专利名称：从卷烟烟雾分离主要有害氧化剂的方法
技术领域：
本发明涉及从卷烟烟雾分离通式1的对苯半醌(p-benzosemiquinone)的分离方法， 该对苯半醌是主要的有害氧化剂。更特别地，本发明提供从卷烟烟雾分离主要的有害氧化剂对苯半醌的方法，对苯半醌是引起蛋白质和DNA氧化损伤的主要有害氧化剂。
背景技术：
曝露于卷烟烟雾是危及生命的疾病如支气管炎、肺气肿、其它呼吸道疾病、冠心病、肺癌和其它恶性肿瘤的主要原因[1-5]。事实上，卷烟烟雾是肺癌的压倒性原因，肺癌是现在全球最通常的癌症。由于由公共卫生运动的停止吸烟的途径和由地方政府通过的反吸烟法律取得的成功有限，最可实行的途径是预防由卷烟烟雾引起的危险效果。已知卷烟烟雾包含约4000种组分，其中约3000种组分存在于气相中和约1000种组分存在于焦油相中[6]。气相中的氧化剂，如O-2、H2O2、NO、过氧基是特别不稳定的[7]。如果将气相通入磷酸盐缓冲液中和将获得的溶液加入到白蛋白溶液中，不发生蛋白质氧化(7)。显然，希望将由气相引起的任何损害限制到口腔前庭和上呼吸道[8]。另一方面，焦油中存在的氧化剂是相当稳定的并且它们显然会在肺、心脏和其它器官中产生氧化损伤[7，9]。约48％的焦油组分是水溶性的[10]和已知焦油的含水萃取物产生生物大分子的氧化损伤，该生物大分子包括蛋白质和DNA[7，11，12]。然而，复杂的是构思焦油含水萃取物中的多少组分会在生物系统中产生氧化损伤。直到现在，在卷烟烟雾的许多组分中，提出三类化合物是癌症和变性性疾病发展中涉及的致病剂，即(i)多环芳族烃(ii)亚硝胺和(iii)自由基。
在多环烃中，苯并[a]芘是研究最多的。但它不是致癌物和要求通过细胞色素P450体系的代谢活化以变成最终致癌物，苯并[a]芘二醇环氧化物。此外，苯并[a]芘在卷烟烟雾中的浓度较少，约10-40ng每支卷烟[13]和苯并[a]芘不能解释由卷烟烟雾产生的蛋白质的氧化损伤。
在烟草特异性亚硝胺(TSNA)中，研究最多的亚硝胺是N1-亚硝基去甲烟碱(NNN)和4-(甲基亚硝氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)。再次TSNA不是直接的致癌物和它们在烟草烟雾中的浓度较宽地变化。NNN观察到的范围是0.004μg-1.35μg和对于NNK，＜0.004μg-1.75μg每支卷烟。可以推断卷烟烟雾中的TSNA不是卷烟烟雾致癌可能性的足够指数[14]。再次TSNA不能解释蛋白质的氧化损伤。
卷烟烟雾另一方面的危险组分是自由基。Pryor和他的伙伴对卷烟烟雾的自由基化学和它的毒理学含意进行了相当的研究。这些作者认为卷烟焦油中的主要相对稳定自由基是苯醌/氢醌络合物，它是活性氧化还原体系和此氧化还原体系能够还原分子氧以产生过氧化物，导致过氧化氢和羟基[15]，这可最后导致生物大分子的氧化损伤但我们观察到由稳定焦油基产生的蛋白质的氧化损伤不由SOD或催化剂抑制，指示氧化损伤不由过氧化物基或过氧化氢介导。申请人进一步观察到焦油基在氮气气氛下和在分子氧不存在下氧化蛋白质，表明焦油基与生物大分子的直接相互作用。然而，这些作者承认焦油中识别的主要基团实际上不是单价基团和可能不是单一种类(16)。他们也承认卷烟焦油难以置信的是络合物混合物并且由于没有分离和明白地识别焦油基，关于焦油基化学或生物化学的任何结论必须认为是假定的[15]。
值得注意地提及到1960年代，烟草工业一般在它自身的实验室中证明卷烟焦油在动物中引起癌症[17]。在整个1960年代，公司的研究人员尝试发现卷烟烟雾中的毒性元素及确信如果可以识别毒性组分，可以除去或消除这些试剂并可以产生“安全”卷烟，该安全卷烟会输送烟碱而不输送毒性物质[17]。但是在二十世纪七十年代末，烟草业广泛地放弃了这种专门研究，因为此目标被证明不能实现，这是一个技术上难以解决的问题，并且证明是难以实现的[17]。
非常近来，我们观察到整体卷烟烟雾/焦油的含水萃取物以相对高数量包含主要的有害氧化剂，该数量是大约190±10μg每支卷烟。申请人分离了该氧化剂，确定了结构并发现它是对苯半醌。该氧化剂几乎定量解释由整体卷烟烟雾/焦油的含水萃取物产生的蛋白质氧化损伤。氧化剂也引起DNA氧化。Nagata等人(18)显示半醌基结合到DNA上并损害它。也已知DNA的氧化损伤牵涉突变和癌症。氧化剂是相对稳定的。它在固态下在室温下的半寿期大约是48小时。卷烟烟雾中稳定氧化剂的存在可解释侧流烟雾和被动吸烟的有害效果(7)。氧化剂不存在于未吸的烟草并在卷烟的燃烧期间产生(7)。申请人识别了许多化合物/药剂，那些化合物/药剂失活氧化剂和可用作解毒剂。
发明目的本发明的主要目的是从整体卷烟烟雾/焦油的含水萃取物中分离和表征主要有害氧化剂，该氧化剂主要引起包括蛋白质和DNA的生物大分子的氧化损伤。
本发明的另一个目的是提供整体卷烟溶液中存在的卷烟烟雾(cs)氧化剂的定量测量方法。
本发明的仍然另一个目的是化合物/药剂的识别，那些化合物/药剂会失活氧化剂并用作对抗氧化剂有害效果的解毒剂。
发明概述通过不同的溶剂萃取，薄层色谱法和制备HPLC，将相对稳定的主要有害氧化剂从整体卷烟烟雾/焦油的含水萃取物分离并精制到＞99％的程度。收率是约16μg每支卷烟，它是一支卷烟的烟雾中存在的数量(≈190μg)的约8.4％。从十二种不同品牌的商业卷烟获得可比的结果。精制的氧化剂从在丙酮中的溶液以细针形非常淡黄色晶体形式结晶。发现氧化剂的结构是对苯半醌，如由元素分析、质谱、UV、荧光、IR、H-NMR、C-NMR和ESR光谱证明以及由化学性能证明。氧化剂可以由UV吸收光谱或HPLC定量测量。
在对苯半醌中，未配对的电子在包含杂原子的芳族框架上离域，导致不同的内消旋形式，即阴离子的、中性的和阳离子形式(
