专利名称：一种平颏海蛇长链神经毒素基因及其表达、应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新基因，特别是一种平颏海蛇长链神经毒素新基因。本发明还涉及上述平颏海蛇长链神经毒素基因的表达及应用。
背景技术：
蛇神经毒素广泛存在于眼镜蛇科和海蛇科，是蛇毒蛋白的重要组成成分。根据其作用靶位点不同，蛇神经毒素可被分为两大类型，即突触前神经毒素和突出触后神经毒素。突触前神经毒素抑制乙酰胆碱从突触前运动神经末梢的释放，而突触后神经毒素特异性地结合于脊椎动动物肌肉突触后膜运动终板或鱼类发电器官中的烟碱胺型乙酰胆碱受体而阻断神经传导，影响肌肉细胞运动终板与烟酰胺型乙酰胆碱结合有关的生理过程。
蛇神经毒素主要作用于N-型的乙酰胆碱。蛇毒突触后神经毒素中含有较多的碱性氨基酸并处于活性表面，乙酰胆碱受体的活性中心正好是由较多的酸性氨基酸残基构成，因此蛇毒突触后神经毒素与乙酰胆碱受体的紧密结合不仅取决于它们间的空间互补和疏水结合作用，而且与二者间的多重静电吸引密切相关。对于长链的突触后神经毒素与乙酰胆碱受体间的互相作用还有可能毒素分子将其大环插入受体的缝隙或通道中，而分子活性表面上的正电荷有利于使毒素分子稳定存在于通道中，证实这种通道的封闭导致去极化的阻断和它们之间结合高亲和性或不可逆性。突触后神经毒素与乙酰胆碱以及受体的抗体相比，具有更高的亲和力，它们三者的结合位点相互重叠但并不完全一样，因此突触后神经毒素能与乙酰胆碱竞争乙酰胆碱受体，并可以阻断乙酰胆碱所传递的神经信号，从而影响机体的正常的生理功能和改变非常的病理反应。
突触后神经毒素根据分子量大小和二硫键数目可以分为短链神经毒素和长链神经毒素两种类型。具有三指形结构的蛇神经毒素一般由60～80个氨基酸残基形成一条多肽链，氨基酸残基的组成及相对位置具有很大的同源性。分子中含有4～5个二硫键，其中4个二硫键聚集在一起形成一个致密的内核，由此核心伸展出三个环就象三个手指，整个分子象一个碟子。二级结构分析结构显示它不存在α-螺旋结构，主要是由β-转角组成。6条β-链通过许多链间氢键维系在一起，不变的或保守的氨基酸除了一部分如4对二硫键与结构稳定性有关外，大部分集中在中间大环上且分布于环的一侧，形成一个活性表面，乙酰胆碱受体正是与毒素分子的带正电荷的活性中心相互作用的。长链和短链的蛇毒突触后神经毒素都属于这类结构，他们在一般结构上的差别在于长链神经毒素中央大环顶部形成分叉，这是第5对二硫键的存在引起的；而且它还有一个长的尾巴从致密的二硫键核心伸出，这一突出的尾部表面是其独特免疫学性质的结构基础。
突触后神经毒素所引起的神经毒症状的主要临床特点是——动物在1小时或更短的时间内产生松弛性的肌肉麻痹，四肢行动缓慢，接着是呼吸困难，最后经过窒息性惊厥死亡。通过人工呼吸可以延迟动物的死亡，有些甚至能因此而得救。蛇神经毒素的医学应用可以追溯到远古，我国很早就有利用以毒攻毒的手段来治疗疑难杂症的传统经验，现在这一经验仍具有现实意义。蛇神经毒素在治疗神经性疾病以及肿瘤的止痛和戒毒等临床领域显示出很好的效果，目前蛇神经毒素在临床上的主要应用有(1)临床上用于诊断重症肌无力等神经性疾病；(2)用于治疗神经性疼痛以及神经硬化症等；(3)蛇神经毒素的单方或复方用于治疗急性中毒昏迷等神经性疾病；(4)蛇神经毒素可以用来进行戒毒治疗。应用蛇神经毒素止痛，不会成瘾，无赖药性，而且在显示疗效后剂量反可减少，现在已经用于吸毒成瘾者戒毒。
神经毒素是海蛇毒液中毒性最强的成分，国内外对海蛇毒素的研究报道要比陆地蛇少得多，而且大多只停留在天然蛋白质水平，有关海蛇毒素基因的研究报道并不多，海蛇毒素编码基因序列发表还不到50个。
目前蛇神经毒素主要采取生化提取方法从蛇毒中获得，成本高、纯度低，而海蛇毒的毒性强烈，排毒量甚微，难以采集到足够的毒液量，因此，分离提纯海蛇毒的组分用于科学研究和实际应用等各方面困难更大。
发明内容本发明的目的在于提供一种新的平颏海蛇长链神经毒素基因。
本发明的另一目的在于提供上述新基因的表达。
本发明的另一目的在于提供上述新基因的应用。
本发明的平颏海蛇长链神经毒素基因(Ln87)，其来源于平颏海蛇(LapemisHardwichi)毒腺cDNA文库，核苷酸序列如附图1所示，其编码92个氨基酸，等电点为8.4，分子量为8,000道尔顿，包括21个氨基酸的信号肽，71个氨基酸的成熟肽，氨基酸序列如附图2所示。
一种重组质粒载体，含有本发明的新基因Ln87，该载体为重组质粒pTRX-Ln87，它是以硫氧还蛋白为担体蛋白，具有6个组氨酸亲和标记位点及PreScission蛋白酶识别位点。该载体转化的是能表达平颏海蛇长链神经毒素融合蛋白的大肠杆菌，大肠杆菌表达平颏海蛇长链神经毒素基因Ln87，基因在大肠杆菌内以胞内可溶的融合蛋白形式高效表达，表达量大于100mg/L。表达产物的超声裂解液经Ni2+Chelating Sepharose亲和色谱层、PreScission蛋白酶切割、离子交换层析、和凝胶过滤层析纯化后，得到纯度为95％以上的融合蛋白，得率高于10mg/L。
所得的蛋白具有生物活性，能应用于制备治疗镇痛、戒毒、相关神经疾病药物的应用。
本发明所选海蛇是海蛇科平颏海蛇属的平颏海蛇(Hydrophiinae，Lapemishardwickii Gray)，采自广西省北海市。平颏海蛇毒素cDNA文库的构建是先解剖得到海蛇的毒囊组织，提取总RNA，再分离出mRNA后进行逆转录，所获得的cDNA插入到质粒载体pcDNA3.0上并转化大肠杆菌DH5α从而构建成平颏海蛇毒腺cDNA文库。
