专利名称：经修饰的fvii用于治疗ards的制作方法
技术领域：
本发明涉及经修饰的FVII用于制备治疗急性肺损伤(ALI)和急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的药物的用途，还涉及治疗ALI和ARDS的方法。本发明还涉及经修饰的FVII用于制备预防或最小化与ALI或ARDS相关的慢性器官衰竭，以及预防或最小化所述慢性器官衰竭的药物的用途。
背景技术：
急性呼吸窘迫综合征(“ARDS”)是在例如创伤患者体内产生的全身性炎症反应综合征(SIRS)现象。该综合征是急性病症，其特征在于全身性炎症介质释放和内皮细胞的普遍活化，最终导致多器官功能异常综合征。感染性损伤(如脓毒病)以及非-感染性病因(如创伤和组织损伤)可产生SIRS并表现出ARDS。ARDS被描述为“炎症和增加的透性的综合征，所述透性增加与临床、放射学和生理学异常的相互影响因素相关”(Am-European Consensusfrom 1994)。它作为急性疾病或损伤，如脓毒病、肺炎、吸入、局部缺血(循环停止、出血性休克)、创伤等的并发症出现。在ARDS患者体内，肺的微管、间质和肺泡间隙是血纤蛋白沉积的主要目标。这主要是因为肺的表面积大(70m2)，以及接受全部心输出量的肺毛细管位置所致。然而，在多个器官(其中肺和肾是暴露最多的器官)中出现破坏微血栓形成的现象，这可导致产生多器官衰竭(MOF)。另外，炎症反应也可导致血浆蛋白质从血管渗漏到肺泡间隙中，导致肺水肿。
ARDS的特点是透性水肿的结果导致血氧合和呼吸系统依从的状况变糟。而多个不同的损伤可导致ARDS，共有的途径可能会导致肺损伤和/或衰竭，肺内白细胞活化以及氧自由基、rachidonic acid代谢物和炎症介质，如白细胞介素-1、蛋白酶和肿瘤坏死因子的释放导致肺泡-毛细管膜透性增加。随着该大分子屏障的丧失，肺泡中充满血清蛋白质，所述蛋白质会损害肺表面活性剂的功能(Said等，J.Clin.Invest.44458-464；Holm等，J.Appl.Physiol.631434-1442，1987)。这会产生静水力，使病情进一步恶化(Jefferies等，J.Appl.Physiol.645620-5628，1988)，导致肺泡水肿和相伴随的气体交换和肺顺应性状况变糟。
ARDS影响医疗和手术患者。综合征经常是渐进性的，其特征在于不同的阶段有不同的临床、组织病理学和放射学表现。急性或渗出期表现为具备疾病风险因子的患者呼吸衰竭的快速发作。对补氧疗法无反应的动脉血氧过少是其特征性的特征。放射学研究结果与心原性肺水肿的没有区别。两侧浸润可以是斑状或不对称的，并可包括胸膜渗漏。肺泡充满、实变和肺膨胀不全主要出现在从属的肺区域，相对而言很少会出现在其它区域。然而，尽管很少会出现上述症状，非从属区域仍会有大量炎症。病理学研究结果包括扩散的肺泡损害，肺泡间隙中有嗜中性白细胞、巨噬细胞、红细胞透明膜和富含蛋白质的水肿液，毛细管损伤和肺泡上皮被破坏。
尽管对某些患者而言，急性期过后，急性肺损伤和ARDS会完全消退，但对另一些患者而言，会发展为纤维化肺泡炎，伴随着持续性血氧过少，肺泡中不起作用的间隙增加，肺泡或肺顺应性进一步降低。因肺-毛细管床闭塞而造成的肺高血压可以是严重的并导致右室衰竭。在大多数战胜ARDS的患者中，尽管病症给肺造成了严重损伤，但肺功能在6至12个月内会恢复至接近正常水平。肺力学的残留损伤包括一氧化碳扩散能力的轻微受限、梗阻、受损，或锻炼时的气体-交换异常，但这些异常通常是无症状的。严重疾病和延长的机械换气鉴定出肺功能持续异常风险最高的患者。从此疾病中存活的患者与健康相关的生活质量降低，与肺病特异性健康相关的生活质量降低。
据大多数对ALI和ARDS的研究报道，死亡率为40-60％。大多数死亡是脓毒病或多器官功能异常而不是原发性呼吸病因所致，但最近换气(一次呼吸进肺内的空气量低)治疗的成功表明在某些情况下，死亡与肺损伤直接相关。
1988年，有人提出扩展综合征的定义，即通过使用四-点肺-损伤评分体系定量生理呼吸损伤，所述体系基于正的和呼气的压力水平、动脉氧与吸入氧的分压之比率、静态肺顺应性、和胸部放射照片上浸润事件的水平。评估中包括的其它因素是刺激性临床疾病和非肺器官功能异常的存在或缺乏。1994年，American-European Consensus Conference Committee推荐了一种新的定义首先认为临床肺损伤的严重程度有所不同血氧过少不太严重(由动脉氧与吸入氧的分压之比率为300或更低来限定)的患者被认为患有ALI，血氧过少更严重(所述比率为200或更低)的患者被认为患有ARDS。第二，该定义可简单地用于临床背景。1994年取得一致的定义和1988年肺-损伤评分体系被广泛接受，这改善了临床研究和试验的标准化。
结果，急性肺损伤(ALI)由下列标准定义(Bernard等，Am.J.Respir.Crit.Care Med 149818-24，1994)-急性发作-胸部放射照片上呈现两侧浸润-肺-动脉契压≤18mmHg或缺乏左前房高血压的临床证据-PaO2∶FiO2≤300ARDS由下列标准定义(Bernard等，Am.J.Respir.Crit.Care Med 149818-24，1994)-急性发作-胸部放射照片上呈现两侧浸润-肺-动脉契压≤18mmHg或缺乏左前房高血压的临床证据-PaO2∶FiO2≤200(PaO2表示动脉氧分压，FiO2表示吸入氧分压)与肺直接损伤有关的临床疾病以及在形成全身性疾病状态时导致间接肺损伤的疾病(见表A)可引起ARDS表A 与ARDS的发展有关的临床疾病
总的来说，脓毒病最有可能发展为ARDS，其风险约为40％。
能改变调节炎症的方式的疾病(如脓毒病)因不适当和/或过度地刺激宿主防御而导致严重的ALI。在炎症过程中，外源性凝血途径的几个组分，包括组织因子(TF)、活化的VII因子(FVIIa)和X因子(FXa)以及凝血酶与关键性的炎症介质相互作用以调节组织反应。灌注内毒素或细菌之后能快速活化凝血途径，在血管间隙中产生前凝血质环境。这些变化依赖于TF并与炎症细胞因子的增加有关。肺中的情况与之类似，在灌注了内毒素或患有实验性ALI的动物中已测出前凝血质状态。在ARDS患者的支气管肺泡灌洗液(BAL)中发现了类似的前凝血质环境，这表明血管外肺炎症也能活化外源性凝血途径。尽管炎症介质对凝血有特殊的作用，但人们对TF作用与相关凝血事件，如炎症反应中的调节因子之间的相反关系知之甚少。
本领域需要可用于治疗ALI或ARDS的药物。我们已发现经修饰的FVII能减弱急性肺损伤发展过程中的炎症和凝血病反应，用经修饰的FVII阻断已确定患有ALI或ARDS的受试者凝血能缓解肺和肾损伤，并能保持肺和肾功能。也能保护其它组织。在已确证的急性肺损伤模型中通过经修饰的FVII阻断TF/FVIIa活性能显著延长存活期，并能减弱炎症和凝血病反应。有数据可以证明这一点，所述数据表明实质上能预防血纤蛋白沉积在肺、肾和其它器官中，保持器官功能和显著减弱IL-6和IL-8释放。
提及的现有技术国际申请WO 92/15686涉及经修饰的VIIa因子，用于产生经修饰的VIIa因子的多核酸和哺乳动物细胞系，以及含有经修饰的VIIa因子、用于抑制血液凝结的组合物。
国际申请WO 94/27631涉及抑制血管再狭窄、组织因子活性和血小板沉积的方法。
国际申请WO 96/12800涉及治疗冠状动脉急性闭塞的方法，所述方法包括给个体施用含有经修饰的VIIa因子以及组织纤溶酶原激活物或链激酶的组合物。
Miller等，FASEB Journal 15(4)，A497，7 March 2001竞争性抑制FVIIa能减弱肺损伤和气管内脂多糖之后的促炎细胞因子释放。
Welty-Wolf等，American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine158(2)，610，1998细菌致敏增加了革兰氏阴性脓毒病患者的肺损伤。
Carraway等，American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine157(3)，938，1998抗E-和L-选择蛋白的抗体不能防止脓毒病狒狒的肺损伤或死亡率。
Taylor等，Critical Care Medicine 2000，28(9)，S12描述了静脉内和腹膜内大肠杆菌脓毒病狒狒模型和内毒素血症人模型中的代偿和非代偿DIC反应；获得更好的DIC定义。
Bajaj等，Thrombosis and Haemostasis 78(1)，471，1997TFPI；潜在的治疗应用。
Gando等，The Journal of TraumaInjury，Infection and Critical Care 47(4)，719，1999发展中的ARDS以及创伤和脓毒病患者的TF依赖型凝血途径的全身性活化。
Taylor等，Haemostasis 1996，26(suppl.1)，83在狒狒中，TF和FVIIa在针对LD100大肠杆菌的促凝剂和炎症反应中的作用。
Welty-Wolf等，Abstract Preview from ATS 2001，得自2001年4月的ATS网页外源性凝血阻断能减弱大肠杆菌脓毒病狒狒的炎症细胞因子水平和肺损伤。
发明简述一方面，本发明提供了经修饰的FVII用于制备治疗人急性肺损伤(ALI)或急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的药物的用途。
在一个实施方案中，本发明提供了经修饰的FVII用于制备治疗与人急性肺损伤(ALI)或急性呼吸窘迫综合征(ARDS)相关的症状和疾病的药物的用途。
在一个实施方案中，所述药物用于治疗器官衰竭。
在一个实施方案中，所述药物用于预防其它器官的衰竭。
在一个实施方案中，所述药物用于维持或改善器官功能。在一个实施方案中，所述药物用于治疗肺高血压。在一个实施方案中，所述药物用于使前凝血质活性降低或最小化。在一个实施方案中，前凝血质活性与肺上皮细胞和组织巨噬细胞的组织因子表达有关。在一个实施方案中，所述药物用于减轻或最小化炎症。在一个实施方案中，所述药物用于使IL-6和IL-8的产生减少或最小化。在一个实施方案中，所述药物用于改善肺气体交换。在一个实施方案中，所述药物用于减轻或最小化肺水肿。在一个实施方案中，所述药物用于减少或最小化肺蛋白渗漏。
另一方面，本发明提供了经修饰的FVII用于制备预防或最小化与人ALI或ARDS相关的慢性器官衰竭的药物的用途。在一个实施方案中，ALI或ARDS在施用经修饰的FVII之前即已被确证。