图1，参见ref.19)。此共振会解释半醌的稳定性。以固态在室温下在空气中并且在黑暗下贮存的氧化剂半寿期是约48小时，由它氧化抗坏血酸的能力确定。在pH7.4的水溶液中，半寿期是约1.5小时。使用BSA的氧化或天竺鼠肺微粒体蛋白质的氧化降解作为模型系统，氧化剂定量解释由整体卷烟烟雾含水萃取物产生的氧化损伤。cs-氧化剂也引起DNA氧化。
已经识别许多化合物/药剂，那些化合物/药剂失活氧化剂和用作解毒剂。
发明详述因此，本发明提供通式1的对苯半醌，有害氧化剂和识别的以抵抗由此氧化剂引起的有害效果的化合物的分离方法。
在本发明的实施方案中，提供一种引起蛋白质和DNA氧化损伤的来自卷烟烟雾的主要有害氧化剂的分离方法，该方法包括如下步骤a)在浸入冰和盐混合物中的玻璃烧瓶中从点燃的常规过滤嘴卷烟获得焦油溶液，b)允许焦油冷凝和在烧瓶底部沉降而收集整体cs溶液，c)在7.4-7.8的pH值范围下采用30-60mM磷酸钾缓冲剂萃取该焦油；d)通过0.45μm微孔过滤器过滤步骤(c)的溶液；e)通过加入NaOH溶液调节从步骤(d)获得的滤液的pH值，以获得所需的卷烟烟雾含水萃取物溶液，f)使用同等体积的二氯甲烷萃取以上所述cs水溶液三次，抛弃下部的二氯甲烷层和收集上层黄色半精制的卷烟烟雾溶液萃取物，g)使用同等体积的水饱和正丁醇进一步萃取步骤(f)的卷烟烟雾含水萃取物两次，合并黄色正丁醇萃取物并在-50℃～-60℃的温度下在真空下冷冻干燥；h)使用HPLC级丙酮萃取步骤(g)的冷冻干燥的材料两次，以获得溶于丙酮的萃取物；i)在真空下干燥步骤(h)的溶于丙酮的萃取物以得到残余物；j)在HPLC级甲醇中溶解步骤(i)的残余物；k)使用非荧光二氧化硅板将以上步骤(j)的甲醇溶液进行制备型TLC，使用以80∶20比例的甲苯和乙酸乙酯混合物构成的溶剂体系展开(developing)该二氧化硅板，取出该板并在约25-30℃下使用干燥器干燥该板，从板两侧切割包含展开的材料的小条并在碘腔中保持它们以定位相应于Rf0.26的谱带，刮去谱带和采用HPLC级丙酮萃取谱带材料，过滤和收集丙酮溶液和在真空下干燥以得到淡黄色残余物；和l)通过加入同等体积的毫Q水而溶解步骤(k)的残余物，采用同等体积的HPLC级水饱和正丁醇萃取水溶液，和最后随后在小玻璃管中在真空下干燥上部正丁醇层，以获得纯度为98-99％和收率为约18-22μg每支卷烟的主要卷烟烟雾(cs)氧化剂。
在本发明的实施方案中，其中将它们溶解在包括比例为90∶10(v/v)的二氯甲烷和甲醇混合物的流动相中，并在0.5ml/min的流量下，在约25℃的温度下和在约29kgf/cm2的压力下，在294nm使用UV检测器将其注入具有正相25cm二氧化硅柱的HPLC仪器，从而由HPLC进一步精制在步骤(1)中获得的该cs氧化剂，收集在8.808min的保留时间下显现为单峰的流出物，提纯的存在于母cs溶液中的总cs氧化剂(对苯半醌)纯度为100％和收率为8.4％。
在本发明的另一个实施方案中，其中也在pH7.4-7.8下通过将整体卷烟烟雾通入30-60mM钾缓冲剂中，通过0.45μm微孔过滤器过滤以上的溶液，通过加入NaOH水溶液调节滤液的pH值到7.4-7.6而从点燃的常规滤嘴卷烟获得步骤(a)的初步cs溶液和进行步骤(b)-(1)用于获得主要cs氧化剂对苯半醌。
本发明的另一个实施方案，其中该分离的纯卷烟烟雾(cs)氧化剂对苯半醌具有如下特性a)当采用丙酮结晶以形成小的微弱黄色针形晶体时，具有相似于酸败乳脂味道的刺激性味道，b)分别地，在甲醇溶液中的UV吸收畸峰是在293.4nm和223.0nm和在水溶液中的UV吸收最大值是在288nm和221nm，c)分别地，在甲醇溶液中在293nm下激发时，观察到的发射畸峰是在329.6nm和651.4nm，和在224nm下激发时，观察到的发射畸峰是在329.6nm和652.6nm，d)分别地，当保持发射波长在330nm下监测激发扫描时，观察到的激发畸峰是在228.2nm和293.8nm和当将发射保持在651nm下和监测激发扫描时，观察到的激发畸峰是在229.2nm和294.8nm，e)高度溶于甲醇、乙醇、丙酮、正丁醇，相当溶于水，微溶于二氯甲烷、乙醚、氯仿和不溶于苯和石油醚，f)在4-5的酸性pH值下化合物损失它的氧化效力和在保持溶液在9-10的碱性pH值下时，化合物逐渐变成棕色，在10和之上的pH值下，立即变暗及具有由UV光谱证明的活性和芳香性两者的损失，g)当在固态下在25℃-30℃的温度下在黑暗下贮存时，氧化剂的半寿期由它的氧化效力确定是约48小时，但在pH7.4的50mM磷酸钾缓冲剂溶液中，在25℃-30℃下，半寿期是约90分钟，h)还原高铁细胞色素C和氯化铁，i)氧化抗坏血酸、蛋白质和DNA，和j)熔点是162℃。
本发明的仍然另一个实施方案，其中使用25cm反相ODS柱和使用水和甲醇(95∶5v/v)的混合物作为流动相，在288nm的波长，0.8ml/min的流量下，在约25℃的温度下和在约147kgf/cm2的压力下和保留时间为13.46min，由具有UV检测器的HPLC定量测定cs溶液中存在的对苯半醌。
本发明的仍然另一个实施方案，其中从整体cs溶液分离的所述对苯半醌是引起蛋白质的氧化损伤的主要原因。
本发明的仍然另一个实施方案，其中对苯半醌，cs氧化剂引起DNA的氧化损伤。
本发明的仍然另一个实施方案，其中通过使蛋白质与从cs溶液获得的对苯半醌反应，随后与2，4二硝基苯肼(DNPH)反应和最后测量在390nm波长下的吸光度，测量蛋白质羰基形成，从而定量测定由cs溶液中存在的对苯半醌引起的蛋白质损害。
在本发明的仍然另一个实施方案中，其中通过反应该蛋白质与cs溶液中存在的对苯半醌，随后由SDS-PAGE和光密度扫描，测量天竺鼠组织微粒体蛋白质的氧化降解，从而定量测定由cs溶液中存在的对苯半醌引起的蛋白质损害。
本发明的仍然另一个实施方案，其中用于蛋白质氧化损伤测定的蛋白质选自BSA和天竺鼠肺微粒体蛋白质。