本发明通过对平颏海蛇毒腺cDNA文库克隆的随机序列测定，从中得到了一个编码平颏海蛇长链神经毒素的cDNA克隆，称为ln87。此cDNA编码92个氨基酸，包括21个氨基酸的信号肽和71个氨基酸的成熟肽，等电点为8.4，成熟肽分子量为8,000道尔顿，具有典型的长链神经毒素一级结构的特征。
本发明通过设计了一对引物，将编码平颏海蛇长链神经毒素成熟肽的基因用PCR方法扩增出来，克隆到原核融合表达载体pTRX上，构建成并将其转化大肠杆菌BL21(DE3)。经过对培养时间，诱导时间，温度等条件的摸索和优化，融合蛋白TRX-LN87的表达量占菌体总蛋白的20％以上，所表达的蛋白约有50％处于胞内可溶状态。表达质粒pTRX-LN87以T7为启动子，硫氧还蛋白TRX为担体蛋白，以胞内可溶的形式表达融合蛋白TRX-LN87，TRX的C端有柔链区和6×His结构，便于利用固定化金属配体亲和层析进行纯化。所设计的上游引物含有PreScission蛋白酶位点，以便外源蛋白单体的获得。
本发明还优化了重组平颏海蛇长链神经毒素LN87的纯化条件。利用6×HIS标签，融合蛋白经Ni2+Chelating Sepharose亲和层析纯化后用PreScission蛋白酶切除担体蛋白TRX，酶切产物进一步采用离子交换层析和凝胶过滤层析进行纯化，最终得到纯度在95％以上的重组平颏海蛇长链神经毒素，重组蛋白质终产量可高达10mg/L以上。
本发明获得的重组平颏海蛇长链神经毒素LN87是有生物活性的。将重组蛋白质LN87腹腔注射昆明小鼠，小鼠在腹腔注射后12小时内，均有出现死亡现象，小鼠死亡前出现四肢抽搐，行动迟缓。解剖死亡动物，观察心、肝、脾、胃、十二指肠、肺主要脏器，无出现出血、腹水现象。重组蛋白质LN87对昆明小鼠腹腔注射的半致死计量(LD50)为6.4624mg/kg。
本发明的重组平颏海蛇长链神经毒素LN87具有明显的镇痛作用。腹腔注射了重组蛋白质LN87的小鼠和大鼠痛阈值有了明显的提高小鼠热板法将痛阈值提高了214.43％，化学法可将痛阈值提高69.3％，大鼠电刺激法可将痛阈值提高52.04％，大鼠机械压痛法可将痛阈值提高25.16％。本发明的重组平颏海蛇长链神经毒素可应用于新型镇静药的研制，用于镇痛、麻醉和戒毒，或临床上诊断重症肌无力等等。
该表达质粒经Kpn I和NotI酶切后可得到两条带，一个为253bp的条带，包括编码6组氨酸、PreScission蛋白酶识别位点和平颏海蛇长链神经毒素成熟肽的DNA序列，另一条带约5.9kb，为pTRX载体质粒。
本发明的表达质粒载体的复制方法参照Sambrook(Sambrook，et al.1989，Molecular cloing.Cold Spring Harbor Labroratory Press.USA)方法，按CaCl2法在E.Coli.DH5α或BL21(DE3)菌株中转化质粒，用含氨苄青霉素钠(100μg/mL)的LB培养基转化细菌，碱法提取质粒。
图1为平颏海蛇长链神经毒素基因Ln87核苷酸序列；图2为平颏海蛇长链神经毒素基因Ln87氨基酸序列；图3为平颏海蛇毒腺总RNA和mRNA电泳结果；图4为平颏海蛇毒腺cDNA电泳结果；图5为平颏海蛇毒素cDNA文库总质粒ECORI/NotI双酶切和PCR检测电泳结果；
图6为平颏海蛇毒腺cDNA质粒表达文库部分重组子的EcoRI和NotI酶切鉴定结果；图7为含有ln87基因的重组质粒pBSK-LN87的构建图；图8为含ln87基因的重组质粒pTrx-LN87的构建图；图9为可融性融合表达载体pTrx的物理图谱；图10为平颏海蛇短链神经毒素基因ln87的PCR产物电泳检测；图11为pBSK-LN87重组质粒酶切鉴定电泳分析；图12为pTrx-LN87重组质粒酶切鉴定电泳分析；图13为不同诱导条件对重组蛋白LN87表达情况的影响的SDS-PAGE分析；图14为融合蛋白TRX-LN87 Ni2+Chelating Sepharose亲和层析结果的SDS-PAGE分析；图15为重组平颏海蛇长链神经毒素LN87的Tris/Tricine系统SDS-PAGE分析；图16为融合蛋白TRX-LN87的Ni2+Chelating Sepharose亲和色谱层析图；图17为重组平颏海蛇长链神经毒素LN87的CM Sepharose阳离子交换层析图；图18为重组平颏海蛇长链神经毒素LN87的Sephadex G-50凝胶过滤层析图。
图3中Lane 1.RNAMarker；lane 2.polyA+mRNA；lane 3.Total RNA。图4中lane 1.1kb DNA ladder(Gibco)；lane 2.Synthesized cDNA of LapemisHardwickii。图5中Lane 1.The plasmid digested by EcoRI and NotI；Lane 2. 1kbDNA ladder(Gibco)；Lane 3.PCR amplification of cDNA library。图6中Lane1，2，3，5，6，7，8.The partial recombinants digested by EcoRI and NotI；Lane 4. 1kb DNAladder(Gibco)。图10中1100bp DNA ladder(华美生物工程公司)；2ln87的PCR扩增产物。图11中11kb DNA ladder(GIBCO)；2pBSK-LN87的BamHI/KpnI酶切产物；3pBSK-LN87的BamHI酶切产物。