在本发明的一个实施方案中，器官是肾、肺、肾上腺、肝脏、小肠、心血管系统或止血系统。在一个实施方案中，器官是肺。在一个实施方案中，器官是肾。在一个实施方案中，器官是心血管系统。在一个实施方案中，器官是止血系统。
一方面，本发明提供了治疗人急性肺损伤(ALI)或急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的方法，所述方法包括给需要这种治疗的受试者施用治疗有效量的经修饰的FVII。
在本发明不同的实施方案中，所述方法用于治疗器官衰竭，预防其它器官衰竭，治疗肺高血压，使前凝血质活性降低或最小化，减轻或最小化炎症，使IL-6和IL-8的产生减少或最小化，改善肺气体交换，减轻或最小化肺水肿，以及减轻或最小化肺蛋白渗漏。
一方面，本发明提供了预防或最小化与人ALI或ARDS相关的慢性器官衰竭的方法，所述方法包括给需要这种治疗的受试者施用治疗有效量的经修饰的FVII。在一个实施方案中，ALI或ARDS在施用经修饰的FVII之前即已被确证。
另一方面，本发明提供了FVIIai用于制备治疗肺衰竭的药物的用途。在一个实施方案中，肺损害是急性肺损伤(ALI)。在一个实施方案中，肺损害是急性呼吸窘迫综合征(ARDS)。在一个实施方案中，治疗肺损害是防止ALI发展成为ARDS。另一方面，本发明提供了FVIIai用于制备防止已确证的ALI或ARDS患者遭受进一步肺损害的药物的用途。另一方面，本发明提供了FVIIai用于制备维持或改善已确证的ALI或ARDS患者的肺功能的药物的用途。一方面，本发明提供了治疗受试者肺损害的方法，所述方法包括给需要这种治疗的受试者施用治疗有效量的FVIIai。在一个实施方案中，肺损害是急性肺损伤(ALI)。在一个实施方案中，肺损害是急性呼吸窘迫综合征(ARDS)。在一个实施方案中，治疗肺损害是防止ALI发展成为ARDS。另一方面，本发明提供了防止已确证的ALI或ARDS患者遭受进一步肺损害的方法，所述方法包括给需要这种治疗的受试者施用治疗有效量的FVIIai。另一方面，本发明提供了维持或改善已确证的ALI或ARDS患者的肺功能的方法，所述方法包括给需要这种治疗的受试者施用治疗有效量的FVIIai。另一方面，本发明提供了经修饰的FVII用于制备治疗肺高血压的药物的用途。另一方面，本发明提供了治疗受试者的肺高压的方法，所述方法包括给需要这种治疗的受试者施用治疗有效量的经修饰的FVII。在一个实施方案中，肺高血压与急性肺损伤(ALI)有关；在另一个实施方案中，肺高血压与急性呼吸窘迫综合征(ARDS)有关。另一方面，本发明提供了经修饰的FVII用于制备降低或抑制肺中的前凝血质活性的药物的用途。另一方面，本发明提供了降低或抑制受试者肺中的前凝血质活性的方法，所述方法包括给需要这种治疗的受试者施用治疗有效量的经修饰的FVII。在一个实施方案中，前凝血质活性与肺上皮细胞和组织巨噬细胞的组织因子表达有关。一方面，本发明提供了经修饰的FVII用于制备减少或抑制血管外血纤蛋白沉积的药物的用途。另一方面，本发明提供了减少或抑制受试者的血管外血纤蛋白沉积的方法，所述方法包括给需要这种治疗的受试者施用治疗有效量的经修饰的FVII。在一个实施方案中，血管外血纤蛋白沉积是肺中的沉积。在一个实施方案中，血管外血纤蛋白沉积是器官损伤过程中的沉积。一方面，本发明提供了经修饰的FVII用于制备减轻或抑制肺炎症的药物的用途。另一方面，本发明提供了减轻或抑制受试者肺炎症的方法，所述方法包括给需要这种治疗的受试者施用治疗有效量的经修饰的FVII。
在本发明的一个实施方案中，经修饰的FVII是在催化三联体中具有至少一个氨基酸残基取代、插入或缺失的FVII。在一个实施方案中，经修饰的FVII是在Ser344，Asp242和His193位(位置参照的是美国专利4,784,950中描述的野生型人FVII序列)具有至少一个氨基酸残基取代、插入或缺失的FVII。在一个实施方案中，活性位点残基Ser344被修饰，被Gly，Met，Thr取代，或更优选被Ala取代。在一个实施方案中，经修饰的FVII是通过与丝氨酸蛋白酶抑制剂反应而被修饰的FVIIa。在一个实施方案中，蛋白酶抑制剂是有机磷化合物，磺酰氟(sulfanyl fluoride)，肽卤甲基酮或氮杂肽(azapeptide)。在一个实施方案中，蛋白酶抑制剂是选自下列的肽卤甲基酮丹磺酰-L-Phe-Pro-Arg氯甲基酮，丹磺酰-L-Glu-Gly-Arg氯甲基酮，丹磺酰-L-Phe-Phe-Arg氯甲基酮和L-Phe-Phe-Arg氯甲基酮，丹磺酰-D-Phe-Pro-Arg氯甲基酮，丹磺酰-D-Glu-Gly-Arg氯甲基酮，丹磺酰-D-Phe-Phe-Arg氯甲基酮和D-Phe-Phe-Arg氯甲基酮。在一个实施方案中，蛋白酶抑制剂是D-Phe-Phe-Arg氯甲基酮。
在一个实施方案中，经修饰的VII因子的催化活性为相应物种的野生型VII因子催化活性的约5％以下，更优选约1％以下。
在一个实施方案中，脓毒病诱发ALI或ARDS；在一个实施方案中，创伤诱发ALI或ARDS。
在一个实施方案中，本发明提供了经修饰的FVII用于制备治疗已确证的人急性肺损伤(ALI)或已确证的人急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的药物的用途。
在一个实施方案中，以一次或多次大丸剂注射的形式施用经修饰的FVII。
在一个实施方案中，对于70kg重的患者而言，经修饰的FVII的给药量约为0.05mg至500mg/天；1mg至200mg/天；1mg至约150mg/天；1mg至约125mg/天；1mg至约100mg/天；10mg至约175mg/天；10mg至约150mg/天；或10mg至约125mg/天。
在一个实施方案中，通过多次静脉内注射施用经修饰的FVII。
在一个实施方案中，经修饰的FVII的每天(24小时)给药剂量为100μg/kg×1，100μg/kg×2，100μg/kg×4，200μg/kg×1，200μg/kg×2，200μg/kg×4，400μg/kg×1，400μg/kg×2，400μg/kg×4，800μg/kg×1或800μg/kg×2。在一个实施方案中，给患者施用一天的经修饰的FVII；在另一个实施方案中，给患者施用两天的经修饰的FVII；在另一个实施方案中，给患者施用三天的经修饰的FVII。
图1.大肠杆菌脓毒病中的组织因子(TF)表达。Western印迹(A)表明与用FVIIai预防性治疗过的正常狒狒肺相比，脓毒病对照动物肺中的TF表达有所增加。两只用TFPI治疗的动物中有一只的TF表达没有变化。图中显示出代表性的印迹。(B)对脓毒病对照和经FVIIai治疗的组进行光密度测定法，并归一化至非-脓毒病正常对照动物的平均值。两个实验组中的n＝6，正常对照组中的n＝3。所示数据为平均值±sem(*p＜0.05对正常对照，δp＜0.05对脓毒病对照)。
图2.通过FVIIai预防脓毒病-诱发的肺损伤。数据被表示为从t＝12小时至显示出药效时的变化。图中还显示出得自用TFPI治疗的两只动物的数据和得自该实验室脓毒病对照的累积数据。-●-表示脓毒病对照组(n＝6)，-*-表示脓毒病+FVIIai(n＝6)，...表示累积的脓毒病对照(n＝11)，----表示脓毒病+TFPI(n＝2)。将数据表示为平均值±sem，并使用二因子ANOVA分析数据(*p＜0.05)。FVIIai能防止(A)动脉-肺泡氧梯度增加(AaDO2，p＜0.0001)，(B)肺系统顺应性下降(Cs，p＜0.001)，(C)肺动脉压(PAM，p＜0.001)的平均值增加，和(D)肺血管抗性(PVR，p＜0.05)。
图3.FVIIai治疗能减轻肺炎症。与脓毒病对照相比，经治疗的动物中的肺MPO活性和BAL LDH有所降低(p＝0.07和*p＜0.01)。这两组之间的BAL蛋白没有区别。将数据表示为平均值±sem，并使用t-检验分析数据。
图4.在经FVIIai治疗的动物中，脓毒病-诱发的损伤的肾和代谢指标有所改善。(A)在经FVIIai治疗的脓毒病动物中，血清[HCO3-]较高(p＜0.01)。(B)在脓毒病对照组而不是经FVIIai治疗的脓毒病组中，血清肌酸酐增加(p＝0.059)。(C)和(D)显示出两组中类似的液体平衡(静脉内液体减去尿排泄量)，但在经FVIIai治疗的动物中，脓毒病过程中的尿排泄量较高(p＜0.0001)。将数据表示为平均值±sem，并使用二因子ANOVA分析数据。-●-表示脓毒病对照组(n＝6)，-*-表示脓毒病+FVIIai(n＝6)。
图5.FVIIai缓解脓毒病-诱发的凝血病。(A)脓毒病导致PTT逐渐延长，而在经FVIIai治疗的动物中，PTT缩短，p＜0.01。治疗组的血纤蛋白原耗尽(B)和TAT复合物升高(C)有所减弱，对两者而言，p＜0.0001。两组中被表示为试剂盒标准的百分比的ATIII活性(D)降低，但差异不具有统计学意义。将数据表示为平均值±sem，并使用二因子ANOVA分析数据。-●-表示脓毒病对照组(n＝6)，-*-表示脓毒病+FVIIai(n＝6)。
图6.通过FVIIai可以减弱脓毒病中的炎症细胞因子。将数据表示为平均值±sem，并使用二因子ANOVA分析数据。-●-表示脓毒病对照组(n＝6)，-*-表示脓毒病+FVIIai(n＝6)。通过用FVIIai治疗，使脓毒病诱发的IL-6(A)，IL-8(B)和TNFR-1(D)水平的增加被减弱，对所有组而言，p＜0.01。通过TF阻断，IL-1β水平(C)未改变。
发明详述简称AaDO2动脉-肺泡氧梯度APTT 活化的部分促凝血酶原激酶时间ALI 急性肺损伤APC 活化的C蛋白ARDS 急性呼吸窘迫综合征ASIS FFR-rFVllaBAL 支气管肺泡灌洗液BUN 血尿氮BW 体重CO 心输出量，UminCs 肺系统顺应性下降DO2 氧传递，mUminDVT 深静脉血栓形成F1-2 纤蛋白原片段1和2FiO2 吸入氧分压FFR D-苯基丙氨酰-L-苯基丙氨酰-L-精氨酰-三肽FFR-rFVIIa FFR-失活的，rFVIIaFPA 血纤肽AFVII 人凝血因子VIIFVIIa人活化的凝血因子VIIIL-1β白细胞介素-1βIL-6 白细胞介素-6IL-8 白细胞介素-8Kg 千克LPS 脂多糖MW 分子量NIH 国立卫生研究院NOEL 未观察到效果水平PAM 平均肺动脉压增加PaO2 动脉血液的氧张力PCWP 肺毛细管契压，mm HgPT 凝血酶原时间PTCA 经皮照影冠状血管成形术PVR 肺血管抗性RBC 红血细胞
