作为预后和治疗靶标的乳腺癌中表达的基因的制作方法

专利名称：作为预后和治疗靶标的乳腺癌中表达的基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及癌症的监测，预后和治疗方法。具体地，本发明涉及基因表达分析的用途，用于检测乳腺癌对内分泌治疗的应答性和帮助选择乳腺癌疗法或监测各种乳腺癌疗法的效力。
背景技术：
乳腺癌是影响美国妇女的最常见的癌症。仅在美国，每年就诊断约200,000例新的乳腺癌病例，并且大约44,000名妇女将死于该疾病。在妇女的一生期间，乳腺癌将以12.5％(每8名妇女中有1名)的概率发生，占妇女癌症病例的32％。它是继肺癌之后女性癌症死亡的第二主要原因。男性乳腺癌占所有新病例的约1％，同女性乳腺癌有类似的自然史。尽管现在乳腺癌的发病率正在缓慢地降低，但是过去几十年的死亡率却保持恒定。全世界，每年诊断约1百万新的乳腺癌病例。一般地，较富裕的西方国家有最高的发病率，而发展中国家有最低的发病率。
尽管乳腺癌的病因仍旧是未知的，但是已经鉴定了大量的危险因素。例如随着年龄的增加，乳腺癌的发病率显著地增加；在美国，50％以上患乳腺癌的妇女是60岁以上。其它危险因素是在月经初潮时的较小年龄和在绝经期时的较大年龄。
最近，发现推测的肿瘤抑制基因，BRCA-1和BRCA-2中的突变可能是大部分乳腺癌的病因。具有这些突变的妇女常常有阳性家族史，并且在所有乳腺癌患者中有5％观察到了常染色体显性遗传的清晰模式(参见，Cecil，“Textbook of Medicine”，Goldman and Bennett，编辑，Saunders Co.，Philadelphia，PA)。
乳腺癌的治疗和最终结果取决于肿瘤病理学和治疗时癌症的分期。最常用的分期系统是TNM系统。该系统根据肿瘤大小、淋巴结累及程度和转移的存在确定癌症的状态和阶段(参见，美国癌症联合委员会AJCCCancer Staging Handbook，Lippincott-Raven，Philadelphia，PA(1998))。检测时的癌症阶段决定了10年不复发的百分率测定结果。这是通过乳房切除术或肿块切除术除去原始肿瘤后，10年中没有经历原始癌症复发的患者的百分数。
乳腺癌的症状变化很大，并且取决于原发肿瘤的位置和大小及转移的存在、位置和范围。然而，可以包括下面的一种或多种症状一侧或两侧可触知的乳腺肿块、乳头溢液、乳房皮肤改变、乳房疼痛。这可能具有也可能不具有天然周期(即伴随着月经期)，血样或水样的乳头溢液、可触知的腋下肿块或其它淋巴结累及迹象。
如果原发肿瘤已经转移，那么可以在身体任何器官系统中出现症状。最常见的转移位点是局部区域的，即胸壁和/或局部淋巴结(20-40％)、骨(60％)、肺(即恶性渗出液和/或实质损害)(15-25)和肝(10-20％)。中枢神经系统(CNS)、脊髓或其它骨骼转移和柔脑脊膜转移可以引起局部或扩散性疼痛，特别是背疼和神经学上的症状或功能障碍包括麻木(parathesias)，截瘫，感觉弱化或丧失和高钙血症。伴随CNS累及最常见的是癫痫发作，头痛，精神状态的改变或者甚至是麻痹或中风。肝转移可以引起肝功能衰竭，伴有升高的肝功能测定，黄疸和/或其它肝功能障碍迹象。肺的累及可以引起呼吸困难、肺炎或其它呼吸症状。因为肿瘤细胞可以在身体的任何组织中侵袭和扩增，所以上述症状在有或无转移的乳腺癌中均是常见的，但也可能在患乳腺癌的患者中出现差不多所有的症候群。
在乳腺癌患者中已经鉴定了大量预后因素，包括肿瘤局部侵袭的程度、累及的腋下淋巴结数量和肿瘤的大小，并且这些因素包含在上述分期系统中。
然而，乳腺癌中一个重要的预示性因素是雌激素受体α(ESR1)在肿瘤细胞表面上的表达。雌激素受体(ER)是配体驱使的转录因子，其调节对乳腺癌生长重要的多种基因(包括生长因子、激素和癌基因)的表达(参见，Gronemeyer，Ann.Rev.Genetics，25卷，89-123页(1991)；Dickson &Lippman，“The Molecular Basis of Cancer”，Mendelsohn编辑；Howley，Israel & Liotta编辑，358-384页，W.B.Saunders Co.，Philadelphia，PA(1994))。ER的表达在乳腺癌的发病和维持中起重要作用。乳腺癌患者中约三分之二的肿瘤是ESR1阳性(参见，Lippman等，Cancer，第46卷，2838-2841页(1980))。大约50％的这些ER阳性肿瘤是雌激素依赖性的，并且对内分泌治疗产生应答(参见，Manni等，Cancer，第46卷，2838-2841页，(1980)；Jensen，Cancer，47卷，2319-2326页，(1981))。在绝经后妇女中出现的乳腺癌常常是ER阳性的(参见，Iglehart，“Textbook of Surgery”第14版，Sabiston编辑，510-550页，W.B.Saunders，Philadelphia，PA(1991)。这些肿瘤中的许多肿瘤表达比正常乳房上皮显著更多的ER(参见，Ricketts等，Cancer Res.，51卷，1817-1822页(1991))。
ESR1基因横跨140Kb，由剪接产生6.3Kb RNA的8个外显子组成，该RNA编码分子量为66千道尔顿有595个氨基酸的蛋白质(参见，Walter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第82卷，7889-7893页；和Ponglikitmongkoli等，EMBO J.，7卷，3385-3388页)。
与原发损害没有表达ER的患者比较，原发损害表达ESR1的患者的存活率至少提高5-10％。
此外，十分重要地，原发损害中ESR1的存在倾向于预示对内分泌治疗形式的辅助治疗的阳性应答。内分泌治疗的目的是阻止肿瘤细胞上ER的活化，由此使肿瘤细胞块的生长和增生降低或停止。
已经利用多种方法阻止乳腺癌患者中ER的活化。最广泛使用的药剂是抗雌激素剂如它莫西芬(tamoxifen)，其在恶性细胞水平抑制雌激素作用。尽管它莫西芬对ER有激动剂和拮抗剂的作用，但是它作为抗雌激素药物起作用。传统上，此药物是晚期乳腺癌患者的首要治疗方法。
然而，不幸地，对于晚期ER阳性乳腺癌的患者而言，对它莫西芬的应答率仅仅是约50％(参见，Clark等，Semin.Oncol.，15卷，2期，增补1，20-25页，(1988))。在许多不存在对它莫西芬的应答的情况下，看起来肿瘤的生长变得不受雌激素的控制，并且抗雌激素药物的应用将不起作用。然而，意外地，约三分之一它莫西芬抗药性患者将对内源雌激素水平的降低产生应答(参见，Dombernowsky等，J.Clin.Oncol.，16920卷，453-461页，(1998)；和Crump等，Breast Cancer Res.Treat.，44卷，3期，201-210页，(1997))。在绝经后的患者中，用选择性非类固醇芳香酶抑制剂来曲唑(letrozole)(FemaraTM)可达到该目的(参见Dombernowsky等，上文)。Femara是一种芳香酶抑制剂，其通过结合芳香酶并且抑制它将肾上腺雄激素转化为雌激素起作用。
此外，也利用了通过降低可到达靶细胞的雌激素浓度而起临床作用的其它药剂。这些药剂包括孕酮，如甲地孕酮和乙酸甲羟孕酮，LHRH，雄激素和其它芳香酶抑制剂，如阿纳托唑(Anastrozole)(参见，Litherland等，Cancer Treatment Reviews，15卷，183-194页(1988))。
因此，一般地，肿瘤为ER阳性的患者是内分泌治疗的好的候选者。然而，如上述所讨论的，仅仅30-70％ESR1阳性的恶性肿瘤将对内分泌治疗，例如抗雌激素或雌激素剥夺治疗产生应答(参见，Clark等，Semin.Oncol.，15卷，20-25页(1988)；和Lutherland等，Cancer Treatment Reviews，15卷，183-194页，(1988))。抗内分泌治疗的ESR1阳性恶性肿瘤的分子基础还不是很了解。
通过测定雌激素调节的基因孕酮受体(PGR)和三叶草因子1(TFF1)，(也称为PS2)的表达，已经进行了增加生物标志物对乳腺癌内分泌治疗的预示能力的尝试。这些蛋白质之一的存在指示功能性和活化ER的存在，并且这两种蛋白质都是乳腺癌内分泌治疗的预示性生物标志物。尽管PGR表达的应用提高了单独ESR1的预示性价值，但是在转移情况下，20％的表达ER和PGR的肿瘤仍旧不能对内分泌治疗产生应答。同样地，尽管TFF1与好的预后有关，并且预示对激素治疗的阳性应答，但是还没有证明其足以作为乳腺癌常规评估的预示性生物标志物(参见，Ribieras等，Biochem.Biophys.Acta.，F-61-F77卷，1378页，(1998))。
尽管评估乳腺癌肿瘤细胞中ER的存在及PGR和TFF1的状态的方法，如基于胞质的配体结合测定法或免疫组织化学(IHC)的应用在预测内分泌治疗应答中是有价值的，但是即使这些蛋白质存在，仍有相当数量的患者对内分泌治疗显示出原发或获得性抗性，并且预测特定的患者肿瘤是否将对内分泌治疗产生应答的能力仍是薄弱的。
在乳腺癌活检组织中具有与ESR1类似的表达模式的基因的鉴定提供了增加ESR1预示性价值的方法。而且，乳腺癌中涉及的关键分子机理大部分是未知的。对于用于乳腺癌的激素应答的生物标志物的开发、乳腺癌的分子机理的阐明及可以用于治疗乳腺癌患者或者有乳腺癌发生危险的患者的新治疗靶标的开发而言，鉴定乳腺癌细胞中受ER调节或与ER共表达的基因是极为重要的。
此外，目前鉴定乳腺癌存在的主要方式是对致密肿瘤组织存在的检测。可以通过乳房外部的直接检查或者通过乳房造影术或其它X射线成像方法完成该检测，该检测具有不同的成功程度(参见，Jatoi，Am.J.Surg.，177卷，518-524页，(1999))。为了确定特定肿瘤是不是ESR1阳性的，有必要获得用于IHC分析的肿瘤活检组织样品。该方法昂贵而且具有侵入性，并且将使患者暴露于并发症如感染。非常期望可以在血液上进行较少侵入性的诊断分析，因为不总是可以得到用于分析的肿瘤组织。
因此，需要更特异和更少侵入性的方法用于检测患者的肿瘤是否为ESR1阳性的。此外，更需要提供确定特定患者的肿瘤——无论是否存在ER——对内分泌治疗将如何应答的方法。这将使得医师能够作出更明智的有关治疗选择方案的决定，并且能够给患者更准确的预后。此外，需要用于鉴定如下化合物的方法，该化合物将提高乳腺癌肿瘤对内分泌治疗的应答率。
发明概述如此后所述，本发明通过鉴定人乳腺癌细胞中受ER调节或与ER共表达的大量基因，克服了目前检测ER阳性乳腺癌的激素应答性的可用方法中的缺陷。相应于这些基因的mRNA转录物和蛋白质有例如作为激素应答性的替代标志物和作为乳腺癌特异性潜在治疗靶标的用途。
而且，本发明鉴定了在对内分泌治疗(包括用芳香酶抑制剂来曲唑(FemaraTM)治疗)产生应答和不产生应答的乳腺癌肿瘤中差异表达的基因。
本发明鉴定了与ESR1表达相关的编码分泌性蛋白质的几种基因，这些分泌性蛋白质包括TFF1；三叶草因子3(TFF3)；丝氨酸或半胱氨酸蛋白酶抑制剂进化枝A成员3(SERPINA3)；催乳素诱导的蛋白质(PIP)，基质Gla蛋白质(MGP)；转化生长因子β的III型受体(TGFRB3)；和含锌α-2-糖蛋白1(AZGP1)。这些蛋白质可以形成基于血清的预示性生物标志物的基础。表6中列出了在本发明各种实施方案中鉴定的所有基因及它们的单基因簇号、基因符号和它们的表达蛋白质的蛋白质登录号。
发明详述本发明涉及基因的鉴定，所述基因在乳腺癌细胞中受ER调节或与ER共表达。原发性乳腺癌中ESR1的表达确定了与内分泌应答、较长的无疾病间隔期和较长的整体存活期有关的肿瘤表型。在大的乳腺癌样品中发现了ESR1基因表达和18种其它基因表达之间存在高度的统计学显著相关性。鉴于乳腺癌细胞中这些基因与ER基因的共表达，这些基因和它们的表达产物可以用于乳腺癌复发患者或处在乳腺癌发病危险中的患者或乳腺癌患者的处理、预后和治疗。表1中显示了这些基因。用表6中所示的单基因簇登录号可以得到本申请中公开的这18种基因和所有其它基因的完整序列。
检测mRNA表达水平的方法是本领域熟知的，包括但不限于Northern印迹法，反转录PCR，实时定量PCR和其它杂交方法。
对于检测获自大量公开基因的mRNA转录物的水平，一个特别有用的方法涉及用标记mRNA与寡核苷酸有序阵列杂交。这种方法允许同时检测这多种基因的转录水平以产生基因表达谱或模式。在另一个实施方案中，来源于对象的样品的基因表达谱可以与来源于无该疾病的个体的样品的基因表达谱比较，由此确定是否所述对象患有或有危险患有乳腺癌。
ER基因调节和这18种基因调节间的强相关性支持了这些基因与ER基因共调节且因此是功能性ER转录体(transcriptosome)的生物标志物的这一假说。表1中列出的基因中有10种基因(基因号8-17)已经被证实与ER基因相关或被雌激素直接调节。表1中所示的前7种基因(基因号1-7，即非电压门控钠通道1α(SCNN1A)；SERPINA3；N-酰基鞘氨醇酰胺水解酶(ASAH)；lipocalin 1(LCN1)；TGFBR3；谷氨酸受体前体2(GRIA2)和细胞色素P450的IIB亚族(苯巴比妥诱导的CYP2B))以前从没有被证实与乳腺癌中ER的表达相关。
因此，本发明提供了在大乳腺癌样品中多种与ER一起调节的基因。可以任意选择这些基因中的至少一个作为替代ER的标志物。在特别有用的实施方案中，可以选择这些基因中的多种，并且同时监测它们的mRNA表达以提供用在各个方面中的表达谱。
在另一实施方案中，可以在各种体液，包括但不限于血液、血浆、血清、淋巴、CSF、胆囊液体、腹水、尿、粪便和胆汁中监测基因表达产物(蛋白质)的水平。该表达产物水平可以用作肿瘤细胞上存在ER的代替标志物，并且可以提供患者肿瘤的内分泌治疗应答的指数。
此外，这些基因中一种或多种基因的表达谱可以提供有价值的分子工具，用于检测乳腺癌中内分泌应答的分子基础和用于评估药物的乳腺癌治疗效力。当细胞暴露于各种修饰条件，如与药物或其它活性分子接触时，表达谱相对于基线谱的改变可以用于指示这些效果。
在另一个实施方案中，本发明鉴定在对内分泌治疗产生和不产生应答的乳腺癌肿瘤中以不同水平表达的基因。由于这些基因的差异表达，可以利用这些基因和/或它们的表达产物以增加有关特定患者乳腺肿瘤是否将对内分泌治疗作出有利应答的预测的确定性。这些基因是神经肿瘤腹侧抗原1(neuro-oncological ventral antigenl，NOVA1)和免疫球蛋白重链γ3恒定区(IGHG3)，在表2中列出了这些基因。通过测定基因表达所对应的mRNA或基因编码的蛋白质可以检测这些公开基因的表达水平。可以在任何方便的体液，包括但不限于血液、血浆、血清、淋巴、CSF、胆囊液体、腹水、尿、粪便和胆汁中测定蛋白质。
因此，本发明提供了用于确定特定乳腺癌样品的细胞是否有内分泌应答表型的方法。此处所用术语“内分泌应答的”意指通过如下治疗可以减缓或阻止乳腺肿瘤或癌的生长或增生，该治疗在肿瘤细胞上引起改变的，即增加的或降低的ER活化作用。
此处所用术语“内分泌治疗”意指作为其临床效果的主要方面可以直接或间接地造成肿瘤细胞上ER活化的增加或降低的任何类型的治疗。因此，术语内分泌治疗包括但不限于封闭ER的药物和作为ER的混合激动剂-拮抗剂的药物及降低内源雌激素浓度的治疗，包括但不限于，例如芳香酶抑制剂、孕酮和LHRH。
因此，本发明提供了筛选乳腺癌患者以确定患者乳腺肿瘤对内分泌治疗产生应答的可能性的方法、在治疗乳腺癌患者中有用的药剂的鉴定方法、监测特定药物的乳腺癌治疗效力的方法和在乳腺癌肿瘤细胞中特异复制的载体。
用在来曲唑(FEMARATM)对它莫西芬比较研究中的客观应答的定义可测量的疾病1.完全应答(CR)通过不少于4周间隔的2次观察确定的所有已知疾病的消失。
2.部分应答(PR)为确定治疗的效力，通过不少于4周间隔的2次观察测量到的50％或以上总肿瘤损伤尺寸的减小。此外，不能出现新的损伤或任何损伤进展。
3.没有变化(NC)既不能确定为50％总肿瘤尺寸的减小，也没有显示一个或多个可测量损伤的尺寸有25％的增加。
4.进行性疾病(PD)一个或多个可测量损伤的尺寸有25％或以上的增加或出现新的损伤。
临床应答评估主要的疗效变量是利用世界卫生组织(WHO)标准(参见，报道癌症治疗结果的WHO手册(WHO Handbook for Reporting Results of CancerTreatment))，通过临床检查评估的肿瘤应答。将其定义为每个治疗组中具有CR或PR的患者的百分率，其中在4个月时通过胸部触诊临床确定CR和PR。可能的应答是CR，PR，NC，PD或不可评估/不可估测(NA/NE)。可触知的同侧腋下淋巴结累及降低临床CR的肿瘤等级。此外，还考虑了其它因素，如经历乳房保存手术(象限切除术/肿块切除术)而不是乳房切除术的患者的百分率。把变得不能手术的患者或者在4个月时依然不能手术的患者算作治疗失败。
用于检测乳腺癌中与ESR1共调节的基因的方法材料和方法细胞培养在加有0.03mg/mL内皮细胞生长补料(ECGS)，0.1mg/mL肝素和1xPen/Strep的DMEM/F-12中生长U373细胞(ATCC，Rockville，MD)。细胞生长到约40％铺满，然后用培养液洗一次。然后用培养基或培养基+PDGF20ng/mL培养细胞48小时。在具有5％FBS，0.03mg/mLECGS，0.1mg/mL肝素和1x Pen/Strep的F-12培养基中生长人静脉内皮细胞HUVEC(ATCC，Rockville，MD)到约40％铺满，然后用培养液洗一次。在培养基或培养基+VEGF 50ng/mL中生长细胞48小时。在MEM+2mM L-谷氨酰胺，0.1mM NEAA，1mM丙酮酸钠，0.1mM牛胰岛素，10％BSA中生长乳腺癌细胞系MCF7(ATCC，Rockville，MD)到80％铺满。用冰冷却的PBS洗所有的细胞培养物2次，然后从培养皿刮下，在冷却的PBS中沉淀，在液氮中快速冷冻。
样品制备从14号针芯活检组织提取21个RNA样品，其中在新的辅助内分泌治疗开始前，从参加随机III期来曲唑(FEMARATM，Novartis Pharma，BasalSwitzerland)对它莫西芬试验的患者收集所述活检组织，其中所述试验针对患有不适于乳房保存手术的原发侵袭性乳腺癌的绝经后妇女。
利用Trizol(Life Technologies，Gaithersburg，MD)从另外30个瑞典收集的原发性乳腺癌、1个另外的ESR1+乳腺肿瘤外科手术活检组织、2个HUVEC样品、2个来自成胶质细胞瘤细胞系U373-MG的样品和一个MCF7样品中提取RNA。根据当地伦理委员会批准的协议获得知情同意后，收集临床样品。购买2个RNA样品，一个为浸润III期导管癌(Ambion，Austin，TX)，另一个为2个正常乳腺组织的混和物(Clontech，Palo Alto，CA)。制备的样品总数是59个，包括53个乳腺癌活检组织和1个混合的正常乳腺样品。如Lockhart等，Nat.Biotechnol.，14卷，1675-1680页(1996)所述，总RNA用QIAGEN RNEASYTM柱(Qiagen，Valencia，CA)纯化，处理后与HUGENETMFL 6800阵列(Affymetrix，Santa Clara，CA)杂交。