图12中11kb DNAladder(GIBCO)；2pTRX-LN87的BamHI/KpnI酶切产物；3pTRX-LN87的BamHI酶切产物；4pTRX的BamHI酶切产物。图13中A.30℃；B.25℃；C.19℃；1. 0.05mM IPTG诱导时工程菌株BL21-pTrx-LN87的可溶蛋白；2. 0.05mM IPTG诱导时工程菌株BL21-pTrx-LN87的总蛋白；3.低分子量蛋白分子量标准(上海生化所)；4. 0.01mM IPTG诱导时工程菌株BL21-pTrx-LN87的可溶蛋白；5. 0.01mM IPTG诱导时工程菌株BL21-pTrx-LN87的总蛋白；6. 0.5mM IPTG诱导时工程菌株BL21-pTrx-LN87的可溶蛋白；7. 0.05mM IPTG诱导时工程菌株BL21-pTrx-LN87的总蛋白。图14中1.工程菌株BL21-pTrx-LN87未经IPTG诱导时的总蛋白；2. 0.1mM IPTG、19℃条件下诱导的工程菌株BL21-pTrx-LN87的总蛋白；3. 0.1mM IPTG、19℃条件下诱导的工程菌株BL21-pTrx-LN87的可溶蛋白；4.低分子量的蛋白分子量标准(上海生化所)；5.工程菌株BL21-pTrx-LN87可溶蛋白的Ni2+Chelating Sepharose亲和层析的穿过峰；6.工程菌株BL21-pTrx-LN87可溶蛋白的Ni2+Chelating Sepharose亲和层析的50mM PB，500mM NaCl，pH6.0条件下洗脱峰；7.工程菌株BL21-pTrx-LN87可溶蛋白的Ni2+Chelating Sepharose亲和层析的50mMPB，500mM NaCl，150mM咪唑，pH6.0条件下洗脱峰；8.工程菌株BL21-pTrx-LN87可溶蛋白的Ni2+Chelating Sepharose亲和层析的50mMPB，500mM NaCl，500mM咪唑，pH6.0条件下洗脱峰。图15中1.低分子量的蛋白分子量标准(上海生化所)；2.Ni2+Chelating Sepharose亲和层析纯化的融合蛋白TRX-LN87；3.融合蛋白TRX-LN87的PreScission蛋白酶酶切产物；4.酶切后的融合蛋白TRX-LN87的CM-Sepharose阳离子交换层析的穿过峰；5.CM-Sepharose阳离子交换层析纯化的重组平颏海蛇长链神经毒素LN87；6.Sephadex G-50凝胶过滤层析纯化的重组平颏海蛇长链神经毒素LN87。图16中A.Ni2+Chelating Sepharose亲和层析的50mM PB，500mM NaCl，Ph7.8条件下穿过峰；B.Ni2+ChelatingSepharose亲和层析的50mM PB，500mM NaCl，pH6.0条件下洗脱峰；C.Ni2+Chelating Sepharose亲和层析的50mMPB，500mM NaCl，150mM咪唑，pH6.0条件下洗脱峰；D.Ni2+Chelating Sepharose亲和层析的50mMPB，500mM NaCl，500mM咪唑，pH6.0条件下洗脱峰。图17中A.重组平颏海蛇长链神经毒素LN87的CM Sepharose阳离子交换层析50mM PB，pH6.3穿过峰；B.重组平颏海蛇长链神经毒素LN87的CM Sepharose阳离子交换层析50mM PB，pH7.0300mM NaCl洗脱峰。图18中洗脱缓冲液50mM PB，150mM NaCl，pH 7.0。
具体实施方式
实施例一 平颏海蛇毒素cDNA文库的构建平颏海蛇毒腺总RNA的提取参考《现代分子生物学实验技术》[11]的一步快速热酚抽提法进行；mRNA的提取按Amersham Pharmacia公司的mRNAPurification Kit说明书操作；cDNA的合成按Amersham Pharmacia公司的TimeSaverTMcDNA Synthesis Kit说明书操作。
采用异硫氰酸胍一步法提取的毒腺总RNA经1％甲醛变性胶电泳检测可见清晰的28S、18S和5.8S三条rRNA条带，和数条特异RNA条带，表明总RNA完整性良好，而且表现出平颏海蛇毒腺的高分化特点。采用mRNA Purification Kit提取mRNA，电泳结果呈现均匀的smear，表明mRNA的完整性良好。取约5μgmRNA进行逆转录，合成双链cDNA，电泳结果显示cDNA呈现smear状，大小在200bp到8kb的范围内，主要是在2kb以下的区域，在500bp附近更为集中，表明所合成的cDNA编码的蛋白分子量大部分较小，这与海蛇蛇毒中富含小分子多肽的事实相吻合。将cDNA插入质粒载体pcDNA3.0上构建成cDNA表达文库，文库克隆数为9.96×105。提取总文库质粒进行酶切和PCR分析，结果表明cDNA插入片段大小落在500bp-8k的范围内，而在在500bp和1kb处出现较亮的泳带，在其它区域还存在数条弱带，挑取172个克隆提取质粒，酶切鉴定表明超过95％的克隆为重组子，表明该cDNA表达文库具有较好的质量。实施例二 平颏海蛇长链神经毒素克隆序列的测定和分析随机挑选500个cDNA克隆，用PEG纯化法提取质粒DNA。以T7和SP6为测序引物，采用ABI377 DNA Sequencer DNA自动序列仪(由大连宝生物工程有限公司提供)，正反向进行序列测定。结果表明平颏海蛇毒腺cDNA表达文库中毒素基因的丰度很高。其中，有一个编码长链神经毒素的基因，称为ln87，编码的蛋白质长92个氨基酸，包括21个氨基酸残基的信号肽，71个氨基酸残基的成熟肽，具有典型的长链神经毒素一级结构的特征。将推测的氨基酸序列通过因特网进行BLAST序列相似性查询，程序为BLASTTP，结果表明ln87编码的长链神经毒素与已发表的其它蛇长链神经毒素的蛋白质序列最大的同源性为57％。，而且在GENEBANK中到目前为止查询不到相同的核苷酸序列。
