专利名称：具有止血活性的尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物医药和蛋白质酶学领域。具体的讲，其涉及一种从尖吻蝮蛇(Agkisdroton acutus)蛇毒中提取的一种具有止血活性的类凝血酶的结构特征，纯化方法和医药领域方面的用途。该止血效应的类凝血酶通过激活纤维蛋白原而加强凝血，同时因不激活XIII因子，不会引起血栓形成。在临床前研究中得出了高效极低毒性效果。尖吻蝮蛇又称五步蛇或蕲蛇，分布在华南各省。其蛇毒中的精氨酸酯酶活性较低，无神经毒和激肽释放酶活性。其组份中，有几种成分在体外能使人或牛纤原凝结，但在动物体内却引起各种不同的生理效应如降纤抗凝、血小板聚集和止血等。F.Kornalic将以纤维蛋白原为底物的蛇毒酶类按其作用方式不同分成三类一类是类凝血酶(Thrombin-like enzyme)或凝血蛋白酶(Thrombic protease)，它们仅分解纤维蛋白原的α链和/或β链的N端肽链，释放A肽(α链)和/或B肽(β链)，使血液凝固。二类是纤维蛋白原裂解酶(Fibrinogenolytic enzyme)，它们直接从纤维蛋白原三条肽链(α，β和γ)的C端水解，将纤原分解成碎片，血液不被凝固。三类是纤溶酶原激活酶(Enzyme activating plasminogen)，它是纤维蛋白溶解的间接激活剂，它通过激活纤溶酶原产生纤溶酶，来裂解纤维蛋白或纤维蛋白原。本发明属第一类.尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶的研究，最早是1967年的Cheng，H.C.和Ouyang，C.等，他们于1971年和1972年相继分离出两个类凝血酶组份，并经动物实验验证，它们均有不同程度抗凝作用。肖昌华等从1988年起和管锦华等从1992年起，多次偿试从尖吻蝮蛇蛇毒中分离使动物凝血时间缩短的组份，但都因无法提纯，对其结构无法准确定性和定量，未成功已放弃。国外相似的产品有Klobusitzky和Konig等从Bothropsjararaca蛇毒中部分纯化出一局部和非胃肠使用安全的止血剂，取名Hemocoagulase，由米兰Ravizzo公司从Bothrops jararaca蛇毒中部分提取的，以商品名Bothropase和由Basle Pentapharm公司从Bothropsatrox蛇毒中提取的，以商品名Reptilase的制剂在欧美有售。其中仅有商品名为立止血(Reptilase)的品种在国内由深圳建安医药公司代理销售，立止血疗效确切，付作用小，临床适应症广，优于其它止血药等特点，并于1996年进入中国国家基本药物。
本发明的类凝血酶作用方式与Reptilase相同，但它的分子结构完全不同于立止血(reptilase)。该类凝血酶通过酶切除纤原分子中的酸性A肽，能使人血浆和牛纤维蛋白原在体外凝固，因不激活XIII因子，导致产生非交联性纤维蛋白单体复合物。在伤口处，该单体复合物与其它凝血因子相互作用产生止血效应，在完整血管内，该单体半衰期较短，可迅速被纤溶酶降解。该类凝血酶在体外使柠檬酸化血浆凝固，在体内可使出凝血时间显著缩短，同时又不造成血栓形成，达到伤口部位的止血或预防出血之目的。
本发明的目的是提供预防临床手术出血，治疗外伤出血及全身和局部止血方面的尖吻蝮蛇类凝血酶，确定其准确的物理化学性质和结构特征。
本发明的目的是提供该酶分子对血液的凝固不受肝素的影响，故可以制成诊断试剂用于临床上测定某些使用肝素患者的出凝血时间。
本发明的目的还在于提供纯化具有止血效应的尖吻蝮蛇类凝血酶的方法，尤其是纯化工艺的全面布局和层析条件。
一种具有防治出血的蛇毒类凝血酶，用SDS-PAGE法测得其全分子量为32KD，有相近两个亚基组成，亚基分子量17KD和15KD，该酶最适温度为35℃，最使PH 7.5，等电点为5.9。根据文献和我们的试验结果证实，该类凝血酶结构与立止血完全不同。