层级聚类由于计算限制，将HuGeneFL 6800阵列的1,156个基因的子集输入用于聚类。该子集由GENECHIP软件(Affymetrix，Santa Clara，CA)认可(call)存在的基因组成，这些基因存在于59个样品之至少一个中并且有20倍的表达差异，即在正常的混合乳腺组织样品和这59个样品之至少一个之间的平均差异(AvDif)。该基因子集在理想情况下代表了在正常和肿瘤间有一些差异水平的那些基因。该子集排除了那些在任何样品中均无表达或未在至少一个样品中有显著变化的基因。利用GENESPRINGTM3.2.8(Silicon Genetics，Redwood City，CA)，用基因表达值对基因和样品进行聚类，其中跨样品对每个基因的平均差异测量值进行归一化以使中值为一。通过标准相关性测定基因表达相似性，最小距离为0.001且分离率为0.5。从所获含有ESR1基因的树形图的分枝汇编了与ESR1共聚类的基因的列表。
结果实验样品树没有或具有很低ESR1表达的样品主要簇集在树形图近一端，具有高ESR1表达的样品簇集在另一端，但没有描绘这两个样品类的清晰分枝(图2)。ESR1的AvDif值的范围从-24.08到3501.6，正常乳腺显示值为124。正常乳腺样品簇集在对于本文报道的18种基因而言通常具有低表达的样品和具有高表达的样品的边界上。图2中，簇集在正常乳腺上的所有样品的ESR1 AvDif的平均值是66.37，标准差是163.54。簇集在正常乳腺样品以下的所有样品的ESR1 AvDif的平均值是1440，标准差是936。
内皮和成胶质细胞瘤细胞培养样品与它们各自的细胞类型簇集在不同于肿瘤活检组织的分枝中。内皮和成胶质细胞瘤分枝位于具有低ESR1表达的树形图的末端。在聚类分析中包含细胞系，以便通过提供可以存在于乳腺肿瘤中的细胞类型如内皮和上皮细胞以及明显不同的细胞类型如成胶质细胞瘤以提高基因的聚类。
与ESR1共聚类的基因18种基因与ESR1共聚类(表1)。这些基因具有在ESR1阳性样品中高表达而在ESR1阴性样品中低表达的独特模式(图2)。与ESR1共聚类的7种基因，即SCNN1A、SERPINA3、ASAH、LCN1、TGFBR3、GRIA2和CYP2B(表1)，以前从未曾与雌激素刺激或乳腺癌联系在一起。
与ESR1共聚类的6种基因以前被认为是雌激素调节的蛋白质，作为乳腺癌的预测或预后生物标志物，这6种基因即癌胚抗原相关细胞粘附分子5(CEACAM5)、LIV-1蛋白质(LIV-1)、PIP、MGP、TFF3和TFF1(也称为PS2)(参见表1)。
CEACAM5是被报道在10-95％乳腺癌中表达的免疫反应性糖蛋白。在对298例乳房组织样品的研究中，发现ESR1阳性/PGR-阳性肿瘤中CEACAM5蛋白质水平最高(参见，Molina等，Anticancer Res.，19卷，2557-2562页(1999))。除了与ESR1表达相关外，在Zach等，J.Clin Oncol，17卷，2015-2019页(1999)的报道中指出CEACAM5与乳腺珠蛋白(mammaglobin)1(MGB1)表达相关。同一报告中还指出MGB1水平与ER水平相关，这支持了基因聚类结果。
LIV-1是文献详细记载的ER基因。通过ESR1依赖性机制，表皮生长因子(EGF)、转化生长因子α(TGFα)和胰岛素生长因子1(IGF1)诱导LIV-1(参见，EI-Tanani等，J.Steroid Biochem.Mol.Biol.，60卷，269-276页，(1997))。
PIP，或者称为总囊性疾病液体蛋白质15(gross cystic disease fluidprotein 15)，其被催乳素和雄激素诱导。PIP表达水平与ESR-1和PGR-阳性状态相关(参见，Clark等，Br.J.Cancer，81卷，1002-1008页(1999))。
MGP属于骨钙蛋白/基质gla蛋白质家族，与骨骼和软骨的有机基质有关，并被认为作为骨骼形成的抑制剂起作用。雌激素是MGP基因表达的强诱导物。
雌激素也强烈地诱导TTF1和TTF3。三叶草因子是在胃肠粘膜中表达的稳定分泌性蛋白质。它们可以起到保护粘膜上皮免受损害和帮助治愈的作用。TFF3可以是乳腺癌内分泌治疗的预测性生物标志物。它在雌激素应答的而不在雌激素不应答的乳腺癌细胞系中表达，并且其可以通过控制APC和E-钙粘着蛋白—连环蛋白复合物的表达而起到促进细胞迁移的作用(参见，Efstathiou等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95卷，3122-3127页(1998))。如前面所讨论的，TFF1是建立良好的内分泌治疗应答的预测性生物标志物，并且据报道，通过雌二醇而不是孕酮、地塞米松或双氢睾酮可以增加TFF1 mRNA的水平(参见，Prud′homme等，DNA，4卷，11-21页(1985))。而且，据报道，它莫西芬抑制TFF1的雌二醇诱导(参见，Prud′homme，上述引文)。
与ESR1共聚类的另一个基因，即肝细胞核因子3α(HNF3A)活化TFF1(参见，Beck等，DNA Cell Biol.，18卷，157-164页(1999))。以前证明在65个乳腺肿瘤的表达谱中HNF3A与ESR1共聚类(Perou等，Nature，406卷，747-752页(2000))。在上文Perou等的报道中，表1列出的3个另外基因也与ESR1共聚类LIV-1；hepsin(HPN)跨膜蛋白酶，其在细胞生长和细胞形态学维持中有根本作用；X盒子结合蛋白质1(XBP1)，其结合HLA-DR-α启动子，并且可以在B细胞中作为转录因子(参见，Liou等，Science，247卷，1581-1584页(1990))。
AZGP1在与ESR1共聚类的基因中是独特的，因为它以前未曾与内分泌应答有联系而被认为是乳腺癌分化的生物化学标志物(参见，Diez-ltza等，Eur.J.Cancer，29A卷，1256-1260页(1993))。AZGP1是刺激脂肪细胞中脂质降解的分泌性蛋白质，其可以促使晚期癌症患者中脂肪大量的损失。其与I类MHC抗原α链的细胞外结构域有高度相似性。
在mRNA水平上对基因表达的整体分析是研究复杂生物学问题如乳腺癌的强有力工具。这里，利用标准相关性算法对表达阵列数据进行聚类分析，从而能够鉴定到与ESR1共调节的基因。发现了18种基因，包括已知的受ESR1调节或与乳腺癌肿瘤发生相关的11种基因。有趣地，这里描述的ESR1分枝中存在的4种基因，即LIV1、HPN、XBP1和HNF3A被鉴定腔上皮ESR1基因簇的成员，参见Perou等(Nature，406卷，747-752页(2000))所述。在Bertucci等(Hum.Mol.Genet.，9卷，2981-2991页，(2000))的第三份乳腺肿瘤基因表达谱的报道中XBP1也与ESR1状态有关。HPN、HNF3A和XBP1与ESR1的共聚类表明这些基因象LIV1一样被雌激素调节，并且应该被认为是完整ER信号途径的可能标志物。
这是ER和下面7种基因间相关性的首次报道SCNN1A、SERPINA3、ASAH、LCN1、TGFBR3、GRIA2和CYP2B。基因TGFBR3和LCN1参与细胞分化和增生，并且它们在特定细胞系——起源上亦是ESR1样性的细胞系——中的下调能引起肿瘤发生和ESR1与这些基因的共聚类(参见，Bratt，Biochim.Biophys.Acta.，1482卷，318-326页(2000))。
表1显示在53个乳腺肿瘤活检组织、1个正常乳腺和5个细胞系样品中1126个基因的层级聚类中与ESR1共聚类的基因。针对每个基因所显示的GenBank登录号是序列的登录号，从此序列可获得用在Affymetrix基因芯片上的25mer探针用于该基因的检测。用+表示以前已证实具有与ER阳性相关的表达的基因。
表1与ESR1共聚类的基因基因 GenBank登录号 已知的与ESR1的相关性1. SCNN1A X76180-2. SERPINA3 X68733-3. ASAH U70063-4. LCN1 L14927-5. TGFBR3 L07594-6. GRIA2L20814-7. CYP2BM29874-8. CEACAM5 M29540+9. MGB1 U33147+10. LIV1 U41060+11. PIP HG1763+12. MGP X53331+13. TFF3 L08044+14. TFF1 X52003+15. HNF3AU39840+16. HPN X07732+17. XBP1 M31627+18. AZGP1X59766-19. ESR1 X03635+治疗前活检组织中内分泌应答的预测性标志物在本发明另一个方面中，从53例患者获得了136个乳腺活检组织。从116个活检组织提取RNA。对来自35例患者的43个活检组织制备了表达谱。鉴定了乳腺肿瘤中内分泌治疗应答的预测性标志物。将来源于来曲唑(FEMARATM)治疗前的制备了表达谱的活检组织和患者的临床结果细分如下4例患者有CR，9例患者有PR，4例患者有NC及4位患者有PD。
对于用它莫西芬治疗的组，没有患者在CR分类中，10例患者有PR，7例患者有NC，4例患者有PD。
具有CR或PR的患者归类为“应答者”，具有NC或PD的患者归类为“非应答者”。在来自接受来曲唑(FEMARATM)给药的患者的治疗前活检组织中比较8,000个基因在这两组间的表达。数值(AvDiff)表示在特定样品中基因的表达水平。因为计算的原因，相对于所有应答者，计算阵列上每个基因的AvDiff值的平均值。然后，将这些平均值和非应答者组中每个单独样品的每个基因作比较。鉴定到两个在应答者的平均值和每个非应答者样品间有3倍或更高的表达差异的基因，即NOVA1和IGHG3，它们在表2和6中列出。表2也包括仅供参考的V5活检组织(治疗后)数据。
与FEMARATM治疗期间有NC或PD的妇女的活检组织比较，发现这两个基因IGHG3和NOVA1在随后最终对FEMARATM治疗呈阳性应答的妇女的治疗前肿瘤中以较高水平表达。使用Mann-Whitney秩和检验，对于基因NOVA1，两组(包括V5样品)间中值的差异比由概率(P＝0.012)所预期的值大。对于IGHG3基因，该数据没有统计学上的显著性。这些基因(IGHG3和NOVA1)在来自它莫西芬治疗患者的活检组织中没有差异表达，因此不能提供标志物以指示是否可对它莫西芬产生有利应答。
为了唯一地确定NOVA1基因，可以利用下面的标志NOVA1(单基因ID Hs.214)位于染色体14q上，由mRNA登录号NM_002515及蛋白质登录号NP_002506标识。
对于IGHG3基因(Hs.300697)，该基因也位于染色体14q上，由mRNA登录号BC016381标识。没有蛋白质登录号。
基因IGHG3和NOVA1存在几种生物学特征，这些生物学特征使得这些基因适于用作诊断标志物和/或治疗靶标。IGHG3与重链疾病(HCD)有关。HCD是天然发生的淋巴增生性疾病，其中在血清或尿中存在单克隆Ig重链(H)可变片段。NOVA1是具有严格调节的表达的核RNA结合蛋白质，在发育的小鼠中，该蛋白质限于CNS的神经元中。在具肿瘤形成征兆的视性眼阵挛-共济失调(POA)患者中观察到了抗该抗原的抗体。POA是自身免疫疾病，在该病中患乳腺癌或小细胞肺癌的妇女发生眼睛、躯干和四肢的异常运动控制。在该疾病中乳腺肿瘤异常地表达NOVA1基因。这引起攻击天然表达NOVA1的CNS的免疫应答。与NOVA1融合蛋白质的血清反应被用于POA的诊断，并且表明存在隐性乳腺、妇科或肺肿瘤。
表2与非应答者比较，应答患者治疗前(FEMARATM)乳腺活检组织中具有可变表达的基因

PG样品号＝独特的患者标识符V0＝第一次调查取样的活检组织(治疗前)V5＝第五次调查(治疗后)▲＝基于基因表达谱和ICH发现存在ER数值(AvDiff)＝特定样品中该基因的表达水平绝对认可(AbsCall)＝由Affymetrix软件确定样品中基因是否表达，并用A(缺乏)；M(临界)；或P(存在)表示。
来自治疗后活检组织的预测性标志物在本发明的另一方面，鉴定了来自治疗后患者的应答标志。为此目的，将来自来曲唑(FEMARATM)治疗患者的活检组织，来自V5的样品，即治疗后的活检组织分为两个种类——应答者和非应答者。来自具有CR或PR的患者的活检组织被作为应答者，来自具有NC或PD的患者的活检组织被划为非应答者。因为计算的原因，针对V5应答者，计算阵列上每个基因的AvgDiff值的平均值。然后，将这些平均值和非应答者组中每个单独样品的每个基因作比较。鉴定到由8组探针代表的7种基因在应答者的平均值和非应答者组的每个样品间有多于3倍的表达差异(表3)。表3也包括仅供参考的来自治疗前活检组织V0的数据。用于β-血红蛋白的两组不同探针表明，对FEMARATM应答的患者的活检组织与非应答者的活检组织比较有较高的该基因表达。有趣地，鉴定的2个基因，即HPN和PIP在通过基因表达进行的ER阳性和ER阴性活检组织的2维层级聚类中与ESR1共聚类。使用Mann-Whitney秩和检验，对于HPN(P＝0.046)和乳运铁蛋白(P＝＜0.001)，在应答者和非应答者间中值有统计学上的显著差异。为了进行Mann-Whitney秩和检验，利用了所有活检组织数据，包括V0和V5活检组织。
标志物列表包括HPN和PIP。在层级聚类分析中也发现这些基因与ESR1共聚类。根据两个独立的分析，应该认为HPN和PIP是可以用于预测对来曲唑(FEMARATM)的应答性的功能ER转录体的生物标志物。
如Kazama(J.Biol.Chem.，270卷，66-72页，(1995))所述，HPN是II类膜相关丝氨酸蛋白酶，已证实其激活人因子VII，并且在细胞表面上启动血液凝固途径而导致形成凝血酶。如Torres-Rosada等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90卷，7181-7185页(1993))所述，据认为大量赘生性细胞可以通过这个和其它途径激活血液凝固系统，引起血凝过快和血管内血栓形成，并且hepsin在它们的细胞生长中起作用。如Tsuji等，J.Biol.Chem.，266卷，16948-16953页(1991)所述，HPN基因的表达是高度受限的；即该基因除了在肝中高水平表达和在肾中中等水平表达外，在大多数身体组织中为低水平表达。
已经报道在几种癌细胞系和卵巢癌(最近报道的，参见例如Tanimoto等，Cancer Res.，57卷，2884-2887页(1997))中高水平表达HPN。此外，尽管在肝中HPN高表达，但是HPN基因的两个拷贝都被破坏的敲除小鼠没有显示肝异常和功能障碍。例如WU等，J.Clin.Invest.，101卷，321-6页(1998)中所述，实际上，这些小鼠并未显示任何可辨别的表现型。例如上述引文Torres-Rosada等所述，已证实靶向HPN细胞外结构域的抗体可阻滞过度表达HPN的肝癌细胞的生长。
鉴定到两个用于β血红蛋白的探针。这表明在治疗后(V5)肿瘤中β血红蛋白在应答者中比在非应答者中表达水平更高。与血管形成较差的肿瘤比较，来曲唑(FEMARATM)可能更成功地靶向血管形成良好的乳腺肿瘤，并且β血红蛋白表达水平与这些活检组织中血管形成的程度相关。乳运铁蛋白(LTF)也包括在潜在标志物列表中。LTF是在奶中表达的铁结合蛋白质，其也在嗜中性粒细胞的次级颗粒中表达。LTF参与铁的运输贮藏和螯合以及宿主防御机制。据报道，在测定的约50％乳腺肿瘤中缺乏LTF(参见，Perou等，Nature，406卷，747-752页，(2000))。
表3与对FEMARATM治疗产生阴性应答的患者相比，在肿瘤对FEMARATM阳性应答的患者中发现的以较高水平表达的基因

表4与对FEMARATM治疗产生阴性应答的患者相比，在肿瘤对FEMARATM阳性应答的患者中发现的以较低水平表达的基因

因此，可以通过任何可靠的方法，包括但不限于这里公开的方法，在应答Femara的患者中和对Femara不产生应答的患者中测定这些基因或它们的基因产物的绝对表达水平，然后对该结果和在未知个体中同样基因或基因产物的表达水平进行比较以确定未知肿瘤是否将对内分泌治疗(包括来曲唑(FEMARATM)治疗)产生应答。
表5与非应答者比较，在FEMARATM应答者的乳腺活检组织中有可变表达的基因

表6除了IGHG3和PIP之外(只得到Mrna序列)，针对本申请中公开的所有基因的完整基因组序列的单基因簇号该表也有HUGO基因符号和该基因表达的蛋白质的蛋白质登录号GenBanK登录号 蛋白质基因 (用于设计 单基因簇号 基因符号Affymetrix探针) 登录号非电压门控钠通道1α X76180Hs.2794 SCNN1A prf2015190A丝氨酸或半胱氨酸蛋白酶抑制剂成员3X68733Hs.234726SERPINANA3N-酰基鞘氨醇酰胺 U70063Hs.75811 ASAH spQ13510水解酶(酸性神经酰胺酶)Lipocalinl L14927Hs.2099 LCN1 prf1908211A转化生长因子β的III型受体L07594Hs.79059 TGFBR3 spQ03167谷氨酸受体前体2 L20814Hs.89582 GRIA2 pir158181苯巴比妥诱导的细胞色素P450-IIB M29874Hs.1360 CYP2B pirA32969癌胚抗原mRNA M29540Hs.220529CEACAM5pirA36319乳腺珠蛋白1 U33147Hs.46452 MGB1 spQ13296-雌激素调节的LIV-1蛋白质 U41060Hs.79136 LIV-1 pirG02273催乳素诱导的蛋白质 HG1763Hs.99949 PIPpirSQHUAC基质Gla蛋白质X53331Hs.279009MGPpirGEHUM三叶草因子3 L08044Hs.82961 TFF3 spQ07654三叶草因子1 X52003Hs.1406 TFF1 pirA26667肝细胞核因子3α U39840Hs.299867HNF3A pirS70357丝氨酸蛋白酶hepsin X07732Hs.823 HPNpirS00845X盒结合蛋白质1 M31627Hs.149923XBP1 spP17861Zn-α2-糖蛋白X59766Hs.71AZGP1 pdb1ZAG雌激素受体αX03635Hs.1657 ESR1 pirS64737X盒结合蛋白质1 M31627Hs.149923XBP1 spP17861神经-肿瘤腹侧抗原1 U04840Hs.214 NOVA1 pir138489免疫球蛋白γ3重链恒定区(G3m标志物) M87789Hs.300697IGHG3 NAβ血红蛋白 M25079Hs.155376HBBprf1701384A离子型谷氨酸受体 L20814Hs.89582 GRIA2 pir158181乳运铁蛋白 X53961Hs.105938LTFpirTFHUL山梨醇脱氢酶 L29008Hs.878 SORD spQ00796肿瘤差异表达的d1 U49188Hs.272168TDE1 NA
药物基因组学药物遗传学/基因组学确定参与对外来化合物或药物的个体应答的遗传/基因组因子。可以将对本发明标志物表达有刺激或抑制作用的药剂或调节剂给予个体以预防或治疗患者乳腺癌。必须将这种治疗和个体的药物基因组学一起考虑。治疗剂的新陈代谢差异通过改变药理活性药物的剂量和血液浓度间的关系可能引起严重毒性和治疗失败。因此，了解个体的药物基因组学有助于有效的筛选预防性或治疗性药剂(例如药物)。进一步可以利用这种药物基因组学确定适合的剂量和治疗方案。因此，可以测定个体中本发明标志物的表达水平以筛选用于个体治疗或预防的适合的药剂。
药物基因组学研究由于个体中药物处置和作用的不同而造成的药物效力或毒性的临床显著变化(参见，例如.Linder，Clin.Chem.，43卷，2号，254-266页(1997))。一般地，可以分为两种类型的药物遗传条件。改变药物对身体的作用方式的、作为单因子遗传的遗传条件称为“改变的药物作用”。改变身体对药物的作用方式的、作为单因子遗传的遗传条件称为“改变的药物代谢”。这些药物遗传条件可以作为罕见的缺陷或者常见的多态性出现。例如，6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PD)缺陷是常见的遗传性酶病，其中主要的临床并发症是摄入氧化剂药物(抗疟疾药，磺胺，止痛药，硝基呋喃)后和食用蚕豆后出现溶血。