采用Clustalw分析软件，可比较ln87所编码的长链神经毒素与已发表的部分蛇长链神经毒素氨基酸序列的同源性，比较结果如下223565 RICYLAPR---DTQICAPGQEICYLKSWDDGTGSIRGNRLEFGCAATCPTVKRGIHIKCCSTDKCNPHPKLA---223564 RICYLAPR---DTQICAPGQEICYLKSWDDGTGFLKGNRLEFGCAATCPTVKPGIDIKCCSTDKCNPHPKLA---P25670 RICYIAPY---DHKTCAAGENICYLKAWCDAWCSSRGKKLEFGCAATCPTVKPGVDISCCDTDNCNPHPKL----BAA32992RECYLNPH---DTQTCPSGQEKCYVKSWCNAWCSSRGKVLEFGCAATCPSVNTGTEIKCCSADKCNTYP------N2LT1E RECYLNPH---DTQTCPSGQEICYVKSWCNAWCSSRGKVLEFGCAATCPSVNTGTEIKCCSADKCNTYP------AAC83981IVCHTTATSPISAVTCPPGENLCYRKMWCDAFCSSRGKVVELGCAATCPSKKPYEEVTCCSTDKCNPHPKQ-RPGP01383 KRCYRTPD--LKSQTCPPGEDLCYTKKWCADWCTSRGKVIELGCVATCPKVKPYEQITCCSTDNCNPHPKM-KP-1065379 ITCYKTPI--ITSETCAPGQNLCYTKTWCDAWCGSRGKVIELGCAATCPTVESYQDIKCCSTDNCNPHPKQKRP-P25668 IRCFITPD--ITSKDCPNG-HVCYTKTWCDGFCSIRGKRVDLGCAATCPTVRTGVDIQCCSTDDCDPFPTRKRP-P01391 -RCFITPD--ITSKDCPNG-HVCYTKTWCDAFCSIRGKRVDLGCAATCPTVKTGVDIQCCSTDNCNPFPTRKRP-AAB87417IRCFITPD--VTSTDCPNG-HVCYTKTWCDGFCSSRGRRVELGCAATCPTVKPGVDIQCCSTDNCNPFPTR--P-P01390 IRCFITFD--VTSQACPDG-HVCYTKMWCDNFCGMRGKRVDLGCAATCPKVKPGVNIKCCSRDNCNPFPTRKRS-P25674 IRCFITPD--VTSQACPDG-HVCYTKMWCDNFCGMRGKRVDLGCAATCPTVKPGVDIKCCSTDNCNPFPTRKRS-P01389 IRCFITPD--VTSQACPDGQNICYTKTWCDNFCGMRGKRVDLGCAATCPTVKPGVDIKCCSTDNCNPFPTRERS-P01386 TKCYVTPD--ATSQTCPDGQDICYTKTWCDGFCSSRGKRIDLGCAATCPKVKPGVDIKCCSTDNCNPFPTWKRKHP01397 RTCNKTPS--DQSKICPPGENICYTKTWCDAWCSQRGKIVELGCAATCPKVKAGVEIKCCSTDNCNKFKFG-KPRN2AT2 LSCYLG---YKHSQTCPPGENVCFVKTWCDAFCSTRGERIVMGCAATCPTAKSGVHIACCSTDNCNIYTKWGSGRN2AT1 LSCYLG---YKHSQTCPPGENVCFVKTWCDGFCNTRGERIIMGCAATCPTAKSGVHIACCSTDNCNIYAKWGS--87 RTCFRTP--YK-PETCPPGQNLCYKKSWCDAFCSSRGKVIELGCTAKCPTVKDGKDITCCATDNCNTVANWKSR-* *. * . *:* * :*. : :**.*.**. . .:* * *.*:
注“*”表示相同；“:”表示差异较小；“.”表示差异明显；空格表示完全不同。实施例三 重组平颏海蛇长链神经毒素表达质粒的构建根据ln87基因编码的成熟肽两端序列，合成一对引物，序列如下上游引物，5′CGGGGT ACCCTGGAAGTTCTGTTCCAAGGTCCACGT ACA TGC TTC AGA ACA CCTKpn I Precision Protease siteTAT AAA 3′下游引物，5′CGCGGA TCCTTA ACG AGA TTT CCA GTT CGC AAC 3′BamH IPCR扩增、基因克隆皆按常规方法进行。以含平颏海蛇长链神经毒素基因的pcDNA3.0质粒为模板进行PCR扩增，PCR产物约253bp。PCR扩增产物以Kpn I/BamH I双酶切后连接到pBSK上构建成重组质粒pBSK-LN87，序列测定证明外源基因核苷酸序列正确后，再以Kpn I/Not I切下外源片段，插入到原核融合表达载体质粒pTrx相应的酶切窗口上，构建成重组表达质粒pTrx-LN87。克隆后的目的基因经酶切鉴定正确。