本发明的仍然另一个实施方案，其中由cs溶液中存在的对苯半醌进行由整个cs溶液产生的BSA氧化。
在本发明的仍然另一个实施方案中，与由整个cs溶液产生的7.53±0.34比较，由cs氧化剂产生的BSA氧化是9.56±0.14，该氧化由每mg BSA形成的羰基纳摩尔数证明。
在本发明的仍然另一个实施方案中，与由卷烟烟雾含水萃取物产生的8.16±0.24比较，由cs氧化剂产生的BSA氧化是9.56±0.14，该氧化由每mg BSA形成的羰基纳摩尔数证明。
在本发明的仍然另一个实施方案中，与由卷烟烟雾TLC精制的含水萃取物产生的9.23±0.14比较，由cs氧化剂产生的BSA氧化是9.56±0.14，该氧化由每mg BSA形成的羰基纳摩尔数证明。
在本发明的仍然另一个实施方案中，SDS-PAGE证明的由对苯半醌溶液产生的天竺鼠组织微粒体蛋白质的氧化降解，可比于由整体cs溶液产生的氧化降解。
在本发明的仍然另一个实施方案中，其中该方法用于卷烟中cs氧化剂对苯半醌的定量测定，以特定商业品牌卷烟的焦油含量计。
在本发明的仍然另一个实施方案中，其中该方法用于卷烟中cs氧化剂对苯半醌的定量测定，以特定商业品牌卷烟的毒性水平计。
本发明的还一个实施方案涉及一种预防体外卷烟烟雾诱导蛋白质氧化的方法，该方法包括使用选自如下的化合物或药剂抑制BSA氧化抗坏血酸、连二亚硫酸钠、酒石酸、柠檬酸、草酸、琥珀酸、组氨酸、赖氨酸、硫脲、谷胱甘肽、红茶提取物、绿茶提取物、儿茶素、表没食子儿茶素(epigallocatechin)和表儿茶素。
在本发明的另一个实施方案中，其中在约100μM的浓度下抗坏血酸抑制BSA氧化直到76％。
在本发明的仍然另一个实施方案中，其中在约2mM的浓度下连二亚硫酸钠抑制BSA氧化直到97％。
在本发明的仍然另一个实施方案中，其中在约500μM-1mM的浓度下酒石酸抑制BSA氧化直到75％。
本发明的仍然另一个实施方案，其中在约500μM-1mM的浓度下柠檬酸抑制BSA氧化直到75％。
在本发明的仍然另一个实施方案中，其中在约500μM的浓度下草酸抑制BSA氧化直到53％。
在本发明的仍然另一个实施方案中，其中在约1mM的浓度下琥珀酸抑制BSA氧化直到60％。
在本发明的仍然另一个实施方案中，其中在约1mM的浓度下组氨酸抑制BSA氧化直到67％。
在本发明的另一个实施方案中，其中在约2.5mg的浓度下红茶提取物抑制BSA氧化直到50％。
本发明的仍然另一个实施方案，其中在约750μg的浓度下儿茶素抑制BSA氧化直到54％。
本发明的仍然另一个实施方案，其中在约140μg的浓度下表没食子儿茶素抑制BSA氧化直到95％。
本发明的仍然另一个实施方案，其中在约50μg的浓度下表儿茶素抑制BSA氧化直到50％。
本发明的仍然另一个实施方案，其中在约2.5mg的浓度下绿茶提取物抑制BSA氧化直到50％。
本发明的仍然另一个实施方案，其中在约1mM的浓度下赖氨酸抑制BSA氧化直到35％。
本发明的仍然另一个实施方案，其中在约10mM的浓度下硫脲抑制BSA氧化直到52％。
本发明的仍然另一个实施方案，其中在约1mM的浓度下谷胱甘肽抑制BSA氧化直到37％。
本发明的还一个实施方案涉及针对卷烟烟雾氧化剂引起的有害效果的解毒剂，该解毒剂选自抗坏血酸、连二亚硫酸钠、酒石酸、柠檬酸、草酸、琥珀酸、组氨酸、赖氨酸、硫脲、谷胱甘肽、红茶提取物、绿茶提取物、儿茶素、表没食子儿茶素和表儿茶素。
本发明的仍然另一个实施方案涉及化合物对苯半醌用于实验室条件下研究氧化损伤诱导的变性性疾病的机理和由对分离的蛋白质、DNA、培养细胞或对试验模型产生氧化损伤的卷烟烟雾引起的癌症机理的用途。
本发明的还一个实施方案涉及一种对有害氧化剂，对苯半醌定量评估的方法，该方法有助于配制要用于卷烟、雪茄、卷烟烟斗和任何其它常规吸烟器具的吸烟材料的数量和性质。
在本发明的仍然另一个实施方案中，提供一种预防体外卷烟烟雾诱导蛋白质氧化的方法，该方法包括使用选自如下的化合物或药剂抑制BSA氧化抗坏血酸、连二亚硫酸钠、酒石酸、柠檬酸、草酸、琥珀酸、组氨酸、赖氨酸、硫脲、谷胱甘肽、红茶提取物、绿茶提取物、儿茶素、表没食子儿茶素和表儿茶素，以下用表格形式显示BSA氧化的该抑制。
由不同化学药剂的cs-氧化剂诱导的白蛋白氧化的保护
在仍然另一个实施方案中，化合物对苯半醌用于在实验室条件下对分离的蛋白质、DNA或培养细胞进行氧化损伤，以使得能够研究由卷烟烟雾引起的氧化损伤诱导的变性性疾病和癌症的机理。
在此参考以下的实施例描述本发明，这些实施例仅是说明性的和不应当解释为以任何方式限制本发明的范围。
附图简述图1显示对苯半醌的内消旋形式。(a)阴离子；(b)，(c)中性；(d)阳离子。
图2在冷冻干燥之后甲醇溶液的谱带薄层色谱-指示cs-氧化剂的谱带。
图3在TLC之后丁醇萃取物的HPLC图。在8.808min保留时间下作为主要峰洗脱的cs-氧化剂(步骤6)。洗脱的cs-氧化剂数量是～12μg。
图4在8.808min保留时间下洗脱的纯cs-氧化剂的HPLC图。
图5纯cs-氧化剂的薄层色谱(Rf＝0.26)。
图6a在甲醇中cs-氧化剂的荧光光谱图。激发是在293nm和从300nm到800nm测量发射扫描。发射畸峰是在329.6nm和在651.4nm。
图6b在甲醇中cs-氧化剂的荧光光谱图。激发是在224nm和从225nm到800nm测量发射扫描。发射畸峰是在329.6nm和在652.6nm。
图7a在甲醇中cs-氧化剂的荧光光谱图。发射是在330nm和从220nm到325nm测量激发扫描。激发畸峰是在228.2nm和在293.8nm。
图7b在甲醇中cs-氧化剂的荧光光谱图。发射是在651nm和从220nm到650nm测量激发扫描。激发畸峰是在229.2nm和在294.8nm。
图8纯cs-氧化剂的晶体结构。
图9在甲醇中cs-氧化剂的UV分光光度图。它具有两个吸收畸峰，一个在293.4nm和另一个在223.0nm。