用液相色谱法测该类凝血酶氨基酸组成为(％)Asp6.2，Thrl.43，Ser4.16，Glu8.74，Gly2.14，Ala2.15，Val2.88，Met1.33，Ile2.35，Leu2.28，Tyr2.45，Phe4.16，Lys4.19，His1.58，Arg1.83，Pro1.8，Cys4.34，Trp4.93，NH32.68。
该止血效应的蛇毒类凝血酶的纯化方法，包括尖吻蝮蛇蛇毒的溶解，Sephedex G75凝胶过滤，DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换，透析和Sephedex G-25脱盐构成。其特征在于该蛇毒类凝血酶采用FPLC DEAE-Sepharose Fast Flow色谱填料进行纯化，流速40ml/min.流动相A10mmol/L磷酸盐缓冲液PH8.0，B液为含有0.35mol/L氯化钠的A液.洗脱梯度呈线性0～0.35mol/L的氯化钠。
具体制备纯该酶的方法是取验证了的尖吻蝮蛇蛇毒，加缓冲液溶解后离心。取上清液上Sephdaex G-75层析柱，活性峰上DEAE-Sepharose Fast Flow层析柱，活性峰经透析后再上DEAE-Sepharose Fast Flow层析柱，收集活性峰，即为纯品。
纯化后的类凝血酶，用SDS-PAGE法测的全分子量位32KD，有17KD和15KD两条多肽链组成.正相HPLC为单一峰.PAGE为单一带，在体外能凝结新鲜人血浆。
体内药效学验证纯化后的尖吻蝮蛇类凝血酶经新西兰白兔耳静脉和臀部肌注注射，实验采用三个剂量组
，结果均使全血凝固时间(表1)明显缩短，并使药效维持6小时立止血以上。各实验剂量组静脉注射使纤维蛋白原含量(表2)和血液粘度(表7)不变或减少。对家兔凝血活酶时间(表3)，血小板数量(表4)无明显影响。对优球蛋白溶解时间(表5)，大剂量可时其缩短，中小剂量无明显影响。本品耳静脉注射10分钟内起效，30分钟达高峰。试验设立立止血阳性对照组和生理盐水阴性对照组。不论肌注还是静注，相同剂量的本品组药效与立止血阳性对照组相近，但优于生理盐水组对照组。实验小鼠尾静脉剪断出血实验(表6)，该品(0.5U/Kg，1.0U/Kg，2.0U/Kg)腹腔注射，各剂量组小鼠尾静脉出血时间与生理盐水组和立止血组相比，均有不同程度的缩短，其中0.5u/kg剂量组与对照组比较有显著性差异(P＜0.01)。
本发明的止血类凝血酶，其特征还在于该酶分子可通过血脑屏障，治疗颅出血。
常用适用途径有肌肉注射，静脉注射；可局部或全身使用等。
表1.尖吻蝮蛇类凝血酶(sTLE)对新西兰兔全血凝固时间的影响(X±SD)
表2.尖吻蝮蛇类凝血酶(sTLE)新西兰白兔纤维蛋白原含量的影响(X±SD)表3.尖吻蝮蛇类凝血酶(sTLE)对新西兰白兔APTT的影响(X±SD)表4.尖吻蝮蛇类凝血酶(sTLE)对血小板数量的影响表5.尖吻蝮蛇类凝血酶(sTLE)对兔优球蛋白溶解时间的影响。
表6.尖吻蝮蛇类凝血酶(sTLE)对小鼠剪尾出血时间的影响表7.尖吻蝮蛇类凝血酶(sTLE)对新西兰兔全血粘度(mPaS)的影响实列一取检验了的尖吻蝮蛇蛇毒1克，加磷酸盐缓冲液溶解蛇毒后，6000转/分离心弃沉淀，取上清液上Sephdaex G-75层析柱(4*80cm)，用磷酸盐缓冲液洗脱，收集活性峰上DEAE-SepharoseFast Flow层析柱(2*15cm)，用包含0.35M氯化钠的磷酸盐缓冲液梯度洗脱，收集活性峰经8～10KD截留半透膜透析后再上DEAE-Sepharose Fast Flow层析柱(2*15cm)，用包含用0.35M氯化钠的磷酸盐缓冲液梯度洗脱，收集活性峰，即收得纯品10.6mg。