rFVIIa 重组、活化的人VII因子SVR 全身血管抗性，达因×cm×kg/10TAT 凝血酶-抗凝血酶复合物TF 组织因子TNFR-1 TNF受体-1TFPI组织因子途径抑制剂VO2 氧消耗，mL/minμg 微克术语“器官损害”包括但不限于肾、肺、肾上腺、肝脏、肠、心血管系统和/或止血系统的结构损害和/或器官功能损害。器官损害的例子包括但不限于形态/结构损害和/或器官功能损害，例如因肺清除损害或肺交换机制损害或肺泡-毛细管膜损害造成的蛋白质(如表面活性剂)或液体的积累。术语“器官损伤”，“器官损害”和“器官衰竭”可以互换使用。一般说来，器官损害导致器官衰竭。器官衰竭指的是与未患ALI或ARDS的人的相应器官的平均正常功能相比，器官功能有所减弱。器官衰竭可以是功能稍微减弱(如为正常功能的80-90％)或功能大幅度减弱(如为正常功能的10-20％)；减弱也可以是器官功能完全衰竭。器官衰竭包括但不限于例如因组织坏死、缺乏肾小球(肾)、血纤蛋白沉积、出血、水肿或炎症造成的生物功能(例如尿排泄量)减小。器官损害包括但不限于组织坏死、缺乏肾小球(肾)、血纤蛋白沉积、出血、水肿或炎症。
术语“肺损害”包括但不限于先天异常或获得性异常所造成的肺损害，如因自身免疫病发作、移植后肺排斥、导致炎症反应的感染、肺内压力/体积关系的变化、使所述哺乳动物暴露于外部因子(如香烟或灰尘)以及有害或有毒试剂(如溶剂或烟)中，或因暴露于治疗剂而导致的不合乎需要的副作用所造成的肺损害。肺损害的例子包括但不限于形态/结构损害和/或肺功能损害，例如因肺清除损害或肺交换机制损害或肺泡-毛细管膜损害造成的蛋白质(如表面活性剂)或液体的积累。术语“肺损伤”，“肺损害”和“肺衰竭”可以互换使用。
检测器官功能和效力的方法和用于这种检测的适当生化或临床参数是熟练的临床医生所熟知的。
器官功能的标志或生化参数是例如呼吸PaO2/FiO2比率凝血血小板肝脏胆红素心血管血压和对血管加压处理的需求肾肌酸酐和尿排泄量其它临床评估可包括无需通风设备的天数，未出现器官衰竭的天数，未进行血管加压处理的天数，SOFA评分和肺损伤评分评价以及生命体征。
检测凝血病或炎症的方法也是熟练的临床医生所熟知的。凝血病或炎症的标志是例如PTT、血纤蛋白原耗尽、TAT复合物升高、ATIII活性、IL-6、IL-8和TNFR-1。
术语“慢性器官损害”包括但不限于因患有ALI或ARDS而导致的长期损害。这一残留的损害，特别是肺力学的损害包括但不限于一氧化碳扩散能力的轻微受限、梗阻、受损，或锻炼时的气体-交换异常，伴随着持续血氧过少的纤维化肺泡炎，肺泡不起作用的间隙增加，肺泡或肺顺应性进一步降低。因肺-毛细管床闭塞而造成的肺高血压可以是严重的并导致右室衰竭。
在本发明的上下文中，术语“治疗”包括治疗已确证的ALI，治疗已确证的ARDS，以及防止已确证的ALI发展成为ARDS。治疗包括减弱、消除、最小化、减轻或缓解与ALI或ARDS有关的症状或病症，包括但不限于防止在施用经修饰的FVII时已遭受某种程度器官衰竭和/或损害的器官进一步损害和/或衰竭，以及防止在给药时尚未遭受器官衰竭和/或损害的其它器官发展为损害和/或衰竭。所述症状或病症的例子包括但不限于对例如但不限于肺、肾、肾上腺、肝脏、肠、心血管系统和/或止血系统这些器官的形态/结构损害和/或功能损害。所述症状或病症的例子包括但不限于对器官的形态/结构损害和/或功能损害，例如，因肺清除损害或肺交换机制损害或肺泡-毛细管膜损害、尿排泄量减少(肾)、组织坏死、缺乏肾小球(肾)、血纤蛋白沉积、出血、水肿或炎症而造成的蛋白质(如表面活性剂)或液体的积累。
“减轻”器官衰竭或损害指的是通过对所述器官的至少一个众所周知的功能标志进行测定，发现器官功能有所改善；当器官衰竭或损害减轻时，与在未患ALI或ARDS的人中发现的值相比较，将选定标志的值归一化。
“经确证的”ALI或ARDS指的是根据上述四-点肺-损伤评分系统，将患者评估为患有ALI或ARDS(Bernard等，Am.J.Respir.Crit.Care Med149818-24，1994)，或者指的是已在患者中观察到与ALI或ARDS相关的症状或病症。
暴露于多种肺损伤因子之后急性肺损伤(ALI)可以发展，所述肺损伤因子例如但不限于吸出胃内容物、肺炎、脓毒病、大量输血、多处创伤和胰腺炎。少数患者发展成更严重的肺损伤，称之为成人或急性呼吸窘迫综合征(ARDS)，其死亡率为40-50％左右。暴露于多种肺损伤因子之后ARDS也可以发展，所述肺损伤因子例如但不限于吸出胃内容物、肺炎、脓毒病、大量输血、多处创伤和胰腺炎。
在本说明书的上下文中，术语“经修饰的VII因子”和“位点-失活的VIIa因子”、“活性位点-失活的VIIa因子”或“FVIIai”可以互换使用。经修饰的VII因子或FVIIai可以是酶原(即单链分子)的形式，或者可以在其活性位点被裂解。因此，“经修饰的VII因子”欲包括经修饰的VII因子和经修饰的VIIa因子分子，这两种分子能结合组织因子并抑制IX因子活化成IXa以及X因子活化成Xa。人FVIIa公开于例如美国专利4,784,950(野生型VII因子)。VII因子序列具有至少一个氨基酸修饰，其中选择修饰以大大降低活化VII因子催化血浆X或IX因子活化的能力，从而能抑制凝血活性。经修饰的VII因子具有被至少一个氨基酸取代修饰的活性位点，其修饰形式能结合组织因子。经修饰的VII因子组合物一般为基本上纯的形式。
在人和牛VII因子的优选实施方案中，活性位点残基Ser344被修饰，被Gly，Met，Thr取代，更优选被Ala取代。所述取代可以分开进行或与催化三联体中其它位点(包括His193和Asp242)的取代联合进行。
经修饰的VII因子可由多核苷酸分子编码，所述分子含有两个可操作相连的区域编码序列，它们分别编码前-肽原和维生素K-依赖型血浆蛋白质的gla结构域以及无gla结构域的VII因子蛋白质，其中通过表达，所述多核苷酸编码经修饰的VII因子分子，该分子不能显著活化血浆X或IX因子，但能结合组织因子。由此多核苷酸表达的经修饰的VII因子分子是具有生物活性的抗凝血剂，即它能抑制凝血级联系统，因此形成血纤蛋白沉积物或凝血块。为了表达经修饰的VII因子，将多核苷酸分子转染至哺乳动物细胞系，例如BHK，BHK570或293细胞系。
通过催化中心或三联体的化学衍生化，可以抑制VIIa因子的催化活性。通过使VII因子与不可逆抑制剂反应，或通过酰化即可完成衍生化，所述抑制剂如有机磷化合物，磺酰氟，肽卤甲基酮或氮杂肽。优选的肽卤甲基酮包括PPACK(D-Phe-Pro-Arg氯甲基酮；参见美国专利4,318,904，列入本文作为参考)，D-Phe-Phe-Arg和Phe-Phe-Arg氯甲基酮(FFR-cmk)；和DEGRck(丹磺酰-Glu-Gly-Arg氯甲基酮)。
通过取代、插入或缺失氨基酸也可以抑制VIIa因子的催化活性。在优选的实施方案中，在VII因子催化三联体的氨基酸序列中进行氨基酸取代，所述三联体在本文中被定义为含有对VIIa因子催化位点起作用的氨基酸的区域。催化三联体中的取代、插入或缺失一般位于或邻近于形成催化位点的氨基酸。在人和牛VII因子蛋白质中，形成催化“三联体”的氨基酸是Ser344、Asp242和His193(下标的数字表示在序列中的位置)。使用目前已知的技术，包括蛋白质分离和氨基酸序列分析，可以测定其它哺乳动物物种的VII因子的催化位点。通过将序列与其它丝氨酸蛋白酶，特别是已测出活性位点的胰凝乳蛋白酶序列(Sigler等，J.Mol.Biol.，35143-164(1968)，列入本文作为参考)进行比对，由所述比对结果确定类似的活性位点残基，也可以测定催化位点。
进行氨基酸取代、插入或缺失以防止或要不然抑制VIIa因子对X和/或IX因子的活化。通过例如在含有包埋于脂质膜中的TF和X因子的系统中，测定VIIa因子产生Xa因子的能力(Persson等，J.Biol.Chem.27219919-19924，1997)；或者在水系统中测定X因子水解(参见下文的“体外蛋白酶解试验”)可以容易地进行测定。然而，经过如此修饰的VII因子应该也能保持与真正的VII因子和/或VIIa因子竞争结合凝血级联系统中的组织因子的能力。通过例如本文所述的凝血试验(如美国专利5,997,864所述)，或使用例如具有细胞表面组织因子的细胞系，如人膀胱癌细胞系J82的竞争结合试验(Sakai等，J.Biol.Chem.2649980-9988(1989)，列入本文作为参考)，或通过使用基于表面胞质基因组共振的仪器测定其与TF的物理结合(例如，Persson，FEBS Letts.413359-363，1997)，可以容易地测定竞争。
在VII因子中形成催化位点的氨基酸，如人和牛VII因子中的Ser344、Asp242和His193可以被取代或缺失。在本发明中，优选仅改变单个氨基酸，从而使增加分子抗原性或抑制其结合组织因子的能力的可能性最小化，然而，也可以进行两个或多个氨基酸改变(取代、添加或缺失)，也可以进行取代、添加和缺失的组合。在人和牛VII因子的优选实施方案中，优选Ser344被Ala取代，但Gly、Met、Thr或其它氨基酸也可以被取代。优选用Glu取代Asp，用Lys或Arg取代His。一般说来，选择取代应尽可能少地破坏蛋白质的三级结构。Dayhoff等(Atlas of Protein Structure 1978，Nat′l Biomed.Res.Found.，Washington，D.C.，列入本文作为参考)的模型可用作选择其它氨基酸取代的指南。可以按上文所述在人、牛或其它物种的适当VII因子序列的催化位点中导入残基改变，并按本文所述检测所得蛋白质抑制催化活性的水平以及所得的抗凝血剂活性。对于经修饰的VII因子而言，催化活性被大幅度抑制，一般为相应物种野生型VII因子催化活性的约5％以下，更优选约1％以下(例如在下文“体外蛋白酶解试验”中测定的数据)。
通过使用重组DNA技术也可产生经修饰的VII因子。一般说来，修饰克隆的野生型VII因子DNA序列以编码所需蛋白质。然后将经修饰的序列插入表达载体，再将表达载体转化或转染至宿主细胞。优选将高等真核细胞，特别是经培养的哺乳动物细胞用作宿主细胞。人VII因子的完整核苷酸和氨基酸序列是已知的。参见美国专利4,784,950，列入本文作为参考，其中描述了重组人VII因子的克隆和表达。牛VII因子序列描述于Takeya等，J.Biol.Chem.26314868-14872(1988)，列入本文作为参考。