作为一个示例性实施方案，药物代谢酶的活性是药物作用强度和持继时间的主要决定因素。药物代谢酶(例如，N-乙酰转移酶2(NAT2)和细胞色素P450酶CYP2D6和CYP2C19)的遗传多态性的发现解释了为什么一些患者在服用标准安全剂量的药物后没有获得期望的药物效果或显示过大的药物反应和严重中毒。
这些多态性在人群中以两种表现型表达强代谢者(EM)和弱代谢者(PM)。不同种群中PM的流行程度不同。例如，编码CYP2D6的基因是高度多态性的，并且在PM中已经鉴定了几种突变，所有的这些突变都导致了功能性CYP2D6的缺乏。当CYP2D6和CYP2C19的弱代谢者接受标准剂量时，他们经常经受过大的药物反应和副作用。正如由CYP2D6形成的可待因代谢物吗啡介导的止痛作用所证明的，如果代谢物是活性治疗部分，PM将显示没有治疗应答。其它的极端情况是不对标准剂量应答的所谓超快速代谢者。最近，鉴定了超快速代谢的分子基础由于CYP2D6基因扩增所致。
因此，可以测定个体中本发明标志物的表达水平或功能水平以选择用于个体治疗或预防的适合的药剂。此外，药物遗传学研究可以用于对编码药物代谢酶或药物靶的多态等位基因进行基因分型以预测个体的药物应答表现型。当这种知识应用于给药和药物筛选时，用本发明标志物的表达调节剂治疗患者可以避免不良反应或治疗失败，由此增强治疗或预防的效率。
蛋白质组学可以分析培养的正常细胞和转化细胞分泌的蛋白质以鉴定可能由癌细胞分泌进入体液的并且在本发明方法中可能有价值的蛋白质。可以分离上清液，并且可以用MWT-CO过滤器简化蛋白质混合物。然后用胰蛋白酶消化蛋白质。然后可以在毛细管HPLC柱上加载胰蛋白酶消化产生的肽，在毛细管HPLC柱中这些肽将被分离，之后通过专门定制的电喷雾电离源直接洗脱到离子阱质谱仪中。在整个梯度上，通过对柱上洗脱的4种最强离子(肽)进行片段化，并同时动态地排除那些之前已经片段化的离子，可以获得序列数据。在这种方法中，可以获得多次扫描的序列数据，对应于样品中约50-200种不同蛋白质。利用相关性分析工具，如MS-Tag，相对于数据库检索这些数据可以鉴定上清液中的蛋白质。
测量方法本发明的实验方法取决于细胞组分的测量。所测量的细胞组分可以来自细胞生物学状态的任何方面。它们可以来自转录状态，其中测定RNA丰度；来自翻译状态，其中测定蛋白质的丰度；来自活性状态，其中测定蛋白质的活性。细胞特征也可以来自混合方面，例如测定一种或多种蛋白质活性连同其它细胞组分的RNA丰度(基因表达)。这部分描述了用于测量药物应答或途径应答中细胞组分的示例性方法。本发明亦适用进行这种测量的其它方法。
优选地，在本发明中测定其它细胞组分的转录状态。可以通过对核酸或核酸模拟探针阵列的杂交技术(如下一小部分所述)或通过其它基因表达技术(随后小部分所述)测定转录状态。不管如何测量，结果是包括代表mRNA丰度和/或比率的值的数据，(在RNA降解速率相同的情况下)其通常反映DNA表达率。
在本发明各种备选的实施方案中，可以测定非转录状态的生物学状态(如翻译状态、活性状态)的方面或混合方面。
在本发明的一个方面，可以随着时间的推移，即在乳腺疾病的各个阶段，在获自患者的体液或乳腺组织样品中，测量对应于表1，2，3或4中鉴定的至少一种基因的mRNA或编码蛋白的表达水平，以监测患者中乳腺癌的存在、进展或预后。对应于鉴定为与整体预后相关的基因的mRNA或编码蛋白质的表达水平可以提供关于乳腺癌治疗或进展的有价值的信息。可以通过如下所述的标准方法检测与该基因对应的mRNA和蛋白质的表达水平。
在一个特别有用的实施方案中，可以同时检测各个乳腺疾病阶段下患者中多种公开基因的mRNA表达水平以产生随着时间推移乳腺疾病的转录或表达谱。例如，可以在不同时间从患者乳腺细胞获得对应于这些基因大多数的mRNA转录物，并且与含有寡核苷酸探针的芯片进行杂交物(其中所述寡核苷酸探针与期望基因的转录物互补)，以比较大量基因在乳腺癌各个阶段的表达。
在另一方面，基于公开基因的细胞分析可以用于鉴定能用在乳腺癌治疗中的药剂。该方法包括a)用候选药剂接触获自怀疑患有乳腺疾病的患者的体液或乳腺组织样品；b)检测表1、2、3或4中鉴定的至少一种基因的表达水平；和c)与在缺乏候选药剂情况下样品中基因的表达水平进行比较，其中相对于药剂缺乏情况下的表达水平，药剂存在情况下样品中表达水平的改变将指示该药剂在乳腺癌治疗中是有用的。如下所述，可以通过测量对应于该基因的mRNA水平或该基因编码的蛋白质水平以检测基因表达水平。
当用于比较两个或多个值时，这里所用术语“相似的”意指这些值相互间相差在10％以内。
这里所用术语“候选药剂”指能改变或降低对应于至少一个公开基因的mRNA水平或该基因编码的蛋白质水平的任何分子。候选药剂可以是天然或合成的分子，如蛋白质或其片段、抗体、小分子抑制剂、核酸分子，例如反义核苷酸、核酶、双链RNA、有机和无机化合物等等。
无细胞测定法也可以用于鉴定能与一种公开基因编码的蛋白质或蛋白质结合伴侣相互作用以改变蛋白质或其结合伴侣的活性的化合物。无细胞测定也可以用于鉴定能调节编码蛋白质和其结合伴侣(如靶肽)间相互作用的化合物。
在一个实施方案中，用于鉴定这种化合物的无细胞测定法包含反应混合物，该反应混合物含有一种公开基因编码的蛋白质和试验化合物或试验化合物库，并且还含有或没有结合伴侣，例如生物学失活的靶肽或小分子。因此，本发明提供了用于鉴定在乳腺癌治疗中有用的药剂的无细胞方法的一个例子，该方法包括将蛋白质或其功能性片段或蛋白质结合伴侣和试验化合物或试验化合物库接触，并检测复合物的形成。为了检测，可以用特定的标志物标记蛋白质，并且用不同的标志物标记试验化合物或试验化合物库。然后，通过测量在温育和冲洗步骤后两种标志物的水平可以检测试验化合物和蛋白质或其片段或蛋白质结合伴侣的相互作用。两种标志物都存在表示有相互作用。
通过检测表面等离子共振—一种光学现象—的即时BIA(生物分子相互作用分析，Pharmacia Biosensor(AB))也可以估测分子间的相互作用。该检测取决于在生物特异界面上质量大分子的质量浓度的改变而不需要标记分子。在一个有用的实施方案中，可以在传感器表面，例如微流室(micro-flow cell)壁上固定试验化合物库。然后，使含有蛋白质、其功能性片段或蛋白质结合伴侣的溶液在传感器表面连续循环流动。信号记录上指示的共振角度的改变表明发生了相互作用。在Pharmacia的BIA技术指南中详细描述了该技术。
无细胞测定法的另一个实施方案包括a)混合至少一种基因编码的蛋白质、蛋白质结合伴侣和试验化合物以形成反应混合物；和b)在试验化合物存在或缺乏情况下检测蛋白质和蛋白质结合伴侣的相互作用。与不存在试验化合物情况下的相互作用比较，试验化合物存在情况下的蛋白质和结合伴侣相互作用的相当大的变化(增强作用或抑制作用)表明试验化合物是蛋白质活性的潜在的激动剂(模拟物或增强剂)或拮抗剂(抑制剂)。测定成分可以同时混合或者用试验化合物接触蛋白质一段时间后向反应混合物添加结合伴侣。通过利用各种浓度的化合物产生剂量应答曲线可以估测化合物的效力。也可以在不存在试验化合物的情况下，通过定量蛋白质和其结合伴侣间复合物的形成进行对照测定。
用可检测地标记的蛋白质如放射性标记、荧光标记或酶标记的蛋白质或其结合伴侣，通过免疫测定法或通过色谱检测法可以检测蛋白质和其结合伴侣间复合物的形成。
在优选的实施方案中，可以固定蛋白质或其结合伴侣以有利于从蛋白质和其结合伴侣的未复合形式中分离复合物和利于测定的自动化。可以在任何类型的容器，例如微量滴定板，微离心管和试管中完成蛋白质与其结合伴侣的复合。在特别优选的实施方案中，蛋白质可以与另一种蛋白质，例如谷胱甘肽-S-转移酶融合以形成融合蛋白质，该融合蛋白质可以吸附在基质，例如谷胱甘肽琼脂糖凝胶珠上(Sigma Chemical，St.Louis，MO)，然后与标记的，例如用35S标记的蛋白质伴侣和试验化合物混合，并且在足以形成复合物的条件下孵育。随后，洗涤珠以除去未结合的标记，并将基质固定化，测定放射性标记。
另一个在基质上固定蛋白质的方法包括利用生物素和链霉抗生物素蛋白。例如，可以利用公知的技术用生物素NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)生物素化蛋白质，并且将其固定在链霉抗生物素蛋白包被的板的孔中。
无细胞测定法也可以用于鉴定能够与至少一种基因编码的蛋白质相互作用并且调节该基因编码的蛋白质的活性的药剂。在一个实施方案中，蛋白质与试验化合物孵育并测定蛋白质的催化活性。在另一个实施方案中，通过本领域已知的方法测定蛋白质对靶分子的结合亲和性。
本发明也提供了对患有或有危险患有乳腺疾病的个体进行预防和治疗的方法。预防性药剂的给药可以发生在乳腺疾病的特征症状显现之前，这样可以预防乳腺疾病的发展或延缓它的进程。在乳腺疾病的治疗方面，并不要求杀死乳腺细胞(例如癌细胞)或诱导其发生细胞死亡。相反实现乳腺疾病治疗所需要的仅是在一定程度上减缓肿瘤生长或使得一些异常细胞恢复正常。适合的治疗药剂的例子包括，但不限于反义核苷酸、核酶、双链RNA和拮抗剂，如下文详述。
这里所用的术语“反义”指与至少一种公开基因的RNA表达产物的一部分互补的核苷酸序列。“互补的”核苷酸序列指根据标准Watson-Crick互补规则能进行碱基配对的核苷酸序列。即，嘌呤将和嘧啶配对以形成鸟嘌呤胞嘧啶和腺嘌呤胸腺嘧啶(在DNA中)或腺嘌呤尿嘧啶(在RNA中)的联合体。其它不常见的碱基，例如次黄苷，5-甲基胞嘧啶，6-甲基腺嘌呤，次黄嘌呤和其它碱基可以包含在杂交序列中，并且它们不干扰配对。
在所有实施方案中，细胞组分的测定应该以相对独立于测量时间的方式进行。
转录状态的测定优选地，通过核酸和寡核苷酸阵列杂交进行转录状态的测定，见本小节描述。在本小节中稍后描述了一些其它的转录状态测定方法。
转录物阵列概述在优选实施方案中，本发明利用了“寡核苷酸阵列”(这里也称为“微阵列”)。可以利用微阵列分析细胞中的转录状态，特别是测定癌细胞的转录状态。
在一个实施方案中，通过将代表细胞中存在的mRNA转录物的可检测标记的多核苷酸(例如，从总细胞mRNA合成的荧光标记的cDNA或标记的cRNA)与微阵列杂交产生转录物阵列。微阵列是具有一系列有序排列的位点的表面，所述位点用于与细胞或生物体基因组中许多基因(优选大多数或几乎所有基因)的产物进行结合(例如杂交)。可以用许多方法制备微阵列，下文描述了其中几种方法。无论如何制造，产生的微阵列有一些共同特征。阵列是可复制的，允许产生特定阵列的多个拷贝，并且这些拷贝之间易于相互比较。优选地，微阵列较小，通常小于5cm2，并且它们由在结合(例如，核酸杂交)条件下稳定的材料制成。微阵列中特定的结合位点或独特的一组结合位点将特异结合细胞的单个基因的产物。尽管每种特定mRNA可能有一个以上的物理结合位点(此后称为“位点”)，但是为了清楚的原因，下述的讨论将假定只有单个位点。在特定实施方案中，利用在每个位置含有固定的已知序列核酸的位置可寻址阵列。
可以理解，当制备与细胞RNA互补的cDNA，并且在适合的杂交条件下将其与微阵列杂交时，与对应于任何特定基因的阵列位点的杂交水平将反映细胞中该基因转录的mRNA的丰度。例如，当与总细胞mRNA互补的可检测标记的(例如用荧光团)cDNA或cRNA与微阵列杂交时，对应于细胞中未转录基因的阵列位点(所述“对应于”即能特异结合基因产物)将没有或几乎没有信号(例如，荧光信号)，而对应于编码的mRNA占优势的基因的位点将有相对强的信号。
微阵列的制备微阵列是本领域已知的，由一个表面组成，在该表面上在序列上相应于基因产物的探针(例如cDNA、Mrna、cRNA、多肽及其片段)可以特异地在已知位置发生杂交或结合。在一个实施方案中，微阵列是阵列(即矩阵)，在其中每个位置是基因编码产物(例如蛋白质或RNA)的一个离散结合位点，并且存在针对生物体基因组中大多数或几乎所有基因产物的结合位点。在优选实施方案中，“结合位点”(此后称“位点”)是特定关连cDNA或cRNA可以特异杂交的核酸或核酸类似物。结合位点的核酸或类似物可以是例如合成的寡聚体、全长cDNA、小于全长的cDNA或基因片段。
尽管在优选的实施方案中，微阵列含有靶生物体基因组中所有或几乎所有基因产物的结合位点，但是这种全面性不一定是必需的。微阵列可以仅有部分靶生物体基因的结合位点。然而，一般地，微阵列有对应于至少约50％，常常至少约75％，更常见至少约85％，甚至更常见多于约90％和最常见至少约99％的基因组基因的结合位点。优选地，微阵列具有如下基因的结合位点，所述基因与测试和验证目的生物学网络模型相关。“基因”被定义为优选具有至少50，75或99个氨基酸的开放阅读框(ORF)，在生物体(例如，如果是单细胞)中或在多细胞生物体的一些细胞中将从该开放阅读框转录信使RNA。可从生物体表达的mRNA数或通过从基因组的详细表征部分外推估测基因组中的基因数目。对感兴趣生物体的基因组测序后，通过DNA序列分析可以确定ORF数目并鉴定mRNA编码区。例如已经完整测序了酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)基因组，据报道其有约6275个长于99个氨基酸的ORF。对这些ORF的分析表明有5885个可能规定蛋白质产物的ORF(参见，例如Goffeau等，“具有6000个基因的生命体”，Science，274卷，546-567页，(1996)，为了所有目的，整体并入该篇文献为参考文献)。相比较，估测人类基因组含有约25,000-35,000个基因。
制备用于微阵列的核酸如上所述，与特定关连cDNA特异杂交的“结合位点”通常是附着在该位点的核酸或核酸类似物。在一个实施方案中，微阵列的结合位点是对应于生物体基因组的每种基因的至少一个部分的DNA多核苷酸。可以通过例如聚合酶链式反应(PCR)扩增来自基因组DNA、cDNA(例如，通过RT-PCR)或克隆序列的基因片段获得这些DNA，或者可以在芯片表面利用例如照相平板印刷技术从头合成序列，例如Affymetrix利用这种不同技术直接在芯片上合成了它们的寡聚体。可以根据基因或cDNA的已知序列选择PCR引物，以便扩增独特的片段(即，该片段与微阵列上任何其它片段不共有10个以上碱基的连续相同序列)。计算机程序在具有所需特异性和最适扩增特性的引物的设计中很有用(参见，例如Oligo pl 5.0版本(National Biosciences))。在结合位点对应于很长的基因的情况下，有时期望扩增基因3’末端附近的片段，这样当寡聚-dT引发的cDNA探针与微阵列杂交时，小于全长的探针可以有效地结合。通常，微阵列上每个基因片段的长度在约20bp和约2000bp间，更通常地在约100bp和约1000bp间，通常约300bp至约800bp。PCR方法是公知的，例如在Innis等编辑，″PCR ProtocolsA Guide to Methods and Applications″，AcademicPress Inc.，San Diego，CA(1990)中描述了该方法，为了所有的目的，整体并入该篇文献为参考文献。很明显，计算机控制的机器人系统对于分离和扩增核酸是有用的。
产生用于微阵列的核酸的备选方法是例如利用N-磷酸酯或亚磷酰胺化学合成多核苷酸或寡核苷酸(Froehler等，Nucleic Acid Res.，14卷，5399-5407页，(1986)；McBride等，Tetrahedron Lett.，24卷，245-248页，(1983))。合成序列长度在约15到约500个碱基之间，更通常地在约20到约50个碱基之间。在一些实施方案中，合成的核酸包括非天然的碱基，例如次黄苷。如上所述，核酸类似物可以用作杂交的结合位点。一个适宜的核酸类似物的例子是肽核酸(参见，例如Egholm等，“PNA遵循Watson-Crick氢键键合规则与互补寡核苷酸杂交”，Nature，365卷，566-568页(1993)；也参见美国专利号5,539,083)。
在备选的实施方案中，结合(杂交)位点从基因、cDNA(例如已表达序列标志)的质粒或噬菌体克隆或来自其中的插入物制备(Nguyen等，“通过与cDNA克隆阵列定量杂交分析小鼠胸腺中的差异基因表达”，Genomics，29卷，207-209页，(1995))。在再一个实施方案中，结合位点的多核苷酸是RNA。
将核酸结合到固相表面核酸或类似物被结合到固相支持体上，该固相支持体可以由玻璃、塑料(例如聚丙烯、尼龙)、聚丙烯酰胺、硝化纤维或其它材料制成。优选的将核酸结合到表面的方法是在玻璃板上印刷，一般地可参见Schena等，“用互补DNA微阵列定量监测基因表达模式”，Science，270卷，467-470页，(1995)。该方法特别可用于制备cDNA微阵列。也参见DeRisi等，“使用cDNA微阵列分析人类癌症中的基因表达模式”，Nature Genetics，14卷，457-460页，(1996)；Shalon等，“使用双色荧光探针杂交分析复杂DNA样品的DNA微阵列系统”，Genome Res.，6卷，639-645页，(1996)；和Schena等，“平行人类基因组分析；1000个基因的基于微阵列的表达”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93卷，10539-11286页，(1995))。为了所有的目的，整体并入每篇前述的文章作为参考文献。
第二种优选的制备微阵列的方法是制备高密度的寡核苷酸阵列。利用用于原位合成的照相平板印刷技术生产含有数千寡核苷酸的阵列的技术是已知的，其中所述寡核苷酸位于表面规定位置并与规定序列互补(参见Fodor等，“光指导的空间可寻址平行化学合成”，Science，251卷，767-773页(1991)；Pease等，“用于快速DNA序列分析的光导寡核苷酸阵列”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91卷，5022-5026页，(1994)；Lockhart等，“通过与高密度寡核苷酸阵列杂交监测表达”，Nature Biotech.，14卷，1675页(1996)；美国专利号5,578,832；5,556,752和5,510,270，为了所有的目的，整体并入每篇文献为参考文献)；用于快速合成和沉淀规定寡核苷酸的其它方法的技术也是已知的(Blanchard等，“高密度寡核苷酸阵列”，Biosensors& Bioelectronics，11卷，687-690页，(1996))。当利用这些方法时，直接在表面如衍生的载玻片上合成已知序列的寡核苷酸(例如25聚体)。通常，产生的阵列是冗余的，每个RNA对应于几个寡核苷酸分子。可以选择寡核苷酸探针以检测可变剪接的mRNA。
也可以利用其它制备微阵列的方法，例如掩蔽法(参见，Maskos和Southern，Nuc.Acids Res.，20卷，1679-1684页，(1992))。尽管如本领域技术人员所认识到的，优选非常小的阵列，因为这样杂交体积较小，但是原则上，可以利用任何类型的阵列，例如尼龙杂交膜上的点印迹(参见，Sambrook等，″Molecular Cloning--A Laboratory Manual(第二版)″，1-3卷，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY(1989)，为了所有目的，整体并入这篇文献为参考文献)。
