专利名称：一种脂肪酸合成酶抑制剂及其制造方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及酶的抑制剂及其制造方法与应用，特别是涉及一种脂肪酸合成酶抑制剂及其制造方法与应用。
此外，还有研究表明脂肪酸合成酶和癌症的发生有着密切的关系，许多癌细胞中都有异乎寻常的高表达脂肪酸合成酶，如人类乳腺癌中便呈现出脂肪酸合成酶的高水平表达和高活性(Kuhajda FP，Jenner K，Wood FD，et a1.Fatty acid synthesisa potential selective target for antineoplastic therapy.Proc Natl Acad SciUSA，1994，916379-6383)。对乳腺癌、前列腺癌、子宫癌和甲状腺癌等的研究表明这些癌的恶性种类中存在脂肪酸合成酶的优先表达。脂肪酸合成酶的表达和恶性肿瘤之间存在的关系还显示脂肪酸合成的活性在肿瘤维持它的恶性表型的过程中起着重要作用。事实上，除了乳房和子宫内膜外，脂肪酸合成酶在绝大多数正常组织中均受到饮食中脂肪的负调节，而相反，脂肪酸合成酶在癌细胞中却通常是高表达，这种的组织分布特异性使得脂肪酸合成酶成为治疗癌症的一个引人注目的新靶点。而且已有实验证明在体内抑制脂肪酸合成酶的活性对人类癌细胞确实表现出了选择性的杀伤毒力(Francis P.Kuhajda，MD，2000.Fatty-Acid Synthase and humancancernew perspectives on its role in tumor bology.Nutrion 16202-208)。
脂肪酸合成酶抑制剂是人类癌细胞的选择性细胞毒素，恶性肿瘤和FAS表达之间的关系显示，脂肪酸合成酶的表达和其自身的活性可能对人类癌细胞的生存和生长均至关重要。体外实验证明FAS抑制剂浅蓝菌素(Cerulenin)是人类癌细胞的选择性细胞毒素，5g/ml的浅蓝菌素对人类NIHOVCAR-3卵巢癌的生长抑制在72小时内达到ID50，但对正常皮肤纤维母细胞没有生长抑制(Pizer ES，Wood FD，Heine HS，et al.Inhibition of fatty acid synthesis delays disease progression in a xenograftmodel of ovarian cancer.Cancer Res 1996；561189)。它对许多人类癌细胞系有广谱抗性，包括乳腺(MCF-7，ZR-75-1，SKBR3，MDA435)(Kuhajda FP，Jenner K，wood FD，et al.Fatty acid synthesisa potential selective target forantineoplastic therapy.Proc Natl Acad Sci USA，1994；916379)，卵巢(OVCAR-3)(Pizer ES，Wood FD，Heine HS，et al.Inhibition of fatty acid synthesisdelays disease progression in a xenograft model of ovarian cancer.Cancer Res1996；561189)，结肠(HCT116，RKO)，白血球(HL60)(Pizer ES，Wood FD，PasternackGR，et al.Fatty acid synthase(FAS)a target for cytotoxic antimetabolitiesin HL60 promyelocytic leukemia cells.Cancer Res 1996，56(4)745-751)，前列腺(TSU-prl)。E.Pizer等发现浅蓝菌素对癌细胞的毒性和脂肪酸合成有关(RashidA，Pizer ES，Moga M，et al.Elevated expression of fatty acid synthase andfatty acid synthetic activity in colorectal neoplasia.Am J Pathol，1997，150(1)201-208)。对脂肪酸合成酶的抑制导致细胞凋亡显示癌细胞的存活是依赖于脂肪酸合成途径的。
