专利名称：一种伤寒疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种预防伤寒的疫苗制剂，特别是一种与蛋白载体结合的伤寒Vi多糖疫苗制剂。
伤寒沙门氏杆菌是一类革兰氏阴性杆菌，细菌的表面包裹着一层多糖，即荚膜。沙门氏菌具有复杂的抗原构造，一般可分为3类抗原(1)Vi抗原或表面抗原，即荚膜多糖；(2)O抗原或细胞壁抗原，是细胞壁的脂多糖，即内毒素；(3)H抗原或鞭毛抗原，是一种蛋白质抗原。
沙门氏菌的不同菌株都有荚膜多糖，它具有抗吞噬作用和保护细菌避免相应的抗体在补体参与下的溶菌作用。同时，荚膜可以保护细菌在血液中得以生存。特异性的抗荚膜多糖抗体与细菌结合后通过活化补体而杀死伤寒杆菌。鉴于荚膜多糖这些与细菌侵袭力和毒力有关的特性，Felix和Pitt于20世纪50年代将沙门氏杆菌的荚膜多糖命名为Vi抗原，随后的研究发现，用粗制的Vi荚膜多糖抗原免疫小鼠后，小鼠可获得对伤寒沙门氏菌感染的抵抗力，可保护小鼠免受再次感染。后来研究人员用乙酸处理荚膜多糖抗原，所得到的精制抗原不能使动物产生有效的保护力。直到20世纪80年代，研究发现乙酸处理抗原可导致Vi多糖变性，从而导致多糖的免疫原性发生了改变，失去了产生保护性抗体的可能。
伤寒疫苗有注射用灭活全菌体疫苗、口服灭活全菌体疫苗、口服减毒活疫苗、Vi多糖疫苗等。20世纪60-70年代，灭活全菌体疫苗在许多国家进行了临床研究，效果不理想，已停止使用。链霉素依赖性伤寒突变株活疫苗在正常人体内繁殖能力较差，免疫后效果难尽人意，且冻干型的该种疫苗又完全丧失保护力，也停止了研究。伤寒Ty21a减毒活疫苗经过了大量临床实验，已被证实是目前较安全有效的伤寒疫苗之一，而且没有严重的副反应，但长期以来一些学者对Ty21a突变株提出以下仍然具有争议的问题该减毒株的遗传稳定性不能确定，并推测其有毒力返祖的可能；galE基因的突变不能完全解释该疫苗的减毒机制；有其他不明部位的基因发生了突变；冻干剂型疫苗的稳定性不规律以及口服接种次数过多等。
纯化Vi多糖疫苗是经使用溴化-16-烷基-3-甲基铵处理的伤寒Vi多糖，具有较好的免疫原性，目前法国巴斯德-梅里厄研究所、比利时史克-必成及中国、印度的疫苗生产企业均已投入生产。在成人及2岁以上的儿童中，伤寒Vi多糖疫苗通常是经肌肉注射或皮下深部注射免疫，一次注射后90％以上的2岁以上的被免疫者可产生Vi多糖抗体，血清抗体的保护性水平可维持2-3年，再次免疫时没有回忆反应，血清抗体水平与初次免疫相似。伤寒Vi多糖疫苗于1989-1997年间共接种了2200万人，其中仅6人发生伤寒感染，而且有2人血培养结果阴性，另外2人则是3年前接种的疫苗，因此，确切判定为伤寒Vi多糖疫苗免疫失败的只有2人。因此可以认为伤寒Vi多糖疫苗是目前所使用的最为安全有效的伤寒疫苗。伤寒Vi多糖疫苗与其他的多糖疫苗一样，为T淋巴细胞非依赖性抗原，不能用于2岁以内儿童的免疫，再次免疫接种时不会产生免疫记忆反应。
本发明所述Vi多糖是指具有免疫原性的沙门氏杆菌的荚膜多糖，蛋白载体是指对人体没有毒性，也不会引起变态反应，同时又能增强多糖的免疫原性的蛋白质如微生物来源的蛋白质，如白喉和破伤风类毒素疫苗，经基因突变发生减毒的白喉毒素以及细菌的外膜蛋白质等，蛋白质载体也可以源于与多糖同一菌种的致病菌，另外还可以是霍乱毒素、霍乱毒素的B亚单位和大肠杆菌的不耐热肠毒素，它们具有佐剂的效应。另外还有绿脓杆菌的外毒素A、P6和一些高分子外膜蛋白质，以及不相关的蛋白质，如人血清免疫球蛋白等。
