专利名称：男用避孕药的制作方法
相关申请的交叉参考本申请要求2001年6月19日提交的美国临时申请第60/299,313号的权益，其公开的内容本文引入作为参考。
政府支持本文描述的发明部分受到国家卫生研究院(National Institutes of Health)健康基金编号U54-HD-13541-20S的支持。因此，政府可对本发明具有权利。
背景技术：
女性生殖系统已被广泛研究了很多年，开发了许多女性避孕方法。相反，男性生殖系统的生理学没有得到很好的了解。因此，目前可用于男子避孕的方法选择非常少。
在过去几十年中，新的男用避孕药的开发主要集中于操纵下丘脑-垂体-睾丸轴以干扰精子发生(见Paulsen等，1994)。高剂量睾酮或合成黄体酮的给予都能抑制垂体促性腺激素的分泌，进而导致精子减少或精子活力缺乏(Frick等，1977)。尽管对精子发生的这种抑制作用是可逆的，外源性地给予类固醇或多肽激素往往会干扰激素平衡并诱导不良副作用。当雄激素水平受到影响，其它第二性征也受到影响。另外，雄激素，作为一种男性激素，在人体中具有多样性作用。还有一些调节生理学终点的雄激素是未知的，同样地，直到最近几年才知道其潜在的副作用。
在精子发生过程中，发生了一系列的分子、生化和细胞活动。这些活动导致减数分裂过程中一个精原细胞通过连续两次减数分裂产生四个精子细胞(关于综述，见de Kretser和Kerr，1988；Byers等，1993)。另一方面，发育中的生殖细胞也必须逐渐地从基部转位到生殖上皮的adluminal区室，如此在精子排放的过程中完全发育的精细胞(精子)可释放到管腔中。另外，构成血-睾屏障(BTB)的足间(inter-足)的密封连接(TJ)必然遭受到破坏并定时地重新装配以允许前细线期精母细胞适时地通过BTB，进入adluminal区室继续它们的发育。这种发育中的精细胞通过BTB和上皮的及时运动对完成精子发生是必需的。
产生血-睾屏障的足(Sertoli)细胞间的TJ在睾丸中起重要作用。首先，它们在生精上皮和限制分子旁细胞(paracellular)转运的基底层之间起着屏障作用。其次，它们构成了使精细胞发育与为精子发生创造良好环境的全身性循环相分离的血-睾屏障的主要部分(Dym等，1970)。第三，TJ产生和保持了细胞的极性。在睾丸中发现了一些与TJ相关的蛋白质，例如ZO-1(Byers等，1991；Pelletier等，1997)、cingulin(Byers等，1993)、occludin(Moroi等，1998)和claudin-1、-3、-5、-7、-8和-11(综述见Fanning等，1999；Tsukita和Furuse，2000)。在这些蛋白质中，只有ZO-1，一种睾丸中得到了广泛研究的胞浆蛋白(Byers等，1991；Pelletier等，1997，Chung等，1999；Wong等，2000)。
Occludin是一种位于TJ链上的65kDa整合性膜蛋白质(Furuse等，1993；Fujimoto等，1995；Saitou等，1997)。Occludin由四个跨膜结构域、一个长羧基末端胞质结构域、一个短氨基末端胞质功能域、两个细胞外环和一个细胞内环组成。在这些结构域中，第一个胞外域富含酪氨酸(Tyr)和甘氨酸(Gly)(约60％)(Ando-Akatsuka等，1996)。这些特征在哺乳动物种类中是非常保守的(Ando-Akatsuka等，1996)。
如跨上皮电阻(TER)评估的那样，检测到当TJ装配时诱导了occludin的表达。这表明TJ的形成需要occludin。当足细胞间的TJ进行装配时诱导了ZO-1和occludin的表达，与观察到的occludin的胞质结构域以1∶1的摩尔比与ZO-1缔合相一致(Furuse等，1994)。这些结果还与这样的看法相一致，即ZO-1在TJ生物发生过程中作用是跨接整合性膜TJ蛋白质例如occludin和肌动蛋白-为基础的细胞骨架的接头(Furuse等，1994；Fanning等，1998)。在TJ装配过程中及时地诱导occludin的表达还与TJ装配过程中观察到磷酸化occludin水平提高的报道相一致(Sakakibara等，1997；Wong等，1997b)。
不同的上皮系统中occludin的功能分析显示在TJ装配中occludin起着关键性作用(综述见Matter和Balda，1999；Mitic和Anderson，1998；Tsukita和Furuse，1999)。例如，用全长occludin的cDNA转染后在MDCK细胞中检测到TER的增加(Balda等，1996；McCarthy等，1996)。然而，还发现occludin缺陷的胚胎干细胞能够分化成为携带TJ的极化上皮细胞(Saitou等，1998)。该结果表明claudin(在至少18种不同动物中发现的另一种TJ-整合性跨膜蛋白质)或其它有待鉴定的TJ-整合性蛋白质在TJ装配中能够代替occludin的作用，它也可与基础的胞质TJ-蛋白ZO-1缔合。其它研究显示claudin-1、-3、-5、-7、-8和-11存在于睾丸中，表明上皮细胞可利用其它TJ蛋白质构建TJ(综述见Mitic等，2000)。
研究了合成的occludin肽的体外作用。例如，一项研究采用了相应于occludin第一外环的合成肽，检验其在细胞-细胞粘附中的作用。当将occludin转染的成纤维细胞与相应于occludin的第一外环的肽一起培养时，occludin诱导的细胞粘附受到抑制(Van Itlalie和Anderson，1997)。该观察引起了该第一外环负现细胞-细胞粘附的推测。在另一项研究中，将鸡occludin第一外环的同源肽加入非洲爪蟾(Xenopus)A6细胞培养物时阻止了TJ的重新密封。相反，相应于第二胞外域的10个氨基酸的肽没有此作用(Lacaz-Viera等，1999)。然而，Wong和Gumbiner(1997)证明根据鸡occludin的整个第一外环合成的44个氨基酸的肽，不能破坏培养的非洲爪蟾(Xenopus)肾上皮(A6)细胞中的TJ，然而，覆盖整个第二外环的44个氨基酸的肽的确干扰了A6细胞中TJ的装配。
发明概述本发明的一个方面涉及一种男用避孕药，该避孕药含有氨基酸序列相应于哺乳动物occludin第二胞外域的肽，或该肽的类似物以及运载体。该肽或其类似物能干扰体内足细胞间的密封连接。在一些实施例中，该类似物对应于哺乳动物occludin第二胞外域的片段。该片段的序列就一个或多个氨基酸的取代、添加和/缺失而言实不同于天然的相应片段。