体内试验也得到类似结果，将人类OVCAR-3移植到裸鼠体内，24小时后用浅蓝菌素处理，会提高存活率并阻止其向恶性发展(Pizer ES，Wood FD，Heine HS，et al.Inhibition of fatty acid synthesis delays disease progression in a xenograftmodel of ovarian cancer.Cancer Res 1996，56(6)1189-1193)。这种处理对腹水瘤影响最大，恶性发展从对照的65％降低到21％，对实体瘤的生长代谢影响相对小一些。Pizer等的研究表明，人体内成长最快的组织子宫内膜在增生期可在其上皮细胞表达大量脂肪酸合成酶(Pizer ES，Kurman RJ，Pasternack GR，et al.Expressionof fatty acid synthase is closely linked to proliferation and stromaldecidualization in cycling endometrium.Int J Gynecol Pathol 1996，1645-50)。用流式细胞仪对HL-60细胞进行分析显示，当抑制了脂肪酸合成时细胞聚集在G1期而不能通过细胞周期。在人类结肠癌细胞系中还发现，抑制FAS后90分钟内DNA合成受到抑制，6小时后凋亡开始。这些发现都表明脂肪酸合成与人体组织的增生存在某种联系。
另一类抑制剂——乙酰辅酶A羧化酶(ACC)抑制剂，如TOFA(Halvorson DL.Inhibition of fatty acid synthesis in isolated adipocytes by 5-(tetradecyloxy)-2-furoic acid.Lipids，1981，19851-856)，也可以抑制细胞中脂肪酸的合成，但它却不能引发癌细胞的凋亡，并且ACC抑制剂还能使癌细胞免受FAS抑制剂的毒害。ACC催化的反应位于FAS催化的反应的上游，前者使乙酰辅酶A羧化成丙二酰辅酶A，后者则继续将乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A缩合成脂肪酸。
进一步研究两种抑制剂对癌细胞毒性的差异，发现两种抑制剂处理细胞后，细胞内丙二酰辅酶A的含量水平发生不同变化。利用HPLC检测用上述两种酶抑制剂处理过的细胞中丙二酰辅酶A的含量，发现用20μg/ml的TOFA处理后，丙二酰辅酶A的含量比对照低60％，而在分别用10μg/ml的浅蓝菌素和另一个化学合成的脂肪酸合成酶抑制剂C75处理的细胞中，丙二酰辅酶A的含量分别升高930％和370％(PizerES，Thupari J，Han WF，et al.Malonyl-coenzyme-A is a potential mediatorof cytotoxicity induced by fatty-acid synthase inhibition in human breastcancer cells and xenografts.Cancer Res，2000，60(2)213-218)。显然，高水平的丙二酰辅酶A积累是仅由脂肪酸合成酶抑制剂带来的一个显著特点。脂肪酸合成酶抑制剂引发癌细胞凋亡可能是由丙二酰辅酶A介导产生。丙二酰辅酶A是细胞能量代谢中一个十分重要的调控分子，它可以抑制线粒体外膜上肉碱棕榈酰转移酶I(CPT I)的活性。CPT I可结合到另一种细胞因子Bcl-2上并使之进一步阻断细胞凋亡。如果抑制了CPT I，Bcl-2可能就不发生作用，细胞随之发生凋亡。
由于脂肪酸合成酶极有可能成为肥胖症和癌症的靶点，其抑制剂极有可能开发出全新的癌症和肥胖症的药物，因此，研制和开发脂肪酸合成酶的抑制剂将具有重大的现实意义及开发潜力。
本发明的脂肪酸合成酶抑制剂是用有机溶剂或/和水的混合物，从祁门红茶中萃取出的物质。
