.6g。乙酸乙酯部分用适量硅胶拌样后，进行硅胶柱层(200-300目)，用CHCl3-MeOH梯度洗脱，得含h4段。该馏段进一步进行硅胶柱层析，CHCl3-EtOAc梯度洗脱，得酒花查尔酮(xanthahumol)4.66g。
该方法分离出的化合物酒花查尔酮(xanthahumol)其化学名称为2’，4，4’-三羟基-6’-甲氧基-3’-异戊烯基查尔酮，化学结构式为 分子量为354.402，分子式为C21H22O5。熔点171-173℃，橙黄色结晶。易溶于甲醇、丙酮，微溶于水。
酒花查尔酮(xanthahumol)的结构是基于它的质谱和核磁共振数据并通过与文献中已知化合物的光谱进行对照而确定(Sun，S.-S.et al.，Phytochemistry1989，28，1776；Tabata，N.et al.，Phytochemistry 1997，46，683)。
紫外光谱数据UVλ(max)(MeOH)(logε)205.5(4.43)，234(sh，4.08)，367(4.50).
红外光谱数据IR vmaxKBr3510-3200(br)，1676.8，1607.5，1579.8，1510.9，1430.1，1402.0，1367.1，1322.2，1264.0，1174.3，1121.2，108206，969.7，913.1，855.9，820.7.
质谱数据MS m/z354[M+](100)，339，311，299[M-C4H7]+，，234[A1]+，179[A1-C4H7]+，120[B1]+.
有关核磁共振数据见表4。
表4.1HNMR and13C NMR Data for H-4(in DMSO)
实施例2按实施例1制得化合物酒花查尔酮(xanthahumol)，按化合物晶体与赋形剂重量比1∶1的比例加入赋形剂，制粒压片。
实施例3按实施例1制得化合物酒花查尔酮(xanthahumol)，按常规胶囊制剂方法制成胶囊。
实施例4按实施例1制得化合物酒花查尔酮(xanthahumol)，按化合物晶体与赋形剂重量比1∶2的比例加入赋形剂，制粒压片。
实施例5按实施例1制得化合物酒花查尔酮(xanthahumol)，按化合物晶体与赋形剂重量比1∶3的比例加入赋形剂，制粒压片。
实施例6片剂酒花查尔酮(xanthahumol) 100mg淀粉 100mg玉米浆17％适量硬脂酸镁 适量实施例7胶囊剂酒花查尔酮(xanthahumol) 100mg淀粉 100mg硬脂酸镁 适量制备方法将酒花查尔酮(xanthahumol)与助剂混合，过筛，在合适的容器中均匀混合，把得到的混合物装入硬明胶胶囊。
实施例8安瓿剂酒花查尔酮(xanthahumol)50mg制备方法将酒花查尔酮(xanthahumol)溶解于2毫升丙二醇中，过滤所得溶液在无菌条件下装入安瓿瓶中。
权利要求
1.一种预防或治疗艾滋病的药物，其中含有预防或治疗艾滋病有效量的式I化合物酒花查尔酮及可药用载体和/或赋形剂。
2.权利要求1的药物的制备方法，其特征在于采集植物啤酒花(Humuluslupulus)室温下用70％乙醇浸泡3-5次，溶剂回收至小体积，分别用石油醚和乙酸乙酯萃取，回收溶剂后，乙酸乙酯部分用适量硅胶拌样，进行硅胶柱层析，用CHCl3-MeOH梯度洗脱，得含h4段，该馏段进一步进行硅胶柱层析，CHCl3-EtOAc梯度洗脱，得权利要求1所述的化合物酒花查尔酮，然后再按药物常规制备方法配制成所需剂型。
3.权利要求1所述式I化合物在制备预防或治疗艾滋病药物中的应用。
全文摘要
提供一种药用有效成分酒花查尔酮(xanthahumol)用于预防和治疗艾滋病。具体地，利用植物啤酒花(Humuluslupulus)为原料，通过酒精提取和溶剂处理，硅胶柱层析以氯仿/乙酸乙酯混合溶剂洗脱，结晶得到酒花查尔酮(xanthahumol)纯品。实验证明该化合物具有显著的体外抗HIV－1活性，可用于制备预防和治疗艾滋病的药物。
文档编号A61P31/00GK1459281SQ0211377
公开日2003年12月3日 申请日期2002年5月21日 优先权日2002年5月21日
发明者刘吉开, 郑永唐, 丁智慧, 王茜, 瞿燕, 董泽军 申请人:中国科学院昆明植物研究所, 中国科学院昆明动物研究所