该避孕药可口服或肠胃外给予(例如通过睾丸内注射方式)。在一些实施例中，使该肽与能特异性靶向睾丸细胞的配体连接(这样形成偶联物)。在其它较佳的实施例中，该配体是一种肽并通过肽键与occludin肽连接，这样occludin肽和该配体以融合蛋白形式相连接。在更佳的实施例中，该配体含有促滤泡激素(FSH)的结合域的至少一部分。还提供了编码occludin肽和融合蛋白的核酸以及含有相同成分的构建物(例如载体和宿主)。还进一步提供了制备此避孕药和使用该肽或核酸在哺乳动物例如人中进行避孕以获得避孕效果的方法。
在正常情况下，通过足细胞间(inter-Sertoli)的密封连接形成的血-睾屏障界定了使生殖细胞发育和成熟为具有完全功能的精细胞的所谓生精上皮的保护性环境。不受具体操作理论的束缚，申请人认为通过破坏足细胞和足细胞之间形成的密封连接，本发明的肽还可引起血-睾屏障(BTB)的破坏，导致人体免疫细胞流入生精上皮。免疫细胞可将精细胞识别为机体的“外来物”并破坏它们。结果，精细胞的数量减少到不育水平。
附图的简要描述
图1说明体外足细胞间(inter-Sertoli)密封连接(TJ)通透性屏障的装配图。
图2A和2C是凝胶，2B和2D说明体外足细胞间TJ装配的过程中，稳肽occludin的mRNA水平的变化图。
图3A和B是层析图，说明用HPLC纯化occludin肽并通过微量测序证实occludin的身份。
图4A和B说明对应于大鼠occludin第二胞外环(残基209-230)的22-氨基酸occludin肽对足细胞间TJ通透性屏障的作用图。
图5说明睾丸内注射一种occludin肽后睾丸重量的变化图。
图6A-L描述通过睾丸内注射给予成年大鼠22-氨基酸的合成occludin肽后，其抗精子生成作用的显微镜观察照片。
图7A和B是睾丸内注射合成的occludin或myotubularin肽后血-睾屏障(BTB)的可逆性破坏图。
图8是人occludin定向于细胞膜的示意图。
发明详述本发明的肽(也称作“occludin肽”)与哺乳动物occludin的第二胞外环相对应或是其类似物，它能破坏足细胞间的密封连接。人occludin的示意图描述见图8。如可以看到的，人occludin肽含有第一和第二胞内环/结构域。代表各种哺乳动物occludin第二胞外环序列的排列对比在表1中给出。该排列对比显示哺乳动物occludin在这一结构域中具有基本上的同源性或序列相似性。
表1人 FTAQ-SSGSLYGSQIYALXNQFYTPAATGLYVDQYLYHYCVVDPQE-COOH(199-243)小鼠FTAQ-ASGSMYGSQIYMICNQFYTPGGTGLYVDQYLYHYCVVDPQE-COOH(197-241)大鼠FTAQ-ASGSMYGSQIYTICSQFYTPGGTGLYVDQYLYHYCVVDPQE-COOH(197-241)鸡 PQAQM-SSGYYYSPLLAMCSQ-AYGST-YLNQYIYHYCTVDPQE-COOH(1987-227)狗 FIAQ-ASGSLYSSQIYAMCNQFYASTATGLYMDQYLYHYCVVDPQE-COOH(198-242)见Mitic等，Ann.Rev.Physiol.60121-142(1998)Genbank编号NP-112619(大鼠occludin)、NP-032782(小鼠occludin)、AAC50451(人occludin)和A49467(鸡occludin)。另外，大鼠袋鼠在这一结构域中显示显著的同源性。其它种类哺乳动物occludin中的第二胞外环可根据标准技术鉴定，例如通过用与第二胞外环或其片段杂交的寡核苷酸探测基因文库。为了便于序列信息的解释，表2给出氨基酸的名称及3-和1-字母符号。
表2氨基酸符号
通常，occludin肽的类似物是全长型式的(表1中给出3序列)，或它们的片段，可具有一个或多个天然发生或合成的(如修饰的)氨基酸取代、添加和/或缺失，只要该类似物能破坏体内足细胞之间形成的密封连接。在该类似物含有一个或多个氨基酸取代的情况下，保守性改变是优选的。例如，亲水性氨基酸如S、Q、G和T可用另一个亲水性氨基酸残基如D、N或G取代。同样，疏水性氨基酸残基例如Y可用另一个疏水性残基，如R、I、K或L取代。在给定的运载体中从肽的溶解性观点看疏水性取代是有利的。非保守性取代也是允许的，只要该类似物能保留破坏密封连接形成的能力。
优选的类似物是与第二胞外环相对应的片段。通常，破坏密封连接形成的片段含有对应于哺乳动物occludin第二胞外环的约12个至全部的(例如43-45个)氨基酸残基，例如含有12、13、14、、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、或45个氨基酸残基的肽。优选的片段是那些位于细胞膜最外部或最远端的(见图8)，并与参与形成密封连接的互锁结构域的环部分相对应的片段。再参见表1中给出的大鼠occludin序列，优选的类似物含有12个氨基酸的序列TICSQFYTPGGT(对应于氨基酸残基214-225)。在人中，相应的12个氨基酸的序列是ALCNQFYTPAAT(也相应于氨基酸残基214-255)。这样，除了这12个氨基酸的肽本身外，其它含有该肽的类似物可通过简单地在两末端之一加入一个或多个侧接该序列的天然发生的氨基酸残基推断。再参见表1，含有这12个氨基酸的序列的代表性类似物包括如下NH2-TICSQFYTPGGT-COOHNH2-YTICSQFYTPGGT-COOHNH2-TICSQFYTPGGTG-COOHNH2-YTICSQFYTPGGTG-COOHNH2-IYTICSQFYTPGGT-COOHNH2-TICSQFYTPGGTGL-COOHNH2-IYTICSQFYTPGGTG-COOHNH2-YTICSQFYTPGGTL-COOHNH2-QIYTICSQFYTPGGT-COOHNH2-QIYTICSQFYTPGGTG-COOHNH2-YTICSQFYTPGGTGLY-COOHNH2-YTICSQFYTPGGTGLYV-COOHNH2-YTICSQFYTPGGTGLYVD-COOHNH2-IYTICSQFYTPGGTGLYVD-COOHNH2-QIYTICSQFYTPGGTGLYVD-COOHNH2-SQIYTICSQFYTPGGTGLYVD-COOH