产生标记探针制备总的和poly(A)+RNA的方法是公知的，在Sambrook等上述引文中概述了该方法。在一个实施方案中，在本发明中利用硫氰酸胍裂解各种类型目的细胞，接着通过CsCl离心提取RNA(Chirgwin等，Biochemistry，18卷，5294-5299页，(1979))。通过用寡聚-dT纤维素选择poly(A)+RNA(参见，Sambrook等，上引文)。目的细胞包括野生型细胞，暴露于药物的野生型细胞、具有修饰的/干扰的细胞组分的细胞和具有修饰的/干扰的细胞组分的暴露于药物的细胞。
通过寡聚dT引物或随机引物反转录从mRNA或备选地直接从RNA制备标记的cDNA，所述两种技术均是本领域已知的(参见，例如Klug和Berger，Methods Enzymol.，152卷，316-325页，(1987))。可以在缀合可检测标记的dNTP，最优选荧光标记的dNTP存在的情况下进行反转录。备选地，可以在标记的dNTP存在的情况下，通过双链cDNA的体外转录合成将分离的mRNA转化为标记的反义RNA(参见，Lockhart等，“通过与高密度寡核苷酸阵列杂交监测表达”，Nature Biotech.，14卷；1675页，(1996)，为了所有目的，整体并入该篇文献为参考文献)。在可替代的实施方案中，在缺乏可检测标记的情况下合成cDNA或RNA探针，并随后通过例如引入生物素化的dNTP或rNTP或一些类似方法(例如使生物素的补骨脂素衍生物光交联到RNA上)及接着添加标记的链霉抗生物素蛋白(例如缀合藻红蛋白的链霉抗生物素蛋白)或等同物来标记该cDNA或RNA探针。
当使用荧光标记的探针时，已知有许多适合的荧光团，包括荧光素、丽丝胺、藻红蛋白、罗丹明(Perkin Elmer Cetus)、Cy2、Cy3、CY3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、FluorX(Amersham)和其它荧光团(参见，例如Kricka，“非同位素DNA探针技术”，Academic Press，San Diego，CA(1992))。可以理解的是，应选择有不同发射光谱的成对荧光团以便于容易地区分它们。
在另一个实施方案中，利用了非荧光标记的标记物。例如，可以利用放射性标记或有不同发射光谱的成对放射性标记(参见，Zhao等，“高密度cDNA滤膜分析大规模定量分析基因表达的新方法”，Gene，156卷，207页(1995)；Pietu等，“通过与高密度cDNA阵列定量杂交揭示的在人类肌肉中优先表达的新基因转录物”，Genome Res.，6卷，492页，(1996))。然而，因为放射性粒子的散射和因此需要宽间隔的结合位点，放射性同位素的使用是不太优选的实施方案。
在一个实施方案中，通过在42℃，与反转录酶(如，TMII，LTI Inc.)一起孵育含有0.5mM dGTP，dATP和dCTP以及0.1mM dTTP和荧光脱氧核糖核苷酸(例如，0.1mM罗丹明110 UTP(Perken Elmer Cetus)或0.1mM Cy3 dUTP(Amersham))的混合物60分钟以合成标记的cDNA。
杂交到微阵列选择核酸杂交和洗涤条件，以便探针“特异地结合”或“特异地杂交”到特定阵列位点，即，使探针与具有互补核酸序列的序列阵列位点杂交、形成双链体或结合但是不与具有非互补核酸序列的位点杂交。如这里所用的，如果两个多核苷酸序列的短者少于或等于25个碱基且利用标准碱基配对规则两者没有错配，或者如果两个多核苷酸序列的短者长于25个碱基且两者之间的错配不超过5％，那么认为其中一个多核苷酸序列与另一个多核苷酸序列互补。优选地，多核苷酸完全地互补(没有错配)。通过进行包括阴性对照的杂交分析，可以很容易证明是否特定杂交条件将导致特异杂交(参见，例如Shalon等，上引文和Chee等，上引文)。
最适杂交条件取决于标记探针和固定的多核苷酸或寡核苷酸的长度(例如寡聚体相对于具有200个以上碱基的多核苷酸)和类型(例如，RNA，DNA，PNA)。在Sambrook等以上引文和在Ausubei等，″Current Protocolsin Molecular Biology″，Greene Publishing and Wiley-interscience，NY(1987)中描述了核酸特异(即严紧)杂交条件的一般参数，为了所有目的，整体并入这些文献为参考文献。当利用Schena等的cDNA微阵列时，典型的杂交条件是在65℃、5xSSC加0.2％SDS中杂交4小时，随后在25℃、低严紧性的洗涤缓冲液(1xSSC加0.2％SDS)中洗涤，接着在25℃、高严紧性的洗涤缓冲液(0.1xSSC加0.2％SDS)中洗涤10分钟(参见，Shena等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93卷，10614页，(1996))。
在例如Tijessen，″Hybridization With Nucleic Acid Probes″，ElsevierScience Publishers B.V.(1993)和Kricka，″Nonisotopic DNA ProbeTechniques″，Academic Press，San Diego，CA(1992)中也提供了有用的杂交条件。
信号检测和数据分析当利用荧光标记的探针时，优选地，通过扫描共聚焦激光显微术来检测转录物阵列上每个位点的荧光发射。在一个实施方案中，利用适合的激发线对所用两个荧光团中的每个荧光团进行单独扫描。可替代地，可以利用激光以特异于所用荧光团的波长照射样品，然后分析荧光团的发射光。在优选实施方案中，用具有计算机控制的X-Y阶(stage)和显微镜物镜的激光荧光扫描仪扫描阵列。可以用多线混合气体激光实现荧光团的相继激发，并按波长分开发射光后用光电倍增管进行检测。在Schena等，GenomeRes.，6卷，639-645页，(1996)和这里引用的其它参考文献中描述了荧光激光扫描装置。可替代地，Ferguson等，Nature Biotech.，14卷，1681-1684页，(1996)描述的光纤束可以用于同时监测许多位点上的mRNA丰度水平。
记录信号并在优选实施方案中通过计算机，例如利用12位模数板对信号实施分析。在一个实施方案中，用图形程序(例如，Hijaak Graphics Suite)除去扫描图像的光斑，然后用图像网格程序分析图像，该程序将产生记录了每个位点每个波长下的平均杂交的电子表格。
Agilent Technologies GENEARRAYTM扫描仪是台式488nM氩离子激光分析仪。该激光可以聚焦到小于4微米大小的点。这种精确度允许对具有小至20微米的探针单元的探针阵列进行扫描。激光束聚焦在探针阵列上，激发荧光标记的核苷酸。然后利用针对分析中所用的染料而选定的滤光器执行扫描。通过移动探针阵列完成正交坐标的扫描。结合在杂交样品中的染料分子将吸收激光辐射而发射荧光。通过透镜校准荧光，使其穿过滤光器以选择波长。然后通过第二透镜聚焦光线在用于强度鉴别的孔上方。然后通过高敏光电倍增管(PMT)检测。PMT输出电流被模数转换器(ADC)转换成电压读数，处理后的数据以样品点的荧光强度水平或当前扫描的图像元素(象素)的形式返回计算机。随着扫描的进行计算机将数据显示为图像。此外，表示样品表达谱的所有样品的荧光强度水平以计算机可读格式记录。
如果必要，可以实验确定以校正两种荧光通道间的“串话”(或重叠)。对于转录物阵列上任何特定的杂交位点，可以计算两种荧光的发射比率。该比率独立于关联基因的绝对表达水平，但是可能对于表达受到药物施用、基因缺失或任何其它检测事件显著调节的基因是有用的。
优选地，除了鉴定干扰为阳性或阴性外，测定干扰的幅度也是有利的。这可以通过本领域技术人员显而易见的方法进行。
当用于比较两个或多个值时，如这里所用术语“类似的”，指当用相同单位时，两个值在数值上相差在20％以内，或更优选地10％以内。
其它的转录状态测量方法可以通过本领域已知的其它基因表达技术测定细胞的转录状态。几种这样的技术产生用于电泳分析的具有有限复杂性的限制性片段库，如结合双限制酶消化和定相引物(phasing primer)的方法(参见，例如Zabeau等1992年9月24日提交的欧洲专利0 534858 A1)，或用最接近规定mRNA末端的位点筛选限制性片段的方法(参见，例如Prashar等Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93卷，659-663页，(1996))。其它方法统计地采样cDNA库，如通过测序多个cDNA之每一个的足够碱基(例如20-50碱基)以鉴定每个cDNA，或通过测序在相对于规定的mRNA末端的已知位置上产生的短标签(例如9-10碱基)(参见，例如Velculescu，Science，270卷，484-487页，(1995))以鉴定途径模式。
其它方面的测量在本发明各种实施方案中，可以测定除了转录状态外的生物学状态方面，如翻译状态，活性状态或混合方面以获得药物和途径应答。在本部分描述了这些实施方案的细节。
翻译状态的测量可以通过可检测地标记的或可随后标记的探针检测基因编码的蛋白质的表达。一般地，该探针是识别所表达蛋白质的抗体。
如这里所用的术语“抗体”包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、人源化或嵌合抗体和足以结合抗体片段到蛋白质的生物功能性抗体片段。
为了产生一种公开基因编码的蛋白质的抗体，可以通过注射多肽或其片段免疫各种宿主动物。这些宿主动物可以包括，但不限于家兔、小鼠和大鼠等。根据宿主物种，可以用各种佐剂增强免疫应答，这些佐剂包括但不限于弗氏佐剂(完全和不完全)、矿物凝胶如氢氧化铝，表面活性物质如溶血卵磷脂、多聚醇、聚阴离子、肽、油乳化佐剂、钥孔蝛血蓝蛋白、二硝基苯酚和潜在有用的人用佐剂如BCG(bacille Camette-Guerin)和小棒杆菌(Corynebacterium parvum)。
多克隆抗体为来自利用抗原免疫的动物血清的异质抗体分子群，上述抗原例如靶基因产物或其抗原性功能衍生物。为生产多克隆抗体，可以通过利用添加了上述佐剂的编码蛋白或其部分注射来免疫例如以上所述的宿主动物。
单克隆抗体(mAb)是针对特定抗原的同质抗体群，其可以通过利用任何可允许培养的连续细胞系产生抗体分子的技术获得。这些技术包括但并不限于Kohler和Milstein的杂交瘤技术(1975，自然(Nature)256495-497；以及美国专利号4,376,110)、人B细胞杂交瘤技术(Kosbor等人，1983，今日免疫学(Immunology Today)472；Cole等人，1983，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)802026-2030)以及EBV杂交瘤技术(Cole等人，1985，单克隆抗体与癌症治疗(MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy)，Alan R.Liss公司，77-96)。这些抗体可以为任何免疫球蛋白种类，包括IgG、IgM、IgE、IgA、IgD以及它们的任何亚类。产生本发明mAb的杂交瘤可以在体外或体内培养。体内产生高效价mAb的方法为目前优选的生产方法。
另外，也可以使用生产“嵌合抗体”的技术(Morrison等人，1984，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)816851-6855；Neuberger等人，1984，自然(Nature)312604-608；Takeda等人，1985，自然(Nature)314452-454)，其通过将具适当抗原特异性的小鼠抗体分子的基因与具有适当生物学活性的人抗体分子的基因拼接在一起而进行。嵌合抗体是其中不同的部分来自不同的动物种类的分子，例如那些具有来自小鼠mAb的可变或高变区和人免疫球蛋白恒定区的抗体。
备选地，可以采用产生单链抗体的技术(美国专利号4,946,778；Bird，1988，科学(Science)242423-426；Huston等人，1988，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)855879-5883；以及Ward等人，1989，自然(Nature)334544-546)来生产差异表达基因的单链抗体。单链抗体可通过使重链和轻链的Fv区片断借助氨基酸桥相连产生单链多肽而形成。
更优选地，采用用于生产“人源化抗体”的技术来生产蛋白质、其片断或衍生物的抗体。这些技术公开在美国专利号5,932,488、5,693,762、5,693,761、5,585,089、5,530,101、5,569,825、5,625,126、5,633,425、5,789,650、5,661,016和5,770,429中。
识别特异表位的抗体片断可以通过公知的技术产生。例如，这些片断包括但并不限于通过胃蛋白酶消化抗体分子产生的F(ab’)2片断和通过还原F(ab’)2片断的二硫键而生成的Fab片断。另外，可以构建Fab表达文库(Huse等人，1989，科学(Science)，2461275-1281)以进行具有期望特异性的单克隆Fab片断的快速而容易的鉴定。
然后可以通过利用上述抗体的免疫测定法检测样品中已知蛋白质的表达程度。这种免疫测定法包括但不限于点印迹，western印迹，竞争性和非竞争性蛋白质结合测定法，酶连免疫吸附测定法(ELISA)，免疫组织化学，荧光激活细胞分选术(FACS)和其它在科学和专利文献中常用和广泛描述的方法及许多商用的方法。
为便于检测，特别优选使用三明治ELISA，该测定法存在多种变异方式。所有方式均包括在本发明范围内。例如，在一般的正向测定中，将未标记抗体固定于固体基质上，并将测试样品与结合的分子接触。经过适当的孵育时间，该时间将足够抗体抗原二元复合体形成。这时，再加入用能够诱导可检测信号的报告分子标记的第二抗体并孵育，孵育时间应足够抗体-抗原-标记抗体三元复合体的形成。将任何未反应物质洗去，并通过观察信号确定抗原的存在或者通过与含有已知量抗原的对照样品比较来定量。正向测定的变异方式包括同时测定和反向测定，其中在同时测定中样品和抗体同时加至结合的抗体中；而在反向测定中标记的抗体与待测试样品首先混合、孵育然后加至未标记的表面结合抗体中。这些技术为本领域技术人员所公知，并且显而易见可以进行小的改动。于此使用的“三明治测定法”意味着包括基于此基本的两位点技术的所有变异方案。对本发明的免疫测定而言，仅有的限制因素是标记的抗体必须是目的基因表达的蛋白质的特异性抗体。
在这种测定中最常使用的报告分子为酶或者含荧光团或放射性核素的分子。在酶免疫测定的案例中，将酶偶联至第二抗体，这通常通过戊二醛或过碘酸实现。然而，正如易于意识到的，存在相当大量不同的连接技术，它们为本领域技术人员所公知。通常使用的酶包括辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶和碱性磷酸酶等等。对于与特定酶一起使用的底物，一般选择在相应酶的水解作用后可以产生可检测的颜色改变的底物。例如对硝基苯磷酸适合与碱性磷酸酶缀合物一起使用；对过氧化物酶缀合物而言，通常使用1，2-苯二胺或甲苯胺。也可以使用荧光底物，其生成荧光产物而不是上文提及的生色底物。然后将含有适当底物的溶液加至三元复合体中。底物与连接至第二抗体的酶反应，产生定性的可见信号，该信号可以进一步通过通常地分光光度计定量以评价血清样品中存在的蛋白量。
备选地，可以将荧光化合物(例如荧光素和罗丹明)在不改变抗体的结合能力的条件下化学偶联至抗体。当利用特定波长的光照射激活后，荧光色素标记的抗体吸收光能，诱导分子进入激发状态，并随后发射出特征长波长的光。该发射光在光学显微镜下表现为可观测的特征颜色。免疫荧光和EIA技术在本领域均是极为成熟的技术并且为本方法所特别优选。然而，本发明也可以使用其它报告分子，例如放射性同位素、化学发光或生物发光分子。对本领域技术人员而言，如何改变方法以适应所需用途是显而易见的。
根据几种其它方法也可以进行翻译状态的测定。例如，通过构建微阵列可以进行整个基因组的蛋白质监测(即“蛋白质组学”，Goffeau等，以上引文)，其中该微阵列的结合位点包含固定化的、对细胞基因组编码的大量蛋白质种类具特异性的抗体，优选单克隆抗体。优选地，存在针对相当大部分的编码蛋白质的抗体，或至少存在与测试或验证目的生物网络模型相关的那些蛋白质的抗体。制备单克隆抗体的方法是公知的(参见，例如Harlow和Lane，″AntibodiesA Laboratory Manual″，Cold SpringHarbor，NY(1988)，为了所有的目的，整体并入该篇文献为参考文献)。在一个优选实施方案中，产生抗合成的肽片断的单克隆抗体，所述合成肽片段是基于细胞基因组序列设计的。使用这种抗体阵列时，使来自细胞的蛋白质接触阵列，并且用本领域已知的测定法检测它们的结合。
可替代地，可以通过二维凝胶电泳系统分离蛋白质。二维凝胶电泳是本领域公知的，通常包括沿着第一维的等电聚焦，随后沿着第二维的SDS-PAGE电泳(参见，例如Hames等，″Gel Electrophoresis of ProteinsAPractical Approach″，IRL Press，NY(1990)；Shevchenko等，Proc.Nat’lAcad.Sci.USA，93卷，1440-1445页(1996)；Sagliocco等，Yeast，12卷，1519-1533页(1996)；Lander，Science，274卷，536-539页(1996)))。可以通过许多技术，包括质谱技术，western印迹和利用多克隆和单克隆抗体的免疫印迹分析法及内部和N-末端微测序方法分析所得到的电泳图谱。利用这些技术，可以鉴定在给定生理条件下(包括暴露于药物的细胞中(例如，酵母中)，或通过例如缺失或过表达特定基因而修饰的细胞中)产生的所有蛋白质的相当大部分。
基于生物学状态的其它方面的实施方案尽管监测mRNA丰度以外的细胞组分目前存在一些在监测mRNA时没有遇到的技术困难，但是对本领域技术人员显而易见的是，使用本发明方法时，可以测量与细胞功能特征有关的蛋白质活性，而且本发明的实施方案可以基于此测量。可以通过适于待表征的特定活性的任何功能性的、生物化学的或物理的方法进行活性测定。当活性涉及化学转化时，可以将细胞蛋白质与天然底物接触，并且测定转化速率。当活性涉及多聚体单元中的联系，例如活化的DNA的结合复合物与DNA的结合时，可以测定相关蛋白质的量或此联系的次级结果，如转录的mRNA量。而且，当仅知道功能活性，例如细胞周期控制中的功能活性时，可以观察功能的实现。然而，不论是如何已知和测量的，蛋白质活性的变化都可以形成本发明上述方法所分析的应答数据。
在可替代的非限制性实施方案中，应答数据可以由细胞生物状态的混合方面组成。可以从例如某些mRNA丰度的变化、某些蛋白质丰度的变化和某些蛋白质活性的变化来构建应答数据。
计算机实现在优选实施方案中，为了提供用于形成和检测生物系统模型的强大的和方便的工具，在计算机系统上或一个或多个联网的计算机系统上执行前述方法的计算步骤。计算机系统可以是包括内部元件并与外部元件连接的单一硬件平台。该计算机系统的内部元件包括与主存储器互相连接的处理器元件。例如计算机系统可以具有200Mhz或更大时钟频率的基于IntelPentium的处理器及32MB或更大的主存储器。
外部元件包括大容量数据存储器。该大容量存储器可以是一个或多个硬盘(其通常与处理器和存储器装在一起)。通常，这种硬盘提供至少1GB的存储。其它外部元件包括用户界面设备，这可以是显示器和键盘及点击设备(这可以是“鼠标”)或其它图形输入设备。通常，此计算机系统还与其它本地计算机系统、远程计算机系统或广域的通讯网络，如互联网连接。这种网络连接允许此计算机系统与其它计算机系统共享数据和处理任务。