图10在黑暗下保持在25℃下的固体氧化剂的稳定性。该稳定性由它氧化抗坏血酸的能力确定。由HPLC分析在254nm下测量抗坏血酸。
图11基于在254nm下的HPLC分析的抗坏血酸标准曲线。
图12由HPLC面积证明的，根据其氧化抗坏血酸盐效力在25℃下测量的在50mM磷酸钾缓冲剂中的cs-氧化剂的稳定性。
图13由在550nm下亚铁细胞色素C随时间的形成测量的由氧化剂的高铁细胞色素C的定量还原。反应在pH7.4的50mM磷酸钾缓冲液中进行，保持高铁细胞色素C的最终浓度为100μM。一纳摩尔的氧化剂还原0.71纳摩尔的高铁细胞色素C。
图14根据294nm下HPLC面积的氧化剂标准曲线。在20μl流动溶剂中使用10ng-100ng的不同数量cs-氧化剂。
图15通过使用1μg-5μg的不同数量氧化剂，根据细胞色素C还原的氧化剂标准曲线。
图16纯cs-氧化剂的质谱图17氢醌在甲醇中的UV分光光度图。它具有两个吸收畸峰，一个在293.8nm和另一个在224.2nm。
图18在室温下在黑暗中贮存8天的cs-氧化剂的UV分光光度图。两个吸收畸峰是在293.6nm和在224.4nm。
图19对苯醌和氢醌的等摩尔混合物在甲醇中的UV分光光度图。靠近242nm存在肩台(对苯醌的λmax)图20在甲醇中氢醌的荧光光谱图。激发是在294nm和从300nm到800nm测量发射扫描。发射畸峰是在329.4nm和在651.6nm。
图21cs-氧化剂的FTIR光谱图。
图22氢醌的FTIR光谱图。
图23cs-氧化剂在CD3COCD3中的H-NMR光谱图。
图24氢醌在CD3COCD3中的H-NMR光谱图。
图25(a)cs-氧化剂和(b)氢醌的对比H-NMR光谱图。
图26在采用连二亚硫酸钠还原之后cs-氧化剂的H-NMR光谱图。
图27cs-氧化剂在CD3COCD3中的C-NMR光谱图。
图28氢醌在CD3COCD3中的C-NMR光谱图。
图29从100支卷烟新制备的cs-氧化剂的室温ESR光谱。在JES-REIX ESR分光计(东京，日本)上记录光谱。光谱参数如下微波频率，9.4356GHz；功率，2mW；场调制宽度，0.4mT；调制频率，100kHz；时间常量，0.3sec；扫描速度，2.5mT/sec图30从400支卷烟制备的老化(10天)CS-氧化剂的室温ESR光谱。
图31在二氧化硅柱(LichrospherSi 60，Merck)中分析的整体cs溶液的HPLC图-指示cs-氧化剂的保留时间，面积和浓度(13.6682％)。
图32在二氧化硅柱(LichrospherSi 60，Merck)中分析的cs溶液含水萃取物的HPLC图-指示cs-氧化剂的保留时间，面积和浓度(13.6682％)。
图33在ODS柱(Shim-pack，CLC-ODS，Shimadzu)中分析的整体cs溶液的HPLC图。在13.467min下洗脱cs-氧化剂。
图34在13.458min的保留时间下洗脱的CLC-ODS柱(Shim-装填，CLC-ODS，Shimadzu)中分析的纯cs-氧化剂的HPLC图。
图35a采用整体cs溶液和cs-氧化剂处理的天竺鼠微粒体蛋白质的SDS-PAGE。泳道1，未处理的微粒体；泳道2，采用50μl cs溶液处理的微粒体；泳道3，采用100μl cs溶液处理的微粒体；泳道4，采用10μgcs-氧化剂处理的微粒体；泳道5，采用20μg cs-氧化剂处理的微粒体。
图35b在图35a中不同泳道的蛋白质谱带的光密度扫描。
表的详述表1.在cs-氧化剂不同精制阶段的氧化效力评估表2.由HPLC分析测量的由cs-氧化剂对抗坏血酸的氧化表3.在不同精制阶段由CS-溶液级分的BSA氧化表4.不同化学药剂的cs-氧化剂诱导白蛋白氧化的保护表5.主要有害cs-氧化剂的失活和使用活性炭过滤器在卷烟烟雾中的烟碱输送实施例实施例1从卷烟焦油或整体卷烟烟雾溶液分离和精制主要危险组分(cs-氧化剂)(i)将每种焦油含量为25mg的五种印度商业过滤嘴卷烟(74mm)安装在玻璃管中，该玻璃管穿过带有侧臂的一升玻璃锥形瓶的玻璃塞子中的孔和在离烧瓶底部约2cm处终止。将烧瓶浸入冰和盐的混合物和将侧臂连接到水泵。将卷烟点燃并允许焦油冷凝和沉降在烧瓶底部。一起收集来自二十支卷烟的焦油。将广口瓶取出到室温和将焦油采用pH7.4的20ml 50mM磷酸钾缓冲剂萃取。将溶液通过0.45μm微孔过滤器过滤。加入20μl的2N NaOH溶液将滤液的pH值调节到7.4。溶液的颜色是褐黄色。此溶液称为焦油溶液。
不从卷烟焦油分离cs-氧化剂，它也可以从整体卷烟烟雾分离。在该情况下，将在5个批次中来自20支卷烟的烟雾直接通入pH7.4的20ml 50mM磷酸钾缓冲剂，剩余的过程相似于用于焦油的过程。在将整体cs通入缓冲液中之后获得的溶液称为整体cs溶液。
cs-氧化剂的收率相似而不管焦油溶液或整体cs溶液用作开始材料。
(ii)将在步骤1中获得的过滤焦油溶液采用15ml二氯甲烷萃取三次。抛弃下部二氯甲烷层和将上部黄色水层收集和称为卷烟烟雾的含水萃取物。
(iii)将来自步骤2的水层采用10ml水饱和的正丁醇萃取两次和然后在Lyolab冷冻干燥器中在-55℃下在真空下冷冻干燥合并的黄色丁醇萃取物。将冷冻干燥的材料采用1ml的HPLC级丙酮萃取两次和将丙酮溶液在Speed Vac(Savant，SC 100)中干燥并溶于120μl的HPLC级甲醇。
(iv)然后使用10cm×10cm非荧光0.2-mm厚二氧化硅板(TLC铝片，硅胶60，MERCK，No 1.05553)将步骤3中获得的甲醇溶液进行谱带TLC。将来自5支卷烟(≈30μl甲醇溶液)的材料沿底部以上约1.5cm的线布点。将板使用甲苯∶乙酸乙酯(80∶20)展开15min。当展开溶剂前端离顶部0.5cm时，将板取出并在室温下使用干燥器干燥。在干燥之后，将0.5cm条从板的左右两侧切出和保持在碘腔中3分钟用于谱带的定位。将相应于Rf0.26的谱带(图2)从每个板刮去，在1.5ml的eppendorf管中吸收和采用间歇涡流以600μl的HPLC级丙酮萃取30min。然后在室温下以12000rpm将管子离心10min。将上清液丙酮层在另一个eppendorf管中仔细吸收。将混合的丙酮萃取物最终在speed vac中的一个eppendorf管中干燥。