结合疫苗具有以下一些特点。(1)能增强婴幼儿对细菌多糖的免疫反应。由于结合疫苗能激活T辅助性淋巴细胞和形成T记忆细胞，重复接种能产生记忆性免疫增强作用，使主要为IgG的抗细菌多糖抗原的抗体水平剧增，对婴幼儿接种后能产生较为持久的免疫保护力。(2)细菌的多糖—蛋白质结合疫苗可成为二价疫苗。这是因为结合疫苗可同时产生针对多糖和蛋白质载体的抗体反应(3)能增强老年人和某些免疫功能低下或有缺陷的病人对细菌多糖抗原的免疫反应。老年人的免疫功能随年龄的增大而下降，因此对细菌多糖的免疫应答能力很差。例如肺炎是老年人的常见病，肺炎多糖和蛋白质的结合疫苗就可以增强疫苗对老年人的免疫保护力。也有报道免疫功能低下的艾滋病患者对结合疫苗产生的抗体反应要远胜于多糖疫苗。结合疫苗也可使一些缺乏对细菌多糖抗原产生免疫反应的个体产生高效价的抗多糖抗原的抗体。(4)结合疫苗具有载体蛋白质的效应。事先或同时接种蛋白质载体会刺激T淋巴细胞的增殖，因而能增强结合疫苗的免疫原性。
本发明的结合疫苗可通过以下方法制备1.伤寒Vi多糖的制备将伤寒沙门氏杆菌接种于改良半综合液体培养基(培养基或国家药品管理局批准的其它培养基。培养基不应含有能与加入的十六烷基三甲基溴化铵形成沉淀的成分，也不能含有对人体有害或其它过敏原物质)，在培养过程中和杀菌前取样进行细菌浓度测定及纯菌试验，涂片做革兰氏染色镜检，如发现污染杂菌，应废弃。培养物于对数生产后期、静止期前期收获。一般培养8-12小时为宜(根据菌种接种量及所用培养基种类而异)。加入甲醛溶液杀菌，其最终浓度为0.5-2.0％(ml/ml)。杀菌完成后，离心去菌体收集上清液，加入十六烷基三甲基溴化铵，充分混匀，形成沉淀。放置适当时间离心，收集沉淀物。用蒸馏水溶解沉淀，并加入适量1mol/L氯化钠(或2mol/L氯化钙)溶液，摇动或搅拌1小时，使多糖与十六烷基三甲基溴化铵解离，加入乙醇至最终浓度为25％(ml/ml)。冷库静置1-3小时或过夜，离心去沉淀，收集澄清的上清液。于上述上清液中加入冷却乙醇至最终浓度为80％(ml/ml)，充分振摇，使多糖沉淀，离心收集沉淀，然后用无水乙醇及丙酮各洗2次以上，干燥，即为多糖粗制品，保存于-20℃以下，待进行一步提取。
多糖精制将粗制品溶解于1/10饱和中性醋酸钠溶液中，使其浓度达5-20mg/ml，按1∶2容量用冷酚(100克结晶酚溶于40ml 1/10饱和醋酸钠溶液)提取3-5次，超速离心(35000RPM，10℃、5小时)去除内毒素，收集上清液，并用0.1mol/L氯化钙溶液或其它适宜溶液透析。再加入乙醇至最终浓度为75％-80％(V/V)。离心收集沉淀物，用无水乙醇及丙酮各洗2次以上，干燥后用无热原质蒸馏水溶解，经除菌过滤后，取样进行无菌试验、血清学试验及各项生化测定。提取过程应在15℃以下进行。提纯多糖应保存在-20℃以下，待下一步与蛋白偶联。若所提纯多糖中的蛋白质、核酸含量(不超过1％)及其它指标若达不到要求时，可再制一次。
精制的伤寒Vi多糖可用超声波处理，使高分子量Vi多糖变为分子量较小的多糖。
2.载体蛋白的活化向载体蛋白溶液中加入己二酰二肼(ADH)，充分混合，然后再加入碳二亚胺(EDAC)，维持反应体系的pH在5.6±0.2的范围内1小时，反应物经透析后，浓缩，置2-8℃保存。
3.伤寒Vi多糖-蛋白结合物的制备将伤寒Vi多糖与活化的载体蛋白等量(w/w)混合，加入碳二亚胺(EDAC)，维持反应体系的pH在5.6±0.2的范围内，2小时后将反应物装入透析袋，用0.2mol/L NaCl溶液2-8℃透析。将透析后的结合物用Sephacral S-1000或S-400HR层析柱纯化，以206nm/280nm监测器监测流洗液的吸光值的改变，收集V0附近的洗脱峰，即为纯化的结合物原液。以0.22μm的滤膜除菌过滤后保存在2～8℃。