通过多种技术可以完成氨基酸序列改变。通过位点-特异性诱变可以修饰DNA序列。位点-特异性诱变技术是本领域众所周知的，描述于例如Zoller和Smith(DNA 3479-488，1984)。因此，使用VII因子的核苷酸和氨基酸序列，可以导入所选择的改变。
相应被修饰的VII因子包括氨基末端部分(gla结构域)被维生素K-依赖型血浆蛋白质IX因子、X因子、凝血酶原、C蛋白、S蛋白或Z蛋白之一的gla结构域取代的蛋白质。维生素K-依赖型血浆蛋白质的gla结构域的特征在于存在γ-羧基谷氨酸残基，一般长度约为30至40个氨基酸，C末端对应于各个基因的外显子-内含子边界的位置。美国专利4,784,950(列入本文作为参考)中公开了产生具有异源gla结构域的VII因子的方法。
用于产生经修饰的VII因子的DNA序列一般在VII因子蛋白质的氨基末端编码前肽原以获得适当的翻译后加工(例如谷氨酸残基的γ-羧基化)并从宿主细胞中分泌出去。前肽原可以是VII因子或另一种维生素K-依赖型血浆蛋白质，如IX因子、X因子、凝血酶原、C蛋白或S蛋白的前肽原。本领域技术人员应懂得在经修饰的VII因子的氨基酸序列中还可进行其它修饰，其中所述修饰不能显著削弱蛋白质用作抗凝血剂的能力。例如，也可在活化裂解位点处修饰催化三联体已被修饰的VII因子，以抑制酶原VII因子转变为其活化的双链形式，所述方法一般性地描述于美国专利5,288,629(列入本文作为参考)。
通过在抗-VII因子抗体柱上进行亲和层析可以纯化经修饰的VII因子。特别优选使用依赖于钙的单克隆抗体，参见Wakabayashi等，J.Biol.Chem.26111097-11108，(1986)和Thim等，Biochem.277785-7793，(1988)(列入本文作为参考)。通过常规的化学纯化方法，例如高效液相层析也可以进行纯化。其它纯化方法，包括柠檬酸钡沉淀也是本领域所熟知的，可应用于纯化本文所述的新的经修饰VII因子(一般性地参见Scopes，R.，ProteinPurification，Springer-Verlag，N.Y.，1982)。为了药用目的，优选均一性至少约为90至95％的基本上纯的经修饰VII因子，最优选均一性为98至99％或更高。一旦被部分纯化或达到所需的均一性，即可将经修饰的VII因子用于治疗。
在其活化位点裂解经修饰的VII因子，以将其转变为双链形式。根据本领域已知的方法进行活化，所述方法如Osterud等，Biochemistry 112853-2857(1972)；Thomas，美国专利4,456,591；Hedner and Kisiel，J.Clin.Invest.711836-1841(1983)；或Kisiel and Fujikawa，Behring Inst.Mitt.7329-42(1983)，列入本文作为参考。然后按下文所述配制和施用所得分子。
给药和剂量本发明打算将用于治疗肺衰竭的药物组合物非肠道给药。优选药物组合物能被非肠道给药，即静脉内、皮下、肌内或肺内给药。用于非肠道给药的组合物包括溶解于可接受载体，优选为含水载体中的经修饰VII因子分子的溶液。可以使用多种含水载体，例如水、缓冲水、0.4％盐水、0.3％甘氨酸等。也可将经修饰的VII因子分子配制成脂质体制品以用于传递或靶向损伤位点。脂质体制品一般性地描述于例如美国专利4,837,028、4,501,728和4,975,282(列入本文作为参考)。可通过常规的众所周知的灭菌技术对组合物进行灭菌。将所得水溶液包装待用，或在无菌条件下过滤并冻干，给药前使冻干制品与无菌水溶液混合。必要时，组合物可含有药物可接受的辅助物质以接近生理条件，如pH调节和缓冲试剂，张力调节剂等，例如醋酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙等。这些制剂中的经修饰VII因子的浓度可以有较宽的范围，即从体重的约0.5％以下，通常为或至少约为1％至高达15或20％，主要根据所选定的具体给药方式，液体体积和粘度等来选择浓度。
因此，静脉内灌注用的典型药物组合物可含有250ml无菌的林格溶液和10mg经修饰的VII因子。制备可非肠道给药的化合物的实用方法对本领域技术人员而言是公知的或显而易见的，该方法详细描述于例如Remington′s Pharmaceutical Science，16th ed.，Mack Publishing Company，Easton，PA(1982)(列入本文作为参考)。
以足以治愈或至少部分抑制疾病及其并发症的量，给上述已患病的患者施用含有经修饰VII因子的组合物。将足以达到此目的的量定义为“治疗有效剂量”。对该用途有效的量取决于疾病或损伤的严重程度以及患者的体重和一般状况，但对于70kg重的患者而言，负载和维持剂量约为0.05mg至500mg/天，更优选为1mg至200mg/天，例如1mg至约150mg/天，1mg至约125mg/天，1mg至约100mg/天，10mg至约175mg/天，10mg至约150mg/天，或10mg至约125mg/天。
必须考虑到本发明的物质一般用于严重疾病或损伤状态，即威胁生命或潜在威胁生命的情况。在这种情况下，考虑到最小化外来物质和经修饰的人VII因子在人中一般无免疫原性，治疗医生可以给患者施用大大过量的所述经修饰VII因子组合物。
通过单次或多次给药即可施用药物。对于每天都需要维持水平的患者而言，可通过例如重复静脉内注射，或通过使用便携式泵系统连续灌注来施用经修饰的VII因子。治疗ARDS时，经修饰FVIIa的给药模式是例如约1mg/kg静脉内剂量作为负载剂量，接着以约0.05mg/kg/小时作为维持剂量(mg/kg指的是患者每kg体重需要的经修饰VII因子的mg数)。另一种模式是例如每天(24小时)施用单剂量或多剂量的经修饰FVII，例如100μg/kg×1，100μg/kg×2，100μg/kg×4，200μg/kg×1，200μg/kg×2，200μg/kg×4，400μg/kg×1，400μg/kg×2，400μg/kg×4，800μg/kg×1或800μg/kg×2。该剂量可以一天或多天施用，例如(每天100μg/kg×1)×2天，(100μg/kg×2)×2天，(100μg/kg×4)×2天，(200μg/kg×1)×2天，(200μg/kg×2)×2天，(200μg/kg×4)×2天，(400μg/kg×1)×2天，(400μg/kg×2)×2天，(400μg/kg×4)×2天，(800μg/kg×1)×2天或(800μg/kg×2)×2天。优选通过静脉内注射施用药物。
经修饰的FVII或另一种TF拮抗剂(如抗-TF抗体)也可以与活化的C蛋白(APC)或其保留APC生物活性的片段或变体联合给药。此时，施用第一量的经修饰FVII或TF拮抗剂和第二种量的APC或其具有生物活性的变体或片段，其中第一和第二种量合起来能有效治疗ALI或ARDS。
组合物可以是单制品形式(单剂量形式)，其中含有适当浓度的经修饰的FVII或另一种TF拮抗剂的制品，以及APC或其具有生物活性的片段或变体的制品。组合物也可以是由多部分组成的试剂盒形式，所述试剂盒由第一单位剂量形式和第二单位剂量形式组成，前者含有经修饰的FVII或另一种TF拮抗剂的制品，后者含有APC或其具有生物活性的片段或变体的制品。可以先施用任一种组分。本说明书上下文中提到第一或第二或第三等单位剂量仅是为了便于表述，并不表示优选的给药次序。优选通过相同的静脉内入口注射这两种产品。试剂盒中包括盛放分开的组合物的容器，如分开的瓶或分开的箔袋。试剂盒中一般还包括施用分开的组分的说明书。当优选以不同的剂量形式，不同的剂量间隔施用分开的组分时，或当开处方的医生要求滴定组合中的各个组分时，试剂盒形式特别有用。
根据本发明施用的经修饰FVII或另一种TF拮抗剂的量和APC或其具有生物活性的片段或变体的量的比率可以在约1∶100至约100∶1(w/w)之间变化。因此，经修饰FVII或另一种TF拮抗剂与APC或其具有生物活性的片段或变体的比率可以是例如约1∶100，或1∶90，或1∶80，或1∶70，或1∶60，或1∶50，或1∶40，或1∶30，或1∶20，或1∶10，或1∶5，或1∶2，或1∶1，或2∶1，或5∶1，或10∶1，或20∶1，或30∶1，或40∶1，或50∶1，或60∶1，或70∶1，或80∶1，或90∶1，或100∶1；或约1∶90至约1∶1，或约1∶80至约1∶2，或约1∶70至约1∶5，或约1∶60至约1∶10，或约1∶50至约1∶25，或约1∶40至约1∶30，或约90∶1至约1∶1，或约80∶1至约2∶1，或约70∶1至约5∶1，或约60∶1至约10∶1，或约50∶1至约25∶1，或约40∶1至约30∶1，或约10∶1至约1∶10，或约5∶1至约1∶5。
经修饰的FVII或另一种TF拮抗剂(如抗-TF抗体)也可以与TFPI或其保留TFPI生物活性的片段或变体联合给药。此时，施用第一量的经修饰FVII或另一种TF拮抗剂和第二种量的TFPI或其具有生物活性的变体或片段，其中第一和第二种量合起来能有效治疗ALI或ARDS。
组合物可以是单制品形式(单剂量形式)，其中含有适当浓度的经修饰的FVII或另一种TF拮抗剂的制品，以及TFPI或其具有生物活性的片段或变体的制品。组合物也可以是由多部分组成的试剂盒形式，所述试剂盒由第一单位剂量形式和第二单位剂量形式组成，前者含有经修饰的FVII或另一种TF拮抗剂的制品，后者含有TFPI或其具有生物活性的片段或变体的制品。可以先施用任一种组分。本说明书上下文中提到第一或第二或第三等单位剂量仅是为了便于表述，并不表示优选的给药次序。优选通过相同的静脉内入口注射这两种产品。试剂盒中包括盛放分开的组合物的容器，如分开的瓶或分开的箔袋。试剂盒中一般还包括施用分开的组分的说明书。当优选以不同的剂量形式，不同的剂量间隔施用分开的组分时，或当开处方的医生要求滴定组合中的各个组分时，试剂盒形式特别有用。
根据本发明施用的经修饰FVII或另一种TF拮抗剂的量和TFPI或其具有生物活性的片段或变体的量的比率可以在约1∶100至约100∶1(w/w)之间变化。因此，经修饰FVII或另一种TF拮抗剂与TFPI或其具有生物活性的片段或变体的比率可以是例如约1∶100，或1∶90，或1∶80，或1∶70，或1∶60，或1∶50，或1∶40，或1∶30，或1∶20，或1∶10，或1∶5，或1∶2，或1∶1，或2∶1，或5∶1，或10∶1，或20∶1，或30∶1，或40∶1，或50∶1，或60∶1，或70∶1，或80∶1，或90∶1，或100∶1；或约1∶90至约1∶1，或约1∶80至约1∶2，或约1∶70至约1∶5，或约1∶60至约1∶10，或约1∶50至约1∶25，或约1∶40至约1∶30，或约90∶1至约1∶1，或约80∶1至约2∶1，或约70∶1至约5∶1，或约60∶1至约10∶1，或约50∶1至约25∶1，或约40∶1至约30∶1，或约10∶1至约1∶10，或约5∶1至约1∶5。