所述有机溶剂效果较好的为极性有机溶剂，其中，优选的是乙醇，最优选的是30％-70％的乙醇，更优选的是40-50％的乙醇。
本发明的另一目的是提供一种制造上述脂肪酸合成酶抑制剂的方法。
生产上述脂肪酸合成酶抑制剂的方法，包括以下步骤(1)将粉碎后的祁门红茶置于容器中，加入有机溶剂或/和水的混合物；(2)在20℃-40℃条件下萃取1-5小时；(3)离心或过滤，收集上清液。
在上述生产方法中，所述加入的有机溶剂或/和水的混合物的重量可以为所述祁门红茶重量的5-50倍，其中优选的为10-20倍；所述有机溶剂为极性有机溶剂，其中，优选乙醇，最优选的是浓度为30％-70％的乙醇，更优选的是浓度为40％-50％的乙醇。
如果萃取在搅拌、常温条件下进行，则萃取2小时即可；如果离心是在8000转/分钟的条件下进行，则进行15分钟。
以本发明的脂肪酸合成酶抑制剂为活性成分生产的药物，特别是用于减肥和用于治疗癌症的药物，是本发明脂肪酸合成酶抑制剂的主要应用领域。需要的时候，在这些药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等，必要时还可以加入香味剂、甜味剂等。
本发明的药物可以制成注射液、片剂、粉剂、粒剂、胶囊、口服液、膏剂、霜剂等多种形式。各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。
本发明的脂肪酸合成酶抑制剂还可以作为食品添加剂、日用化学品(特别是化妆品)添加剂及保健品添加剂等而得到广泛应用。
祁门红茶简称“祁红”，常常列入我国十大名茶之一。主要产地为安徽省祁门、东至、贵池、石台、黟县等。茶的名称得名于祁门县。祁门红茶叶条索紧细秀长，汤色红艳明亮，特别是其香气酷似果香，又带兰花香，清鲜而且持久。既可单独泡饮，也可加入牛奶调饮。
本发明巧妙地将祁门红茶碎末用有机溶剂或/和水的混合物，特别是乙醇和水的混合物进行萃取，创造性地揭示出，所萃取出的物质是有效的脂肪酸合成酶抑制剂。由于祁门红茶作为饮品已有一百多年历史，没有毒性，因而为该脂肪酸合成酶抑制剂的进一步开发利用提供了广阔的前景。实验表明脂肪酸合成酶抑制剂可以有效抑制脂肪酸合成酶的活性，而脂肪酸合成酶活性的强弱直接影响到生物细胞内合成脂肪的多少。也就是说，抑制了脂肪酸合成酶的活性，生物细胞内合成脂肪的过程会弱化，脂肪含量即会得到控制，甚至减少，更重要的是脂肪酸合成酶抑制剂还可以通过抑制脑中前噬信号肽Y的表达以控制动物的食欲，因此本发明的脂肪酸合成酶抑制剂可以作为减肥药物的活性成分，生产口服液、冲剂、胶囊、片剂、针剂等各种剂型的减肥药物。脂肪酸合成酶抑制剂具有对癌细胞的选择性杀伤作用，因此以本发明的脂肪酸合成酶抑制剂为活性成分的各种剂型的治疗癌症的药物，由于没有副作用，将会得到非常广泛的应用。本发明的脂肪酸合成酶抑制剂还可以作为保健品、食品的添加剂，比如，可作为高热量食品的添加剂，使喜食高热量食品的人既满足了口福，又不用担心会增胖。本发明的脂肪酸合成酶抑制剂还可以作为美容日用化学品的添加剂，如可以制成减肥霜，对需要减肥的部位进行定点涂抹。同时，由于祁门红茶产量很大来源广泛，技术成熟，为脂肪酸合成酶抑制剂的工业化生产提供了保证。
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
脂肪酸合成酶活性采用乙酰辅酶A、丙二酰辅酶A、NADPH为底物的标准测活方法测定(W.X.Tian et al.，1985.J.Biol.Chem.，260(20)11375-11387；田维熙等，1996.不同生长期蛋鸡的体脂水平和肝脏脂肪酸合成酶活性的关系.生物化学杂志，12(2)234-236)。
脂肪酸合成酶(FAS)活性被抑制的程度用I％(抑制程度)来表示，其计算方法为底物中加入脂肪酸合成酶抑制剂提取液的为实验组，测得其脂肪酸合成酶活性的数值为A。以底物中只加入相应提取溶剂的为对照，测定其脂肪酸合成酶活性值，该值用A0表示，并设定其为100％；RA％(剩余活性)＝A/A0×100％I％(抑制程度)＝100％-RA％实施例1用乙醇从祁门红茶中萃取脂肪酸合成酶抑制剂(1)取祁门红茶，粉碎后置于容器中，加入10倍重量的50％乙醇，充分搅拌后密封；(2)在室温、搅拌的条件下萃取2小时；(3)将上述萃取液在8000转/分钟的条件下离心15分钟，取上清液，即为含脂肪酸合成酶抑制剂的提取液，以备下面的实验使用。