载体质粒pTRX以T7为启动子，分子伴侣硫氧还蛋白TRX为担体蛋白，以胞内可溶的形式表达，TRX的C端有柔链区和6×HIS结构，便于利用固定化金属配体亲和层析进行纯化。所设计的上游引物含有Precision蛋白酶识别位点，以便外源蛋白单体的获得。。实施例四 融合蛋白TRX-LN87的表达与纯化将质粒pTRX-LN87转化大肠杆菌BL21(DE3)，构建成工程菌株BL21-pTRX-LN87。工程菌BL21-pTRX-LN87的超声波裂解液经SDS-PAGE分析表明该工程菌经IPTG诱导后有明显的特异表达产物带，其分子量与软件PROTEINANALYSIS预测的理论值23.3kD相符。
经过对不同温度和IPTG浓度条件下融合蛋白TRX-LN87表达情况的摸索，证明了工程菌株BL21-pTRX-LN87在低温和低IPTG浓度下表达的融合蛋白TRX-LN87的表达量和可溶性都较好。最后确定工程菌株BL21-pTRX-LN87的摇瓶培养条件为接单菌落于50ml含氨卞的LB培养基中，37℃，250rpm培养过夜，取过夜培养物以1∶50的比例接种于含氨卞的LB培养基中，37℃，250rpm下继续培养至菌的OD600≈0.6时，将培养温度降至19℃，加入100mM IPTG和20％葡萄糖至终浓度分别为0.1mM和0.2％，250rpm诱导培养10h后离心收获菌体。薄层扫描分析表明，在此条件下融合蛋白TRX-LN87的表达量占菌体总蛋白的20％以上，50％以上的融合蛋白处于胞内可溶状态。
收获的菌体以1g/10ml上样缓冲液(50mM PB，500mM NaCl，Ph7.8)的比例进行重悬，冰浴状态下进行超声波破碎，超声裂解液离心后取上清进行Ni2+Chelating Sepharose亲和层析。所采用的洗脱条件为50mM PB，500mMNaCl，pH7.8(A液)；50mM PB，500mM NaCl，pH6.0(B液)；50mM PB，500mM NaCl，150mM咪唑，pH6.0(C液)；50mM PB，500mMNaCl，500mM咪唑，pH6.0(D液)。融合蛋白TRX-LN87在D液被洗脱下来。在此洗脱条件下的融合蛋白TRX-LN87的纯度约为50％，得率约为100mg/L。实施例五 重组平颏海蛇长链神经毒素LN87的纯化将经Ni2+Chelating Sepharose亲和层析纯化的融合蛋白TRX-LN87用Sephadex G-25更换缓冲系统(缓冲液为50mM Tris·HCl，150mM NaCl，1mM EDTA，pH7.0)后，加入100mM DTT至终浓度为1mM，再加入适量的Precision Protease，在4℃下酶切过夜。
将过夜的融合蛋白TRX-LN87的Precision Protease酶切产物用SephadexG-25更换缓冲系统(缓冲液为50mM PB，pH6.3)后，进行CM Sepharose弱阳离子交换层析，重组平颏海蛇长链神经毒素LN87用50mM PB，300mM NaCl，pH7.0的条件洗脱下来。
将重组平颏海蛇长链神经毒素LN87的CM柱洗脱液进行Sephadex G-50凝胶过滤层析，平衡缓冲液为50mM PB，150mM NaCl，pH7.0，由于目的蛋白纯度较高，所以此凝胶过滤层析只有一个主峰，其它的杂峰并不明显。实施例六 重组平颏海蛇长链神经毒素LN87的半致死剂量(LD50)的测定本实验观察小鼠腹腔注射给予受试样品由于短时间内大剂量给药使药物蓄积产生毒性反应及其严重程度，为拟定临床人用剂量提供参考。
选取健康昆明系小鼠，体重20±2g，雌雄各半，由广东省医学实验动物中心提供；合格证号2000A025。
将受试样品用磷酸缓冲液配成所需的不同浓度，按照《新药(西药)临床前研究揩导原则汇编》的急性毒性实验方法，对小鼠一次腹腔注射受试样品0.2ml/20g体重，连续观察7d，记录动物死亡或异常反应，按Bliss′s法计算半数致死量LD50。
小鼠在腹腔注射不同重组蛋白质LN87后12小时内，有出现死亡现象，小鼠死亡前出现典型的神经中毒现象，表现为四肢抽搐，行动迟缓，死亡率随着给药剂量的增加而增加，存活的动物连续观察7d，不再出现死亡。解剖死亡动物，观察心、肝、脾、胃、十二指肠、肺主要脏器，无出现出血、腹水现象。
表1重组平颏海蛇长链神经毒素LN87的半数致死剂量LD50的测定剂量对数剂量 死亡率 实验机率 拟合回归机率回归机率误差mg/kg 单位单位 单位2.058.31 03.042.91 2.91-.0002712.94 .47 10 3.723.56 3.56-.0001924.2 .62 20 4.164.21 4.21-.0001136.78 50 5 4.86 4.86-.0000338.571.93 70 5.525.52 5.520.00004612.245 1.09 80 5.846.17 6.170.00012617.493 1.24 100 6.966.82 6.820.000205显著性指数G＝0.1441 X 50＝.8104 Sx＝.0459 G较小，已省略异质性检查Chi2＝1.35Chi2.05＝11.07 Sb＝0.8163 无异质性回归方程式为Y(Probit)＝1.5847+4.2144*log(D)r＝0.9756LD50＝6.4624±1.3494(5.2524-7.9511)mg/kg实施例七 重组平颏海蛇长链神经毒素LN87的镇痛作用采用小鼠热板法，化学法，大鼠的电刺激，机械压痛法，评价重组平颏海蛇长链神经毒素LN87的镇痛作用。重组平颏海蛇长链神经毒素LN87使用时用50mMPB，100mM NaCl pH7.0配成所需浓度，供小鼠及大鼠腹腔注射。阳性药为度冷丁麻醉性镇痛药，由医院提供。