纯化后的类凝血酶，用SDS-PAGE法测的全分子量位31849D，两条亚基分子量16465D和15384D，分子筛HPLC为单一峰，纯度100％.PAGE为单一带，在体外能凝结新鲜人血浆。蛋白比活15.38U/mg(reptilase unit)。等电点为5.9。用液相色谱法测的纯化后的类凝血酶氨基酸组成为(％)Asp6.2，Thr1.43，Ser4.16，Glu8.74，Gly2.14，Ala2.15，Val2.88，Met1.33，Ile2.35，Leu2.28，Tyr2.45，Phe4.16，Lys4.19，His1.58，Arg1.83，Pro1.8，Cys4.34，Trp4.93，NH32.68。
药效学见表1～7。
实列二取检验了的尖吻蝮蛇蛇毒20克，加150ml磷酸盐缓冲液溶解蛇毒后，6000转/分离心弃沉淀，取上清液分五次上Sephdaex G-75层析柱(7*100cm)，用磷酸盐缓冲液洗脱，收集活性峰上DEAE-Sepharose Fast Flow层析柱(4.5*30cm)，用包含用0.35M氯化纳的磷酸盐缓冲液梯度洗脱，收集活性峰经8～10KD截留半透膜透析后再上DEAE-Sepharose Fast Flow层析柱(4.5*30cm)，用包含0.35M氯化钠的磷酸盐缓冲液梯度洗脱，收集活性峰，即得纯品189.9mg。
纯化后的类凝血酶，用SDS-PAGE法测的全分子量位32540D，两条亚基分子量17036D和15504D，分子筛HPLC为单一峰，纯度97.5％.PAGE为单一带，在体外能凝结新鲜人血浆。酶比活17.5U/mg。
药效学见表1～7。
表1.尖吻蝮蛇类凝血酶(sTLE)对新西兰兔全血凝固时间的影响(X±SD)
*P＜0.05 by paired t test表2.尖吻蝮蛇类凝血酶(sTLE)新西兰白兔纤维蛋白原含量的影响(X±SD)
*P＜0.05，**P＜0.01 by paired t test.
表3.尖吻蝮蛇类凝血酶(sTLE)对新西兰白兔APTT的影响(X±SD)
*P＜0.05，**P＜0.01 by paired t test.
表4.尖吻蝮蛇类凝血酶(sTLE)对血小板数量的影响组别 动物数血小板数量(109/L)10min 1h3h生理盐水组7319.4±72 317.7±79.6 237.1±90.3sTLE组0.025u/kg 7288.0±79.1255.0±59.6 233.0±12.70.05u/kg 7272.0±77.9226.1±46.4*272.2±290.1u/kg 7339.0±88.1330.9±88.7 238.3±70.3立止血0.05u/kg7267.0±73.9306.2±81.2 269.4±62.1与生理盐水组相比*P＜0.05表5.尖吻蝮蛇类凝血酶(sTLE)对兔优球蛋白溶解时间的影响组别 动物数 优球蛋白溶解时间(n) 10min 60min 180min生理盐水 7246.0±7.7225.1±76.4 191.4±3.8sTLE 0.025u/kg7133.8±7.4**141.7±34.7*235.0±7.6***0.05u/kg 8169.0±96.6 156.3±3.5151.4±3.8***0.1u/kg 885.0±28.3***75.0±28.3***136.3±7.4***立止血0.05u/kg8211.4±85.5 138.8±86.3 286.3±90.4*与生理盐水组相比*P＜0.05**P＜0.01***P＜0.001表6.尖吻蝮蛇类凝血酶(sTLE)对小鼠剪尾出血时间的影响组别剂量(u/kg) 给药途径 动物数出血时间生理盐水--- Ip 1034.1±11.1sTLE0.5 Ip 1019.7±7.5**sTLE1.0 Ip 1126.9±12sTLE2.0 Ip 1226±18.0立止血 0.5 Ip 1028.7±17.1**与生理盐水组相比P＜0.01表7.