可以用与该实施例相同的方法，用不同浓度梯度的乙醇(如10％，30％，50％，70％，90％，100％)、水来萃取脂肪酸合成酶抑制剂。如果是在非搅拌条件下进行萃取，则至少应半小时搅拌一次，萃取3-4小时。另外，还可以用弱极性的丁醇、丙酮等来萃取，但实验证明溶解性不高，在非极性溶剂中不溶。用该实施例的方法自祁-门红茶中萃取脂肪酸合成酶抑制剂，搅拌条件下，萃取时间只要不低于1小时，温度在20-100℃之间均能萃取出有效成分。在实际生产中，萃取后一般采用压滤机来收取上清液。
1克祁门红茶用10ml 50％乙醇溶液萃取后，将萃取液中的乙醇挥发去掉，120℃烘干2小时，可得到221mg的干物质(标准偏差(SD)为8.8mg)。
实施例2相同的实验系统溶液中加入不同数量的脂肪酸合成酶抑制剂对FAS活性的影响(测活的酶加入量为每毫升实验系统溶液2.72微克)。
表1中列出了在相同的实验系统溶液中加入不同数量的脂肪酸合成酶抑制剂的处理剂量及实验结果
由以上实验结果可以看出，随着加入提取液量的增加，FAS酶活性被抑制程度I％升高，当每毫升实验系统溶液中加入0.15微升的提取液时，I％已高达80％。
实施例3萃取溶剂对脂肪酸合成酶活性的影响取与实施例2相同的实验系统溶液，分别向每毫升溶液中加0.10、0.2、0.3、0.4、0.5微升50％的乙醇，加入的酶量也与实例2相同，检测计算FAS酶活性被抑制的程度I％，结果是I％均为0，表明所加量的萃取溶剂乙醇不会抑制脂肪酸合成酶的活性，抑制脂肪酸合成酶活性的是从祁门红茶中萃取出的物质。
实施例4脂肪酸合成酶抑制剂的半抑制浓度用实施例1所得的提取液进行实验，结果表明，要达到I％＝50％，每毫升溶液中需加入0.081微升的提取液，折算成加入祁门红茶的毫克数为0.016，折算成抑制每毫克酶的活性需加入祁门红茶的毫克数为5.9，半抑制浓度很低，说明本发明的脂肪酸合成酶抑制剂对脂肪酸合成酶的活性有强烈的抑制作用，并且所需有效剂量很低。
实施例5不同萃取剂对萃取出的脂肪酸合成酶抑制剂活性的影响分别用溶剂水，50％乙醇，乙醇，丙酮，丁醇，乙醚，石油醚按照实例1的方法来萃取脂肪酸合成酶抑制剂，然后各取1微升在相同的实验系统溶液中对相同量的酶进行抑制活性检测，结果如表2所示表2
从以上实验结果可以看出，本发明的脂肪酸合成酶抑制剂可以溶于水，水和乙醇的混合物等极性偏高的溶剂中，而在极性低的溶剂和非极性溶剂中溶解性不高。
实施例6不同比例的水和乙醇的混合物对萃取脂肪酸合成酶抑制剂活性的影响分别用水，10％，30％，50％，70％，90％的乙醇为溶剂按照实施例1的方法来萃取脂肪酸合成酶抑制剂，然后检测它们对FAS活性的影响.(每毫升实验系统溶液中含酶10微克)，结果如表3所示表3
从以上结果可以看出，乙醇的浓度对萃取液中有效成份的含量具有显著的影响，比较优选的是浓度为30％-70％的乙醇，最优选的是浓度为40-50％的乙醇。
实施例7萃取液对脂肪酸合成酶不可逆抑制性的判断把一定量实施例1所得的萃取液与酶混合，使酶的剩余活性接近0％，放置80分钟，然后过Sephadex G25离心柱。如果其中的抑制剂和酶是可逆结合的话，过柱后，小分子会留在柱上，酶的活性就会恢复，若是不可逆结合，就会和酶一起通过凝胶柱，酶的活性不能恢复。为防止过柱本身对酶造成失活而产生不可逆的假像，同时用不加萃取液的酶做一对照。实验结果发现，对照组的酶过柱后活性尚剩70％，而与萃取液混合的酶的活性没有恢复，说明萃取液除对脂肪酸合成酶有很强的快结合外对脂肪酸合成酶有不可逆抑制。
实施例8、萃取液对大鼠的减肥作用(1)处理萃取液，去除有机溶剂的影响将实施例1中的提取液在常温下干燥，再用同剂量的水溶解，去除沉淀；
(2)将30只标准实验大鼠随机分为3组，10只一组，分别为阴性对照组、阳性对照组、给药组。阴性对照组大鼠每只每日灌喂2ml水；阳性对照组大鼠每只每日灌喂2ml 0.1mg/ml芬氟拉明、给药组大鼠每只每日灌喂2ml步骤(1)处理水液。