经修饰的FVII或另一种TF拮抗剂(如抗-TF抗体)也可以与能降低血液葡萄糖的药剂，如胰岛素，优选能将每分升患者血浆中的血液葡萄糖维持在100mg或更低的药剂联合给药。此时，施用第一量的经修饰FVII或另一种TF拮抗剂，和第二种量的能降低血液葡萄糖的药剂，如胰岛素或其具有生物活性的变体或片段，其中第一和第二种量合起来能有效治疗ALI或ARDS。
组合物可以是单制品形式(单剂量形式)，其中含有适当浓度的经修饰的FVII或另一种TF拮抗剂的制品，以及能降低血液葡萄糖的药剂，如胰岛素或其具有生物活性的片段或变体的制品。组合物也可以是由多部分组成的试剂盒形式，所述试剂盒由第一单位剂量形式和第二单位剂量形式组成，前者含有经修饰的FVII或另一种TF拮抗剂的制品，后者含有能降低血液葡萄糖的药剂，如胰岛素或其具有生物活性的片段或变体的制品。可以先施用任一种组分。本说明书上下文中提到第一或第二或第三等单位剂量仅是为了便于表述，并不表示优选的给药次序。优选通过相同的静脉内入口注射这两种产品。试剂盒中包括盛放分开的组合物的容器，如分开的瓶或分开的箔袋。试剂盒中一般还包括施用分开的组分的说明书。当优选以不同的剂量形式，不同的剂量间隔施用分开的组分时，或当开处方的医生要求滴定组合中的各个组分时，试剂盒形式特别有用。
根据本发明施用的经修饰FVII或另一种TF拮抗剂的量和能降低血液葡萄糖的药剂，如胰岛素或其具有生物活性的片段或变体的量的比率可以在约1∶100至约100∶1(w/w)之间变化。因此，VII因子与能降低血液葡萄糖的药剂的比率可以是例如约1∶100，或1∶90，或1∶80，或1∶70，或1∶60，或1∶50，或1∶40，或1∶30，或1∶20，或1∶10，或1∶5，或1∶2，或1∶1，或2∶1，或5∶1，或10∶1，或20∶1，或30∶1，或40∶1，或50∶1，或60∶1，或70∶1，或80∶1，或90∶1，或100∶1；或约1∶90至约1∶1，或约1∶80至约1∶2，或约1∶70至约1∶5，或约1∶60至约1∶10，或约1∶50至约1∶25，或约1∶40至约1∶30，或约90∶1至约1∶1，或约80∶1至约2∶1，或约70∶1至约5∶1，或约60∶1至约10∶1，或约50∶1至约25∶1，或约40∶1至约30∶1，或约10∶1至约1∶10，或约5∶1至约1∶5。
对实验和狒狒模型的描述脓毒病-诱导的组织因子(TF)表达激活了肺中的凝血，并导致前凝血质环境，从而使血纤蛋白沉积，炎症变得更加严重。在TF-VIIa因子(FVIIa)复合物处防止凝血开始能阻断血纤蛋白沉积并控制炎症，从而抑制脓毒病中的急性肺损伤(ALI)和其它器官损害。使用ALI狒狒模型，其中用灭活的大肠杆菌(E.coli)(1×109CFU/kg)使动物致敏，12小时之后，通过灌注1×1010CFU/kg活的大肠杆菌诱发致命的脓毒病。在灌注活细菌时，给治疗组动物静脉内施用TF竞争性抑制剂，即位点-失活的FVIIa(经修饰的FVII)，对动物进行36小时生理学监测。FVIIai显著保护气体交换和肺顺应性，防止肺水肿和肺高血压，相对于载体而言能保留肾功能(p＜0.01)，并能降低全身性促炎细胞因子反应，如白细胞介素-6(p＜0.01)。使用组织因子途径抑制剂(TFPI)进一步证实脓毒病-诱发的ALI中TF阻断的保护作用。结果表明在脓毒病灵长类动物中，TF-FVIIa复合物能部分通过选择性刺激促炎细胞因子释放和血纤蛋白沉积来调节器官损伤。
革兰氏阴性脓毒病患者急性呼吸窘迫综合征(ARDS)和多器官衰竭(MOF)的发病率高。这些患者的肺特征性地显示出肺泡和间隙区室中的血纤蛋白沉积，但血纤蛋白对脓毒病中ARDS的发病机理起作用的证据有其偶然性。经设计通过防止弥散性血管内凝血(DIC)来治疗脓毒病的策略降低了伴有休克的人和非人灵长类动物的死亡率，但这些研究受显著的残留死亡率、缺乏器官特异性分析和动物模型不能再现类似于ARDS的急性肺损伤(ALI)的限制。由于ARDS在脓毒病患者中导致显著的病态和死亡率，我们使用ARDS和MOF的非人灵长类动物模型来研究组织因子(TF)启动的凝血和血纤蛋白沉积对脓毒病中肺和全身性器官损害的作用。
当内毒素或细菌进入循环时，外源性凝血被快速激活，血管间隙中产生前凝血质环境。这依赖于TF并与能介导内毒素的前凝血质作用的炎症细胞因子的增加有关。类似地，在灌注内毒素之后或处于实验性急性肺损伤(ALI)过程中的动物肺中，以及ARDS患者的支气管肺泡灌洗液(BAL)中能发现前凝血质环境。与在全身性循环中相同，肺中的前凝血质活性与TF表达有关，这表明血管外炎症也能激活外源性途径。尽管前凝血质活性和肺损伤之间有一定联系，但尚未确定TF和其它凝血因子在肺损伤反应中的特定病原学作用。与TF一样，活化的VII因子(FVIIa)和X因子(FXa)、凝血酶和血纤蛋白对细胞信号传导具有特殊的作用，所述信号传导能改变血管通透性、炎症细胞迁移和肺表面活性剂功能异常。仍不清楚对脓毒病的反应中，凝血和炎症之间复合物串话的确切作用。
在革兰氏阴性脓毒病过程中阻断凝血能通过减弱与凝血相关的炎症反应防止ALI和其它器官损害。这一点在已建立的大肠杆菌狒狒模型中得到检验，其中通过灭活细菌的致敏性灌注预先激活了全身性炎症反应。施用第二致死剂量的细菌之后，动物产生类似于ARDS人患者的肌力过度心血管反应以及肺和肾衰竭。在施用致敏剂量的细菌之后，我们使用位点-失活的FVIIa(FVIIai)在TF-FVIIa复合物处阻断凝血的启动，所述FVIIai对TF的亲和性比天然FVIIa的高5倍，因此能竞争性抑制FVIIa。下述研究表明使用FVIIai阻断凝血能减轻脓毒病综合征患者的全身性炎症和血纤蛋白原耗尽，并能防止对肺和肾的损伤。
这是首次研究表明阻断致死性脓毒病的凝血启动之后，终器功能有特异性改善。该发现确定了TF在脓毒病-诱发的呼吸和肾衰竭中的病原学作用，并且表明阻断TF能有效保持肺和肾功能。评价疗效的方法是强有力的，因为被致敏的狒狒的生理学和组织学反应与人对脓毒病的反应非常一致。据以前用多种策略阻断脓毒病凝血的动物研究报道阻断TF或抗凝血之后有较好的存活，但严重脓毒病休克的存在使得终器损伤评估变得复杂。致敏能预先激活炎症，并导致类似于人实验性内毒素血症的肺气体交换、力学和血液动力学的轻微而自身-受限的改变。随后，无法抵抗的革兰氏阴性脓毒病导致进行性肺和肾损伤、炎症细胞因子持续升高和凝血病。这些动物的免疫应答是复杂的，某些疗法，例如抗白细胞粘附分子的mAb能使致敏动物的结果显著恶化。相反，灌注致死性大肠杆菌之后，阻断TF-FVIIa复合物能减轻凝血病和血纤蛋白沉积，防止肺和肾损伤。
过去，对脓毒病进行凝血阻断的主要目的是抑制血管区室中的血纤蛋白沉积，但我们已阐明器官损伤过程中的血管外血纤蛋白沉积也能服从干预。血纤蛋白为组织修复中的细胞迁移和胶原形成提供了重要基质，但它也会刺激炎症。在肺中，血纤蛋白的实质积累对炎症细胞迁移、表面活性剂功能异常和前纤维变性过程起作用。尽管在我们的研究中气体交换和肺水得以大大改善，但在经FVIIai治疗的动物的肺泡区域和肺小管附近仍可检测到残留的血纤蛋白。这表明因缺乏血纤蛋白，使得TF阻断的强保护作用不完全，在用FVIIai治疗的过程中，包括凝血的关键修复过程保持完整。
在脓毒病发生36小时之后，FVIIai能防止肺和肾的管腔内出现血纤蛋白块，这可能会对组织保护起作用。血管内血纤蛋白沉积作为小营养血管中阻塞性血栓的直接结果，并通过增强内皮细胞-白细胞相互作用对器官衰竭起作用。尽管血管内血纤蛋白对某些组织和在某些临床背景下，例如当出现无法抵抗的休克和组织低灌注时是重要的，上皮细胞和组织巨噬细胞的血管外TF表达也能启动前凝血质、促炎事件。居留的和浸润的巨噬细胞以及固定的细胞群体作为发炎的肺和肾病中的TF来源被牵连，暗示着血管外实质中的凝血受不同方式调节。
TF是II组细胞因子受体，它可直接调节免疫功能，也可通过产生FXa、凝血酶和血纤蛋白(它们都表现出与炎症的串话)来调节免疫功能。每个组分对炎症反应都有独立的作用，阻断TF启动对削弱途径中随后步骤的炎症相互作用是有利的。TF激活与ALI的发展相关的促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)细胞因子调节。特别是，IL-6与ARDS中长时间的炎症和糟糕的结果有关。在体外，FVIIai抑制MAPK活化，这表明经由这些途径的TF信号传导需要具有催化活性的FVIIa。TF与FVIIa连接诱导了大量免疫调节基因，包括IL-1β、IL-8和其它趋化因子、凝血和生长因子以及胶原酶。在本发明的脓毒病狒狒中，FVIIai能降低IL-6、IL-8和TNFR-1的血浆水平。这源于TF信号传导减弱或下游产生的FXa和凝血酶减少，它们也可以诱导促炎细胞因子。IL-6和IL-8进一步增加TF表达，而用FVIIai阻断TF能显著降低肺中由脓毒病诱导的TF表达。调节急性肺损伤的其它重要介质，如VEGF需要由TF-FVIIa产生FXa，或需要TF的胞质尾。最终的其它数据表明当TF高表达时，它作为将FVIIa呈递给其它起始信号传导事件的跨膜蛋白质的辅因子起作用。当TF象在脓毒病中一样过量表达时，如果这种相互作用是重要的，直接靶向FVIIa将优于其它抑制TF的发明。
在对患有暴发性脓毒病的动物进行的早期研究中，三种实验性药剂TFPI、抗TF mAb和DEGR-FVIIa被靶向TF-启动的凝血。这些药剂改善了存活，然而，远离TF-FVIIa复合物的天然蛋白酶抑制剂，包括活化的C蛋白(APC)和抗凝血酶III(AT III)也显示出存活效力。由于在预先未经攻击的、快速发展成为进行性休克的动物中检验了所有这些策略，凝血活性可能对TF-FVIIa复合物下游的休克死亡率起作用。与抗-TF药剂一样，尚未研究它们对ALI和MOF的影响。
在上述研究中，观察到血清IL-6和IL-8的降低，所述降低被认为是改善存活的机理。这些介质的重要作用难以定位，并且不能将凝血和细胞因子与存活一致地联系起来。在FXa和凝血酶处抑制凝血的AT III能降低死亡率、减轻凝血病、减少IL-6产生，然而，这些结果在人试验中无法重复再现。相反，DEGF-FVIIa能减轻凝血病和减少IL-6产生，但对与细胞因子水平不相关的存活具有可变的作用。灭活的FXa也能减轻凝血病，但不能改善急性脓毒病休克的存活。这些研究中凝血阻断的作用与器官功能的生理学终点不相关。在人中，用TFPI阻断TF不会影响低剂量内毒素灌注后的IL-6水平，但能防止凝血被活化。总之，这些研究暗示了灵长类动物中凝血蛋白酶的炎症和凝血功能，尤其是作为炎症攻击进程的不同界限。