昆明系小鼠，体重22±2g，热板法均用雄性小鼠，化学法雌雄各半，由广东省医学实验动物中心提供；SD系大鼠，体重180-200g，雌雄各半，由广东省医学实验动物中心提供；1.小鼠热板法把小鼠放于事先加热到55℃的GJ-8402型热板测痛仪上，用秒表记录小鼠自投入热板至出现舔后足的时间(秒)为该鼠的痛阈值。给药前先测定每只小鼠的痛阈(共测二次，以平均值不超过30秒者为合格，实验中根据实际情况选用痛阈大于10秒而不超过30秒的小鼠。)给药后0.5h，1h，2h，3h，6h，12h，24h测定一次，连续数次，如痛阈值超过60秒，即停止测试而按60秒计算(时间过久，易烫伤足部)。
实验结束，按所测之痛阈平均值计算痛阈提高百分率。痛阈提高百分率＝(用药后平均痛阈值-用药前平均痛阈值)÷用药前平均值。一般来说，给药后，痛反应时间延长1倍以上者，作为有效镇痛作用。表2重组平颏海蛇长链神经毒素LN87小鼠热板法实验结果(x±SD，n＝10，C％为镇痛提高百分率)组别 给药前 给药后(秒)(秒) 0.5h 1h 2h 3h 6h 24h空白 13.25± 18.1± 13.39± 13.72± 19.8± 19.24± 14.01±6.61 8.27Δ3.05Δ6.77Δ8.23Δ8.15Δ3.51Δ痛阈提高％ 36.60％ 1.06％ 3.55％ 49.43％45.21％5.74％给药1 14.64± 19.42±22.45± 30.56± 30.55± 39.28± 14.67±80ug/kg 5.36 6.95Δ10.3*19.46**21.54*17.5***6.2Δ痛阈提高％ 32.65％ 53.35％108.74％ 108.67％ 168.31％ 0.2％给药2 16.98± 21.93±28.98± 37.92± 36.85± 35.78± 21.98±40ug/kg 6.57 15.2Δ15.8*21.42**24.51**17.1**13.5Δ痛阈提高％ 29.15％ 70.67％123.32％ 117.02％ 110.72％ 29.45％给药3 16.16± 27.32±28.25± 32.85± 39.6±44.5±23.52±20ug/kg 6.57 13.2 16.2*18.13**18.5***21.39***15.4Δ痛阈提高％ 69.06％ 74.81％103.28％ 145.05％ 175.37％ 45.54％给药4 18.53± 26.94±25.47± 25.94± 32.79± 37.75± 17.61±10ug/kg 6.17 16.4Δ19.5Δ19.55Δ15.13*21.6*6.1Δ痛阈提高％ 45.38％ 37.45％39.99％76.96％103.72％ -4.96％给药5 15.36± 19.42±16.9± 27.55± 34.35± 33.65± 17.33±5ug/kg3.69 11.4Δ8.67Δ17.88*18.55**19.8**6.2Δ痛阈提高％ 26.43％ 10.03％79.36％123.63％ 119.08％ 12.83％度冷丁12.88± 31.41±24.41± 26.08± 27.7± 32.54± 17.11±1.08mg/20g5.50 17.8 20.3Δ20.67Δ16.29*20.9**6.72Δ痛阈提高％ 143.87％ 89.52％102.48％ 115.06％ 152.64％ 32.84％与同组给药前相比ΔP＞0.05，*P≤0.05，**P≤0.01，***P≤0.001。
以给药时间为横坐标，痛域净提高率(用药组痛域提高百分率-相对的空白组痛域提高百分率)为纵坐标，作出重组平颏海蛇长链神经毒素LN87的量效曲线。该曲线表明，重组蛋白质LN87的镇痛作用在腹腔注射后0.5～1h间起效，起效时间晚，起效速度慢，一般在2～6小时镇痛作用较强，最高镇痛效果是痛阈提高百分率为175.37％，稍高于度冷丁阳性组，而24小时内仍有一定的镇痛效果。
LN87 1.75mg/ml 净提高率0.5h1h 2h 3h 6h 24h给药1 -3.95 52.29 105.19 59.24 123.1 -5.54给药2 -7.45 69.61 119.77 67.59 65.51 23.71给药3 32.46 73.75 99.7395.62 130.16 39.8给药4 8.7836.39 36.4427.53 58.51 -10.7给药5 -10.17 8.9775.8174.273.87 7.09阳性组 107.27 88.46 98.9365.63 107.43 27.1 2.小鼠化学法选用体重18-22克的小鼠，随机分组。腹腔注射样品，给药后1小时每鼠腹腔注射1.44％冰醋酸0.2ml/20g，记录注射致痛剂后20min内各鼠扭体次数，比较组间差异，然后计算药物镇痛百分率。药物镇痛百分率＝(给药组扭体次数-空白组扭体次数)÷空白组扭体次数。