(3)每隔一日测定每只大鼠的体重、摄食量，实验持续20天，分为实验中期、全期计算3组大鼠的体重、摄食量平均值并进行t校验分析。实验最后一天断颈椎处死大鼠按标准方法取血清测定血糖，甘油三酯，胆固醇和低密度脂蛋白，取出每组大鼠的肝分别匀浆，离心后测定其上清液脂肪酸合成酶活性，结果分别如表4、表5、表6所示表4、大鼠体重变化表
表5、大鼠摄食量变化表
表6、大鼠血清和肝脂肪酸合成酶数据
t校验结果表明本发明的脂肪酸合成酶抑制剂通过口服能起到比阳性对照更显著的减轻体重和抑制食欲的效果，通过测定血清中的各项指标发现该抑制剂还能显著地降低甘油三酯的含量，并能显著降低肝中脂肪酸合成酶的活性。在实验剂量下，给药组大鼠未表现出任何不良反应，活动正常，没有观察到明显毒性。
实施例9、萃取液对癌细胞的作用(1)处理萃取液，去除有机溶剂的影响将实施例1中的提取液在常温下干燥，再用同剂量的水溶解，去除沉淀；(2)在标准培养条件下，把人体乳腺癌细胞MCF-7和成纤维细胞培养在RPMI培养基1640(含10％FBS)中，细胞分装在96孔板中，每孔8000个细胞，培养过夜，然后分别加入不同量的处理后的提取液(从5μl-50μl)，同时用同剂量的溶剂(水)做阴性对照，分别用5氟尿嘧啶和顺铂做阳性对照。加完样后，将细胞在37℃度下保温72小时，然后用MTT染色，37℃度下保温4小时，加DMSO终止反应，在570nm下测定吸收值，通过线性回归求出其半抑制浓度(IC50)。
结果表明，加入抑制剂的MCF-7细胞的生长受明显抑制；加入溶剂(水)的对照组无生长抑制现象。上述结果表明，本发明的脂肪酸合成酶抑制剂对癌细胞确实有选择性杀伤作用，IC50为0.698±0.624mg茶叶/ml。阳性对照5氟尿嘧啶、顺铂的IC50分别为9.43±4.88×10-3mg/ml和4.295±1.415×10-3mg/ml。
权利要求
1.脂肪酸合成酶抑制剂，它是用有机溶剂或/和水从祁门红茶中萃取出的物质。
2.根据权利要求1所述的脂肪酸合成酶抑制剂，其特征在于所述有机溶剂为极性有机溶剂。
3.根据权利要求2所述的脂肪酸合成酶抑制剂，其特征在于所述极性有机溶剂为乙醇水溶液，乙醇的优选浓度为30％-70％，更优选的浓度为40％-50％。
4.一种生产权利要求1所述脂肪酸合成酶抑制剂的方法，包括以下步骤(1)将粉碎后的祁门红茶置于容器中，加入有机溶剂或/和水的混合物；(2)在20℃-40℃条件下萃取1-5小时；(3)离心或过滤，收集上清液。
5.根据权利要求4所述的生产脂肪酸合成酶抑制剂的方法，其特征在于所述加入的有机溶剂或/和水的混合物的重量为所述祁门红茶重量的5-50倍；其中优选的为10-20倍；所述有机溶剂为极性有机溶剂，其中，优选乙醇水溶液，最优选的是浓度为30％-70％的乙醇，更优选的是浓度为40-50％的乙醇。
6.以权利要求1所述的脂肪酸合成酶抑制剂为活性成分的减肥药。
7.以权利要求1所述的脂肪酸合成酶抑制剂为活性成分的预防和治疗癌症的药物。
8.权利要求1所述的脂肪酸合成酶抑制剂作为食品添加剂的应用。
9.权利要求1所述的脂肪酸合成酶抑制剂作为日用化学品添加剂的应用。
10.权利要求1所述的脂肪酸合成酶抑制剂作为保健品添加剂的应用。
全文摘要
本发明公开了一种脂肪酸合成酶抑制剂及其制造方法与应用，涉及酶的抑制剂及其制造方法与应用。本发明的目的是提供一种能有效抑制脂肪酸合成酶活性的脂肪酸合成酶抑制剂。本发明的脂肪酸合成酶抑制剂是用有机溶剂或/和水从祁门红茶中萃取出的物质。所述有机溶剂效果较好的为极性有机溶剂，其中，优选的是乙醇水溶液。生产脂肪酸合成酶抑制剂的方法，包括以下步骤(1)将粉碎后的祁门红茶置于容器中，加入有机溶剂或水或有机溶剂与水的混合物；(2)在20℃－40℃条件下萃取1－5小时；(3)离心或过滤，收集上清液。以本发明的脂肪酸合成酶抑制剂为活性成分的药物及添加剂将会得到非常广泛的应用。
文档编号A61P3/04GK1475249SQ0215528
公开日2004年2月18日 申请日期2002年12月12日 优先权日2002年8月13日
发明者田维熙, 王玄, 吴晓东 申请人:田维熙