在本发明的动物中，FVIIai消除了肺炎症，但不会完全阻断凝血。新的观察结果给应避免出血的脓毒病患者提供了前景。尽管FVIIai能有效结合TF，但它在体外不完全地阻断凝血。因此，相对于凝血而言，炎症需要更高程度地活化TF-FVIIa，以本研究所用的FVIIai剂量，未观察到严重的出血。另外，如果发生了出血，用人重组FVIIa可逆转药物对凝血的作用。
概括地说，我们已证实在TF-FVIIa复合物处阻断凝血能防止非人灵长类动物大肠杆菌脓毒病过程中的肺和肾损伤。对其它组织也有不同程度的保护，这暗示着在不同器官中，对脓毒病损伤的基于-TF的作用是不同的。在病情危急的ARDS人患者中，我们在存在持久炎症时检验了该策略，其中长期的细胞因子表达对功能性结果具有至关重要的影响。以前基于凝血的不同方面的脓毒病休克策略取得了不同的临床成功。
这可能反映了脓毒病不均一的损伤以及与炎症有关的不同凝血蛋白酶之间的相互作用。我们的数据暗示在凝血级联系统中作用最接近的药剂对脓毒病的肺和肾损伤具有较高的积极影响。
提供下述实施例是为了阐明而不是限制本发明。
实施例实施例1FVII的生物活性使用适当浓度为100-1000nM的生理学底物，如X因子测定VIIa因子或VIIa因子变体的活性，其中在加入适当的生色底物(如S-2765)之后测定产生的Xa因子。另外，可在生理学温度下进行活性试验。
“体外蛋白酶解试验”平行检测天然(野生型)VIIa因子和VIIa因子变体(下文称之为“VIIa因子”)以直接比较它们的比活性。在微滴板(MaxiSorp，Nunc，Denmark)中进行该试验。将溶于100μl 50mM Hepes，pH7.4(含有0.1M NaCl，5mM CaCl2和1mg/ml牛血清白蛋白)的VIIa因子(10nM)和X因子(0.8μM)保温15分钟。然后通过加入50μl含有0.1M NaCl，20mM EDTA和1mg/ml牛血清白蛋白的50mM Hepes，pH7.4以终止X因子裂解。通过加入终浓度为0.5mM的生色底物Z-D-Arg-Gly-Arg-p-硝基酰苯胺(S2765，Chromogenix，Sweden)，测定所产生的Xa因子的量。在SpectraMaxTM340微滴板读数仪(Molecular Devices，USA)中连续测定450nm处的光吸收值。减去不含FVIIa的空白对照孔中的光吸收值之后，10分钟内产生的光吸收值被用于计算变体和野生型VIIa因子的蛋白酶解活性之间的比率比率＝(VIIa因子变体的A405nm)/(野生型VIIa因子的A405nm)根据该比率，可以鉴定出活性大大低于天然VIIa因子的VIIa因子变体，例如，变体活性和天然VII因子(野生型FVII)活性之间的比率低于5％，或1％或更低的变体。
实施例2阻断外源性凝血能降低已确证患有革兰氏阴性脓毒病的狒狒中的肺损伤已阐明在用活细菌灌注时使用活性位点-被灭活的VIIa(ASIS)阻断凝血启动能减轻狒狒体内与脓毒病相关的急性肺损伤(ALI)和肾衰竭。我们已证实经确证的大肠杆菌脓毒病对ASIS治疗的反应是ALI和肾衰竭减轻。
用1×109/kg热-灭活的大肠杆菌灌注成年雄性狒狒，12小时之后静脉内施用1×1010/kg活的大肠杆菌。对动物实行机械通风48小时，用液体支持动物以维持8-12mm Hg的PCWP(肺毛细管契压)。灌注活细菌之后1小时，用ASIS治疗6只动物(1mg/kg静脉内给药，接着以50μg/kg/小时给药)。将6只动物用作脓毒病对照。数值被表示为平均值±SE。
ASIS能防止血浆血纤蛋白原耗尽，这与治疗性阻断外源性途径一致。脓毒病诱发的中性白细胞减少症和血小板减少症未受影响。48小时之后，经治疗的动物的气体交换功能得以保留(ΔAaDO2，mmHgC＝25.4±3.9，ASIS＝14.4±5.2)，而肺湿/干重降低(C＝6.9±0.8，ASIS＝5.0±0.2)。肺组织学显示出在经ASIS治疗的脓毒病动物中，炎症有所减轻。在用ASIS治疗的脓毒病动物中，尿排泄量较高(UOP，ml/kg/hr C＝5.7±1，ASIS＝12.3±1.7，p≤0.01)，代谢性酸中毒减轻(ΔHCO3-，meq/dlC＝-4.3±2.9，ASIS＝+3±1.1，p≤0.05)。与脓毒病对照相比，取自经ASIS治疗的动物的肾显示出受保护的小管构造。药物灌注被较好地耐受，并无出血并发症。结果表明在已确证的脓毒病中抑制外源性凝血的启动能防止急性肺和肾损伤。
ASIS是D-Phe-Phe-Arg-FVIIa。
实施例3 实验性急性肺损伤中的组织因子阻断我们在因大肠杆菌脓毒病而患有ALI的狒狒中研究了对由TF-启动的凝血的阻断。活性位点被灭活的FVII(ASIS)阻断了外源性凝血，并能降低全身性细胞因子反应，包括白细胞介素(IL)-6、IL-8和组织坏死因子受体-1。它也可减轻与脓毒病相关的肺、肾和其它组织损伤。对血浆血纤蛋白原和凝血酶-抗-凝血酶III(TAT)复合物的测定进一步证实了用ASIS治疗之后，血管内凝血活化的降低。
在未经治疗的脓毒病动物中，肺和其它组织的血管内和血管外区室中，血纤蛋白显著沉积。在用ASIS治疗的脓毒病动物中，血纤蛋白沉积被减轻但不能被消除，这表明TF-阻断的保护作用不仅仅是因为血纤蛋白产生量的减少。用ASIS阻断TF也能减少肺中的炎症变化，包括嗜中性粒细胞浸润，并能减轻水肿和出血。用ASIS阻断凝血和减轻血纤蛋白沉积能通过维持气体交换和顺应性改善肺功能、减轻肺高血压以及改善肾功能。用TFPI治疗的两只脓毒病狒狒也显示出气体交换和肺顺应性的改善，但其改善程度低于用ASIS治疗的狒狒。这些结果表明TF-FVIIa复合物是对脓毒病的病理学反应的重要调节位点。
在脓毒病中阻断凝血的一个可能的保护性机制是减少促炎细胞因子的产生。凝血和炎症之间的串话很可能是调节异常的炎症的关键组分，该可能性与终器损害的程度有关。在肺中，由肺上皮细胞和巨噬细胞在肺泡和间隙表达的TF可启动脓毒病中的促凝血、促炎事件，当通过TF阻断作用发生改变后，可导致肺功能的改善。
ASIS是D-Phe-Phe-Arg-FVIIa。
实施例4方法制备动物。将体重为14至20kg的成年雄性狒狒(Papio cyanoce-phalus)隔离至少4周，使用前确定它们未患肺结核。根据AAALAC指南处理动物，实验方法得到Duke University Institutional Animal Care and Use Commitee的认可。将狒狒随机分成治疗和脓毒病对照组(每组n＝6)。在时间t＝12小时时，给治疗动物静脉内(iv.)施用1mg/kg活性位点-灭活的FVIIa(FVIIai，NovoNordisk，Copenhagen)，然后立即灌注活细菌，接着静脉内施用50mcg/kg/小时FVIIai。非治疗动物仅接受载体的静脉内灌注。药物衍生自人重组FVIIa，其中通过掺入小肽(D-Phe-L-Phe-L-Arg氯甲基酮)阻断了活性位点，根据对人患者的安全性研究选择剂量。修饰阻断了蛋白酶解活性并将TF亲和性增加了5倍。为了用独立的TF抑制剂进一步证实该发现，以相同的方法，用相同剂量的组织因子途径抑制剂(TFPI，Abla Creasy惠赠，Chiron，Emeryville，CA)治疗另外两只狒狒。
禁食过夜之后，通过肌内施用克他命(20-25mg/kg)使每只动物麻醉，并给所有动物插管。用克他命(3-10mg/kg/h)和安定(每2小时0.4-0.8mg/kg)使动物保持深度麻醉。用体积-循环通风设备给动物通风，间隙性地用巴夫龙(静脉内4mg)使动物麻痹，然后测定呼吸。FiO2为0.21，一次吸入肺内的空气量为12mg/kg，正的末梢-呼气压为2.5cm H2O，调节速率以使动脉PCO2维持在40mm Hg。通过切开股动脉在其中放置动脉线和肺动脉导管以进行血液动态监测。有关该模型的详细描述已经公开(例如Welty-Wolf等，Am JResp Crit Care Med 1998；158610-619)。
在t＝0小时，以60分钟的灌注给所有动物施用约109CFU/kg热-灭活的大肠杆菌，12小时之后，即当t＝12小时时，在60分钟内灌注体积为50ml的1010CFU/kg活的大肠杆菌以诱导活大肠杆菌脓毒病。完成活大肠杆菌灌注后60分钟，施用庆大霉素(3mg/kg静脉内)和头孢他定(1mg静脉内)。必要时施用液体以维持肺毛细管契压(PCWP)为8-12mmHg并保持血压。当尽管补充了液体，平均动脉压(MAP)仍降至65mmHg时，可使用多巴胺治疗血压过低。48小时(灌注活细菌之后36小时)之后，通过注射KCl深度麻醉并杀死动物。预先确定的终结标准包括难治疗的血压过低(MAP低于60mmHg)、血氧过少(需要FiO2大于40％)或难治疗的代谢性酸中毒(PaCO2正常时pH＜7.10)。
血液动态监测。每个小时记录一次生理学参数，包括心率(HR)、温度、动脉血压、肺动脉压、通风设备参数和液体摄取量。按文献报道(如Welty-Wolf等，Am J Resp Crit Care Med 1998；158610-619)，获得每6个小时一次的心输出量(CO)(通过热稀释)、中枢静脉压(CVP)、PCWP、动脉和混合的静脉血气体、氧饱和度、氧容量和血红蛋白(Hgb)测量结果。每6个小时测量一次尿导管排泄量，将液体平衡计算为总静脉内摄取量减去尿排泄量。
制备大肠杆菌。按文献(7-10)的描述制备大肠杆菌(美国典型培养物保藏中心，Rockville，MD；血清型为086aK61)，将其调整为终剂量为每只狒狒1×1010CFU/kg(LD100)。通过在65℃水浴中将装有细菌的试管加热至少30分钟以制备热灭活的大肠杆菌。通过倒平板进行菌落计数，进一步证实细菌数目和热灭活的效力。
对全血、血浆和血清的测量。在0，12，13，18，24，36和48小时取血样。对全血进行全血计数(Sysmex-1000血细胞计数器，Sysmex，Inc.，Long Grove，IL)。分离血浆(从柠檬酸化的血液中)和血清并储存于-80℃。使用ST4机械凝血分析仪(Diagnostiga Stago，Parsippany，NJ)测定血纤蛋白原。以双份试验重复测定凝血酶原时间(PT)和活化的部分促凝血酶原激酶时间(aPTT)，在MDA凝血分析仪(Organon Teknika；Durham，NC)上用生色试验测定抗凝血酶III(ATIII)活性，将结果表示为试剂盒标准的百分数。使用ELISA测定血浆凝血酶-抗凝血酶(TAT)复合物(Dade Behring，Deerfield，IL)以及血浆和BAL中的FVIIai水平(Novo Nordisk，Copenhagen)。使用ELISA试剂盒(R andD Systems，Inc.，Minneapolis，MN)检测血清样品中的白细胞介素1β(IL-1β)，IL-6，IL-8和TNF受体-1(TNFR-1)。用标准的临床技术测定血液尿氮(BUN)和肌酸酐。