NH2-TICSQFYTPGGTGLY-COOHNH2-TICSQFYTPGGTGLYV-COOHNH2-TICSQFYTPGGTGLYVD-COOHNH2-GSQIYTICSQFYTPGGTGLYV-COOHNH2-GSQIYTICSQFYTPGGTGLY-COOHNH2-GSQIYTICSQFYTPGGTGL-COOHNH2-GSQIYTICSQFYTPGGTG-COOH以编号的方式进行描述(例如TICSGFYTPGGT表示为(214-225)，某些含有该序列的其它类似物包括氨基酸残基(213-225)、(212-225)、(211-225)、(210-225)、(209-225)、(208-225)、(207-225)、(206-225)、(205-225)、(204-225)、(203-225)、(202-225)、(201-225)、(200-225)、(199-225)、(214-226)、(214-227)、(214-228)、(214-229)、(214-230)、(214-231)、(214-232)、(214-233)、(214-234)、(214-235)、(214-236)、(214-237)、(214-238)、(214-239)、(214-240)、(214-241)、(214-242)、(214-243)、(213-226)、(212-227)、(211-228)、(210-229)和(209-230)。使用相同的方案，可不难产生其它哺乳动物包括人occludin衍生的适当的类似物列表。
采用文献中描述的标准方法可检验其它的类似物以确定它们是否能破坏睾丸中足细胞之间的密封连接。见，Lui WY，Lee WM和Cheng CY(2001)转化生长因子-b3可能通过其对occludin、zonula occludins-l和claudin-ll的作用体外介导足细胞间密封连接通透性屏障的干扰，Endocrinology 1421867-1877；Chung NPY和ChengCY(2001)氯化镉诱导的足细胞间密封连接通透性屏障的破坏是研究大鼠睾丸中精子发生过程中连接分解现象的适当体外模型吗？Endocrinology 1421878-1888；和GrimaJ，Wong CSC，Zhu LJ，Zong SD和Cheng CY(1998)由足细胞分泌的睾丸素与细胞表面联合，并且其表达与足生殖细胞连接的破坏相关而与足细胞间密封连接无关，J.Biol.Chem.27321040-21053。制备足细胞的单层悬浮液(例如将足细胞以约1×106细胞/cm2的密度在Matrigel包被的二房室的装置上培养)。然后，在两个电极(例如银-氯化银)之间施加电流脉冲(约20uA)通过足细胞上皮短时间(例如约2秒)，并定量测定电阻(例如使用Millicell电阻系统(Millipore Corp))。用滤波器的表面积(约0.6cm2)乘以电阻得到欧姆×cm2的电阻。然后将类似物加入悬浮液中。如果类似物干扰密封连接屏障，通过足细胞上皮的电阻将降低(例如从约100欧姆×cm2降到约40-80欧姆×cm2或更少)。
本发明的肽和类似物可根据标准技术制备，例如固相肽合成或通过基因工程，例如在重组宿主(例如细胞)中表达编码该肽的DNA。已知的适当宿主可包括细菌、酵母、真菌、哺乳动物和植物细胞。参数例如密码子偏爱、调节序列的选择和宿主等可根据已知的方法优化。
本发明的肽可用作雄性避孕药。因此，可配制它们给予任何雄性哺乳动物，尤其是人。给予的肽的量将取决于例如体重、男性的整体健康状况和给予的方式等一些因素。然而通常剂量将在约0.1-10mg/睾丸的范围内。男性通常在给药后的大约2-4周内将会不育。该肽的作用是暂时的。男性将保持不育约6个星期直到作用逐渐消失和生育能力恢复。这些时间将因个体与体而不同。
给予避孕药的适当方式包括口服和肠胃外给予，例如通过皮下或睾丸内注射方式。另外，可以定向将此肽传递给睾丸，例如通过将此肽与一配体偶联，配体是例如活性已降低(与野生型蛋白质相比)或优选完全缺乏激素活性的促滤泡激素(FSH)或其衍生物来选择性地与睾丸细胞结合。配体性质上可以是肽或非肽。因此，依照标准技术和试剂，例如通过化学交联的方式，可将配体与occludin肽偶联形成偶联物。在配体是肽的实施例中，occludin肽和配体可通过肽键连接以产生融合蛋白。选择的配体应能靶向于大量存在或专门存在于睾丸细胞，优选足细胞上的受体。因此，这些偶联物或融合蛋白能优先地或选择性地与这种细胞结合，而不与少量或根本不表达此类受体的细胞结合。
FSH是一个由两个非共价连接的α和β亚基组成的异质二聚体糖蛋白(综述见Pierce等，1981)。FSH通过其受体结合位点与存在于足细胞上的FSH受体结合(综述见Fritz等，1978)，该受体结合位点存在于β亚基C-末端区域的氨基酸残基93-99(Lindau Shepard等，1994)，和α亚基的His90和Lys91中(Zeng等，1995)。FSH受体是否存在于其它细胞类型中尚不知道。α亚基上的氨基酸残基Asn52和Asn78以及β亚基上的残基Asn7和Asn24使其具有激素活性(综述见Rose等，2000)。已报道α亚基的两个Asn残基的去糖基化导致野生型的生物效能明显下降约41％(Bishop等，1994)。因此，在这四个位点进行定点诱变将产生具有很少或可忽略不计的(功能上无意义的)激素活性同时保留与足细胞结合亲合力的FSH。然后可将这种突变的FSH编码序列插入表达载体并转染宿主(例如CHO细胞)用于生产重组蛋白质(FSH与肽融合)或FSH与肽连接的偶联物(例如通过化学交联剂)(Keene等，1989；VanWezenbeek等，1990)。在这种情况下，皮下给予(例如肌肉内)将特别适合。其它适当配体的选择，及其能保留所需结合亲合力但有效地除去其它天然改能的修饰，是细胞特异性输送系统领域技术人员水平范围内的事。
同样，对于任何给定的给予药式可进行运载体的选择和优化，这是药物领域技术人员水平范围内的事。用于配制任何给药方式的肽的其它成分，例如佐剂、稀释剂、赋形剂和/或稳定剂的选择是本领域已知的，并可依据行业中的标准操作进行选择(Remington，药剂科学与实践(The Science and Practice of Pharmacy(2000))。
也可将occludin肽与蛋白质转导域(PTD)(具有大量带阳电荷的赖氨酸(K)和精氨酸(R)残基的约10-16个残基的小肽)偶联用于输送。较佳地，PTD应具有1-5个这样的残基。研究显示如β-半乳糖苷酶(约120kDa)一样大的功能性蛋白质当与带有NH2-RKKRRQRRR序列的Tat-PTD(Tat代表慢病毒的反式激活蛋白)偶联时，可通过腹膜间注射从细胞内传递给细胞(Schwarze等，1999；Schwarze和Dowdy，2000)。与PTD偶联可通过改善occludin肽向睾丸足细胞的输送提高避孕药的功效。