在该系统运行期间几个软件被下载到存储器，它们在本领域是标准的并且对本发明是特定的。根据本发明的方法，这些软件组件共同地使计算机系统起作用。这些软件组件通常存储在大容量存储器上。可选地，可以在可移动介质如软盘或CD-ROM(未示出)上存储软件组件。这些软件组件代表操作系统，该操作系统负责管理计算机系统和其网络互连。该操作系统可以是，例如Microsoft Windows家族，如Windows95，Windows98或Windows NT，或Unix操作系统，如Sun Solaris。软件包括适于存在于该系统上的常用语言和函数以帮助程序实现本发明特定的方法。可以用于编程本发明的分析方法的语言包括C、C++或不太优选地JAVA。最优选地，用数学软件包编程本发明方法，该数学软件包允许符号输入方程式以及处理的高级别说明，其包括所要用的算法，因此用户不需要程序化地编程单个的方程或算法。这种软件包包括例如Mathworks(Natick MA)的MATLABTM、Wolfram Research(Champaign，IL)的MATHEMATICATM和Mathsoft(Cambridge，MA)的MATHCADTM。
在优选实施方案中，分析软件组件实际上包括相互作用的单独软件组件。分析软件代表包含系统运行所有必需的数据的数据库。这种数据一般包括，但不是必须限于以前试验的结果、基因组数据、实验步骤和费用及其它信息，这些对本领域技术人员是显而易见的。分析软件包括数据简化和计算成分，该计算成分包括一个或多个执行本发明分析方法的程序。分析软件也包括用户界面(UI)，该界面使得计算机系统用户可以控制和输入测试网络模型，并且可选地，实验数据。用户界面可以包括用于说明系统假设的拖放界面。用户界面也可以包括用于从大容量存储组件(例如，硬驱动)、从可移动介质(例如软盘或CD-ROM)或通过网络(例如，局域网或广域通讯网络如互联网)从与本系统通讯的不同计算机系统载入试验数据的方法。
本发明还提供了构建包含至少一个本发明所述标志物，例如mRNA或蛋白质产物的数据库的方法。例如，多核苷酸或氨基酸序列可以被存储在数字存储介质中以便可以编译处理系统以标准化的表现可鉴定乳腺癌细胞的基因。该数据处理系统对分析两个细胞间的基因表达有用，其中首先选出一个被怀疑为具有肿瘤表现型或基因型的细胞，然后从该细胞中分离多核苷酸。测序分离的多核苷酸。用同源性检索技术比较样品序列和数据库中存在的序列。试验序列和本发明多核苷酸序列间大于90％，更优选地，大于95％，更优选地，大于或等于97％的序列同一性从正面表明该多核苷酸已经从上面所定义的乳腺癌细胞中分离出来。
实现本发明分析方法的备选计算机系统和方法对本领域技术人员显而易见，并且包括在所附权利要求中。具体地，所附权利要求旨在包括实现本发明方法的备选程序结构，这些程序结构对本领域技术人员是显而易见的。
修饰mRNA的丰度或活性的方法在本发明各种实施方案中，通过改变或修饰表达mRNA的丰度或活性来产生临床上有益的效果。目前，修饰RNA丰度和活性的方法包括4类核酶、反义物、双链RNA和RNA适体(aptamer)(Good等，Gene Therapy，4卷，45-54页(1997))。将细胞可控性应用或暴露于这些实体允许可控地干扰RNA的丰度，包括mRNA丰度和活性，所述活性包括mRNA向活性或可检测的基因表达产物(即蛋白质)的翻译。
核酶核酶是以与DNA限制性内切核酸酶相似的方式特异切割其它单链RNA的RNA分子。核酶具有催化RNA切割反应的能力(Cech，Science，236卷，1532-1539页(1987)；1990年10月4日公开的PCT国际公布WO90/11364；Sarver等，Science，247卷，1222-1225页(1990))。如Cech，Amer.Med.Assn.，260卷，3030页(1988)所述，通过修饰编码RNA的核苷酸序列，可以合成核酶以识别分子中特异核苷酸序列并将其切割。因此，仅具有特定序列的mRNA被切割和失活。
两种基本类型的核酶包括“锤头”型(如，Rossie等，Pharmac.Ther.，50卷，245-254页(1991)中所述)和“发夹”型核酶(如Hampel等，Nucl.Acids Res.，18卷，299-304页(1999)和美国专利号5,254,678中所述)。可以设计发夹和锤头RNA核酶以特异切割特定的靶mRNA。已经确立了设计具有核酶活性的短RNA分子的规则，该RNA分子能以高度序列特异性方式切割其它RNA分子，并且能靶向实际上所有种类的RNA(Haseloff等，Nature，334卷，585-591页(1988)；Koizumi等，FEBS Lett.，228卷，228-230页(1988)；Koizumi等，FEBS Lett.，239卷，285-288页(1988))。
核酶方法涉及使细胞暴露于这种小RNA核酶分子以诱导细胞中的表达，等(Grassi和Marini，Annals of Medicine，28卷，499-510页(1996)；Gibson，Cancer and Metastasis Reviews，15卷，287-299页(1996))。可以通过靶向对应于至少一种公开基因的mRNA的锤头和发夹核酶在细胞内的表达以抑制该基因编码的蛋白质。
可以用包含核酶序列的RNA寡核苷酸形式直接向细胞递送核酶，或者以编码期望核酶RNA的表达载体形式向细胞引入核酶。核酶可以在体内以足够有效催化切割mRNA的数量常规地表达，因此修饰细胞中mRNA丰度(参见，Cotton等，“核酸介导的体内RNA破坏”，The EMBO J.，8卷，3861-3866页(1989))。特别地，可以将根据以前规则设计，并且例如通过标准亚磷酰胺化学法合成的核酶编码DNA序列连接到编码tRNA的基因的反密码子茎和环的限制性酶位点中，然后通过本领域常规方法转化其进入目的细胞并在细胞中表达。优选地，还向该构建体引入诱导型启动子(例如，糖皮质激素或四环素效应元件)，这样可以选择地控制核酶表达。对于饱和应用，可以利用具有组成型高活性的启动子。因为tDNA基因(即，编码tRNA的基因)的小尺寸和在不同种类组织中的高转录速率及普遍表达，所以在本申请中是有用的。
因此，可以常规地设计核酶以切割实际上任何mRNA序列，并且可以用编码这种核酶序列的DNA常规地转化细胞以可控表达催化有效量的核酶。因此，可以修饰或干扰细胞中实际上任何RNA物类的丰度。
可以用与就反义核苷酸所述的方式基本相同的方式修饰核酶序列，例如核酶序列可以含有修饰的碱基部分。
反义分子在另一个实施方案中，可以通过反义核酸的可控应用可控地抑制靶RNA(优选mRNA)种类的活性，特别是其翻译速率。高水平应用引起饱和抑制。这里所用的“反义”核酸指能够借助于与编码和/或非编码区域的一定序列互补性而与靶RNA的序列特异(例如非polyA)部分(例如其翻译起始区)杂交的核酸。本发明的反义核酸可以是双链或单链寡核苷酸，可以是RNA或DNA或其修饰物或衍生物，并且可以以可控方式给细胞直接施用，或者可以通过外源引入序列的转录-以足够干扰靶RNA翻译的可控量在细胞内产生。
优选地，反义核酸至少具有6个核苷酸，优选是寡核苷酸(范围从6到约200个寡核苷酸)。在特定方面，寡核苷酸具有至少10个核苷酸，至少15个核苷酸，至少100个核苷酸，或至少200个核苷酸。寡核苷酸可以是DNA或RNA或它们的嵌合混合物或衍生物或修饰形式，并可以是单链或双链。可以在碱基部分，糖部分或磷酸骨架修饰寡核苷酸。寡核苷酸可以包含其它附加基团，如肽或有利于跨细胞膜转运的因子(参见，例如Letsinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86卷，6553-6556页(1989)；Lemaitre等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84卷，648-652页(1987)；1998年12月15日公开的PCT公开号.WO 88/09810)、杂交触发的切割剂(参见，例如Krol等，BioTechniques，6卷，958-976页(1988))或嵌入剂(参见，例如Zon，Pharm.Res.，5卷，539-549页(1988))。
在本发明优选方面，提供优选为单链DNA的反义寡核苷酸。可以用本领域公知的组分在寡核苷酸结构的任何位置上修饰它。
典型的反义方法包括与基因编码的mRNA互补的寡核苷酸(DNA或RNA)的制备。反义寡核苷酸将与该基因编码的mRNA杂交，并且阻止翻译。反义核苷酸序列与期望基因杂交的能力将取决于反义核苷酸序列的互补程度和长度。通常，随杂交核酸长度增加，它可以含有更多与RNA错配的碱基而仍旧形成稳定的双螺旋或三股螺旋。通过利用常规方法测定杂交复合物熔点，本领域技术人员可以确定错配的耐受程度。
优选地，设计与mRNA 5’末端，例如，非翻译序列直到并且包含mRNA起始位点，即AUG的区域互补的反义核苷酸。然而，正如Wagner，Nature，372卷，333页(1994)所述，与mRNA 3’非翻译序列互补的寡核苷酸序列也被证实可以有效地抑制mRNA翻译。尽管可以设计与mRNA编码区互补的反义寡核苷酸，但是这种寡核苷酸是不太有效的翻译抑制剂。
反义寡核苷酸可以包含至少一个修饰的碱基部分，所述修饰的碱基部分选自包括但不限于5-氟尿嘧啶，5-溴尿嘧啶，5-氯尿嘧啶，5-碘尿嘧啶，次黄嘌呤，黄嘌呤，4-乙酰胞嘧啶，5-(羧基羟甲基)尿嘧啶，5-羧基甲基氨甲基-2-硫尿嘧啶，5-羧基甲基氨甲基尿嘧啶，二氢尿嘧啶，β-D-半乳糖queosine，次黄苷，N6-异戊烯腺嘌呤，1-甲基鸟嘌呤，1-甲基次黄苷，2，2-二甲基鸟嘌呤，2-甲基腺嘌呤，2-甲基鸟嘌呤，3-甲基胞嘧啶，5-甲基胞嘧啶，N6-腺嘌呤，7-甲基鸟嘌呤，5-甲基氨基甲基尿嘧啶，5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶，β-D-甘露糖queosine，5′-甲氧基羧基甲基尿嘧啶，5-甲氧基尿嘧啶，2-甲硫基-N6-异戊烯腺嘌呤，尿嘧啶-5-氧乙酸(v)，wybutoxosine，假尿苷，queosine，2-硫代胞嘧啶，5-甲基-2-硫尿嘧啶，2-硫尿嘧啶，4-硫尿嘧啶，5-甲基尿嘧啶，尿嘧啶-5-氧乙酸甲基酯，尿嘧啶-5-氧乙酸(v)，5-甲基-2-硫尿嘧啶，3-(3-氨基-3-N-2羧基丙基)尿嘧啶，(acp3)w和2，6-二氨基嘌呤。
在另一个实施方案中，寡核苷酸包含至少一个修饰的糖部分，所述修饰的糖部分选自但不限于阿拉伯糖，2-氟代阿拉伯糖，木酮糖和己糖。
在再一个实施方案中，寡核苷酸包含至少一个修饰的磷酸骨架，所述修饰的磷酸骨架选自硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，硫代氨基磷酸酯，氨基磷酸酯，二氨基磷酸酯，甲基膦酸酯，烷基磷酸三酯和formacetal或其类似物。
在再一个实施方案中，寡核苷酸是2-a-端基异构寡核苷酸。a-端基异构寡核苷酸与互补RNA形成特殊的双链杂合体，其中与常见的B-单元相反，链的走向互相平行(Gautier等，Nucl.Acids Res.，15卷，6625-6641页(1987))。
寡核苷酸可以与另外的分子，例如肽、杂交触发的交联剂、转运剂、杂交触发的切割剂等缀合。
本发明的反义核酸包含与靶RNA物的至少一部分互补的序列。然而，尽管优选完全互补，但是这不是必需的。如这里所提到的“与RNA至少一部分互补”的序列意指有足够能与RNA杂交形成稳定双螺旋的互补性的序列；在双链反义核酸的情况下，可以检测双螺旋DNA的单链，或可以测定三股螺旋的形成。杂交能力将取决于互补性程度和反义核酸长度。一般地，杂交核酸越长，它可以包含越多与靶RNA错配的碱基而仍旧形成稳定双螺旋(或可能情况下，三股螺旋)。通过利用标准程序测定杂交复合物的熔点，本领域技术人员可以确定错配的耐受程度。可以通过标准测定技术确定有效抑制靶RNA翻译的反义核酸量。
可以通过本领域已知的标准方法，例如通过应用(如从Biosearch，Applied Biosystems等商购的)自动DNA合成仪合成本发明寡核苷酸。例如，可以通过Stein等，Nucl.Acids Res.，16卷，3209页(1988)的方法合成硫代磷酸酯寡核苷酸，可以通过可控有孔玻璃聚合物载体的应用制备甲基膦酸酯寡核苷酸(参见，Sarin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85卷，7448-7451页(1988))等)。在另一个实施方案中，寡核苷酸是2’-O-甲基核糖核苷酸(Inoue等，Nucl.Acids Res.，15卷，6131-6148页(1987))，或嵌合RNA-DNA类似物(Inoue等，FEBS Lett.，215卷，327-330页(1987))。
然后可以以可控或饱和方式给细胞施用合成的反义寡核苷酸。例如，可以在细胞生长环境中以可控水平放置反义寡核苷酸，从该环境中细胞可以摄取所述反义寡核苷酸。通过本领域公知方法的应用可以帮助反义寡核苷酸的摄取。
当反义寡核苷酸被引入宿主细胞时，其特异地与相应于基因的细胞mRNA和/或基因组DNA杂交以例如，通过抑制细胞内的转录和/或翻译抑制编码蛋白质的表达。
可以例如，以表达载体的形式递送包含反义核苷酸序列的分离的核酸分子，当在细胞中转录时，其将产生与基因编码的mRNA的至少一个独特部分互补的RNA。可替代地，包含反义核苷酸序列的分离的核酸分子是离体制备的寡核苷酸探针，并且当将它引入细胞时，通过它与该基因的mRNA和/或基因组序列杂交将引起编码蛋白质的表达受抑。
优选地，寡核苷酸含有人工核苷酸间键，其使得反义分子具有对外切核酸酶和内切核酸酶的抗性，因此在细胞中稳定。例如，如在美国专利号5,176,996；5,264,564；和5,256,775所述，修饰的核酸分子用作反义核苷酸序列的例子是DNA的氨基磷酸酯、硫代磷酸酯和甲基膦酸酯类似物。例如，在Van der Krol.，BioTechniques，6卷，958-976页(1988)；和Stein等，Cancer Res.，48卷，2659-2668页(1988)中描述了制备用于反义治疗中的寡聚体的一般方法。
细胞内表达的反义分子如上所述，可以通过各种技术向表达所述基因的细胞体内递送反义核苷酸，所述技术包括例如直接注射反义核苷酸进入乳腺组织位点，在脂质体中包载反义核苷酸，通过连接反义核苷酸和特异性结合细胞表面表达的受体或抗原的肽或抗体而施用靶向乳腺细胞的修饰的反义核苷酸。
然而，利用上述递送方法获得足够抑制内源mRNA翻译的细胞内浓度可能是困难的。因此，在可替代的实施方案中，将包含反义核苷酸序列的核酸置于启动子(即，起始特定基因转录所需的DNA序列)的转录控制之下以形成表达构建体。通过从外源序列转录在细胞内可控地表达本发明的反义核酸。如果控制高水平的表达，那么就会出现饱和干扰和修饰结果。例如，可以体内引入载体，这样细胞将摄取该载体，在细胞内载体或其部分转录产生本发明反义核酸(RNA)。这种载体将含有编码反义核酸的序列。只要载体可以转录产生期望的反义RNA，该载体可以保持游离型或在染色体上整合。可以通过本领域标准重组DNA技术方法构建这种载体。载体可以是质粒，病毒或本领域已知的其它可以用于哺乳动物细胞中复制和表达的载体。可以通过本领域已知的任何启动子起动目的细胞中编码反义RNA的序列的表达。这种启动子可以是诱导型或组成型的。最优选地，启动子可以通过外源部分的施用而控制或诱导，以实现反义寡核苷酸的可控表达。这种可控启动子包括Tet启动子。其它可用于哺乳动物细胞的启动子包括但不限于SV40早期启动子区域(参见，Bernoist和Chambon，Nature，290卷，304-310页(1981))，劳氏肉瘤病毒3’长末端重复含有的启动子(Yamamoto等，Cell，22卷，787-797页(1980))，疱疹病毒胸苷激酶启动子(Wagner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，78卷，1441-1445页(1981))，金属硫蛋白基因调节序列(Brinster等，Nature，296卷，39-42页(1982))等。
因此，可以常规设计反义核酸以实际上靶向任何mRNA序列，可以用编码这种反义序列的核酸常规地转化细胞，或将细胞暴露于编码这种反义序列的核酸，这样可以表达有效和可控或饱和量的反义核酸。因此，可以修饰或干扰细胞中实际上任何RNA种类的翻译。
双链RNA也可以利用对应于至少一种公开基因的双链RNA，即有义-反义RNA干扰至少一种公开基因的表达。已经证明了在各种生物体，如秀丽隐杆线虫(C.elegans)中通过双链RNA可以干扰内源基因的功能和表达，参见如Fire等，Nature，391卷，806-811页(1998)中所述。
RNA适体最后，在再一实施方案中，可以在细胞中引入或表达RNA适体。RNA适体是蛋白质的特异RNA配体，如针对Tat和Rev的RNA(Good等，GeneTherapy，4卷，45-54页(1997))，其能特异地抑制它们的翻译。
修饰表达蛋白质的丰度或活性的方法修饰蛋白质丰度的方法尤其包括改变蛋白质降解速率的方法和利用抗体的方法(抗体结合蛋白质从而影响天然靶蛋白质物的活性或丰度)。直接修饰蛋白质活性的方法尤其包括抗体、显性负突变、特异性药物或化学部分的应用。
增加(或降低)一种蛋白质的降解速率可以降低(或增加)该种蛋白质的丰度。通过应答升高的温度和/或暴露于特定的药物而增加靶蛋白质降解速率的方法是本领域已知的，可以在本发明中利用该方法。例如，一种方法利用了热诱导或药物诱导的N-端degron，其是N-端蛋白质片段，在较高温度(例如37℃)该片段暴露降解信号促进快速蛋白质降解，在较低温度(例如23℃)该片段被隐藏起来以阻止快速降解(参见，Dohmen，Science，263卷，1273-1276页(1994))。这种degron的一个例子是Arg-DHFRts—鼠科二氢叶酸还原酶的变异体，其中在N-末端Arg置换Val并且Leu置换位置66的Pro。根据该方法，可以例如，通过本领域已知的标准基因靶向方法(Lodish等，″Molecular Biology of the cell″，W.H.Freeman和Co.，NY(1995)，特别是第8章)，用编码融合蛋白质Ub-Arg-DHFRts-P(“Ub”代表遍在蛋白，“P”代表靶蛋白)的基因置换靶蛋白质P的基因。N-末端的遍在蛋白在翻译后被快速切割从而暴露出N-末端degron。在较低温度时，不暴露Arg-DHFRts内部的赖氨酸，没有出现融合蛋白质的遍在蛋白化，降解慢，并且活性靶蛋白质水平高。在较高温度(在氨甲喋呤不存在的情况下)，暴露Arg-DHFRts内部的赖氨酸，融合蛋白质出现遍在蛋白化，降解快速，并且活性靶蛋白质水平低。
因为降解的热活化可以通过暴露氨甲喋呤可控地阻断，所以该技术也允许降解速率的可控修饰。该方法适用于对其它诱导因素，如药物和温度变化产生应答的其它N-末端degron。而且，本领域技术人员将理解可以利用结合和抑制靶蛋白质的抗体的表达作为另一个显性负策略。
用小分子药物或配体修饰表达的蛋白质活性此外，可以通过暴露于外源药物或配体，以可控或饱和方式修饰或干扰一些靶蛋白质的活性。因为本发明方法常常应用于试验或证明各种药物对治疗癌症的有用性，所以药物暴露是修饰/干扰细胞组分-mRNA和表达的蛋白质的重要方法。在优选实施方案中，通过药物暴露或基因操作(如基因缺失或剔除)干扰输入细胞组分，并通过基因表达技术(如下述对基因转录物阵列的杂交)测定系统应答。