组织收集和制备。实验后给动物开膛，结扎左边的主支气管，取出左肺。在左上方的肺叶上用240ml 0.9％的盐水进行BAL。用手给取自左下方肺叶的肺组织样品充气，浸入4％多聚甲醛以进行光学显微镜检查和免疫组织化学。从剩下的左肺中随机取出4个样品以测定湿/干重，取样时要小心以避开大的血管和支气管结构。在液氮中快速冷冻其它取自肺、肾、肝脏、小肠、心脏和肾上腺的样品，储存于-80℃供Western印迹和生物化学研究用。在30cm的固定压力下，用含2％戊二醛的0.85M甲次砷酸钠缓冲液(pH7.4)将整个右肺充气-固定15分钟。通过浸入4％多聚甲醛固定其它取自肾、肝脏、小肠、心脏和肾上腺的组织。随机选择4份小肠样品以测定湿/干重。
生物化学测定按文献所述(如Caraway等，AM J Resp Crit Care1998，157938-949)测定肺匀浆液的髓过氧化物酶(MPO)活性和蛋白质浓度，以及BAL液体的蛋白质和乳酸脱氢酶(LDH)浓度。MPO活性被表示为光吸收值/分钟/g湿重组织的变化。LDH值被表示为每升的活性单位(U/L)。
Western印迹在冰冷的裂解缓冲液(150mM NaCl，50mM Tris，pH7.61％SDS，3％ Nonidet P-40，5mM EDTA，1mM MgCl2，2mM 1，3-二氯异香豆素，2mM 1，10-菲咯啉，和0.4mM E-64)中匀浆肺样品，15,000×g离心10分钟。将上清液与Laemmli缓冲液混合，冷冻于-80℃。使用12％聚丙烯酰胺凝胶，在还原条件下进行电泳。将等量蛋白质上样于泳道，在Hoefer微量凝胶系统(Hoefer Scientific Instruments，San Francisco，CA)上进行电泳。转移之后，使用抗-TF mAb(小鼠抗人，American Diagnostica，Greenwich，CT)和与HRP缀合的第二Ab(山羊抗小鼠，Transduction Laboratories，Lexington，KY)探测印迹中的TF表达。通过ECL检测显示信号，使用商用软件(Quantity One，BioRad，Hercules，CA)测定印迹的密度。
组织学和免疫化学。将经多聚甲醛固定的组织包埋于石蜡中，切片并用苏木精和伊红(H&E)染色，通过光学显微镜进行检查。在肺、肾、肾上腺和小肠的石蜡切片上，使用mAb(抗-人血纤蛋白原β-链，AmericanDiagnostica，Greenwich，CT)进行血纤蛋白的免疫定位。所述Ab与血纤蛋白发生强烈反应，与血纤蛋白原发生微弱反应。用二甲苯去除切片(5微米)上的石蜡，并在分级醇中重新水合，清洗后于4℃同抗-血纤蛋白Ab保温过夜。然后清洗切片，与生物素化的第二Ab保温，用与过氧化物酶缀合的亲和素和氨基联苯胺显示信号。按上述处理阴性对照，不同之处在于与非-免疫小鼠血清(Jackson Laboratories，Bar Harbor，ME)进行初次保温。
统计学。将数据输入计算机电子数据表，使用商用软件(StatView，Calabasas，CA)进行分析。通过二-因子ANOVA分析生理学数据和一系列血样的数据。使用不成对的t-试验分析实验结束时获得的BAL和组织的生化数据。图和表中提供了平均值±sem和p值；可以认为p＜0.05是显著的，还标明了p＜0.10的趋势。
结果在灌注致死剂量的活大肠杆菌之前，死细菌能活化凝血和炎症。就在施用活大肠杆菌之前，动物已患有轻微的凝血病，伴有与急性期反应一致的TAT复合物和aPTT增加，血小板减少，和血纤蛋白原增加。炎症介质IL-6，IL-8和TNFR-1增加2-10倍。给这些动物灌注活细菌导致大面积的肺损伤、肾功能不全以及对其它重要器官，包括肝脏、小肠和肾上腺的损害。以不断灌注的方式静脉内施用FVIIai能有效阻断凝血和炎症的进一步活化，防止器官损伤，并减少血管内和血管外的血纤蛋白沉积。对肺和肾中血纤蛋白组织沉积的作用最显著，而与经载体治疗的脓毒病对照相比，经FVIIai治疗的动物显示出显著改善的气体交换和肾功能。未经治疗的脓毒病对照动物的肺中具有强TF上调，用FVIIai可以防止这种上调(p＜0.05，图1)。测定血浆和BAL中的药物水平，结果表明FVIIai侵入肺泡区室，其中实验结束时BAL液体中的药物水平为194.2±34.7ng/mg蛋白质。表1显示了血浆水平。下文提供了对这些动物中的FVIIai治疗对肺和肾保护作用的分析。
脓毒病中的急性肺损伤。FVIIai治疗能防止脓毒病-诱发的血氧过少、肺高血压和肺系统顺应性损失。这些生理学数据示于图2，以从t＝12小时至显示出药效时的变化作图。在图上以虚线表示早期未经治疗的动物(n＝11)和用TFPI治疗的两只脓毒病动物的历史数据，其目的仅是为了进行比较(统计学分析中未包括这些数据)。灌注灭活的细菌之后，两组中的肺泡动脉氧梯度(AaDO2)增加，而在t＝12小时时，活细菌脓毒病发作之后，脓毒病对照组中的AaDO2逐渐恶化。脓毒病对照组中的一只动物需要补氧。用FVIIai治疗能防止脓毒病过程中的气体交换恶化(p＜0.0001)，与t＝12小时时相比，这些动物中的最终AaDO2实际上得以改善。FVIIai能减缓脓毒病诱发的平均肺动脉压(PAM)和肺血管抗性kg(PVR*kg)的增加(对未经治疗的脓毒病对照而言p＜0.001和p＜0.02)。FVIIai也能防止可在脓毒病对照动物中观察到的肺系统顺应性损失(p＜0.001)。类似地，在实验过程中，无功能的间隙有所增加，两组的分钟通风量(VE)都需要增加30-35％(表1)。将两组的PaCO2控制在40mm Hg(对VE和PaCO2而言p＝NS)。
在死后，用FVIIai治疗的动物的肺看上去很正常，类似于未损伤的、经通风处理的动物的肺。相反，脓毒病对照动物的肺增厚并有出血。在治疗组中，有关肺湿/干重、嗜中性白细胞(PMN)积累和灌洗LDH的定量测量结果都有改善(图3)。脓毒病对照中的肺湿/干重为5.81±0.19，而在经FVIIai治疗的动物中为5.05±0.09(p＜0.01，正常参照范围为4.6-5.0)。BAL LDH几乎降低60％(p＜0.01)，肺MPO活性降低40％以上(p＝0.07)。两组的BAL蛋白没有显著不同。
肺组织学显示出用FVIIai治疗的脓毒病动物中的显著保护作用。用抗-血纤蛋白抗体染色代表性的肺切片。脓毒病对照动物的肺具有增厚的肺泡间隔、斑状肺泡水肿和出血、以及巨噬细胞和PMN的肺泡内炎症细胞浸润。抗-血纤蛋白染色显示出沿着间隔、肺泡内炎症细胞上以及肺泡液中大面积扩散的血纤蛋白沉积。肺中的一些小管含有血纤蛋白块。经治疗的动物的肺具有正常的肺泡间隔构造、最小程度的肺泡PMN浸润、而不具有肺水肿。在这些动物中，血纤蛋白的间隔染色是不均匀的，与脓毒病对照相比，面积较小。在经治疗的动物中，血纤蛋白染色经常局限于紧邻小管四周的区域，然而，血管内血纤蛋白块不明显，肺泡巨噬细胞和血管内单核细胞成为染色的焦点。
脓毒病中的肾和其它器官损害。FVIIai也能防止脓毒病中的肾衰竭(图4)。脓毒病对照组中的血清肌酸酐加倍，但治疗组中的血清肌酸酐正常(p＝0.05)。在未经治疗的动物中，灌注活大肠杆菌之后，尿排泄量相应有所减少。相反，在治疗组中，尿排泄量能维持或增加(p＜0.0001)。这不是复苏的差异造成的，因为两组中的液体平衡(图4)和全身性血液动力学(表1)类似。在未经治疗的动物中，血液pH和血清[HCO3-]较低(分别为p＜0.001和p＜0.1，图4)。
死亡后，未经治疗的动物的肾肿胀并出血，但在经FVIIai治疗的动物中，肾看上去是正常的。未经治疗的动物的肾H&E染色切片具有斑状急性小管坏死(ATN)区域并且缺乏肾小球。经治疗动物的肾除了有少量ATN病灶外，显示出正常的肾构造。免疫染色显示出脓毒病对照动物肾小球中的血纤蛋白沉积，伴有毛细管结构闭合。小管上皮细胞也被染色，一些小管含有血纤蛋白为阳性的不定形物质。可以容易地鉴定出被血纤蛋白块阻塞的血管。在经治疗的动物中，未见肾小球血纤蛋白沉积，仅在几只动物中观察到最低程度的小管上皮细胞染色。
在经FVIIai治疗的动物中，肾上腺、肝脏和小肠的外观正常。相反，未经治疗的动物的肾上腺肿胀并出血，小肠严重水肿。在未经治疗的动物中，小肠湿/干重较高，但肠损伤中的高变异性不允许组之间存在统计学差异(治疗组动物为6.36±0.51，而非治疗组动物为8.30±1.13，p＝0.15)。与肺和肾中的血纤蛋白染色减少相反，在治疗和非治疗组脓毒病动物的肾上腺和小肠中观察到集中的血纤蛋白沉积。尽管在用FVIIai治疗的脓毒病动物中，肾上腺皮质充血和出血以及小肠出血和水肿已被减轻。FVIIai对除肺以外的器官中的PMN含量没有统计学上的显著作用。在对照动物中，肾、肝脏和小肠中的MPO活性是可变的，两组之间的差别在统计学上不显著。
脓毒病-诱发的凝血病。与对照相比，在用FVIIai治疗的脓毒病动物中，凝血的血管内活化有所减弱(图5)。最初的凝血参数值处于该物种的正常范围。通过治疗性阻断凝血，药物治疗能如预期的那样防止血浆血纤蛋白原耗尽(p＜0.0001)。在脓毒病对照中，施用活大肠杆菌之后，TAT复合物增加，13-18小时达到峰值，然后因AT III活性水平的降低而降低。在经治疗的动物中，TAT复合物的增加减缓(p＜0.0001)，然而，AT III活性的降低在统计学上没有差异。尽管在未经治疗的脓毒病动物中，实验后期的TAT水平降低，但凝血仍在这些狒狒中发展着。aPTT在这两组中逐渐增加，但在未经治疗的动物中较高(p＜0.01)。因药物对该试验的作用，治疗组中的PT较高，在药物灌注过程中PT为53至67s(p＜0.0001)。在非治疗组中，PT从12小时(灌注活大肠杆菌之前)时的17.8±0.4逐渐增加为实验结束时的25.5±3.6。