还可经适当的输送系统给予雄性编码occludin肽(或融合蛋白)的核酸实现避孕。例如，腺病毒/逆转录病毒介导的基因转移系统也可用于输送此肽。见，Blanchard和Boekelheide，1997；Nagano等，2000。例如，可将编码对应于与报道基因如β-半乳糖苷酶连接的occludin肽的肽的DNA分子插入复制-缺陷型病毒表达载体例如人腺病毒血清5型(Stratford-Perricaudet等，1990；Lee等，1993；Blanchard等，1997)。在一个较佳的实施例中，构建了含有E1和E3缺失的复制机能不全的人腺病毒血清5型，其中插入了occludin肽的编码序列和报道基因并由腺病毒启动子驱动。进行体外病毒包装以产生高效价的病毒原液。病毒原液的浓度采用噬斑形成单位检验以293人胚肾细胞进行定量测定(Hitt等，1995)。然后用含有CaCl2和MgCl2的PBS将病毒原液稀释到适当的浓度并通过睾丸内注射输入睾丸。
应理解尽管本发明结合优选具体实施例进行了描述，上文所描述的以及以下实施例旨在说明而不是限制本发明的范围。在本发明范围内的其它方面、优点以及修饰是本发明所属领域熟练技术人员所明白的。
下文实施例描述使用本发明的肽进行的实验，该肽是与大鼠occludin第二胞外域相对应的22个氨基酸的肽。通过测定跨越足细胞上皮的跨上皮电阻体外检验了该肽。该肽能可逆地破坏足细胞间的密封连接。还通过雄性大鼠睾丸注射体内评估了该肽，其结果显示生精上皮的生殖细胞可逆性缺失和血-睾屏障的破坏。
动物。从Charles River实验室(Kingston，MA)获得成年(体重250和300g之间)和20日龄Sprague-Dawley大鼠。所有大鼠在Rockefeller大学实验动物研究中心(Rockefeller University Laboratory Animal Research Center(LARC)中饲养。每笼两只成年大鼠。在控温(22℃)和恒定的光照12小时黑暗12小时周期中，所有的动物可自由接近标准的大鼠食物并随意取水。这些动物依据动物福利法案(Animal Welfare Act)部分和卫生和公共事业部(Department of Health and Human Services)的出版物“管理和使用实验动物指南(Guide for the Care and Use of Laboratory Animal)”中的准则进行饲养。本申请中描述的动物的使用经Rockefeller大学动物管理和使用委员会(Rockefeller University Animal Care and Use Committee)批准，方案编号97117，95129R和00111。
足细胞培养物的制备。如前所述(Cheng等，1986)从20日龄Sprague-Dawley大鼠分离得到原代足细胞。将足细胞以5×104细胞/cm2的密度接种在100-mm的培养皿中[约4.5×106细胞/100-mm培养皿/9ml的Ham氏F12营养混合物/Dulbecco修饰的Eagle氏培养基(F12/DMEM，1∶1，v/v，Life Technologies，Inc.)；F12/DMEM中添加有15mM的HEPES、1.2g/L的碳酸氢钠、10μg/ml的牛胰岛素、5μg/ml的人转铁蛋白、2.5ng/ml的EGF、20mg/L的庆大霉素和10μg/ml的杆菌肽(bacitrain)。当用TER测定监测(Grima等，1998)时低细胞密度培养的足细胞形成了没有足细胞间TJ装配的单层上皮。但是形成了粘附连接(AJ)和空隙连接(GJ)(Chung等，1999)。对于高细胞密度的培养物，如前所述(Grima等，1998)足细胞接种在包被MatrigelTMCollaborative Biochemical Products)，Belford，MA)(用F12/DMEM，作1∶7(v/v)稀释)的24孔培养皿上(有效表面积约1.88cm2，每孔2ml F12/DMEM)以0.6-3×106/cm2的密度接种以形成TJ、AJ和GJ，当用各种标准评估时，模拟了体内发现足细胞(Grima等，1992)。细胞培养物35℃培养在含有95％的空气和5％的CO2(v/v)的湿润气体中，24小时后记录TER读数且取名为第一天培养物。当用显微镜观察检验时这些足细胞培养物显示95％以上的纯度(Wong等，2000；Grima等，1992；Grima等，2000)。
用半定量RT-PCR检测occludin的稳态mRNA水平。基本上如前所述进行半定量RT-PCR(Grima等，1998；Chung等，1998a、b；1999；Monk和Cheng，1999)。RNA STAT-60TM(Tel Test“B”Inc.，Friendswood，TX)在特定的时间点提取培养细胞的RNA。在25μl最终反应体积中，用1μg寡-dT15和MMLV逆转录试剂盒(Promega，Madison，WI)将大约3μg的总RNA逆转录为cDNA。为了定量测定和比较不同样品的occludin mRNA水平，用S16共扩增occludin，这样occludin的相对表达可相对于S16标准化。在初步实验中，采用不同浓度的模板和引物对进行PCR，检测了经20-28轮扩增的PCR产物以确保靶基因和S16的线性化。在大多数实验中，通过将3μl的RT产物与0.4μg的各个occludin引物(有义引物5’-CTGTCTATGCTCGTCATCG-3’，核苷酸770-788和反义引物5’-CATTCCCGATCTAATGACGC-3’，核苷酸1044-1063)(Genebank编号AB016425)、80ng各个大鼠核糖体S16引物(有义引物5’-TCCGCTGCAGTCCGTTCAAGTCTT-3’，核苷酸15-38和反义引物5’-GCCTTTCTTCTTGGATTCGCAGCG-3’，核苷酸376-399)(Chan等，1990)、5μl的10XPCR缓冲液、3μl的MgCl2(25mM)、8μl的dNTP(200μM的各个dATP、dGTP、dCTP和dTTP)、2.5单位的Taq DNA聚合酶(Promega)相混合，并用无菌双蒸水稀释到50μl的最终体积进行PCR。PCR的循环参数如下94℃变性1分钟，62℃退火2分钟和72℃延伸3分钟，总共进行23轮，随后72℃延伸15分钟。