Vi多糖-蛋白结合物原液用pH 6.5～7.5的PBS稀释，调整每毫升疫苗溶液中含伤寒Vi多糖量在10-100μg之间。疫苗液中可以加入防腐剂，如0.01％硫柳汞，疫苗液中可以加入铝佐剂如氢氧化铝佐剂或磷酸铝佐剂(1mg/ml)。
将以上疫苗溶液制成注射用的疫苗制剂即可应用于人预防伤寒。
本发明的结合疫苗，其中的伤寒Vi多糖可以是经超声波或化学方法裂解后的产物。
本发明的结合疫苗，其中的伤寒Vi多糖蛋白载体的结合是共价结合。
本发明的结合疫苗，其中可加入氢氧化铝或磷酸铝佐剂，加入量为0.25～1.5mg铝佐剂/ml。
本发明的结合疫苗，其中可以加入其他已知的可提高机体免疫的人体、植物或微生物蛋白质、多糖、磷脂或小分子化合物。
本发明的结合疫苗，是注射剂。
本发明的结合疫苗，每剂含有伤寒Vi多糖与蛋白载体结合物5～100μg/ml(按伤寒Vi多糖计算)，铝佐剂0.25～1.5mg/ml。
本发明的结合疫苗，每剂含有伤寒Vi多糖与蛋白载体结合物5～100μg/ml(按伤寒Vi多糖计算)。
以上说述每剂是指每一疫苗制剂，如每一注射针剂，或每支注射剂，或每次使用量的注射用药剂。
本发明的结合疫苗，可与其他含铝佐剂的疫苗联合组成多价疫苗，这些疫苗包括DTP，乙型肝炎疫苗、灭活脊髓灰质炎病毒疫苗、灭活日本脑炎病毒疫苗。
本发明的伤寒Vi多糖-蛋白结合疫苗的使用方法为肌肉注射。本发明的结合疫苗特别适合于2岁以内儿童应用，也可用于2岁以上儿童或成年人，老年人。
破伤风类毒素的活化向50ml破伤风类毒素(蛋白含量为200mg)溶液中加入700mg己二酰二肼(ADH)，充分混合，然后再加入1000mg碳二亚胺(EDAC)，维持反应体系的pH在5.6±0.2的范围内1小时，反应物经透析后，用截留分子量为100KD的滤膜超滤浓缩至6mg/ml蛋白浓度以上，置2-8℃保存。
伤寒Vi多糖-蛋白结合物的制备将150mg伤寒Vi多糖与活化的破伤风类毒素等量(w/w)混合，调pH至5.6，加入1000mg碳二亚胺(EDAC)，维持反应体系的pH在5.6±0.2的范围内，2小时后将反应物装入透析袋，用0.2mol/LNaCl溶液2-8℃透析或用分子量为300KD、500KD的超滤膜超滤除去小分子物质。
将透析后的结合物用2.6×100cm的Sephacral S-1000或S-400HR层析柱纯化，以206nm/280nm监测器监测流洗液的吸光值的改变，收集V0附近的洗脱峰即为纯化的结合物原液。保存在2～8℃。
将多批Vi多糖-蛋白结合物原液合并，然后加入pH 6.5～7.5的PBS稀释，以0.01％硫柳汞为防腐剂，每毫升疫苗溶液含伤寒Vi多糖量在10-100μg/ml。按0.5ml、1.0ml/支分装后即为伤寒Vi多糖-破伤风类毒素结合疫苗，疫苗液中可加入铝佐剂0.5～1.2mg/ml。
实施例2伤寒Vi多糖-破伤风类毒素结合疫苗的制备方法之二将200mg伤寒Vi多糖(50ml)与200mg破伤风类毒素(4mg/ml，50ml)混合，调pH至5.6，加入1000mg碳二亚胺(EDAC)，维持反应体系的pH在5.6±0.2的范围内，2小时后将反应入2-8℃，继续搅拌24小时，之后将结合物装入透析袋内，用0.2mol/L NaCl溶液于2-8℃透析48小时。