小鼠醋酸扭体实验结果表明，重组平颏海蛇长链神经毒素LN87具有一定的外周镇痛作用，这种镇痛作用具有量效性，但是其镇痛作用要明显低于阳性对照度冷丁。表3重组平颏海蛇长链神经毒素LN87醋酸扭体法实验结果(x±SD，n＝10，C％为镇痛提高百分率)组别空白组 80ug/kg 40ug/kg20ug/kg 10ug/kg 5ug/kg度冷丁1.08mg/20g扭体次数73.4± 35.8± 44.7± 50.8± 45.8± 51.4± 8.5±6.9 10.6*** 18.2***20.2**12.7*** 17.2*** 6.9***镇痛百分率 51.22％ 39.1％ 30.8％37.6％30.0％64.9％与空白组相比ΔP＞0.05，*P≤0.05，**P≤0.01，***P≤0.001。2.大鼠电刺激法选用体重于180-200gSD系大鼠，生理实验多用仪JL-C型，调节电压2.85-3V，波宽0.5ms，频率100Hz，75％酒精擦去大鼠尾部皮脂，两根针状电极插入其尾中部皮下4mm。调节电流，从零开始，由低到高，至动物出现第一次嘶叫时，立即记录该值，测定3次，取其平均值作为给药前痛阈值。给药后0.5h，1h，1.5h，2h，4h测定大鼠的痛阈值。
大鼠电刺激法实验结果表明，部分给药组在实验中出现了超敏现象，但给药组80ug/kg和40ug/kg均表现出明显的镇痛作用，甚至强于阳性对照度冷丁。表4重组平颏海蛇长链神经毒素LN87大鼠电刺激法实验结果(x±SD，n＝10，C％为镇痛提高百分率)组别 给药前 给药后1h/0.5h2h/1.5h 4h/3h空白组0.077±0.0220.074±0.011Δ0.08±0.042Δ0.061±0.031Δ-3.9％3.9％ -20.78％LN87 0.113±0.0080.117±0.017Δ0.126±0.038Δ0.107±0.013Δ160ug/kg 3.54％11.50％ -5.31％LN87 0.098±0.0310.129±0.035* 0.149±0.020*** 0.099±0.031Δ80ug/kg 31.63％ 52.04％ 1.02％LN87 0.102±0.0140.150±0.023*** 0.131±0.025** 0.088±0.037Δ40ug/kg 47.06％ 28.43％ -13.73％LN87 0.097±0.0320.102±0.039Δ0.115±0.039Δ0.096±0.029Δ20ug/kg 5.12％18.56％ -1.03％LN87 0.105±0.0330.089±0.020Δ0.097±0.034Δ0.068±0.035*10ug/kg -15.24％ -7.62％ -35.24％度冷丁0.090±0.0170.123±0.017*** 0.119±0.032*0.071±0.025Δ9.9mg/kg 36.67％ 32.22％ -21.11％阳性药每0.5h，1.5h，3h测定痛阈值。
与同组给药前相比ΔP＞0.05，*P≤0.05，**P≤0.01，***P≤0.001。4.大鼠机械压痛法使用压力测痛装置，测痛时大鼠尾置于刀口下，在注射器处用力加压，使刀口对鼠尾的压力按一定速度上升，同时毛细管水银上升，于是反映出相应的压力。当放松注射器时，压力则下降，刀口上升。中间连接处通过三阀调节阀门方向。实验用的大鼠体重在180-200g，压痛部位为敏感性较高的鼠尾的尾尖端1/3处，加压以产生嘶叫为痛阈值。实验前，连续测二次，筛除不合格的动物，取其平均值作为对照值。给药后0.5h，1h，1.5h，2h，3h，4h测定其痛阈值，并计算痛阈提高百分率来比较镇痛强度。
平颏海蛇长链神经毒素LN87对大鼠机械压痛法表现出的镇痛效果不明显。表5重组平颏海蛇长链神经毒素LN87大鼠机械压痛法实验结果(x±SD，n＝10，C％为镇痛提高百分率)组别给药前 给药后1h/0.5h2h/1.5h 4h/3h空白组 8.981±1.208 9.813±1.033Δ10.063±1.208Δ7.163±1.423Δ9.26％ 18.36％ -20.24％LN87 10.825±1.52912.75±3.723Δ13.5±3.873Δ10.238±1.774Δ40ug/kg 17.78％24.71％ -5.42％LN87 10.8±1.011 12.00±1.626Δ10.563±2.352Δ8.425±1.683***20ug/kg 11.11％2.19％-21.99％LN87 9.588±0.869 12.00±2.841* 10.188±1.193Δ9.188±1.650Δ10ug/kg 25.16％6.26％-4.17％LN87 9.188±0.783 8.525±1.925Δ6.713±1.084***6.588±1.347***5ug/kg -7.216％ -26.94％ -28.3％LN87 9.288±1.215 9.788±1.997Δ7.588±1.604* 6.35±0.993***2.5ug/kg5.38％ -18.30％ -31.63％度冷丁 8.475±0.968 14.75±2.699***9.95±2.442Δ7.188±1.582Δ9.9mg/kg74.04％17.40％ -15.19％阳性药每0.5h，1.5h，3h测定痛阈值。与同组给药前相比ΔP＞0.05，*P≤0.05，**P≤0.01，***P≤0.001。