在一种优选的情况下，已知药物与细胞中仅仅一种靶蛋白质相互作用，并且改变仅仅该一种靶蛋白质的活性，即或者增加活性或者降低该活性。因此，细胞与变化量的该药物的梯度接触将引起对其中该靶蛋白质作为输入物的网络模型的梯度干扰。饱和暴露引起饱和修饰/干扰。例如，环孢菌素A是非常特异的钙调磷酸酶蛋白质的调节剂，其通过亲环蛋白复合起作用。因此可以利用一系列滴度的环孢菌素A产生任何期望强度的钙调磷酸酶蛋白质抑制作用。可替代地，饱和暴露于环孢菌素A将最大程度地抑制钙调磷酸酶蛋白质。
用抗体和拮抗剂修饰蛋白质活性术语“拮抗剂”指当与基因编码的蛋白质结合时可抑制其活性的分子。拮抗剂包括但不限于肽、蛋白质、碳水化合物和小分子。
在特别有用的实施方案中，拮抗剂是对至少一种基因表达的细胞表面蛋白质特异的抗体。用作治疗剂的抗体包括上述抗体。抗体单独可以作为治疗的效应物起作用，或它可以征募其它细胞以实际上实现细胞杀伤。抗体也可以与试剂，如化疗药物，放射性核素，蓖麻毒蛋白A链，霍乱毒素，百日咳毒素等缀合，并且用作定向药剂。可替代地，效应物可以是带有直接或间接与肿瘤靶相互作用的表面分子的淋巴细胞。各种效应细胞包括细胞毒性T细胞和NK细胞。
用在治疗中的抗体-治疗剂缀合物的例子包括，但不限于1)与放射性核素如125I，131I，123I，111In，105Rh，153Sm，67Cu，67Ga，166HO′，177LU，186Re和188Re偶联的抗体，并且可参见如，Goldenberg等，Cancer Res.，41卷，4354-4360页(1981)；Carrasquillo等，Cancer Treat.Rep.，68卷，317-328页(1984)；Zalcberg等，J.Natl.Cancer Inst.，72卷，697-704页(1984)；Jones等，Int.J.Cancer，35卷，715-720页(1985)；Lange等，Surgery，98卷，143-150页(1985)；Kaltovich等，J.Nucl.Med.，27卷，897页(1986)；Order等，Int.J.Radiother.Oncol.Biol.Phys.，8卷，259-261页(1982)；Courtenay-Luck等，Lancet，1卷，1441-1443页(1984)；和Ettinger等，Cancer Treat.Rep.，66卷，289-297页(1982)中所述；2)与药物或生物应答修饰剂，如氨甲喋呤，阿霉素和淋巴因子，如干扰素偶联的抗体，参见例如Chabner等，″Cancer，Principles and Practice of Oncology″，J.B.Lippincott Co.，Philadelphia，PA，1卷，290-328页(1985)；Oldham等，″Principles and Practice of Oncology″，Cancer，J.B.Lippincott Co.，Philadelphia，PA，2卷，2223-2245页(1985)；Deguchi等，Cancer Res.，46卷，43751-43755页(1986)；Deguchi等，Fed.Proc.，44卷，1684页(1985)；Embleton等，Br.J.Cancer，49卷，559-565页(1984)；和Pimm等，CancerImmunol.Immunother.，12卷，125-134页(1982)中所述；3)与毒素偶联的抗体，参见例如Uhr等，″Monoclonal Antibodiesand Cancer″，Academic Press，Inc.，85-98页(1983)；Vitetta等，″Biotechnology and Bio.Frontiers″，P.H.Abelson编辑，73-85页(1984)；和Vitetta等，Science，219卷，pp.644-650页(1983)中所述；4)异功能抗体，例如与另一个抗体偶联或结合的抗体，这样复合物既结合癌也结合效应细胞，例如杀伤细胞如T细胞，参见例如Perez等，J.Exper.Med.，163卷，166-178页(1986)；和Lau等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82卷，8648-8652页(1985)中所述；和5)天然的，即非缀合或非复合的抗体，参见例如，Herlyn等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79卷，4761-4765页(1982)；Schulz等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，80卷，5407-5411页(1983)；Capone等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，80卷，7328-7332页(1983)；Sears等，Cancer Res.，45卷，5910-5913页(1985)；Nepom等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81卷，2864-2867页(1984)；Koprowski等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，81卷，216-219页(1984)；和Houghton等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82卷，1242-1246页(1985)中所述。
偶联抗体或其片段与如上所述治疗剂的方法是本领域公知的，并且在上述参考文献中提供的方法中描述了这些方法。
拮抗剂作为治疗剂的用途在再一个实施方案中，作为治疗乳腺癌治疗剂的拮抗剂可以是一种公开基因编码的蛋白质的抑制剂。例如，通过利用特异的丝氨酸蛋白酶抑制剂可以抑制膜结合的丝氨酸蛋白酶hepsin的活性，而这将以最小的系统毒性阻断恶性乳腺细胞的生长。这种丝氨酸蛋白酶抑制剂是本领域已知的。例如，arotinin是已批准用于降低心肺旁路手术中的血液损失和输血需要的丝氨酸蛋白酶抑制剂，其抑制激肽释放酶和血纤蛋白溶酶，引起参与炎症反应的多系统的抑制(参见，Ann.Thorac.Surg.，71卷，2期，745-754页(2001))。
Maspin(乳房Serpin)是具有抑制乳腺癌肿瘤功能的、与serpin家族有关的新丝氨酸蛋白酶抑制剂(参见Acta.Oncol.，39卷，8期，931-934页(2000))。
凝血酶和因子Xa(fXa)是唯一开发出的小的、有效的、选择性非共价抑制剂的丝氨酸蛋白酶，这些抑制剂最终计划用作药物开发的候选者(在这种情况下，作为抗凝血剂)(参见，Med.Res.Rev.，19卷，2期，179-197页(1999)).。
通过(中和)抗体也可以降低靶蛋白质活性。通过提供对这种抗体的可控或饱和暴露，可以以可控或饱和方式修饰或干扰蛋白质丰度/活性。例如，针对蛋白质表面上适合抗原表位的抗体可以通过聚集靶蛋白质活性形式成为与未聚集野生型形式的野生型比较具有较少或最少活性的复合物而降低靶蛋白质野生型活性形式的丰度，由此间接地降低活性。可替代地，抗体可以通过，例如直接与活性位点相互作用或通过阻断底物接近活性位点，直接降低蛋白质活性。相反地，在一些情况下，(激活)抗体也可以与蛋白质和它们的活性位点相互作用以增加所产生的活性。在任何情况下，均可以(通过将要描述的方法)产生抗特异蛋白质种类的(将要描述的各种类型的)抗体并对它们的效果进行筛选。例如可以测定抗体的效果，选择提高或降低靶蛋白质种类的浓度和/或活性的适合抗体。这种测定包括向细胞引入抗体(参见下文)，并通过本领域已知的标准方法(如免疫测定法)测定野生型靶蛋白质浓度或活性。通过适于靶蛋白质已知活性的测定方法可以测定野生型形式的净活性。
向细胞中引入抗体可以用许多方式将抗体引入细胞，包括，例如显微注射抗体进入细胞(参见，Morgan等，Immunology Today，9卷，84-86页(1988))或转化编码期望抗体的杂交瘤mRNA进入细胞(参见，Burke等，Cell，36卷，847-858页(1984))。在另一技术中，可以人工构建重组抗体并在广泛多种的非淋巴细胞类型中异位地表达以结合靶蛋白质及阻断靶蛋白质活性(Biocca等，Trends in Cell Biology，5卷，248-252页(1995))。优选地，抗体表达受可控启动子如Tet启动子或组成活性启动子(用于产生饱和干扰)控制。第一步是筛选对靶蛋白质具有适当特异性的特定单克隆抗体(参见下文)。然后，将编码选定抗体可变区的序列克隆入各种基因工程化抗体形式，包括，例如完整抗体、Fab片段、Fv片段、单链Fv片段(通过肽接头连接的VH和VL区域)(”ScFv”片段)、diabodies(两个结合在一起的具有不同特异性的ScFv片段)等等(Hayden等，Current Opinion in Immunology，9卷，210-212页(1997))。通过使细胞内表达的各种形式抗体表达为与各种已知细胞内前导序列融合的蛋白质，可以使它们定向进入细胞区室(例如，细胞质、细胞核和线粒体等)(Bradbury等，Antibody Engineerinq，2卷，Borrebaeck编辑，295-361页，IRL Press(1995))。特别地，ScFv形式看似特别适合于细胞质靶向。
各种有用的抗体类型抗体类型包括但不限于多克隆、单克隆、嵌合、单链抗体及Fab片段和Fab表达文库。本领域已知的各种方法可以用于产生靶蛋白质的多克隆抗体。为了产生抗体，可以用靶蛋白质注射免疫各种宿主动物，这种宿主动物包括但不限于家兔、小鼠和大鼠等。可以根据宿主物种，利用各种佐剂增加免疫应答，所述佐剂包括但不限于弗氏(完全和不完全)佐剂、矿物凝胶如氢氧化铝、表面活性物质如溶血卵磷脂、多聚醇、聚阴离子、肽、油乳剂、二硝基苯酚和潜在有用的人用佐剂如卡介菌(BCG)和小型棒状杆菌(Corynebacterium parvum)。
单克隆抗体为了制备指向靶蛋白质的单克隆抗体，可以利用任何可允许培养的连续细胞系生产抗体分子的技术。这种技术包括但不限于Kohler和Milstein，Nature，256卷，495-497页(1975)最初研究开发的杂交瘤技术，trioma技术和人B细胞杂交瘤技术(参见，Kozbor等，Immunology Today，4卷，72页(1983))，和产生人单克隆抗体的EBV杂交瘤技术(Cole等，″MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy″，Alan R.Liss，Inc.，77-96页(1985))。在本发明其它实施方案中，可以利用最近的技术在无菌动物中产生单克隆抗体(PCT/US90/02545)。根据本发明，可以利用人抗体，并且可以通过利用人杂交瘤(参见，Cote等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，80卷，2026-2030页(1983))或通过用EBV病毒体外转化人B细胞(参见，Cole等，″MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy″，Alan R.Liss，Inc.，77-96页(1985))获得人抗体。实际上，根据本发明，可以利用开发的“嵌合抗体”产生技术，该技术通过将对靶蛋白质特异的小鼠抗体分子的基因和具适当生物学活性的人抗体分子的基因拼接在一起实施(参见Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81卷，6851-6855页(1984)；Neuberger等，Nature，312卷，604-608页(1984)；Takeda等，Nature，314卷，452-454页(1985))；这种抗体在本发明范围内。
此外，当单克隆抗体是有利的时，备选地可以用噬菌体展示技术从大抗体文库选择它们(参见，Marks等，J.Biol.Chem.，267卷，16007-16010页(1992))。利用该技术，已在fd丝状噬菌体表面表达了多达1012个不同抗体的文库，产生可用于单克隆抗体筛选的“单罐”体外抗体免疫系统(参见，Griffiths等，EMBO J.，13卷，3245-3260页(1994))。可以通过本领域已知的技术，包括让噬菌体接触固定的靶蛋白质、筛选和克隆结合靶的噬菌体并将编码抗体可变区的序列亚克隆入表达期望抗体形式的适合载体中，从这种文库中筛选抗体。
根据本发明，可以适应性修改美国专利号4,946,778所述的单链抗体产生技术以产生对靶蛋白质特异的单链抗体。本发明的其它实施方案利用了Fab表达文库构建技术(参见，Huse等，Science，246卷，1275-1281页(1989))以允许快速和简便地鉴定对靶蛋白质具有期望特异性的单克隆Fab片段。
可以通过本领域已知的技术产生包含独特型的靶蛋白质的抗体片段。例如，这种片段包括但不限于可以通过胃蛋白酶消化抗体分子产生的F(ab’)2片段；可以通过还原F(ab’)2片段的二硫桥产生的Fab’片段；可以通过用木瓜蛋白酶和还原剂处理抗体分子产生的Fab片段和Fv片段。
在抗体产生中，可以通过本领域已知的技术，例如ELISA完成期望抗体的筛选。为了筛选对靶蛋白质特异的抗体，可以测定产生的杂交瘤或噬菌体展示抗体库以寻找能结合靶蛋白质的抗体。
修饰蛋白质活性的其它方法显性负突变是当在细胞中表达时可破坏靶蛋白质物活性的内源基因突变或外源基因突变体。根据靶蛋白质的结构和活性，存在选择构建显性负突变适当策略的一般指导原则，所述显性负突变将破坏靶活性(参见，Hershkowitz，Nature，329卷，219-222页(1987))。在活性单体形式的情况下，失活形式的超表达可以引起足以显著地降低靶蛋白质净活性的对天然底物或配体的竞争。通过，例如连接具有增加活性的启动子，优选可控或诱导型启动子，或组成型表达启动子和突变体基因可以实现这种超表达。可替代地，可以进行对活性位点残基的改变，从而造成与靶配体实际上不可逆转的连接。这可以通过小心置换活性位点的丝氨酸残基，用某些酪氨酸激酶实现(参见，Perlmutter等，Current Opinion in Immunology，8卷，285-290页(1996))。
在活性多亚基形式的情况下，有几种策略可以指导对显性负突变体的选择。通过表达编码外源蛋白质片段的基因可以以可控或饱和方式降低多亚基的活性，所述外源蛋白质片段能结合多亚基关联结构域并且阻止多聚体形成。可替代地，特定类型失活蛋白质单元的可控或饱和超表达可以将野生型活性单元束缚在失活多聚体中，因此降低多聚体活性(参见，Nocka等，EMBO J.，9卷，1805-1813页(1990))。例如，在二聚体DNA结合蛋白质的情况下，可以从DNA结合单元中缺失DNA结合结构域，或者从活化单元中缺失活化结构域。而且，在这种情况下，可以表达这样的DNA结合结构域单元，该结构域单元没有引起与活化单元结合的结构域。因此，占用DNA结合位点，而没有任何可能激活表达。
对于在活性期间特定类型的单元正常将进行构象变化的情况，刚性单元的表达可以失活由此得到的复合物。再例如，参与细胞机制，如细胞运动、有丝分裂过程、细胞构建等的蛋白质通常是由许多属于几种类型的亚基相结合而组成。这些结构对将几种具有结构缺陷的单体单元包括在内的破坏常常高度敏感。这种突变单体将破坏相关蛋白质活性，可以在细胞内以可控或饱和方式表达。
除了显性负突变外，通过本领域公知的诱变和筛选方法可以发现对温度(或其它外源因子)敏感的突变靶蛋白质。
治疗形式在用反义核苷酸治疗的情况下，该方法包括给予治疗有效量的分离的核酸分子，该分离的核酸分子包含来源于表1，2，3或4中鉴定的至少一种基因的反义核苷酸序列，其中该反义核苷酸有改变所述至少一种基因的转录/翻译的能力。术语“分离的”核酸分子意指从其原始环境中(例如，当核酸分子为天然的，则为天然环境)移出的核酸分子。例如，天然存在的核酸分子不是分离的，但是对于从天然系统中的一些或所有共存物质中分离出的相同核酸分子，即使其随后再将被引入该天然系统，其也是分离的。这种核酸分子可以是载体的一部分或组合物的一部分，并且仍旧是分离的，因为这种载体或组合物不是核酸分子的天然环境的一部分。
在用核酶或双链RNA分子治疗的方面，该方法包括给予治疗有效量的编码核酶的核苷酸序列或双链RNA分子，其中编码核酶的核苷酸序列/双链RNA分子有改变所述至少一种基因的转录/翻译的能力。
在用拮抗剂治疗的情况下，该方法包括给予患者治疗有效量的拮抗剂，该拮抗剂能抑制或激活表1，2，3或4中鉴定的至少一种基因所编码的蛋白质。
包含反义核苷酸的分离核酸分子、编码核酶的核苷酸序列、双链RNA或拮抗剂的“治疗有效量”是指这些治疗剂之一足以治疗乳腺癌(例如限制乳腺癌生长或延缓或阻止肿瘤转移)的量。治疗有效量的确定在本领域技术人员的能力范围内。对于任何治疗而言，可以在例如赘生性细胞的细胞培养物中或者在动物模型，通常是小鼠、兔，狗或猪中最初测估治疗有效剂量。也可以用动物模型确定给药的适合浓度范围和途径。然后可以利用这些信息确定人类给药时的有用剂量和途径。
可以通过标准药理学方法，在细胞培养物或实验动物中测定治疗效力和毒性，例如ED50(在50％群体中治疗有效的剂量)和LD50(造成群体50％致死的剂量)。毒性作用和治疗作用间的剂量比率是治疗指数，并且其可以表示为比率LD50/ED50。优选显示大治疗指数的反义核苷酸、核酶、双链RNA和拮抗剂。在制定人用剂量范围时可以利用从细胞培养物测定和动物研究获得的数据。在这种组合物中含有的剂量优选在如下循环浓度范围内，该循环浓度范围包括几乎没有或完全没有毒性的ED50。根据所用的剂量形式、患者的敏感性和给药途径，剂量可在该范围内变化。
根据与需要治疗的患者相关的因素，医师可以确定确切的剂量。可以调整剂量和给药方案以提供足够水平的活性部分或维持期望的效果。可能考虑的因素包括患者疾病状态的严重性、总的健康、患者的年龄、体重和性别、饮食、给药时间和频率、药物联合、反应敏感性和对治疗的耐受性/应答。
根据给药途径，正常的剂量可以从0.1到100,000微克，直到约1g的总剂量。在文献中提供了关于特定剂量和递送方法的指导，并且本领域的从业者一般可以获得该指导。本领域技术人员将对核苷酸和拮抗剂使用不同的制剂。
对于治疗应用，优选反义核苷酸、编码核酶的核苷酸序列、双链RNA(无论在脂质体中包载还是包含在病毒载体中)和抗体作为药物组合物给药，该药物组合物将含有一种或多种药学上可接受的载体以及所述治疗剂。可以单独给予该组合物或与至少一种其它药剂，如稳定化合物联合给药；可以在任何无菌、生物相容的药物载体，包括但不限于盐水，缓冲盐水，葡萄糖和水中施用该组合物。可以单独给予患者该组合物，或者还给予患者其它药剂、药物或激素。
可以通过多种途径，包括但不限于口服，静脉内，肌内，关节内，动脉内，髓内，鞘内，心室内，透皮，皮下，腹膜内，鼻内，肠道，局部，舌下或直肠方式给予药物组合物。除了活性组分外，这些药物组合物可以含有适宜的药学上可接受的载体，包括有利于将活性化合物加工为药学上可利用的制剂的赋形剂和助剂。可以在最近版本的“Remington’sPharmaceutical Sciences”，Maack Publishing Co.，Easton，PA.中发现关于制剂和给药技术的更多细节。
利用本领域公知的适于口服给药的药学上可接受的载体，可以配制备口服给药的药物组合物。这种载体使得药物组合物可以配制成可被患者消化的片剂，丸剂，糖衣丸，胶囊，液体，凝胶，糖浆，浆液，悬浮液等。
通过如下方式可以获得口服用的药物制剂混合活性化合物和固体赋形剂，可选地，研磨由此得到的混合物，并加工颗粒混合物(如果期望，在添加适宜助剂后)，获得片剂或糖衣丸芯。适宜的赋形剂是碳水化合物或蛋白质填充剂，如糖，包括乳糖，蔗糖、甘露醇或山梨糖醇；来源于玉米、小麦、水稻、马铃薯或其它植物的淀粉；纤维素，如甲基纤维素，羟丙基甲基纤维素或者羧甲基纤维素钠；树胶如阿拉伯胶和黄蓍胶；和蛋白质如明胶和胶原蛋白。如果期望，可以添加崩解剂或稳定剂，如交联的聚乙烯吡咯烷酮，琼脂，海藻酸或其盐，如海藻酸钠。