为了在对获得的放射自显影图进行光密度扫描后提高检测限度和产生半定量分析的数据，在[γ-32P]-标记的引物存在下进行PCR。简言之，occludin和S16的有义引物在5’-末端用T4多核苷酸激酶(Promega，Madison，WI)以[γ-32P]-dATP(比活性，6000Ci/mmol，AmershamPharmacia Biotech)标记。[γ-32P]-S16(有义引物，～10,000cpm/PCR管)[γ-32P]-occludin(有义引物)的相对比率与未标记的相应有义引物相同，因此获得的放射自显影图是溴化乙锭染色凝胶的复制品。将约10μl的PCR产物等分用0.5x TBE(45mM的Tris-硼酸盐，1mM的EDTA，pH 8.0)作为电泳缓冲液在5％的T聚丙烯酰胺凝胶上分辨。通过溴化乙锭染色观察PCR产物。然后干燥凝胶并用Kodak X-OMAT AR感光胶片(Eastman Kodak，Rochester，NY)放射自显影。得到的放射自显影图用UltroScan XL激光增强密度计(Pharmacia Amersham Biotech)在600nm处进行光密度扫描，将数据相对于S16标准化以产生半定量的数据。
22个氨基酸的occludin合成肽的合成、纯化和特征分析。从SynPep公司(Dublin，CA)获得对应于大鼠occludin第二胞外域的22个氨基酸的肽(NH2-GSQIYTICSQFYTPGGTGLYVD-COOH，氨基酸残基209-230)(Genebank编号AB016425)和22个氨基酸的myotubularin(NH2-TKVNERYELCDTYPALLAVPAN-COOH，残基156-177)(Li等，2000a)。用BLAST搜索软件在Genbank现存的序列中这些肽序列没有同源物。然而，大鼠occludin序列的一小段在不同种类动物分离的occludin中，具有90％的同源性。为了纯化该合成肽，将500μg粗肽溶解于溶剂A(含有0.1％三氟乙酸的5％乙腈、95％水，v/v)中并以1ml/分钟的流速加载到VydacTM(Separations Group，Hesperia，CA)C18反相HPLC柱上(4.6×250mm)。然后从其它杂质中分离occludin肽并如所描述的(Li等，2000；Monk和Cheng，1999)用15-65％线性梯度的溶剂B(含有0.1％三氟乙酸的95％乙腈、5％水，v/v)洗脱30分钟以上。以220nmUV吸光率监测洗脱液，并收集每份0.5ml。合并含有occludin肽的组分、冷冻和冻干。然以后，微量测序约50pmol的纯化occludin肽以验证其身份，如前所述(Monk和Cheng，1999；Cheng等，1998；和Cheng等，1989)。重复产量约为96％。
通过测定跨足细胞上皮的跨上皮电阻(TER)评估足细胞间TJ-通透性屏障的完整性。为了评估occludin肽对足细胞间TJ装配的影响，分离了20日龄大鼠睾丸中的足细胞以1.2×106个细胞/cm2的密度培养以使足细胞间TJ进行装配，并且如前所述定量测定了(Wong等，2000；Grima等，1998)横跨足细胞上皮的、定量衡量TJ完整性的TER。将细胞接种在顶室(Millipore，Bedford，MA)(25，28)中的MatrigelTM(1∶7)包被的HA滤膜上。非常小心去做，不要在足细胞聚集物之间形成气泡，由于气泡能在相邻的足细胞之间产生物理孔隙，所以是获得跨越足细胞上皮的稳定TER的主要障碍。在特定的时间点如所描述通过Millicell电阻系统测定跨越足细胞上皮的TER(Grima等，1998；Cheng和Chung，2001)。电阻欧姆乘以两室装置(bicameral unit)的有效表面积(约0.6cm2)以产生面积电阻(ohm.cm2)。然后通过从足细胞接种室的值减去本底(在Matrigel包被的无细胞室上测定)值。为了在TER测定过程中将温度-引起的波动减到最小，在记录跨越足细胞上皮的TER前，将培养物稳定在室温20-30分钟。刚刚分离的足细胞接种在Martigel包被的小室上24小时后，将0.2-4μM合成occludin肽加入两室装置的基底室(含0.03％DMSO的0.5ml F12/DMEM，v/v，DMSO用于溶解肽于培养液中)和顶室中(含0.03％DMSO的0.5ml的F12/DME，v/v)(第一天)。每天更换培养液时，将肽加入含0.03％DMSO(v/v)的F12/DMEM中。在选择试验中，用不含肽的F12/DMEM和随后用也不含肽的培养液两次连续洗涤冲洗细胞，从足细胞上皮除去合成occludin肽。对照实验包括(i)单独培养的足细胞，(ii)仅用运载体(含0.03％DMSO的培养液，v/v)培养的足细胞，和(iii)如上文所述在存在4μM的22-氨基酸合成myotubularin肽条件下培养的足细胞。各个时间点包括一式三份培养物，而各次实验用不同批足细胞重复2-3次。我们选择不同于其它方法的TER测定以定量测定Sertoli间TJ的装配和维持，该方法包括(i)限制[3H]-菊糖、[125I]-BSA或荧光素异硫氰酸盐标记的葡聚糖跨越足细胞上皮的扩散，(ii)维持两室装置的顶室和基底室中培养液的非平衡状态，和(iii)为了如下原因，如所描述的(Grima等，1992；Grima等，2000)，极化足细胞产物，例如转铁蛋白、rABP、睾丸素、簇集素、和α2-巨球蛋白的分泌。首先，这是本领域细胞生物学家广泛采纳的一项技术(Wong等，1997；Balda等，1996)。其次，它可对足细胞间TJ的装配和维持产生定量测定。第三，也是最重要的，TER测定获得的结果与上文所述其它繁琐方法获得的结果一致，例如用[3H]-菊糖和荧光素异硫氰酸盐标记的葡聚糖的扩散性限制(用Tecan GENios细胞荧光计监测)与TER同时评估该密封连接和通透性屏障。