(v)向步骤4中获得的显现为淡黄色针状物的干燥材料中，加入200μl毫Q水和向此200μl水中加入饱和的正丁醇并涡旋5min，随后在12000rpm下在室温下离心5min。将上部正丁醇层仔细取出和在speed vac中的小玻璃管中干燥。
收率≈来自20支卷烟的400μg。在此阶段，cs-氧化剂是98.5％纯，如由HPLC分析证明。
(vi)将在步骤5之后获得的总样品溶于400μl流动溶剂和将20μl此溶液(≈20μg氧化剂)注入Shimadzu 10AVP HPLC仪器，该仪器具有正相Merck 25cm二氧化硅柱(LiChrospherSi 60)，使用UV检测器和连接的色谱纸束(chromatopac)C-R6A。总共在不同的批次中进行20次注入。
保持的其它条件如下。
吸光度；294nm(甲醇中氧化剂的λmax是293.4nm，由UV分光光度计扫描证明，参见图9)流动溶剂二氯甲烷∶甲醇(90∶10)流量0.5ml/min压力29kgf/cm2
温度25℃氧化剂的保留时间8.808min氧化剂在8.808min的保留时间下洗脱为主要峰(图3)。将从不同注入批次获得的合并的HPLC流出物在25ml玻璃烧杯中收集和在speedvac中干燥。氧化剂显现为非常微弱黄色微小针形晶体。HPLC-精制的氧化剂，当在相同条件下再注入时，在8.808-min保留时间下在HPLC图中显现为单峰(图4)，指示100％纯度。
收率≈来自20支卷烟的300μg。
(Vii)在装载的样品数量和在HPLC分析中获得的cs-氧化剂的相应峰面积(任意)的基础上，从整体cs溶液的活性氧化剂的回收百分比计算如下。
采用流动溶剂将4μl过滤的整体cs溶液(参见步骤1)稀释到80μl和将20μl注入HPLC柱。
相应于保留时间8.808min，在20μl中氧化剂的任意面积是340583。
因此，在80μl中的面积≡1362332≡4μl整体cs溶液。
因此一毫升整体cs溶液中氧化剂的任意面积≡3.4×108。
由于1ml整体cs溶液等同于一支卷烟(参见步骤1)，每支卷烟的cs-氧化剂面积＝3.4×108。
在HPLC精制之后从20支卷烟的纯氧化剂产量＝300μg。
因此从一支卷烟的产量＝15μg＝15000ng。
从标准曲线(参见图14)，100ng纯cs-氧化剂的HPLC峰面积＝190000。
因此，等同于一支卷烟的15000ng的峰面积＝2.85×107。
因此从整体cs溶液的纯cs-氧化剂的回收率是(2.85×107×100)/3.4×108＝8.4％。
(viii)通过测量牛血清白蛋白(BSA)的氧化而确定在不同精制阶段cs-氧化剂的氧化效力。结果呈现为每mg BSA形成的纳摩尔蛋白质羰基(表1)。在不同的精制制阶段，如在以上的“分离和精制过程”下所述，等同于二十分之一支卷烟的材料数量(50μl溶液)用于焦油溶液(步骤1)，含水萃取物(步骤2)和丁醇萃取物(步骤3)的情况。在丁醇萃取物的情况下，采集50μl丁醇溶液，在speed vac中蒸发出丁醇，将干燥的残余物称重和直接用于BSA的氧化。对于在步骤4(TLC)和步骤6(HPLC)获得的材料，使用的数量分别是15μg和10μg。
(ix)cs-氧化剂的纯度标准(a)TLC在TLC中，Rf0.26，使用甲苯∶乙酸乙酯(80∶20)作为展开溶剂获得单点(图5)。
(b)HPLC由HPLC分析获得单峰。使用流动溶剂，二氯甲烷∶甲醇(90∶10)，保留时间是8.808min(图4)。
(c)熔点化合物在162℃下急剧熔融。
(d)荧光光谱cs-氧化剂(在1ml甲醇中的5mg)的UV分光光度扫描产生在293.4nm和在223.0nm的两个吸收畸峰(参见图9)。在甲醇溶液中进行荧光光谱，如用于UV分光光度扫描的那样。当在293nm下激发时，从300nm到800nm监测发射扫描，当在224nm下激发时，从225nm到800nm监测发射扫描。当在293nm下激发时，观察到的发射畸峰在329.6nm和在651.4nm(图6a)。当在224nm下激发时，观察到的发射畸峰在329.6nm和在652.6nm(图6b)。当保持发射在330nm下监测激发扫描时，观察到的激发畸峰是在228.2nm和在293.8nm(图7a)。再次，当将发射保持在651nm下并监测激发扫描时，观察到的激发畸峰在229.2nm和在294.8nm(图7b)。观察到的光谱图指示两个吸收畸峰来自相同的化合物和有益于分离的cs-氧化剂的纯度。
实施例2通过测量羰基含量定量测定蛋白质损伤培育系统包含1mg BSA和50μl cs溶液或在其最终体积为200μl的pH值为7.4的50mM磷酸钾缓冲剂中的不同精制阶段获得的当量。培育在37℃下进行1小时。通过与2，4-二硝基苯肼(DNPH)的反应，按照Levine等人的方法(Methods Enzymol.186464-478，1990)测量蛋白质羰基，相似于以前在我们实验室中所做那样(Panda等人，FreeRadic.Biol.& Med.271064-1079，1999)。在BSA与整体相cs溶液，cs或cs-氧化剂的含水萃取物的培育之后(最终体积200μl)，将蛋白质采用200μl 20％三氯乙酸溶液沉淀，随后由200μl 10％三氯乙酸溶液洗涤以使沉淀的粒料没有cs组分。然后向此洗涤的粒料中加入500μl在2MHCl中的10mM DNPH溶液和采用间歇涡漩在37℃下培育1h。其后，将蛋白质再次由500μl冷20％三氯乙酸溶液沉淀和将粒料首先采用500μl 10％三氯乙酸溶液洗涤，随后由1ml的乙醇∶乙酸乙酯(1∶1，v/v)混合物连续洗涤三次。最后，将洗涤的沉淀物溶于1ml的6M盐酸胍(pH2.3)并在390nm下使用双光束Hitachi分光光度计型号U3020对照2M HCl的试剂空白测量吸光度。使用22,000的摩尔消光系数，结果表达为每毫克蛋白质形成苯腙的纳摩尔数。从以cs-氧化剂培育BSA之后获得的总体苯腙数值，扣除采用未处理BSA获得的该苯腙数值以得到形成的净蛋白质羰基的数值。结果见表1。