在灌注了活的大肠杆菌之后，两组动物都发展成为中性白细胞减少症、血小板减少症和贫血(见表1)。在灌注1小时之后(t＝13小时)，两组中的WBC达到约1,500(×103/μl)的最低点，在实验结束前，逐渐增加至接近基线水平(治疗组动物为9,400±1,800，而非治疗组动物为13,000±3,900，p＝0.08)。在灌注活大肠杆菌12小时(t＝24小时)之后，所有动物都患有血小板减少症，实验结束时两组中的平均血小板计数为30,000或更少。类似地，两组中的Hgb也有所降低，在任一组中都没有显著出血的迹象(表1)。
促炎细胞因子水平。用FVIIai治疗能减缓炎症细胞因子的升高(图6)。灌注了活大肠杆菌之后，治疗和非治疗组动物中的IL-1β，IL-6，IL-8和TNFR-1的循环水平急速升高。两组中的IL-6峰值水平没有差异，但在经FVIIai治疗的动物中，IL-6降低地更快(p＜0.001)，并返回至在首次用于实验的动物中发现的水平。类似地，与对照相比，IL-8和TNFR-1水平降低(p＜0.01和p＜0.001)。两组中的IL-8水平没有差异。
全身性血液动态参数。用FVIIai治疗不会改变血液动态测量结果，包括HR，MAP，PCWP，CO/kg和全身性血管抗性*kg(SVR*kg)(表1)。在两组动物中，低血压对IV液体作出反应；治疗组的一只动物在灌注活细菌之后马上需要低剂量的多巴胺。12只动物中有10只可以存活到该方案计划好的终点。一只脓毒病对照动物在30小时时(灌注活细菌后18小时)死于ALI，伴有难治疗的血氧过少和难治疗的酸中毒，FVIIai治疗组的一只动物在研究结束前3小时死于气管内插管的并发症。在实验过程中，每组中有两只动物发展成为自身-受限的血尿，FVIIai治疗组的一只动物死亡后，支气管中间部有血块。两组中的大多数动物有一些与某些研究点的吸气引液有关的染血分泌物。在两组中都未出现严重的或威胁生命的出血并发症。
TFPI灌注后的肺和肾损伤。为了进一步证实TF阻断对大肠杆菌脓毒病中ALI的作用，以相同的实验方法用TFPI治疗两只狒狒。灌注TFPI之后，阻断了脓毒病中的凝血活化，血浆血纤蛋白原水平也得到类似的改善。这些动物中的最终血纤蛋白原水平(t＝48小时)为12小时数值的75％和95％。与FVIIai一样，TFPI不会改变全身性血液动态参数。两只动物的气体交换和肺力学都得到保护(见图2)。施用TFPI之后，肺组织的组织病理学和血纤蛋白免疫染色显示出肺中减少的炎症细胞浸润、减小的间隔增厚和减弱的血纤蛋白沉积。与FVIIai治疗组相同，施用TFPI之后，肾构造正常，肾中没有血纤蛋白染色。
表1
表1脓毒病对照和经FVIIai治疗的脓毒病组的全身性检测结果。在t＝0小时灌注热-灭活的细菌，在t＝12小时灌注活细菌。数据被表示为平均值±sem，用二因子ANOVA分析数据。以ng/ml血浆表示治疗组中的FVIIai药物水平。缩写Temp(温度℃)，Hgb(血红蛋白)，VE(分钟通风量，L/分钟)，HR(心率)，MAP(平均动脉压，mmHg)，CO(心输出量，L/分钟)，DO2(氧传递，mL/分钟)，VO2(氧消耗，mL/分钟)，SVR(全身性血管抗性，达因×cm×kg/10)，PCWP(肺毛细管契压，mmHg)。
权利要求
1.经修饰的FVII用于制备治疗人急性肺损伤(ALI)或急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的药物的用途。
2.根据权利要求1的用途，用于治疗器官衰竭。
3.根据权利要求2的用途，其中器官是肾、肺、肾上腺、肝脏、小肠、心血管系统或止血系统。
4.根据权利要求3的用途，其中器官衰竭是肺衰竭。
5.根据权利要求1至4中任一项的用途，用于维持或改善器官功能。
6.根据权利要求1的用途，用于治疗肺高血压。
7.根据权利要求1的用途，用于使前凝血质活性降低或最小化。
8.根据权利要求7的用途，其中前凝血质活性与肺上皮细胞和组织巨噬细胞的组织因子表达有关。
9.根据权利要求1的用途，用于使炎症减弱或最小化。
10.根据权利要求9的用途，用于使IL-6和IL-8的产生减少或最小化。
11.根据权利要求1的用途，用于改善肺气体交换。
12.根据权利要求1的用途，用于使肺水肿减弱或最小化。
13.根据权利要求1的用途，用于使肺蛋白渗漏减弱或最小化。
14.根据权利要求1至13中任一项的用途，其中经修饰的FVII是在催化三联体中具有至少一个氨基酸残基取代、插入或缺失的FVII。
15.根据权利要求14的用途，其中经修饰的FVII是在Ser344，Asp242和His193位具有至少一个氨基酸残基取代、插入或缺失的FVII。
16.根据权利要求15的用途，其中的活性位点残基Ser344被修饰，被Gly，Met，Thr取代，或更优选被Ala取代。
17.根据权利要求1至13中任一项的用途，其中经修饰的FVII是通过与丝氨酸蛋白酶抑制剂反应而被修饰的FVIIa。
18.根据权利要求17的用途，其中的蛋白酶抑制剂是有机磷化合物，磺酰氟，肽卤甲基酮或氮杂肽。
19.根据权利要求18的用途，其中的蛋白酶抑制剂是选自下列的肽卤甲基酮丹磺酰-L-Phe-Pro-Arg氯甲基酮，丹磺酰-L-Glu-Gly-Arg氯甲基酮，丹磺酰-L-Phe-Phe-Arg氯甲基酮和L-Phe-Phe-Arg氯甲基酮，丹磺酰-D-Phe-Pro-Arg氯甲基酮，丹磺酰-D-Glu-Gly-Arg氯甲基酮，丹磺酰-D-Phe-Phe-Arg氯甲基酮和D-Phe-Phe-Arg氯甲基酮。
20.根据权利要求19的用途，其中的蛋白酶抑制剂是D-Phe-Phe-Arg氯甲基酮。
21.经修饰的FVII用于制备防止或最小化与人ALI或ARDS相关的慢性器官衰竭的药物的用途。
22.根据权利要求21的用途，其中在施用经修饰的FVII之前确证ALI或ARDS。
23.根据权利要求21或22的用途，其中的器官衰竭是肾、肺、肾上腺、肝脏、小肠、心血管系统或止血系统的衰竭。
24.根据权利要求23的用途，其中的器官衰竭是肺衰竭。
25.根据权利要求21至24中任一项的用途，其中经修饰的FVII是在催化三联体中具有至少一个氨基酸残基取代、插入或缺失的FVII。
26.根据权利要求25的用途，其中经修饰的FVII是在Ser344，Asp242和His193位具有至少一个氨基酸残基取代、插入或缺失的FVII。
27.根据权利要求26的用途，其中的活性位点残基Ser344被修饰，被Gly，Met，Thr取代，或更优选被Ala取代。
28.根据权利要求21至24中任一项的用途，其中经修饰的FVII是通过与丝氨酸蛋白酶抑制剂反应而被修饰的FVIIa。
29.根据权利要求28的用途，其中蛋白酶抑制剂是有机磷化合物，磺酰氟，肽卤甲基酮或氮杂肽。
30.根据权利要求29的用途，其中蛋白酶抑制剂是选自下列的肽卤甲基酮丹磺酰-L-Phe-Pro-Arg氯甲基酮，丹磺酰-L-Glu-Gly-Arg氯甲基酮，丹磺酰-L-Phe-Phe-Arg氯甲基酮和L-Phe-Phe-Arg氯甲基酮，丹磺酰-D-Phe-Pro-Arg氯甲基酮，丹磺酰-D-Glu-Gly-Arg氯甲基酮，丹磺酰-D-Phe-Phe-Arg氯甲基酮和D-Phe-Phe-Arg氯甲基酮。
31.根据权利要求30的用途，其中蛋白酶抑制剂是D-Phe-Phe-Arg氯甲基酮。
32.治疗人急性肺损伤(ALI)或急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的方法，所述方法包括给需要这种治疗的受试者施用治疗有效量的经修饰的FVII。
33.根据权利要求32的方法，用于治疗器官衰竭。
34.根据权利要求33的方法，其中的器官衰竭是肾、肺、肾上腺、肝脏、小肠、心血管系统或止血系统的衰竭。
35.根据权利要求34的方法，其中的器官衰竭是肺衰竭。
36.根据权利要求32至35中任一项的方法，用于维持或改善器官功能。
37.根据权利要求32的方法，用于治疗肺高血压。
38.根据权利要求32的方法，用于使前凝血质活性降低或最小化。
39.根据权利要求38的方法，其中的前凝血质活性与肺上皮细胞和组织巨噬细胞的组织因子表达有关。
40.根据权利要求32的方法，用于使炎症减弱或最小化。
41.根据权利要求40的方法，用于使IL-6和IL-8的产生减少或最小化。
42.根据权利要求32的方法，用于改善肺气体交换。
43.根据权利要求32的方法，用于使肺水肿减弱或最小化。
44.根据权利要求32的方法，用于使肺蛋白渗漏减弱或最小化。
45.根据权利要求32至44中任一项的方法，其中经修饰的FVII是在催化三联体中具有至少一个氨基酸残基取代、插入或缺失的FVII。
46.根据权利要求45的方法，其中经修饰的FVII是在Ser344，Asp242和His193位具有至少一个氨基酸残基取代、插入或缺失的FVII。
47.根据权利要求46的方法，其中的活性位点残基Ser344被修饰，被Gly，Met，Thr取代，或更优选被Ala取代。
48.根据权利要求32至44中任一项的方法，其中经修饰的FVII是通过与丝氨酸蛋白酶抑制剂反应而被修饰的FVIIa。
49.根据权利要求48的方法，其中的蛋白酶抑制剂是有机磷化合物，磺酰氟，肽卤甲基酮或氮杂肽。
50.根据权利要求49的方法，其中的蛋白酶抑制剂是选自下列的肽卤甲基酮丹磺酰-L-Phe-Pro-Arg氯甲基酮，丹磺酰-L-Glu-Gly-Arg氯甲基酮，丹磺酰-L-Phe-Phe-Arg氯甲基酮和L-Phe-Phe-Arg氯甲基酮，丹磺酰-D-Phe-Pro-Arg氯甲基酮，丹磺酰-D-Glu-Gly-Arg氯甲基酮，丹磺酰-D-Phe-Phe-Arg氯甲基酮和D-Phe-Phe-Arg氯甲基酮。
51.根据权利要求50的方法，其中的蛋白酶抑制剂是D-Phe-Phe-Arg氯甲基酮。
52.防止或最小化与人ALI或ARDS相关的慢性器官衰竭的方法，所述方法包括给需要这种治疗的受试者施用治疗有效量的经修饰的FVII。
53.根据权利要求52的方法，其中在施用经修饰的FVII之前确证ALI或ARDS。
54.根据权利要求52或53的方法，其中的器官衰竭是肾、肺、肾上腺、肝脏、小肠、心血管系统或止血系统的衰竭。
55.根据权利要求54的方法，其中的器官衰竭是肺衰竭。
全文摘要
本发明涉及经修饰的VII因子用于制备治疗人急性肺损伤(ALI)或急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的药物的用途。
文档编号A61P7/00GK1522151SQ02813430
公开日2004年8月18日 申请日期2002年5月1日 优先权日2001年5月2日
发明者米雷拉·埃兹本, 史蒂文·艾德尔, 克劳德·A·皮安塔多西, A 皮安塔多西, 艾德尔, 米雷拉 埃兹本 申请人:诺沃挪第克公司