将透析后的结合物用2.6×100cm的Sephacryl S-1000或S-400HR层析柱纯化，以206nm/280nm监测器监测流洗液的吸光值的改变，收集V0附近的洗脱峰即为纯化的结合物原液。用0.22μm除菌滤膜过滤后保存在2～8℃。
用pH6.5～7.5的PBS稀释至10-100μg/ml，以0.01％硫柳汞为防腐剂(也可不加)，按0.5ml、1.0ml/支分装后即为伤寒Vi多糖-破伤风类毒素结合疫苗。疫苗液中可加入铝佐剂，铝佐剂的加入量为0.5-1.2mg/ml。
实施例3伤寒Vi多糖-白喉类毒素结合疫苗的制备方法将200mg伤寒Vi多糖(50ml)与200mg白喉类毒素(5mg/ml，40ml)混合，调pH至5.0，加入1800mg碳二亚胺(EDAC)，用0.1M HCl调整反应体系的pH在5.0±0.2的范围内，3小时后将反应移到2-8℃环境中，继续搅拌24小时，之后产物装入透析袋内，用0.2mol/L NaCl溶液于2-8℃透析24小时以上，或用分子量为300KD、500KD的超滤膜超滤除去小分子物质。
将透析或超滤后的结合物用5.0×100cm的Sephacryl S-400HR或Sepharose CL-4B层析柱纯化，以206nm/280nm监测器监测流洗液的吸光值的改变，收集V0附近的洗脱峰，即为纯化的结合物原液。用0.22μm除菌滤膜过滤后保存在2～8℃。
用pH 6.5～7.5的PBS稀释至10-100μg/ml，以0.01％硫柳汞为防腐剂(也可不加)，按0.5ml、1.0ml/支分装后即为伤寒Vi多糖-白喉风类毒素结合疫苗。稀释后的疫苗液中可加入铝佐剂(0.5-1.2mg/ml)。
实施例4伤寒Vi多糖-人IgG结合疫苗的制备方法将200mg伤寒Vi多糖(4mg/ml，50ml)与200mg人血清免疫球蛋白(IgG10mg/ml，20ml)混合，调pH至5.5，加入1400mg碳二亚胺(EDAC)，以0.1MHCl调节反应体系的pH在5.5±0.5的范围内，3小时后将反应物移入2-8℃，继续搅拌24小时，之后装入透析袋内，用0.2mol/L NaCl溶液于2-8℃透析24小时以上，或用分子量为300KD、500KD的超滤膜超滤除去小分子物质。
将透析或超滤后的结合物用5.0×100cm的Sephacryl S-400HR或Sepharose CL-4B层析柱纯化，以206nm/280nm监测器监测流洗液的吸光值的改变，收集V0附近的洗脱峰即为纯化的结合物原液。用0.22μm除菌滤膜过滤后保存在2～8℃。
用pH6.5～7.5的PBS稀释至10-100μg/ml，以0.01％硫柳汞为防腐剂(也可不加)。按0.5ml、1.0ml/支分装后即为伤寒Vi多糖结合疫苗。疫苗液中可加入铝佐剂，铝佐剂的加入量为0.5-1.2mg/ml。
实施例5动物实验SPF级雌性BALB/c小鼠，体重16-18克。于0、14、21天皮下注射下列各组配方的疫苗0.5ml。分别于第2次免疫后7天、第3次免疫后7天时采集鼠血液标本，分离血清后冻存于-20℃，直到测定。
各组实验动物疫苗配方及动物只数Vi组伤寒Vi多糖疫苗，5μg/ml，10只BALB/c小鼠。
Vi-TT组伤寒Vi多糖-TT结合疫苗，含伤寒Vi多糖5μg/ml，15只BALB/c小鼠。
Vi-TT-Al(OH)3组伤寒Vi多糖-TT结合疫苗，含伤寒Vi多糖5μg/ml，含氢氧化铝佐剂0.5mg/ml(按铝离子计算)，15只BALB/c小鼠。
NS组生理盐水对照组，10只BALB/c小鼠。