实施例3cs-氧化剂的物理化学性能(a)外观当从丙酮溶液结晶时，氧化剂显现为小针形微弱黄色晶体(图8).在干燥状态或在溶液中，在空气中在光线下化合物逐渐变成棕色。
(b)气味刺激性味道，相似于酸败乳脂的味道。
(c)UV吸收氧化剂在甲醇溶液中具有两个吸收畸峰，一个在293.4nm和另一个在223.0nm(图9)。在水溶液中，吸收畸峰在288nm和221nm。在400nm-700nm的可见光区域没有吸收指示该氧化剂缺乏发色团。
实施例4cs-氧化剂的化学性能(a)溶解度高度溶于甲醇、乙醇、丙酮、正丁醇，相当溶于水，微溶于二氯甲烷、乙醚、氯仿和不溶于苯和石油醚。
(b)pH的效果在酸性pH值(4-5)下，化合物并不变成棕色但损失它的氧化效力。在保持溶液在碱性pH值(pH9)下时，化合物逐渐变成棕色。在接近10和之上的pH值下，立即变暗并由UV光谱证明活性和芳香性两者都损失。
(c)固体氧化剂的稳定性当在固态下在室温下在黑暗下贮存时，氧化剂的半寿期由它氧化抗坏血酸效力确定为约48小时(图10)。由HPLC分析测量抗坏血酸的氧化。在图11中显示使用不同浓度抗坏血酸制备的抗坏血酸的标准曲线。为确定cs-氧化剂的稳定性，将新制备的氧化剂分布在五个单独的样品管中。每个管包含5μg的cs-氧化剂。立即检验一个管(0天，图10)以确定它氧化抗坏血酸的能力。随后分别在第1、2、3和5天检查其它的管(图10)。向每个管中，加入在200μl 50-mM磷酸钾缓冲剂中的5μg抗坏血酸和在室温下培育45min。其后，将16μl检测混合物在不同时间间隔下抽出和加入到24μl流动溶剂中以使最终体积为40μl。注入20μl的此稀释溶液，该溶液初始等于200ng抗坏血酸。没有该氧化剂的平行对照物用以监测抗坏血酸的自动氧化。在254nm下检测抗坏血酸。在该条件下，抗坏血酸的保留时间是6.1min。可以由HPLC在该条件下确定的最少抗坏血酸数量是500pg。
HPLC分析的条件是仪器Shimadzu 10A柱子Lichro CART 250-4 NH2柱(Merck)流动溶剂乙腈∶50mM KH2PO4(75∶25)流量1.5ml/min压力132kgf/cm2温度25℃(d)在溶液中氧化剂的稳定性与在固体条件下贮存时的48小时半寿期相反，当在25℃下储存于pH值为7.4的50mM磷酸钾缓冲液溶液中时，氧化剂的半寿期是约1小时30分钟(图12)。
测定条件与以上在“固体氧化剂的稳定性”下所述的相同。
(e)与氯化铁溶液的反应向包含500μg cs-氧化剂的200μl甲醇溶液中，加入20μl的氯化铁(1mg)水溶液。出现瞬间短暂的绿色。这指示该氧化剂包含酚类-OH基团。
(f)高铁细胞色素c的还原氧化剂不仅仅氧化蛋白质和抗坏血酸(如以后所示)，而且定量还原高铁细胞色素c，如由亚铁细胞色素c随时间的形成所测量(图13)。
向pH值为7.4的890μl 50-mM磷酸钾缓冲剂中，加入100μl 1mM高铁细胞色素c溶液以获得100μM的最终浓度。向此物质中，加入在pH值为7.4的10μl 50-mM磷酸钾缓冲剂中的4.5μg cs-氧化剂的溶液并在550nm下在30秒间隔下测量吸光度。结果(图13)指示1纳摩尔的氧化剂(取M.W＝110，如下所示)还原0.71纳摩尔的高铁细胞色素c，它近似于1∶1的摩尔比。或换言之，显现氧化剂每分子包含一个还原基团。在550nm下亚铁细胞色素c的摩尔消光系数取为25×103cm-1。也观察到由氢醌对高铁细胞色素c的还原大约为1∶0.71的摩尔比，显示cs-氧化剂的还原组分相似于氢醌的还原组分。
(g)抗坏血酸的氧化由抗坏血酸的HPLC分析测量由新制备的cs-氧化剂溶液对抗坏血酸的氧化，如由之前在固体氧化剂的稳定性下所述的那样(在cs-氧化剂化学性能下的项目c)。
使用限制量抗坏血酸(28.41纳摩尔)和过量抗坏血酸(85.23纳摩尔)两者测量抗坏血酸氧化，关于在最终体积为200μl的pH值为7.4的50mM钾缓冲剂中的氧化剂固定数量(45.45纳摩尔)。在不同时间间隔下抽出等分试样，如在cs-氧化剂化学性能的项目c下讨论的那样，并由HPLC分析测定抗坏血酸。获得抗坏血酸氧化的相似结果而不管使用高数量(85.23纳摩尔)或限制数量(28.41纳摩尔)抗坏血酸。
在45min培育之后，氧化的抗坏血酸纳摩尔数对cs-氧化剂的纳摩尔数的比例是0.55(表2)。此比例实际上是1∶1，这是由于抗坏血酸的氧化是一电子转移反应，产物，抗坏血酸自由基(AH·)是化学惰性的，根据以下所示的岐化反应衰变。
(AH2＝抗坏血酸，A＝脱氢抗坏血酸，OX＝氧化剂)[(Bielski，B.H.Jr.和Richter，H.W.(1975)，抗坏血酸自由基的一些性能.Ann.N.Y.Acad.Sci，258，pp.231-237)]。
在抗坏血酸氧化和高铁细胞色素c还原上获得的结果(以上的项目f)指示cs-氧化剂以化学计量比例在分子中包含一个氧化基团和一个还原基团。
实施例5cs-氧化剂的定量测量可以由(a)UV光谱(b)HPLC分析和(c)高铁细胞色素c的还原定量测量氧化剂。
(a)UV吸收将5μg氧化剂溶于1ml的HPLC级甲醇和在200-500nm下在Hitachi双光束分光光度计(型号U3020)记录该溶液相对甲醇的UV吸收。
图9显示氧化剂具有两个吸收畸峰(λmax).