序列表<110>中山大学<120>一种平颏海蛇长链神经毒素基因及其表达、应用<160>2<210>1<211>495<212>DNA<213>平颏海蛇(Hydrophiinae，Lapemis hardwickii Gray)<220><221>CDS<222>(4)…(282)<220><221>sig_peptide<222>(4)…(66)<220><221>mat_peptide<222>(67)…(279)<220><221>PolyA_signal<222>(450)…(455)<220><221>PolyA_siteRNA<222>(467)…(495)<400>1aag atg aaa att ctg ctg ctg acc ttg gtg gtg gtg aca atc gtg tgc 48Met Lys Ile Leu Leu Leu Thr Leu Val Val Val Thr Ile Val Cys1 5 10 15ctg gac tta gca tac acc agg aca tgc ttc aga aca cct cag aac cct 96Leu Asp Leu Ala Tyr Thr Arg Thr Cys Phe Arg Thr Pro Try Lys Pro20 25 30aga act tgt cca cct ggg cag aac cta tgc tat aaa aag agt tgg tgt 144Glu Thr Cys Pro Pro Gly Gln Asn Leu Cys Tyr Lys Lys Ser Trp Cys35 40 45gat gct ttt tgt tcc agc aga gga aag gta atc gaa ctg gga tgt act 192Asp Ala Phe Cys Ser Ser Arg Gly Lys Val Ile Glu Leu Gly cys Thr50 55 60gct aaa tgc cct aca gtg aag gac gga aaa gat att acc tgt tgc gca 240Ala Lys Cys Pro Thr Val LYs Asp Gly Lys Asp Ile Thr Cys Cys ala65 70 75aca gac aat tgc aac aca gtt gcg aac tgg aaa tct cgt tgagtgttgc 289Thr Asp Asn Cys Asn Thr Val Ala Asn Trp Lys Ser Arg80 85 90tctcatccat gttgcaccat ccttgaaaat ttatgcttgt ggcctttacc gcagatggtc 349catcatcccc ctctcccctg ctgtctttga catctcaaca tctttccctt ttctctcgtt 409ctgtacgttt ccttctgcta gttctgtagt ttgagaatcg aataaaactc agcattcaaa 469aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 495<210>2<211>92<212>PRT<213>平颏海蛇(Hydrophiinae，Lapemis hardwickii Gray)<220><221>SIGNAL<222>(1)…(21)<400>2Met Lys Ile Leu Leu Leu Thr Leu Val Val Val Thr Ile Val Cys1 5 10 15Leu Asp Leu Ala Tyr Thr Arg Thr Cys Phe Arg Thr Pro Try Lys20 25 30Pro Glu Thr Cys Pro Pro Gly Gln Asn Leu Cys Tyr Lys Lys Ser35 40 45Trp Cys Asp Ala Phe Cys Ser Ser Arg Gly Lys Val Ile Glu Leu50 55 60Gly cys Thr Ala Lys Cys Pro Thr Val LYs Asp Gly Lys Asp Ile65 70 75Thr Cys Cys ala Thr Asp Asn Cys Asn Thr Val Ala Asn Trp Lys80 85 90Ser Arg
权利要求
1.一种平颏海蛇长链神经毒素基因Ln87，其来源于平颏海蛇毒腺cDNA文库，核苷酸序列如附图1所示。
2.如权利要求1所述的基因，其特征在于编码92个氨基酸，等电点为8.4，分子量为8,000道尔顿，包括21个氨基酸的信号肽，71个氨基酸的成熟肽，氨基酸序列如附图2所示。
3.一种载体，其特征在于含有权利要求1所述的基因Ln87。
4.如权利要求3所述的载体，其特征在于载体为大肠杆菌表达载体。
5.如权利要求4所述的载体，其特征在于载体为重组质粒pTRX-Ln87，是以硫氧还蛋白为担体蛋白，具有6个组氨酸亲和标记位点及PreScission蛋白酶识别位点。
6.如权利要求4或5所述的载体，其特征在于载体转化的是能表达平颏海蛇长链神经毒素的大肠杆菌。
7.如权利要求6所述的载体，其特征在于大肠杆菌表达平颏海蛇长链神经毒素基因Ln87，基因在大肠杆菌内以胞内可溶的融合蛋白形式高效表达。
8.如权利要求7所述的载体，其特征在于表达产物的超声裂解液经Ni2+Chelating Sepharose亲和色谱层、PreScission蛋白酶切割、离子交换层析、和凝胶过滤层析纯化后，得到融合蛋白。
9.权利要求2或8所述的蛋白在制备治疗镇痛、戒毒、相关神经疾病药物的应用。
全文摘要
本发明公开了一种平颏海蛇长链神经毒素基因Ln87，其来源于平颏海蛇毒腺cDNA文库。本发明的平颏海蛇长链神经毒素LN87具有生物活性，并具有明显的镇痛作用。本发明还公开了上述基因的表达及在制备治疗镇痛、戒毒、相关神经疾病药物的应用。
文档编号A61K38/16GK1432647SQ0211474
公开日2003年7月30日 申请日期2002年1月15日 优先权日2002年1月15日
发明者徐安龙, 钟肖芬, 彭立胜, 卫剑文, 杨文利, 吴文言 申请人:中山大学