Occludin肽的睾丸内注射和睾丸的组织学分析。为了评价occludin肽对精子发生的体内作用，如下通过直接睾丸内注射将肽给予成年大鼠的睾丸。将肽悬浮于0.9％无菌盐水中，通过暴露UV进行5分钟灭菌。应注意在肽使用前短暂UV处理灭菌肽悬浮液不会改变肽的结构，并以两种方法验证。首先，当与UV处理前的肽比较时，UV处理的肽在采用Vydac C18层析柱(4.6×250mm，i.d.)(Cheng等，1998，Cheng等，1989)的反相HPLC上保持相同的滞留时间。其次，当如所描述的(Mruk和Cheng，1990；Cheng等，1998；Cheng等，1989)进行定向蛋白质微测序时，UV处理的肽的初级序列保持不变。处理前，体重250g和300g之间的成年大鼠用Metofane麻醉。大鼠通过睾丸内注射接受300μl的0.9％无菌盐水(运载体对照)，不处理(对照)，或者悬浮于300μl 0.9％无菌盐水中的1.5-10mg occludin肽。动物的右侧睾丸接受肽或运载体而同一动物的左侧睾丸不做处理用做对照。如前所述，基本上以约100ul样品/每点在每一睾丸上3个点给予肽或运载体(Grima等，1998；Eng等，1994)。在另一对照组中，大鼠用基于已知的足细胞蛋白质、大鼠myotubularin(rMTM)的合成性22个氨基酸的NH2-TKVNERYELCDTYPALLAVPAN-COOH肽注射(Li等，2000；Li等，2001)，该肽与occludin没有序列同源性。在各处理组中使用3个大鼠，并在特定时间点通过CO2窒息杀死大鼠。立即取出睾丸并固定于10％中性缓冲福尔马林中。用石蜡包埋睾丸，并以分级乙醇脱水。为了进行形态学分析，切成5μm的切片并用苏木精和曙红染色。采用带有Olympus PM-30曝光控制组件的Olympus BX40显微镜(Tokyo，Japan)检测睾丸各不同点的约50张切片，(Exposure Control Unit)。
使用显微穿刺术评估occludin-肽诱导的血-睾屏障(BTB)的破坏。
牛血清白蛋白(BSA)的放射性碘化简言之，如所描述的(Cheng等，1983)，将5μg的BSA(Sigrna，RIA级，Mr 68kDa)用1mCi的[125I]-碘化钠(Amersham Pharmacia Biotech)通过Iodogen(Fraker等，1978)进行放射性碘化。
检测生精小管液体(STF)和睾丸网液体(RTF)中的[125I]-BSA。如上文所述(在三个点给予右侧睾丸)，睾丸内给予1.5mg occludin或者myotubularin肽/睾丸后2、4、6和12周，其中同一动物的左侧睾丸用作对照。用盐酸开他敏(ketamine HCl)(Fort DodgeLaboratories，Inc.，Fort Dodge IA)以60mg/kg体重的浓度麻醉大鼠(n＝每个时间点4-6个大鼠，在肽处理时体重约为250克)。基本上如描述的(Turner等，1984；Stahler等，1991)进行显微穿刺术。简言之，通过剖腹术暴露睾丸，并用手术丝线结扎输出管。然后将睾丸放回阴囊，用70％乙醇洗净伤口，外科缝合使动物恢复。输出管结扎后24小时，用盐酸开他敏麻醉大鼠，进行两侧的肾切除以防止肾排泄[125I]-BSA，将大约6×106cpm的[125I]-BSA通过颈静脉注入大鼠。注入后2小时，取出睾丸，如所描述收集RTF和STF(Turner等，1984；Stahler等，1991)在γ-计数器中进行放射性测定。没有接受occludin或者myotubularin肽的同一动物左侧睾丸用作对照，也收集STF和RTF作放射性测定以评估BTB的完整性。
统计分析。用Student’s t-检验将处理的样品与它们相应的对照进行比较，或者通过采用GB-STAT统计分析包(Statistical Analysis Package)(7.0版，DynamicMicrosystems Inc.，Silver Spring，MD)的ANOVA分析结果的统计学显著性。对ANOVA用Tukey’s可靠的显著性差异(HSD)检验，将各个样品的结果与对照相比较以及与同一组中经受相同处理的样品比较。在研究细胞基因表达或TER测定以评估足细胞间TJ通透屏障的所有培养实验中，各个时间点有重复培养物并且各个实验使用不同批足细胞重复2-3次。
足细胞的occludin表达与足细胞间TJ-通透性屏障的体外装配相关。
当在Matrigel包被的二室装置上以2×104和3×106个细胞/cm2之间的不同细胞密度培养足细胞时，注意到跨越足细胞上皮的TER稳定增加(图1)。如跨越足细胞上皮的稳定TER(图1)所表明的那样，足细胞间TJ的装配在第4天完成。这些结果与用于评估足细胞间TJ通透性屏障的其它技术所得的结果一致，例如跨越足细胞上皮的[3H]-菊糖的限制性扩散，足细胞分泌产物，例如rABP、转铁蛋白的极化分泌和检验(Grima等，1992；Byers等，1986；和Janecki等，1986)。由于TER测定对足细胞间TJ装配可产生定量性评估，它不需要用放射性同位素；该方法具有高度可重复性并且建立和维持相对容易。另外，它为本领域的细胞生物学家广泛使用(Wong等，1997；Balda等，1996)。因此，选择了这一方法而不是其它方法。
以不同的细胞密度在Matrigel包被的两室装置上培养的足细胞，在TJ装配期间培养时间里显示相似的TER模式图，但足细胞间TJ的“密封度”与细胞密度呈正相关。当足细胞以3×106细胞/cm2密度培养时，4天后在三个不同的试验中TER轻度下降。这可能是细胞过密和死亡、代谢废物的聚集和营养液不足的结果。形态学研究显示以这种高密度培养的细胞伴有降解足细胞产生的DNA碎片的增加(Wong等，2000)。以低的细胞密度(2×104细胞/cm2)培养，没有检测到可测量的TJ通透性，可能是由于细胞数量不足而缺乏使TJ能够装配的邻近细胞(图1)。以高细胞密度培养(1.2×104细胞/cm2)，当Stertolil比较图2)，在第2和4.5天之间occludin稳态mRNA水平明显而短暂地提高(图2A，B)，说明TJ装配需要重新合成TJ的结构单元之一的occludin。第五天后，稳态occludin的mRNA恢复到与第1天相似的基础水平(图2A，B)。这种occludin表达的瞬时诱导在2×104细胞/cm2的低细胞密度培养物中没有检测到(图2C比较图2A、B)。这些结果与先前显示ZO-1诱导、以及TJ-缔合蛋白、和足细胞间TJ装配之间的相关性观察相一致(Chung等，1999；Wong等，2000)。