λmax吸收293.4nm 0.3192223.0nm 0.6994在293.4nm下的吸收与氧化剂的浓度成比例。以它在293.4nm下吸收最大值计的氧化剂摩尔消光系数从图9计算并发现为ε293.4＝7018cm-1。
(b)HPLC分析在HPLC中注入在20μl流动溶剂中为10ng-100ng的不同浓度的氧化剂和在294nm下检测氧化剂。根据氧化剂的峰面积(任意的)得到标准曲线(图14)。在条件下可以由HPLC分析检测的氧化剂最小数量是500pg。
使用的参数是仪器Shimadzu 10A柱子25-cm二氧化硅柱(LiChrospherSi 60，Merck)流动溶剂二氯甲烷∶甲醇(90∶10，v/v)流量0.5ml/min压力29Kgf/cm2
温度25℃保留时间8.808min(c)高铁细胞色素c的还原根据在氧化剂化学性能下的项目(f)下描述的方法，1μg-5μg的不同数量cs-氧化剂用于还原高铁细胞色素c。根据获得的结果画出标准曲线(图15)。
实施例6cs-氧化剂的结构确定由以下参数确定氧化剂的结构元素分析，质谱，熔点测量，UV光谱，荧光光谱，FTIR，H-NMR，C-NMR，ESR和XRF分析。
(a)元素分析使用1mg氧化剂，在PERKIN ELMER 2400系列11CHNS/O分析仪中进行元素分析。
结果碳％氢％ 氮％64.06 5.33 1.16从此百分比分析的C，H和O比例是碳5.34氢5.33氧(由差值)1.84故经验式是C6H6O2(b)质谱使用EI技术在70eV下由VG 7070 H质谱仪测量氧化剂的分子量。
观察到的分子量是110及分别m/e 81和53的两个随后片段(图16)。
尽管该化合物的分子量显现为氢醌(C6H6O2)的分子量，该化合物实际上是强氧化剂。对比H-NMR光谱研究(以下所示)指示该氧化剂具有比氢醌更少数量的杂原子连接的质子和从ESR光谱(以下所示)计算的g因子指示该化合物是对苯半醌(MW109)。观察到的化合物的分子量110可以由如下事实解释采用在室温下贮存7天的样品进行质谱分析。可能的是在固态下在室温下贮存时，对苯半醌转化成它的阳离子形式。已经观察到在固态下贮存5-7天时，该化合物得到相似于氢醌(MW 110)的UV吸收光谱，伴随有氧化剂活性的损失(以下所示)。
(c)熔点测量发现cs-氧化剂的熔点为162℃。初始在显微镜下氧化剂显现为暗黑色棒状晶体束。随着从约140℃增加温度，在晶体边缘的亮度增加并出现晶体彼此的分离。当温度接近熔点时，从晶体边缘的黑色阴影开始消失和晶体的清晰度和光亮增加。正好在大部分晶体在162℃下熔融之后，一些细棒状晶体在熔融池中出现，该晶体随后在172℃下熔融，172℃已知为氢醌的熔点。可能的是在高熔融温度下，一部分氧化剂转化成氢醌。在相似的条件下，发现氢醌的熔点为172℃。在氢醌的情况下，如上所述在熔融之前氧化剂晶体图案中的特征变化较不显著。
混合熔点研究将相同数量的氢醌和cs-氧化剂溶于丙酮并干燥以得到混合晶体。发现混合晶体的熔点为165℃。
从熔点试验，明显的是化合物不是氢醌。
(c)UV分光光度分析将5μg氧化剂溶于1ml甲醇和从500nm到200nm在Hitachi双光束分光光度计，型号U3020中监测相对于作为空白样的甲醇的波长扫描。
图9中所示的吸收畸峰如下λmax吸收293.4nm 0.3192223.0nm 0.6994在λmax 223nm的吸收λmax 293.4nm的吸收的比例＝2.19在相似条件下氢醌的UV分光光度分析产生1.98的比例(图17)，它不同于氧化剂的比例。
有趣的是注意到在室温下在黑暗中贮存一直到8天时，贮存的氧化剂的UV光谱更相似于氢醌的UV光谱，得到1.99的比例(图18)。这指示在贮存时，cs-氧化剂缓慢转化成氢醌。
在贮存时，没有显示形成苯醌。当以等摩尔比例将对苯醌与氢醌混合时，吸收光谱显示靠近242nm的肩台(图19)。这样的肩台在贮存的氧化剂中完全不存在(图18)。
(e)荧光光谱使用在294nm下的激发波长，图20显示在相同的条件下，氧化剂的荧光发射图案相似于氢醌的荧光发射图案(cf.图6a)。
(f)FTIR光谱在FTIR-8300分光光度计，Shimadzu，日本中进行氧化剂的FTIR光谱分析。采用1mg干燥氧化剂，制备将KBr片剂并用于FTIR光谱。图21指示相应于以下各项的峰·在3234.4cm-1下的O-H伸展·在3030.0cm-1下的对于芳族环C-H伸展·在1514.0cm-1下的C-C-伸展·在1355.9cm-1下的O-H弯曲·在1193.9cm-1下的C-O伸展·在756.0cm-1下的C-H弯曲在相似的条件下进行氢醌的FTIR光谱和它得到具有某些细微差异的可比较的峰图案(图22)。
(g)NMR光谱法使用Bruker 500MHz分光计进行NMR光谱法。
分析和解释1H-NMR将200-μg氧化剂溶于500μl CD3COCD3并分析。NMR图显示相应于氢醌结构四个芳族质子在6.56ppm的一个锐峰和相应于杂原子连接的质子在7.55ppm的另一个峰，即连接到氢醌中氧原子的质子(图23)。在(图24)中给出氢醌在CD3COCD3中的H-NMR图。在氢醌和氧化剂之间两个峰的化学位移中没有差异。