糖衣丸芯可以与适合的包衣，如浓缩的糖溶液联合使用，其也可以含有阿拉伯胶，滑石，聚乙烯吡咯烷酮，聚羰乙烯凝胶，聚乙二醇和/或二氧化钛，紫胶漆溶液和适合的有机溶剂或溶剂混合物。可以向片剂或糖衣丸包衣中添加着色剂或色素用于产品鉴定或表征活性化合物的量，如剂量。
可以口服使用的药物制剂包括明胶制成的推入填充(push-fit)胶囊及由明胶和包衣如甘油或山梨醇制成的软密封胶囊。推入填充(push-fit)契合胶囊可以含有与填充剂或粘合剂如乳糖或淀粉，润滑剂如滑石或硬脂酸镁和可选地稳定剂混合的活性组分。在软胶囊中，可以在有或无稳定剂的适合液体，如脂肪油、液体或液体聚乙二醇中溶解或悬浮活性化合物。
可以在水溶液中，优选生理学上相容的缓冲液，如Hank’s溶液、Ringer’s溶液或生理缓冲盐水中制备适于肠胃外给药的药物制剂。水性注射悬浮液可以含有增加悬浮液粘度的物质，如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖。此外，可以将活性化合物的悬浮液制备为适合的油性注射悬浮液。适合的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油如芝麻油、或合成脂肪酸酯如油酸乙酯或甘油三酯、或脂质体。非脂质多聚阳离子(polycatonic)氨基聚合物也可以用于递送。可选地，悬浮液也可以包含适合的稳定剂或增加化合物溶解性的试剂以允许高浓缩溶液的制备。
对于局部或鼻给药，可在制剂中利用适于待渗透的特定屏障的渗透剂。这种渗透剂通常在本领域是已知的。
可以用本领域已知的方法制造本发明的药物组合物，例如传统的混合，溶解，粒化，制成糖衣丸，研磨，乳化，包封，截留(entrap)或冻干过程。
药物组合物可以作为盐提供，可以用许多酸，包括但不限于盐酸、硫酸、乙酸、乳酸、酒石酸、苹果酸和琥珀酸等来成盐。盐在水性或其它质子溶剂中比相应的游离碱形式倾向于更容易溶解。在其它情况下，优选的制剂可以是冻干粉末，该冻干粉末可以含有下列任一项或所有1-50mM组氨酸、0.1-2％蔗糖和2-7％甘露醇，pH4.5-5.5，使用前将粉末和缓冲液混合。
制备药物组合物后，可以将它们放置在适合容器中并标记上其用于治疗的适应症。对于反义核苷酸或拮抗剂的施用，这种标记将包括用量、频率和给药方法。本领域技术人员将对反义核苷酸和拮抗剂，例如抗体或抑制剂使用不同制剂。例如，在美国专利号5,008,114；5,505,962；5,641,515；5,681,811；5,700,486；5,766,633；5,792,451；5,853,748；5,972,387；5,976,569；和6,051,561中描述了适于蛋白质口服给药的药物制剂。
在另一方面，可以通过检测至少一种公开基因编码的mRNA或蛋白质的表达水平，或至少一种公开基因编码的蛋白质的活性，监测用如上所述治疗剂进行的患者治疗。这些测定将表明是否治疗是有效的或是否应该调整或优化该治疗。因此，在临床试验期间，这里描述的一种或多种基因可以用作药物效力的标志物。
在特别有用的实施方案中，提供了监测药剂(如拮抗剂、蛋白质、核酸、小分子或其它治疗剂或通过本文所述筛选方法鉴定的候选药剂)对患乳腺癌或有患乳腺癌危险的患者的治疗效力的方法，包括a)在药剂施用前从患者获得给药前的样品；b)检测给药前样品中由至少一种所述基因编码的mRNA或蛋白质的表达水平或由至少一种所述基因编码的蛋白质的活性；c)从患者获得一个或多个给药后的样品；d)检测给药后样品中由所述至少一种基因编码的mRNA或蛋白质的表达水平或由所述至少一种基因编码的蛋白质的活性；e)将给药前样品中由所述至少一种基因编码的mRNA或蛋白质的表达水平或由所述至少一种基因编码的蛋白质的活性和一个或多个给药后样品中由该至少一种基因编码的mRNA或蛋白质的表达水平或由该至少一种基因编码的蛋白质的活性作比较；和f)相应地调整药剂的给药。
例如，可能期望增加药剂给药以改变所述至少一种基因的表达水平或活性使之比检测到的水平高或低，即增加药剂的有效性。可替代地，可能期望减少药剂给药以改变所述至少一种基因的表达使之比检测到的水平高或低，即降低药剂的有效性。
在另一方面，提供了抑制患者中乳腺癌组织增生的方法，该方法利用了上述治疗剂，例如反义核苷酸、核酶、双链RNA和拮抗剂如抗体。在利用反义核苷酸抑制乳腺癌组织增生的方面，该方法包括给患者施用治疗有效量的分离的核酸分子，该核酸分子包含来源于表1，2，3或4中鉴定的至少一种基因的反义核苷酸序列，其中该反义核苷酸有改变所述至少一种基因的转录/翻译的能力。
在利用核酶抑制乳腺癌组织增生的方面，该方法包括给患者施用治疗有效量的编码核酶的核苷酸序列，该编码核酶的核苷酸序列有改变表1，2，3或4中鉴定的至少一种基因的转录/翻译的能力。
在利用双链RNA抑制乳腺癌组织增生的方面，该方法包括给患者施用治疗有效量的对应于表1，2，3或4中鉴定的至少一种基因的双链RNA，其中双链RNA有改变所述至少一种基因的转录/翻译的能力。
在利用拮抗剂抑制乳腺癌组织增生的方面，该方法包括给患者施用治疗有效量的拮抗剂，该拮抗剂可以引起表1，2，3或4中鉴定的至少一种基因所编码的蛋白质的抑制或活化。
在抑制乳腺癌组织增生的情况下，包含反义核苷酸的分离的核酸分子、编码核酶的核苷酸序列、双链RNA或拮抗剂的“治疗有效量”指这些治疗药剂之一足以抑制乳腺癌组织增生(例如，抑制或稳定乳腺癌组织的细胞生长)的量，并且可以如上所述测定。
病毒载体的用途在另一个方面，提供了包含如下基因启动子的病毒载体，该基因选自表1，2，3或4中鉴定的至少一种基因，其中所述启动子可操作地连接载体复制所必需的基因编码区，其中该载体适应于在转染进入乳腺细胞后进行复制。
这种载体能在乳腺组织中而不在非乳腺组织中选择性复制。复制是以乳腺组织中存在阳性转录因子而非乳腺组织中不存在该阳性转录因子为条件的，该阳性转录因子将激活公开基因的启动子。由于缺乏正常地出现在非乳腺组织中阻止启动子转录的转录抑制因子，也可以出现复制。因此，当转录发生时，它继续进入复制必需的基因，因此，在乳腺组织中而不在非乳腺组织中出现载体的复制和其伴随的功能。利用该载体可以选择性治疗患病的乳腺组织，例如乳腺肿瘤，而具有最小的系统毒性。
在一个实施方案中，病毒载体是腺病毒载体，其包含载体复制所必需的基因编码区，其中编码区选自E1a，E1b，E2和E4编码区。制备这种载体的方法对本领域普通技术人员是公知的，参见例如，Sambrook等，″Molecular CloningA Laboratory Manual″，Cold Spring Harbor，NY(1989)所述。
在再一实施方案中，载体编码异源基因产物，该异源基因产物将在乳腺细胞中从该载体表达。异源基因产物提供了对患病乳腺组织，例如乳腺肿瘤生长的抑制、阻止或破坏作用。
基因产物可以是RNA，例如反义RNA或核酶，或蛋白质，如细胞因子，例如白细胞介素，干扰素或毒素如白喉毒素、假单胞菌毒素等。异源基因产物也可以是负选择性标志物如胞嘧啶脱氨酶。这种负选择性标志物可以与其它药剂相互作用以阻止、抑制或破坏患病乳腺细胞的生长。
可以将本发明的载体转染进入用于病毒复制和产生感染性病毒颗粒的辅助细胞系。可替代地，可以通过电穿孔、磷酸钙沉淀，显微注射或通过蛋白脂质体(Proteoliposome)将载体转染进入乳腺细胞。在例如美国专利号5,998,205中详细描述了制备组织特异性复制载体的方法和它们在肿瘤细胞和其它类型异常细胞治疗中的用途，所述肿瘤细胞和其它类型异常细胞在患者体内是有害的或者是不希望的。
作为标志物的核酸和蛋白质的检测在特别实施方案中，利用本领域已知的方法，通过在生物样品中以原位和体外的方式检测对应于标志物的mRNA的水平。术语“生物样品”意指包括从患者分离的组织、细胞、生物液体和其分离物以及患者体内存在的组织、细胞和液体。许多表达检测方法利用分离的RNA。对于体外方法，任何不会选择性地抵抗mRNA分离的RNA分离技术都可以用于乳腺细胞RNA的纯化(参见，例如Ausubel等编辑，″Current Protocols in MolecularBiology″，John Wiley & Sons，NY(1987-1999))。此外，利用本领域技术人员公知的技术，如，Chomczynski，美国专利号4,843,155(1989)的单步RNA分离方法可以容易地处理大量的组织样品。
分离的mRNA可以用在杂交或扩增测定中，所述测定包括但不限于Southern或Northern分析，聚合酶链式反应分析和探针测定。一种优选的用于mRNA水平检测的诊断方法包括使分离的mRNA和核酸分子(探针)接触，该核酸分子能与待检测基因编码的mRNA杂交。核酸探针可以是，例如全长cDNA或其部分，如长至少7，15，30，50，100，250或500个核苷酸并且在严格条件下足以特异性地与编码本发明标志物的mRNA或基因组DNA杂交的寡核苷酸。这里还描述了其它适用在本发明诊断测定中的适合探针。mRNA与探针的杂交表明正在表达所述标志物。
在一种形式中，通过例如在琼脂糖凝胶上电泳分离的mRNA，然后从凝胶转移mRNA到膜，如硝酸纤维素膜上，固定mRNA在固相载体上并与探针接触。在可替代形式中，例如在Affymetrix基因芯片阵列中，固定探针在固相载体上，并使mRNA与探针接触。本领域技术人员可以容易地修改已知的mRNA检测方法以用在检测本发明标志物编码的mRNA的水平中。
用于检测样品中对应于本发明标志物的mRNA水平的可替代方法涉及核酸扩增过程，例如，通过rtPCR(见Mullis，美国专利号4,683,202(1987)中所述的实验实施方案)；连接酶链式反应(Barany，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88卷，189-193页(1991))；自动维持序列复制(Guatelli等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87卷，1874-1878页(1990))；转录扩增系统(Kwoh等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86卷，1173-1177页(1989))；Q-β复制酶(Lizardi等，Bio/Technology，6卷，1197页(1988))；滚环复制(Lizardi等，美国专利号5,854,033(1988))；或任何其它核酸扩增方法进行的核酸扩增过程，接着利用本领域技术人员公知的技术检测扩增的分子。如果核酸分子以非常低的数量出现，这些检测方案对于这种核酸分子的检测特别有用。如这里所用，扩增引物定义为能与基因(分别是正和负链，或反之亦然)5’或3’区域退火的一对核酸分子，在两者间含有短区域。一般地，扩增引物约是10-30个核苷酸长度，并且侧翼为约50-200个核苷酸长度的区域。在适合的条件和具有适合试剂的情况下，这种引物允许包含引物所包围的核苷酸序列的核酸分子扩增。
对于原位方法，检测前不需要从乳腺细胞分离mRNA。在这种方法中，用已知的组织学方法制备/处理细胞或组织样品。然后在载体，通常是载玻片上固定样品，然后与探针接触，该探针可以与编码标志物的mRNA杂交。
作为基于标志物的绝对表达水平进行检测的替代方案，可以基于标志物的标化表达水平进行检测。通过比较标志物的表达和不是标志物的基因，例如组成表达的持家基因的表达修正标志物的绝对表达水平来标准化表达水平。用于标准化的适合基因包括持家基因如肌动蛋白基因或上皮细胞特异的基因。该标准化允许一个样品，例如患者样品中的表达水平与另一个样品，例如非乳腺癌样品中的表达水平进行比较，或允许在不同来源的样品间进行比较。
可替代地，可以以相对表达水平的形式提供表达水平。为了确定标志物的相对表达水平，在检测所述样品的表达水平前，检测10个或更多，优选50个或更多个正常的和癌细胞的分离物样品的标志物表达水平。确定在大量样品中测定的每个基因的平均表达水平，并且用这个作为标志物的基线表达水平。然后用测定的试验样品的标志物表达水平(绝对表达水平)除以针对该标志物获得的平均表达值。这提供了相对表达水平。
优选地，用在基线测定中的样品将来源于乳腺癌或者来源于乳腺组织的非乳腺癌细胞。细胞来源的选择取决于相对表达水平的应用。利用正常组织中的表达作为平均表达分数可以有助于验证是否测定的标志物是乳腺特异的(相对于正常细胞)。此外，随着更多数据的积累，可以修正平均表达值，根据积累的数据提供改进的相对表达值。来自乳腺细胞的表达数据提供了分级乳腺癌状态严重性的手段。
在本发明另一个实施方案中，检测对应于标志物的多肽。检测本发明多肽的优选试剂是能结合本发明标志物对应的多肽的抗体，优选具有可检测标记的抗体。抗体可以是多克隆，或更优选地单克隆抗体。可以利用完整的抗体，或其片段(例如Fab或F(ab’)2)。涉及探针或抗体的术语“标记的”意在包括通过偶联(即，物理结合)可检测的物质到探针或抗体上对探针或抗体直接标记，及通过与直接标记的另一种试剂反应对探针或抗体间接标记。间接标记的例子包括利用荧光标记的第二抗体检测第一抗体，和用荧光标记的链霉抗生物素蛋白检测生物素末端标记的DNA探针。
利用本领域技术人员公知的技术可以从乳腺细胞分离蛋白质。可以使用，例如，在Harlow和Lane，″AntibodiesA Laboratory Manual″，Harlow和Lane，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(1988)中所述的蛋白质分离方法。
可以利用各种形式检测是否样品含有结合给定抗体的蛋白质。这些形式的例子包括但不限于酶免疫测定法(EIA)；放射性免疫测定法(RIA)，Western印迹分析和ELISA。本领域技术人员可以容易地修改已知的蛋白质/抗体检测方法以用在检测是否乳腺细胞表达本发明标志物的方法中。
在一种形式中，抗体或抗体片段可以用在方法，如Western印迹或免疫荧光技术中以检测表达的蛋白质。在这种应用中，一般优选在固相支持体上固定抗体或蛋白质。适合的固相支持体或载体包括能结合抗原或抗体的任何支持体。公知的支持体或载体包括玻璃，聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龙、直链淀粉、天然和改性的纤维素、聚丙烯酰胺、辉长岩和磁铁矿。
本领域技术人员知道许多其它的用于结合抗体或抗原的适合载体，并且可以适应性修改这种支持体以与本发明一起使用。例如，从乳腺细胞分离的蛋白质可以在聚丙烯酰胺凝胶上电泳，并且固定在固相支持体如硝酸纤维素上。然后用适合的缓冲液洗支持体，接着用可检测标记的抗体处理。然后可以用缓冲液二次洗涤固相支持以除去未结合的抗体。然后可以通过常规方法检测固相支持体上结合的标记量。
本发明也包括用于检测生物样品(例如，乳腺相关体液、血清、血浆、淋巴、胆囊液体、尿、粪便、CSF、腹水或血液)中对应于本发明标志物的多肽或核酸存在的试剂盒。这种试剂盒可以用于检测是否患者患有乳腺癌，或者处在患有乳腺癌的增加危险中。例如，该试剂盒可以包含能够检测生物样品中对应于本发明标志物的多肽或编码多肽的mRNA的标记化合物或试剂，和测定样品中多肽或mRNA量的手段(例如，结合多肽的抗体或结合编码多肽的DNA或mRNA的寡核苷酸探针)。试剂盒也可以包含解释用该试剂盒所得结果的说明书。
对于基于抗体的试剂盒，试剂盒可以包括，例如1)能结合对应于本发明标志物的多肽的第一抗体(例如，与固相支持体连接)，和可选地2)第二不同的抗体，该第二抗体可以结合多肽或第一抗体并且与可检测标记缀合。
对于基于寡核苷酸的试剂盒，该试剂盒可以包含，例如1)可与编码对应于本发明标志物的多肽的核酸序列杂交的寡核苷酸，例如可检测标记的寡核苷酸；或者2)一对可用于扩增对应于本发明标志物的核酸分子的引物。该试剂盒也可以包含，例如缓冲剂、防腐剂或蛋白质稳定剂。试剂盒可以进一步包含检测可检测标记所必需的组分(例如酶或底物)。试剂盒也可以包含对照样品或系列对照样品，可以测定这些对照样品并且与试验样品比较。
试剂盒的每种组分可以装在单独的容器中，并且所有的这各种容器可以与解释该试剂盒的测定结果的说明书一起包在单个包装中。
监测临床试验监测试剂(例如药物组合物)对本发明标志物表达水平的影响不仅可以应用在基本药物筛选中，也可以应用在临床试验中。例如，可以在接受乳腺癌治疗的患者的临床试验中监测试剂影响标志物表达的有效性。在优选实施方案中，本发明提供了监测用药剂(例如激动剂、拮抗剂和多肽模拟、蛋白质、肽、核酸、小分子或者其它药物候选物)治疗患者的有效性的方法，包括下面步骤(i)在施用药剂前，从患者获得给药前样品；(ii)检测给药前样品中一种或多种选定的本发明标志物的表达水平；(iii)从患者获得一个或多个给药后样品；(iv)检测给药后样品中该标志物的表达水平；(v)将给药前样品中的标志物表达水平和一个或多个给药后样品中的标志物表达水平进行比较；和(vi)相应地改变患者的药剂施用方案；例如，可能期望增加药剂给药以增加标志物的表达使其高于检测到的水平，即增加药剂的有效性。可替代地，可能期望减少药试剂给药以降低药剂的有效性。
实验方案扣除文库和制作转录物谱利用基于PCR的方法产生扣除文库，该方法允许分离出在一个mRNA群(测试者)中比在另一个群(驱动者)中以较高水平表达的克隆。通过反转录将测试者和驱动者mRNA群转换为cDNA，然后用Clontech的SMARTTMPCR试剂盒进行PCR扩增。然后用Clontech的PCR-选择cDNA扣除试剂盒使测试者和驱动者的cDNA杂交。该技术导致扣除和标准化，即，使低丰度和高丰度序列的拷贝数均衡化。扣除文库产生后，用反相Southern杂交检测每个文库的一组96个或更多个克隆以证实差异表达。
对于通过上述扣除文库杂交技术鉴定的本发明标志物，扣除文库的“测试者”来源由从3种乳腺癌(从人患者获得的)组织样品或者从乳腺癌细胞系产生的cDNA组成。扣除文库的“驱动者”来源由从非癌性乳腺组织细胞产生的cDNA组成。
对于转录物谱，利用与样品数据库连接的机器人网格系统，通过在尼龙膜上点上纯化的PCR产物制备尼龙阵列。在每个尼龙滤膜上可以点上几千个克隆。
利用来自(肿瘤和正常的)临床样品和细胞系的RNA或DNA杂交尼龙阵列。该RNA或DNA利用体外反转录反应标记，该体外反转录反应包含可以在反应期间掺入的放射性标记核苷酸。可替代地，通过反转录将mRNA转化为cDNA，然后利用Clontech的SMART PCR试剂盒进行PCR扩增。通过在杂交室中将标记的RNA或DNA样品与尼龙滤膜混合进行杂交试验。进行两份重复的独立杂交试验以产生转录谱数据(参见，NatureGenetics，21卷(1999))。
引用的参考文献在这里为了所有目的整体并入本文引用的所有文献为参考文献，并且这种并入就等同于详细和单独地指明为所有目的整体并入每篇出版物或专利或专利申请为参考文献一样，此外，为了所有目的这里整体并入本文中引用的所有GenBank登录号、单基因簇号和蛋白质登录号作为参考，并且这种并入等同于为所有目的详细和单独地指明整体并入每个这种编号作为参考一样。
本发明不限于本申请描述的特定实施方案，这些特定实施方案旨在作为本发明各方面的单个举例说明。可以对本发明进行许多修改和变动，而不背离本发明的精神和范围，这对本领域技术人员将是显而易见的。除了这里列举的方法和仪器外，从前述描述和附图
中，本领域技术人员将明了功能性等同方法和仪器亦在本发明范围内。这种修改和变动旨在落入所附权利要求的范围内。本发明仅受限于所附的权利要求及该权利要求所涵盖的等同物的全部范围。
权利要求