尖吻蝮蛇类凝血酶(sTLE)对新西兰兔全血粘度(mPaS)的影响组别 动物数 切变率38.4s-110min 1h 3h生理盐水组7 8.22±3.46 7.01±1.20 6.89±2.70sTLE组0.025u/kg 7 6.89±1.00 6.09±0.80 6.29±1.320.05u/kg 7 7.21±1.40 6.08±1.65 5.74±0.900.1u/kg 7 7.28±0.95 7.48±2.02 6.39±1.85立止血0.05u/kg7 7.43±1.88 6.02±0.86 6.46±1.5权利要求
1.一种防治出血的尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶.其特征在于其全分子量32KD，有17KD和15KD两条多肽链组成，等电点5.9。
2.根据权利要求1所述的止血类凝血酶，其特征在于氨基酸组成为(％)Asp6.2，Thr1.43，Ser4.16，Glu8.74，Gly2.14，Ala2.15，Val2.88，Met1.33，Ile2.35，Leu2.28，Tyr2.45，Phe4.16，Lys4.19，His1.58，Arg1.83，Pro1.8，Cys4.34，Trp4.93，NH32.68。
3.根据权利要求1所述的止血类凝血酶，其特征在于在体外，促进人枸橼酸化血浆凝固和能使牛纤维蛋白原凝固，在体内使凝血时间缩短。
4.一种防治出血的尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶的纯化方法包括取验证了的尖吻蝮蛇蛇毒，加缓冲液溶解后离心，取上清液上Sephdaex G-75层析柱，活性峰上DEAE-Sepharose Fast Flow层析柱，活性峰经透析后再上DEAE-Sepharose FastFlow层析柱，收集活性峰，即为纯品。
5.包括权利要求4所述的该类凝血酶的纯化方法，其特征在于该蛇毒类凝血酶采用FPLC DEAE-Sepharose Fast Flow色谱填料进行纯化，流速40ml/min.流动相A10mmol/L磷酸盐缓冲液PH8.0，B液为含有0.35mol/L氯化钠的A液.洗脱梯度呈线性0～0.35mol/L的氯化钠.
6.根据权利要求1所述的止血类凝血酶，其特征在于可预防临床手术出血，治疗外伤出血及全身和局部止血。
7.根据权利要求6所述的止血类凝血酶，其特征在于不仅可肌肉注射，还可静脉注射和静脉滴注。不仅全身，还可局部使用。
8.根据权利要求1和6所述的止血类凝血酶，其特征在于该酶分子对血液的凝固不受肝素的影响，故可以制成诊断试剂用于临床上测定某些使用肝素患者的出凝血时间。
全文摘要
本发明的尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶涉及生物医药和酶学领域。具体地讲，涉及一种从尖吻蝮蛇蛇毒中提取的、具有止血活性酶的结构特征，纯化方法和医药领域用途。该酶全分子量为32KD(SDS－PAGE法)，有相近两个亚基17KD和15KD组成。HPLC为单峰。该酶最适温度为35℃，最适pH7.5，等电点为5.9。用酸水解测得该酶有18或20种氨基酸组成。血浆凝结试验在60±20秒，同时纤原凝结试验230±50秒。该酶切除纤原分子中的酸性A肽(α链)和不激活XIII因子，在体内使全血凝固时间显著缩短，不造成血栓形成。本发明的用途是预防临床手术出血、治疗外伤出血、全身和局部止血及诊断某些临床凝血时间。
文档编号A61K38/48GK1502693SQ02138630
公开日2004年6月9日 申请日期2002年11月22日 优先权日2002年11月22日
发明者唐松山 申请人:唐松山