体外用对应于occludin第二外环一片段的22个氨基酸合成肽可逆性扰乱足细胞间TJ-通透性屏障评估了对应于大鼠occludin第二外环最远区域的22-个氨基酸的合成肽(表1中的残基209-230)影响足细胞间TJ装配的能力。该肽合成后，通过反相HPLC纯化合成的occludin肽(图3A，B)，并且通过定向蛋白微测序证实其身份。以1.2×106细胞/cm2的密度分离后24小时将occludin肽加入足细胞上皮诱导了TER的剂量依赖性下降(图4A)。这种肽诱导的旁细胞(paracellular)通透性屏障的破坏可在肽从培养物中除去后回复(图4B)。当与未处理的对照比较时，在第4-5天，用4μM occludin肽培养的足细胞引起TER的明显下降大约50％。在选择实验中，当第五天用F12/DMEM连续洗涤两次，从两室装置中除去occludin肽时，足细胞间TJ通透性屏障可重新装配，使TER读数在3-4天内与对照没有区别(图4B)。令人感兴趣的是，重新装配因occludin肽诱导所破坏的足细胞间TJ所用的时间与用刚刚体外分离的足细胞进行足细胞间TJ装配所用的时间大约相同，这与[Ca2+]缺失的诱导的TJ渗漏不同，因为它仅花费90分钟使足细胞重新密封受破坏的TJ(Grima等，1998)。由于occludin肽扰乱足细胞间TJ通透性屏障的作用在肽除去后是可逆的，可确定occludin肽对足细胞是无毒的。当使用4μM的22个氨基酸rMTM肽替代occludin肽时，对扰乱足细胞间TJ屏障没有明显作用(数据未显示)。而且，当在选择试验中用台盼蓝染料排斥试验评估occludin肽处理的培养物与对照培养物的细胞成活力时，没有检测到明显的差别(数据未显示)。从occludin(或其类似物)第二胞外环获得的其它多肽可通过进行前述试验容易地评估效能。
Occludin肽对体内精子发生的可逆作用HPLC纯化后，将occludin或myotubularin肽悬浮于0.9％无菌盐水中并在UV下无菌5分钟。实验组各大鼠接受含0.15mg或者1.5mg的相应纯化肽的300μl的盐水睾丸内注射。如材料和方法以及其它文献中详细描述的(Grima等，1992；Eng等，1994)那样，肽悬浮液分布于各睾丸的3个点(每个位点约100ml)。当与没有接受处理、仅用运载体处理(0.9％无菌盐水)或myotubularin肽处理的对照大鼠比较时，该纯化occludin肽睾丸内注射在2周内引起睾丸重量减少(图5)。虽然occludin肽诱导了睾丸重量和睾丸大小的下降(图5)，但睾丸的外观和附睾看来正常。图6A-C显示没有接受处理(图6A)、仅睾丸内注射运载体后14天(图6B)或者睾丸内注射盐水后14天(图6C)的对照大鼠的睾丸。图6D-F是睾丸的另一对照组，其中大鼠接受myotubularin肽睾丸内注射处理后10天(图6D)、23天(图6E)和40天(图6F)。处理睾丸的形态学分析显示更晚期的生殖细胞，例如延长的精子细胞，在occludin肽处理后8天(图6G)和16天之间开始从上皮中缺失。occludin肽睾丸内注射后27天，观察到生殖细胞基本上从所有测定的精细管上皮中大量地缺失(图6I和6J)。另外，当与仅接受运载体或myotubularin肽的对照大鼠或睾丸相比较时，occludin处理的睾丸生精小管明显缩小，小管直径减少了20-30％之多(图6I和6J比较6A-C)。occludin肽处理后27天上皮中的生殖细胞开始恢复。到第47天，在所有检测的生精小管中可清楚地看到精母细胞(图6K)，到occludin肽处理后的68天，生精上皮的形态学看来与对照大鼠没有区别(图6L)，显示从occludin肽诱导的睾丸破坏中完全恢复(图6L)。睾丸在40天内几乎完全恢复的事实(处理后68天的图6L对比处理后27天的图6I、J)说明大多数精母细胞没有被occludin肽的处理所破坏。
Occludin肽对血-睾屏障(BTB)的作用为了确定肽-诱导的生殖细胞损失是否由于BTB的破坏(它进而诱导宿主免疫系统提高了攻击从而引起生殖细胞的吸收，如图6中所显示)，在每个睾丸的三个点睾丸内注射合成肽(occludin肽或myotubularin肽)后评估了BTB的完整性，而同一动物(成年Sprague-Dawley大鼠，体重270-300gm)的其它睾丸用做对照(n＝每一时间点4-6个大鼠)。图7显示的结果清楚地表明以1.5mg/睾丸的occludin肽睾丸内注射后BTB遭到破坏。与通过颈静脉注入[125I]-BSA后的同一大鼠的未处理睾丸比较，处理后2-6周之间在occludin肽注射的睾丸中，[125I]-BSA在STF(图7A)和RTF(图7B)中累积。该肽-诱导的BTB损伤看来是可逆的，因为当用类似于图6显示的那些组织学分析检测时(数据未显示)，到处理后12周，STF和RTF中[125I]-BSA的累积急剧下降(图7A，B)，与生精上皮的恢复相一致。而从肽处理的大鼠收集的STF和RTF中的放射性水平变成与未接触occludin肽的对照睾丸没有区别(图7)。由于22个氨基酸的大鼠myotubularin肽不能诱导BTB的破坏，该occludin肽-诱导的BTB损伤似乎是特异性的，因为在myotubularin肽处理的大鼠STF或RTF中检测到的放射活性与未接受肽处理的对照大鼠没有区别(图7A，B)。
通过PCR制备编码野生型FSH亚基和相应突变体的cDNA表3显示编码野生型促滤泡激素(“FSH”)的α和β亚基、FSH-α的两个突变体和FSH-β的一个突变体的全长cDNA。表4显示可用Sorrentino等，1998所描述的杆状病毒系统制备的三个重组FSH突变体。为了获得这些cDNA，可如McPherson，1991所描述的采用PCR进行定点诱变。简言之，从大鼠脑垂体分离得到总RNA，用于采用寡(dT)15的RT反应。这些cDNA用做随后PCR的模板。合成含有突变位点的适当的引物对，如所描述的(McPherson，1991；Sorrentino等，1998)该引物对用于采用上述RT产物作为模板的PCR。制备缺乏推定的糖基化位点(见表3和4)的重组FSH蛋白(已知该糖基化位点提供了FSH的全部激素活性(Rose等，2001))，方法是将N-末端起第56和82位的Asn(N)转变为Asp(D)(见表3和表4中的突变体1)。另外，用Lys-Lys-Lys和Ala-Ala-Ala分别取代Thr-Met-Leu(残基50-52)和Met-Gly-Asn(残基75-77)制备突变体(见表3和表2中的突变体4)。目的是改变靠近推定的糖基化位点部位的疏水性和构象。第三个突变体仅由缺失推定的糖基化位点的FSH-β组成(见表3和表2中的突变体4)。表3和4显示编码三个不同的FSH-α和两个FSH-β亚基的定点诱变实验后的PCR产物，将它们亚克隆入pGEM-T载体(Promega)中用于定向核苷酸序列分析以验证序列在所需突变位点上。然后可将含有所需突变位点的cDNA与一质粒连接，例如，pAcGzt，它可用于转染入杆状病毒生产重组蛋白质。