1.一种筛选乳腺癌患病对象以预测所述乳腺癌对内分泌治疗的应答的方法，包括a)检测获自对象的乳腺肿瘤活检组织中对应于基因NOVA1的mRNA表达水平，以获得第一值；b)检测获自其肿瘤对内分泌治疗产生应答的患者的乳腺肿瘤活检组织中对应于基因NOVA1的mRNA表达水平，以获得第二值；c)检测获自其肿瘤对内分泌治疗不产生应答的患者的乳腺肿瘤活检组织中对应于基因NOVA1的mRNA表达水平，以获得第三值；和d)比较第一值与第二和第三值，其中第一值与第二值相似并且比第三值高预示对象的肿瘤将对内分泌治疗产生应答；而其中第一值比第二值小并且与第三值相似表明对象对内分泌治疗将不产生应答。
2.一种筛选乳腺癌患病对象以预测所述乳腺癌对内分泌治疗的应答的方法，包括a)检测获自对象的乳腺肿瘤活检组织中对应于基因IGHG3的mRNA表达水平，以获得第一值；b)检测获自其肿瘤对内分泌治疗产生应答的患者的乳腺肿瘤活检组织中对应于基因IGHG3的mRNA表达水平，以获得第二值；c)检测获自其肿瘤对内分泌治疗不产生应答的患者的乳腺肿瘤活检组织中对应于基因IGHG3的mRNA表达水平，以获得第三值；d)比较第一值与第二和第三值，其中第一值与第二值相似并且比第三值高预示对象的肿瘤将对内分泌治疗产生应答；而其中第一值比第二值小并且与第三值相似表明对象对内分泌治疗将不产生应答。
3.一种筛选乳腺癌患病对象以预测所述乳腺癌对内分泌治疗的应答的方法，包括a)检测获自对象的乳腺肿瘤活检组织中对应于至少一种表3中鉴定的基因的mRNA表达水平，以获得第一值；b)检测获自其肿瘤对内分泌治疗产生应答的患者的乳腺肿瘤活检组织中对应于a)中所述至少一种鉴定的基因的mRNA表达水平，以获得第二值；c)检测获自其肿瘤对内分泌治疗不产生应答的患者的乳腺肿瘤活检组织中对应于a)中所述至少一种鉴定的基因的mRNA表达水平，以获得第三值；d)比较第一值与第二和第三值，其中第一值与第二值相似并且比第三值高预示对象的肿瘤将对内分泌治疗产生应答；而其中第一值比第二值小并且与第三值相似表明对象对内分泌治疗将不产生应答。
4.一种筛选乳腺癌患病对象以预测所述乳腺癌对内分泌治疗的应答的方法，包括a)检测获自对象的乳腺肿瘤活检组织中对应于至少一种表4中鉴定的基因的mRNA表达水平，以获得第一值；b)检测获自其肿瘤对内分泌治疗产生应答的患者的乳腺肿瘤活检组织中对应于a)中所述至少一种鉴定的基因的mRNA表达水平，以获得第二值；c)检测获自其肿瘤对内分泌治疗不产生应答的患者的乳腺肿瘤活检组织中对应于a)中所述至少一种鉴定的基因的mRNA表达水平，以获得第三值；d)比较第一值与第二和第三值，其中第一值与第二值相似并且比第三值低预示对象的肿瘤将对内分泌治疗产生应答；而其中第一值与第三值相似并且比第二值高预示对象的肿瘤对内分泌治疗将不产生应答。
5.一种治疗乳腺癌的方法，包括给需要这种治疗的患者施用可以调节表1、2、3或4中所示的一种或多种基因或这些基因的基因产物的合成、表达或活性的化合物，以改善至少一种乳腺癌症状。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述基因选自非电压门控钠通道1α(SCNN1A)；丝氨酸或半胱氨酸蛋白酶抑制剂进化枝A成员3(SERPINA3)；N-酰基鞘氨醇酰胺水解酶(ASAH)；lipocalin 1(LCN1)；转化生长因子-β的III型受体(TGFBR3)；谷氨酸受体前体2(GRIA2)和苯巴比妥诱导的细胞色素P450的IIB亚族(CYP2B)、AZGP1、NOVA1和IGHG3。
7.如权利要求5所述的方法，其中所述基因产物选自如下基因表达的蛋白质非电压门控钠通道1α(SCNN1A)；丝氨酸或半胱氨酸蛋白酶抑制剂；进化枝A成员3(SERPINA3)；N-酰基鞘氨醇酰胺水解酶(ASAH)；Lipocalin 1(LCN1)；转化生长因子-β的III型受体(TGFBR3)；谷氨酸受体前体2(GRIA2)和苯巴比妥诱导的细胞色素P450的IIB亚族(CYP2B)、AZGP1、NOVA1和IGHG3。
8.一种确定乳腺肿瘤对基于内分泌的治疗是否将产生应答的方法，包括a)检验乳腺肿瘤组织样品中对应于至少一种表1、2、3或4中鉴定的基因的mRNA表达水平，以提供第一值；b)检测获自非患病个体的乳腺组织样品中对应于至少一种表1、2、3或4中鉴定的基因的mRNA表达水平，以提供第二值；和c)比较第一值与第二值，其中第一值比第二值高表明患有乳腺肿瘤的个体对基于内分泌的治疗将产生应答。
9.一种确定对象的乳腺癌是否将对基于内分泌的治疗产生应答的方法，包括a)检测获自对象的患病样品中NOVA1基因的基因表达产物的表达水平，以获得第一值；b)检测获自其肿瘤对内分泌治疗产生应答的患者的患病样品中NOVA1基因的基因表达产物的表达水平，以获得第二值；c)检测获自其肿瘤对内分泌治疗不产生应答的患者的患病样品中NOVA1基因的基因表达产物的表达水平，以获得第三值；和d)比较第一值与第二和第三值，其中第一值与第二值相似并且比第三值高表明对象的肿瘤将对内分泌治疗产生应答；而其中第一值比第二值低并且与第三值相似表明对象的肿瘤对内分泌治疗将不产生应答。
10.如权利要求9所述的方法，其中代替NOVA1基因，检测IGHG3基因的基因产物的表达水平。
11.如权利要求9或10所述的方法，其中患病样品是乳腺相关身体样品，选自乳腺活检组织、血液、血清、血浆、淋巴、腹水、胆囊液体、尿、CSF、乳腺渗出液或乳头吸出物。
12.如权利要求9，10或11所述的方法，其中基因表达产物的表达水平通过检测对应于该基因表达产物的蛋白质的存在来评估。
13.如权利要求12所述的方法，其中利用特异结合蛋白质的试剂检测蛋白质的存在。
14.如权利要求13所述的方法，其中试剂选自抗体、抗体衍生物和抗体片段。
15.一种用于检测是否患者的乳腺癌将对基于内分泌的治疗产生应答的试剂盒，其包括在适于接触乳腺相关体液的容器中的权利要求13或14的试剂。
16.如权利要求15所述的试剂盒，其中所述试剂包括抗体，其中所述抗体特异地结合权利要求12的对应于基因表达产物的蛋白质。
17.一种治疗患者乳腺癌的方法，包括给所述患者施用可以调节一群基因中的一种或多种基因或基因表达产物的合成、表达或活性的化合物，以改善至少一种乳腺癌症状，其中所述的基因群包含表1、2、3或4中鉴定的那些基因。
18.如权利要求17所述的方法，其中化合物选自反义分子、双链RNA、核酶、小分子化合物、抗体或抗体片段。
19.监测患有或有危险患有乳腺癌的患者中乳腺癌进展的方法，包括随着时间的推移，测量获自患者的体液或乳腺组织样品中对应于一群基因中的至少一种基因的mRNA表达水平，其中所述的基因群包含表1、2、3或4中鉴定的那些基因，其中随着时间的推移，所述至少一种基因的mRNA表达水平的增加表明患者中乳腺癌的进展。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述至少一种表1、2、3或4中鉴定的基因选自TFF1，TFF3，SERPINA3，PIP，MGP，TGFRB3和AZGP1。
21.如权利要求19所述的方法，其中通过选自Northern印迹分析、反转录PCR和实时定量PCR的技术检测mRNA的表达水平。
22.监测患有或有危险患有乳腺癌的患者中乳腺癌进展的方法，包括随着时间的推移，测量获自患者的体液或乳腺组织样品中由至少一种表1、2、3或4中鉴定的基因编码的蛋白质的表达水平，其中随着时间的推移，所述至少一种基因编码的蛋白质的表达水平的增加表明患者中乳腺癌的进展。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述至少一种表1、2、3或4中鉴定的基因选自TFF1，TFF3，SERPINA3，PIP，MGP，TGFRB3和AZGP1。
24.监测患有或有危险患有乳腺癌的患者中乳腺癌进展的方法，包括随着时间的推移，测量获自患者的体液或乳腺组织样品中对应于选自表1、2、3或4中鉴定的那些基因的至少一种基因的mRNA表达水平，其中随着时间的推移，所述至少一种基因的mRNA表达水平的改变表明患者中乳腺癌的进展。
25.监测患有或有危险患有乳腺癌的患者中乳腺癌进展的方法，包括随着时间的推移，测量获自患者的体液或乳腺组织样品中选自表1、2、3或4中鉴定的那些基因的至少一种基因所编码的蛋白质的表达水平，其中随着时间的推移，所述至少一种基因编码的蛋白质的表达水平的改变表明患者中乳腺癌的进展。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述至少一种基因编码的蛋白质的表达水平利用对该蛋白质特异的标记探针通过Western印迹检测。
27.如权利要求26所述的方法，其中标记探针是抗体。
28.如权利要求27所述的方法，其中抗体是单克隆抗体。
29.一种鉴定可以用于乳腺癌治疗中的药剂的方法，其由如下步骤组成a)用候选药剂接触获自乳腺癌疑似患者的乳腺组织样品；b)检测样品中至少一种基因的mRNA表达水平，其中所述至少一种基因选自包括表1、2、3或4中鉴定的那些基因的基因群；和c)将在候选药剂存在的情况下样品中所述至少一种基因的mRNA表达水平与在候选药剂缺乏的情况下样品中所述至少一种基因的mRNA表达水平进行比较，其中相对于在候选药剂缺乏的情况下样品中该至少一种基因的mRNA表达水平，在候选药剂存在的情况下样品中该至少一种基因的mRNA表达水平的降低或增加表明药剂在乳腺癌治疗中是有用的。
30.如权利要求29所述的方法，其中所述至少一种表1、2、3或4中鉴定的基因选自TFF1，TFF3，SERPINA3，PIP，MGP，TGFRB3和AZGP1。
31.如权利要求29所述的方法，其中通过选自Northern印迹分析、反转录PCR和实时定量PCR的技术检测mRNA的表达水平。
32.如权利要求29所述的方法，其中药剂选自小分子和反义多核苷酸。
33.一种鉴定可以用于乳腺癌治疗中的药剂的方法，其由如下步骤组成a)用候选药剂接触获自乳腺癌疑似患者的体液或乳腺组织样品；b)检测样品中至少一种基因编码的蛋白质的表达水平，其中所述至少一种基因选自包含表1、2、3或4中鉴定的那些基因的基因群；c)将在候选药剂存在的情况下样品中所述至少一种基因编码的蛋白质的表达水平与在候选药剂缺乏的情况下样品中所述至少一种基因编码的蛋白质的表达水平进行比较，其中相对于在候选药剂缺乏的情况下样品中该至少一种基因编码的蛋白质的表达水平，在候选药剂存在的情况下样品中该至少一种基因编码的蛋白质的表达水平的降低或增加表明药剂在乳腺癌治疗中是有用的。
34.如权利要求33所述的方法，其中所述选自包含表1、2、3或4中鉴定的那些基因的基因群的至少一种基因是TFF1，TFF3，SERPINA3，PIP，MGP，TGFRB3和AZGP1。
35.如权利要求33所述的方法，其中所述至少一种基因编码的蛋白质的表达水平利用对该蛋白质特异的标记探针通过Western印迹检测。
36.如权利要求35所述的方法，其中标记探针是抗体。
37.如权利要求36所述的方法，其中抗体是单克隆抗体。
38.一种鉴定可以用于乳腺癌治疗中的药剂的方法，包括a)用候选药剂接触获自乳腺癌疑似患者的乳腺组织样品；b)检测样品中至少一种基因的mRNA表达水平，其中所述基因选自表1、2、3或4中鉴定的那些基因；和c)将在候选药剂存在的情况下样品中所述至少一种基因的mRNA表达水平与在候选药剂缺乏的情况下样品中所述至少一种基因的mRNA表达水平进行比较，其中相对于在候选药剂缺乏的情况下样品中该至少一种基因的mRNA表达水平，在候选药剂存在的情况下样品中该至少一种基因的mRNA表达水平的改变表明药剂在乳腺癌治疗中是有用的。
39.如权利要求38所述的方法，其中通过选自Northern印迹分析、反转录PCR和实时定量PCR的技术检测mRNA的表达水平。
40.如权利要求41所述的方法，其中药剂选自小分子和反义多核苷酸。
41.一种鉴定可以用于乳腺癌治疗中的药剂的方法，包括a)用候选药剂接触获自乳腺疾病疑似患者的体液或乳腺组织样品；b)检测样品中至少一种基因编码的蛋白质的表达水平，其中所述基因选自表1、2、3或4中鉴定的那些基因；和c)将在候选药剂存在的情况下样品中所述至少一种基因编码的蛋白质的表达水平与在候选药剂缺乏的情况下样品中所述至少一种基因编码的蛋白质的表达水平进行比较，其中相对于在候选药剂缺乏的情况下样品中该至少一种基因编码的蛋白质的表达水平，在候选药剂存在的情况下样品中该至少一种基因的蛋白质的表达水平的改变表明药剂在乳腺癌治疗中是有用的。
42.如权利要求41所述的方法，其中所述至少一种基因编码的蛋白质的表达水平利用对该蛋白质特异的标记探针通过Western印迹检测。
43.如权利要求41所述的方法，其中标记探针是抗体。
44.如权利要求43所述的方法，其中抗体是单克隆抗体。
45.如权利要求41所述的方法，其中药剂选自小分子和反义多核苷酸。
46.一种治疗患有或有危险患有乳腺癌的患者的方法，包括给患者施用治疗有效量的分离的核酸分子，该分离的核酸分子由来源于选自表1、2、3或4中鉴定的那些基因的至少一种基因的反义核苷酸序列组成，并能够改变所述至少一种基因的转录/翻译。
47.如权利要求46所述的方法，其中所述至少一种基因选自TFF1，TFF3，SERPINA3，PIP，MGP，TGFRB3和AZGP1。
48.一种治疗患有或有危险患有乳腺癌的患者的方法，包括给患者施用治疗有效量的拮抗剂，该拮抗剂可以抑制/激活由选自表1、2、3或4中鉴定的那些基因的至少一种基因编码的蛋白质。
49.如权利要求48所述的方法，其中所述至少一种基因选自TFF1，TFF3，SERPINA3，PIP，MGP，TGFRB3和AZGP1。
50.如权利要求48所述的方法，其中拮抗剂是对所述蛋白质特异的抗体。
51.如权利要求50所述的方法，其中抗体是单克隆抗体。
52.如权利要求51所述的方法，其中单克隆抗体与毒性剂缀合。
53.一种治疗患有或有危险患有乳腺癌的患者的方法，其由如下步骤组成给患者施用治疗有效量的分离的核酸分子，该分离的核酸分子由来源于选自表1、2、3或4中鉴定的那些基因的至少一种基因的反义核苷酸序列组成，并能够降低/增加所述至少一种基因的转录/翻译。
54.一种治疗患有或有危险患有乳腺癌的患者的方法，其包括给患者施用治疗有效量的拮抗剂，该拮抗剂可以抑制/激活由选自表1、2、3或4中鉴定的那些基因的至少一种基因编码的蛋白质。
55.如权利要求54所述的方法，其中拮抗剂是对所述蛋白质特异的抗体。
56.如权利要求55所述的方法，其中抗体是单克隆抗体。
57.如权利要求56所述的方法，其中单克隆抗体与毒性剂缀合。
58.一种治疗患有或有危险患有乳腺癌的患者的方法，包括给患者施用治疗有效量的编码核酶的核苷酸序列，该核苷酸序列能够降低/增加选自表1、2、3或4中鉴定的那些基因的至少一种基因的转录/翻译。
59.一种治疗患有或有危险患有乳腺癌的患者的方法，包括给患者施用治疗有效量的对应于权利要求58中定义的至少一种基因的双链RNA，该双链RNA能够降低该至少一种基因的转录/翻译。
60.一种治疗患有或有危险患有乳腺癌的患者的方法，包括给患者施用治疗有效量的编码核酶的核苷酸序列，该核苷酸序列能够改变选自表1、2、3或4中鉴定的那些基因的至少一种基因的转录/翻译。
61.一种治疗患有或有危险患有乳腺癌的患者的方法，包括给患者施用治疗有效量的对应于选自表1、2、3或4中鉴定的那些基因的至少一种基因的双链RNA，该双链RNA有改变该至少一种基因的转录/翻译的能力。
62.一种用于监测药剂对患有或有危险患有乳腺癌的患者的治疗效力的方法，该方法包括a)在给与药剂前从患者获得给药前样品；b)检测对应于选自表1、2、3或4中鉴定的那些基因的基因的mRNA表达水平；c)从患者获得一个或多个给药后样品；d)检测此一个或多个给药后样品中对应于所述至少一种基因的mRNA表达水平；e)将给药前样品中对应于该至少一种基因的mRNA表达水平与给药后样品中对应于该至少一种基因的mRNA表达水平进行比较；f)相应地调整药剂的给药方案。
63.一种用于监测药剂对患有或有危险患有乳腺癌的患者的治疗效力的方法，该方法包括a)在给与药剂前从患者获得给药前样品；b)检测选自表1、2、3或4中鉴定的那些基因的至少一种基因编码的蛋白质的表达水平；c)从患者获得一个或多个给药后样品；d)检测此一个或多个给药后样品中所述至少一种基因编码的蛋白质的表达水平；e)将给药前样品中该至少一种基因编码的蛋白质的表达水平与给药后样品中该至少一种基因编码的蛋白质的表达水平进行比较；f)相应地调整药剂的给药方案。
64.一种抑制患者乳腺癌组织增生的方法，该方法包括给患者施用治疗有效量的分离的核酸分子，该分离的核酸分子由来源于选自表1、2、3或4中鉴定的那些基因的至少一种基因的反义核苷酸序列组成，并能够改变所述至少一种基因的转录/翻译。
65.一种抑制患者乳腺癌组织增生的方法，该方法包括给患者施用治疗有效量的分离的核酸分子，该分离的核酸分子由来源于选自表1、2、3或4中鉴定的那些基因的至少一种基因的反义核苷酸序列组成，并能够改变所述至少一种基因的转录/翻译。
66.一种抑制患者乳腺癌组织增生的方法，该方法包括给患者施用治疗有效量的编码核酶的核苷酸序列，该核苷酸序列能够改变选自表1、2、3或4中鉴定的那些基因的至少一种基因的转录/翻译。
67.一种抑制患者乳腺癌组织增生的方法，该方法包括给患者施用治疗有效量的编码核酶的核苷酸序列，该核苷酸序列能够改变选自表1、2、3或4中鉴定的那些基因的至少一种基因的转录/翻译。
68.一种抑制患者乳腺癌组织增生的方法，该方法包括给患者施用治疗有效量的对应于选自表1、2、3或4中鉴定的那些基因的至少一种基因的双链RNA，该双链RNA有改变该至少一种基因的转录/翻译的能力。
69.一种抑制患者乳腺癌组织增生的方法，该方法包括给患者施用治疗有效量的对应于选自表1、2、3或4中鉴定的那些基因的至少一种基因的双链RNA，该双链RNA有改变该至少一种基因的转录/翻译的能力。
70.一种抑制患者乳腺癌组织增生的方法，该方法包括给患者施用治疗有效量的拮抗剂，该拮抗剂可以抑制/激活由选自表1、2、3或4中鉴定的那些基因的至少一种基因编码的蛋白质。
71.如权利要求70所述的方法，其中拮抗剂是对所述蛋白质特异的抗体。
72.如权利要求71所述的方法，其中抗体是单克隆抗体。
73.如权利要求72所述的方法，其中单克隆抗体与毒性剂缀合。
74.一种抑制患者乳腺癌组织增生的方法，该方法包括给患者施用治疗有效量的拮抗剂，该拮抗剂可以抑制由选自表1、2、3或4中鉴定的那些基因的至少一种基因编码的蛋白质。
75.如权利要求74所述的方法，其中拮抗剂是对所述蛋白质特异的抗体。
76.如权利要求75所述的方法，其中抗体是单克隆抗体。
77.如权利要求76所述的方法，其中单克隆抗体与毒性剂缀合。
78.一种病毒载体，其包含选自表1、2、3或4中鉴定的那些基因的至少一种基因的启动子，此启动子可操作地与载体复制所必需的基因编码区连接，其中所述载体适应于在转染进入乳腺细胞中后进行复制。
79.如权利要求78所述的载体，其中病毒载体是腺病毒载体。
80.如权利要求78所述载体，其中载体复制所必需的基因编码区选自E1a、E1b、E2和E4编码区。
81.如权利要求78，79或80所述的载体，其还包含编码异源基因产物的核苷酸序列。
全文摘要
本发明公开了用于确定乳腺癌内分泌应答及治疗和监测乳腺癌进展的方法，该方法以乳腺肿瘤中差异表达的基因为基础。本发明也公开了用于鉴定乳腺癌治疗中有用的药剂的方法、监测乳腺癌治疗效力的方法、抑制乳腺癌增生的方法和包含公开基因的启动子的乳腺特异载体。
文档编号A61K48/00GK1526025SQ02809997
公开日2004年9月1日 申请日期2002年4月11日 优先权日2001年5月16日
发明者M·M·德雷斯曼, M M 德雷斯曼, C·N·拉韦丹, 拉韦丹, M·波利默罗普罗斯, 奁章匏 申请人:诺瓦提斯公司