Al组氢氧化铝佐剂对照组，含氢氧化铝佐剂0.5mg/ml(按铝离子计算)，10只BALB/c小鼠。
将伤寒Vi多糖用0.02mol/L PBS(pH7.2)稀释为5μg/ml，包被96孔酶标板，100μl/孔，37℃放置2小时，4℃放置过夜。次日用1％牛血清白蛋白封闭酶标板，200μl/ml，室温下封闭1小时，用PBS-Tween 20(0.2％)洗液洗板3遍，净化工作台内吹干，用铝泊袋真空封口后4℃放置。
以酶联免疫方法测定免疫小鼠血清抗Vi多糖抗体的滴度。NS组、Al组小鼠血清血清进行25倍稀释，37℃反应1小时，洗涤3次后加入羊抗鼠-HRP，反应1小时后洗涤3次，加入底物液避光显色15分钟，以2mol/L硫酸终止反应，测定A450/650值，以其平均值的2.1倍作为Cut off值。其它各组的血清效价测定方法同上，但血清的稀释度不同，Vi组小鼠血清自25倍开始稀释，倍比稀释至1600倍，其它各组小鼠血清自100倍开始稀释，倍比稀释至12800倍。以A450/650值大于或等于Cut off值的最高血清稀释度为效价。各组免疫动物血清的实验结果见表1。
表1不同配方伤寒疫苗免疫小鼠2、3次后1周的血清抗体几何平均滴度
从上述实验结果可以看出，单纯用伤寒Vi多糖疫苗免疫小鼠2、3次后，抗体滴度的差别无显著性(P＞0.05)；Vi-TT、Vi-TT+Al(OH)3组与Vi组相比，第2次、第3次免疫后的抗体几何平均滴度(GMT)明显高于Vi组(p＜0.01)；第2次免疫后，Vi-TT+Al(OH)3组的GMT显著高于Vi-TT组(p＜0.05)；第3次免疫后，Vi-TT+Al(OH)3组与Vi-TT组的GMT无显著性差异；Vi-TT、Vi-TT+Al(OH)3组第3次、第2次免疫后的抗体几何平均滴度无显著性差异(p＞0.05)。
权利要求
1.一种结合疫苗制剂，其特征在于，含有伤寒Vi多糖与蛋白载体结合物。
2.权利要求1的疫苗制剂，其中的伤寒Vi多糖可以是经超声波或化学方法裂解后的产物。
3.权利要求1的疫苗制剂，其中的蛋白载体可以是破伤风类毒素、白喉类毒素、人血清免疫球蛋白、B群流行性脑脊髓膜炎球菌外膜蛋白。
4.权利要求1的疫苗制剂，其中的伤寒Vi多糖蛋白载体的结合是共价结合。
5.权利要求1的疫苗制剂，其中可加入氢氧化铝或磷酸铝佐剂，加入量为0.25～1.5mg铝佐剂/ml。
6.权利要求1的疫苗制剂，其中可以加入其他已知的可提高机体免疫的人体、植物或微生物蛋白质、多糖、磷脂或小分子化合物。
7.权利要求1的疫苗制剂，是注射剂。
8.权利要求1的疫苗制剂，每剂量含有伤寒Vi多糖与蛋白载体结合物5～100μg/ml(按伤寒Vi多糖计算)，铝佐剂0.25～1.5mg/ml。
9.权利要求1的疫苗制剂，每剂量含有伤寒Vi多糖与蛋白载体结合物5～100μg/ml(按伤寒Vi多糖计算)。
10.权利要求1的疫苗制剂，可与其他含铝佐剂的疫苗联合组成多价疫苗，这些疫苗包括DTP，乙型肝炎疫苗、灭活脊髓灰质炎病毒疫苗、灭活日本脑炎病毒疫苗。
全文摘要
本发明将伤寒Vi多糖共价结合到载体蛋白上形成结合疫苗，用于人及哺乳类动物的主动免疫，用于预防伤寒感染。伤寒Vi多糖与蛋白结合后，改变了有机体对伤寒Vi抗原的识别方式，使其变成了T细胞依赖性抗原，可用于各年龄人群的免疫，并表现出明显的加强免疫效果。
文档编号A61K39/112GK1404873SQ0214887
公开日2003年3月26日 申请日期2002年11月22日 优先权日2002年11月22日
发明者蒋先敏, 吴冠江 申请人:北京绿竹生物技术有限责任公司