表3.野生型FSH和FSH突变体的α和β亚基的氨基酸序列α-亚基rFSHαWTNH2-MDCYRRVAAVILVMLSMVLHILHSLPDGDLIIQGCPECKLKENKYFSKLGAPIYQCMGCCFSRAYPTPARSKKTMLVPKNITSQATCCVAKSFTKATVMGNARVENHTDCHCSTCYYHKS-COOHΔrFSHα-(56/82) NH2-MDCYRRVAAVILVMLSMVLHILHSLPDGDLIIQGCPECKLKENKYFSKLGAPIYQCMGCCFSRAYPTPARSKKTMLVPKDITSQATCCVAKSFTKATVMGNARVEDHTDCHCSTCYYHKS-COOHΔrFSHα- NH2-MDCYRRVAAVILVMLSMVLHILHSLPDGDLIIQ(50-52/75-77) GCPECKLKENKYFSKLGAPIYQCMGCCFSRAYPTPARSKKKKKVPKNITSQATCCVAKSFTKATVAAAARVENHTDCHCSTCYYHKS-COOHβ-亚基rFSHβWTNH2-MMKSIQLCILLWCLRAVCCHSCELTNITISVEKEECRFCISINTTWCEGYCYTRDLVYKDPARPNTQKVCTFKELVYETIRLPGCARHSDSLYTYPVATECHCGKCDSDSTDCTVRGLGPSYCSFGEMKE-COOHΔrFSHβ-(22-24) NH2-KSIQLCILLWCLRAVCCHSCELTNITISVEKEECRFCIS---TWCEGYCYTRDLVYKDPARPNTQKVCTFKELVYETIRLPGCARHSDSLYTYPVATECHCGKCDSDSTDCTVRGLGPSYCSFGEMKE-COOH*显示了编码大鼠FSH相应的α和β亚基的全长核苷酸序列及其突变体。以粗体表示的氨基酸残基代表信号肽。带下划线形式的氨基酸残基代表已知赋予FSH激素活性的推定的糖基化位点。以粗斜体表示的残基代表建议的突变。虚线代表缺失。
表4.推荐的重组的FSH突变体和野生型FSH(对照)FSHα-亚基FSHβ-亚基对照rFSHαWTrFSHβWT突变体1 ΔrFSHα-(56/82) ΔrFSHβ-(22-24)突变体2 ΔrFSH α-(50-52/75-77) ΔrFSHβ-(22-24)突变体3 无α亚基 ΔrFSHβ-(22-24)
行业适用性本发明涉及医疗、兽医和制药行业，具体涉及避孕领域。
本说明书中提及的所有的出版物表明了本发明所属领域技术人员的水平。所有这些出版物本文以相同的程度引入作为参考。
前面描述的具体的实施例全面揭示了本发明的总体特征，这样其它人为了各种运用，可通过应用现有的知识不难地修改和/或改写这种具体的实施例而不背离本发明总的特征。因此，这种修改和改变旨在理解与本发明公开的实施例相同的意义和范围。另外，本文所用的术语是为了描述目的而无限制性。
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权利要求
1.一种男用避孕药，所述避孕药包含具有与哺乳动物occludin第二胞外域相应的氨基酸序列的肽，或所述肽的类似物和运载体，其中，所述肽或所述肽的类似物能破坏体内足细胞间的密封连接。
2.如权利要求1所述的避孕药，其特征在于，所述避孕药还含有特异性地靶睾丸足细胞的配体，其中所述配体与所述的肽连接。
3.如权利要求2所述的避孕药，其特征在于，所述肽和所述配体通过肽键连接。
4.如权利要求2所述的避孕药，其特征在于，所述配体含有促滤泡激素(FSH)。
5.如权利要求1所述的避孕药，其特征在于，所述避孕药为适合于睾丸内注射的形式。
6.如权利要求1所述的避孕药，其特征在于，所述避孕药为适合于肠胃外给予的形式。
7.一种避孕的方法，其特征在于，所述方法包括给予雄性哺乳动物一种组合物，所述组合物包含具有与哺乳动物occludin第二胞外域相应的氨基酸序列的肽，或所述肽的类似物，和运载体，其中所述的肽能破坏体内足细胞间的密封连接。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述雄性哺乳动物是人。
9.一种生产男用避孕药的方法，所述方法包括(a)制备具有与哺乳动物occludin第二胞外域相应的氨基酸序列的肽，或所述肽的类似物，其中所述的肽能破坏体内足细胞间的密封连接；和(b)使所述肽与运载体结合。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法还包括(a)制备特异地靶向睾丸足细胞的配体；和(b)将所述肽与所述配体连接。
11.一种哺乳动物occludin第二胞外域的肽片段，所述片段可含有一个或多个取代、添加和/或缺失，并且其中所述片段能破坏体内细胞间的密封连接。
12.如权利要求11所述的肽片段，其特征在于，所述片段含有肽序列ALCNQFYTPAAT。
13.如权利要求11所述的肽片段，其特征在于，所述片段含有肽序列GSQIYTICSQFYTPGGTGLYVD。
14.一种编码具有与哺乳动物occludin第二胞外域相应的氨基酸序列的肽，或其类似物的DNA分子，其中所述肽或其类似物能破坏体内足细胞间的密封连接。
15.如权利要求14所述的DNA分子，其特征在于，所述DNA分子的第一部分编码所述的肽，其第二部分编码能选择性靶向睾丸足细胞的配体，并且其中所述DNA分子的表达产生含有所述肽和所述配体的融合蛋白。
16.如权利要求15所述的DNA分子，其特征在于，其中所述第二部分编码促滤泡激素结合域的至少一部分，该部分足以使所述融合蛋白选择性靶向睾丸足细胞。
17.如权利要求14所述的DNA分子，其特征在于，所述类似物具有对应于哺乳动物occludin第二胞外域一片段的氨基酸序列，并且就其具有至少一个氨基酸取代、添加或缺失而言，它可能不同于所述片段的天然序列。
18.一种含有如权利要求14所述的DNA分子的载体。
19.一种用如权利要求14所述的DNA分子转化的非人宿主。
20.如权利要求19所述的非人宿主是大肠杆菌。
全文摘要
本发明公开的是含有与哺乳动物occludin第二胞外域相应的氨基酸序列的肽及其类似物的男用避孕药。所述的肽可与靶向睾丸细胞的运载体连接，较佳地与修饰的促滤泡激素连接。还公开了生产这种避孕药的方法和使用方法。
文档编号A61K38/00GK1518592SQ02812282
公开日2004年8月4日 申请日期2002年6月19日 优先权日2001年6月19日
发明者C·Y·程, C Y 程 申请人:人口委员会股份有限公司