在氘化丙酮中，对于氢醌芳族质子对杂原子连接的质子的比例发现为1∶0.4143。对于氧化剂，此特定的比例是1∶0.2589。这显示氧化剂包含比氢醌更少数量的杂原子连接的质子。图25显示在7.55ppm下，在氧化剂峰的本质和氢醌峰本质之间有清楚的差异。
当将一撮连二亚硫酸钠加入到在CD3COCD3中的氧化剂溶液中时，芳族质子对杂原子连接的质子的比例是1∶0.36。这指示氧化剂由连二亚硫酸盐还原成氢醌(图26)。
C-NMR氧化剂的C-NMR图(图27)指示这与氢醌的图(图28)相同。在两种情况下，随着质子完全去偶和使用CD3COCD3作为溶剂，分别在116.101ppm和150.695ppm下获得峰。在150.695ppm下的峰表示杂原子(＞C＝O)连接的碳。
(h)XRF分析迄今为止描述的所有分析得到的主意是cs-氧化剂的结构相似于氢醌的结构，区别在于它包含较小数量的杂原子连接的质子。此外，与氢醌相反，cs-氧化剂是强氧化剂。使用在包含pH7.4，50mM磷酸钾缓冲剂的200-μl-培育混合物中的1mg BSA，10μg氧化剂在1小时内产生9纳摩尔羰基。在相似的条件下，10μg氢醌产生可忽略数量的蛋白质羰基。同样与氢醌相反，氧化剂按化学计量氧化抗坏血酸。因此显现cs氧化剂可以是氢醌的过渡金属络合物或自由基，即，包含未配对的电子的对苯半醌。为检测如果存在的金属，将化合物进行X-射线荧光光谱分析。
采用硼酸备份，在与污垢样品混合之后以压挤片剂的形式分析氧化剂。使用具有铑x-射线管的Philips PW 2404波长分散x-射线荧光分光计(WDXRF)测量主要元素和微量元素。操作条件是50KV和40mA。
XRF分析并不指示化合物中任何过渡金属的存在。因此化合物的强氧化性能不是由于任何过渡金属的存在。
(i)ESR分析由于如XRF分析所示，该化合物并不包含任何过渡金属，其它的可选方案为氧化剂是自由基，最可能是对苯半醌。为检测未配对电子的存在，使用两种不同的方案将氧化剂进行ESR光谱分析。
方案#1.由于在贮存时，cs-氧化剂的活性经历衰变，采用新制备的氧化剂研究ESR光谱。收集来自100支卷烟的焦油并将氧化剂在同一天精制和经受ESR光谱。
使用的仪器是JES-REIX ESR分光计(东京，日本)。
使用的参数是场调制宽度＝0.4mT温度＝25℃功率＝2mW扫描场＝(335±10)mT扫描时间＝8min或2.5mT每min时间常数＝0.3sec接收器增益＝3.2×1000ESR图(图29)显示单一对称Lorentzian线的存在。这指示由在芳族框架上离域的未配对电子组成的单一类型自由基。参考标准固体DPPH(二苯基苦基偕腙肼)基计算谱线裂距因子或g因子。cs-氧化剂和DPPH精确中心的位置差异(其中第1导数信号交叉零)是13mm，相应于1.8G。
由于在相同的固定频率下记录两个光谱，在其下共振发生(hv＝gBH)的频率(v)对于两个光谱相同h.VDPPH＝gDPPH.B.HDPPH和h.Vcs-氧化剂＝gcs-氧化剂B.Hcs-氧化剂由于VDPPH和Vcs-氧化剂相同，gDPPH.B.HDPPH＝gcs-氧化剂.B.Hcs-氧化剂B是常数，因此gDPPH.HDPPH＝gcs-氧化剂.Hcs-氧化剂HDPPH是约3353.15G和因此Hcs-氧化剂是(3353.15G-1.8G)＝3351.35G。
重排得到gcs-氧化剂＝2.0036×3353.15/3351.35＝2.00468cs-氧化剂的此g-数值几乎与以前报导的对苯半醌的g-数值(2.004679±0.000006)相同(Wertz，J.E.和Bolton，J.R.电子自旋共振，理论和实际应用，McGraw-Hill Book Company，纽约，1972，p.465)。
将cs-氧化剂的自旋密度使用标准云杉苷作为参考物计算并发现为对于100支卷烟为1.82×1013mg-1或，自旋密度＝1.82×1011/卷烟。
方案#2.将每天分批次收集的来自400支卷烟的焦油，在7天期间聚集和在-72℃下贮存。在接着的两天期间进行来自聚集的焦油的cs-氧化剂的精制。在第10天进行精制氧化剂(8mg)的ESR光谱。
图30显示从400支卷烟收集的老化的cs-氧化剂的ESR光谱。
如以前使用标准云杉苷计算分子的自旋密度并发现其为1.0713×1013mg-1(来自400支卷烟)或，0.2678×1011/卷烟。
应当注意到如在方案#2中所述，在10天期间精制的老化cs-氧化剂的自旋密度(0.2678×1011/卷烟)，仅为新制备cs-氧化剂自旋密度的约15％(1.82×1011/卷烟)(方案#1)。此顺磁性损失伴随着老化cs-氧化剂的氧化剂活性的约85％损失，如由氧化抗坏血酸的能力证明。结果证明的事实是由cs-氧化剂氧化活性伴随的顺磁性在贮存时衰变。
cs-氧化剂的分子结构根据采用HPLC分析获得的结果以及化学和光谱研究，cs-氧化剂的分子结构可以衍生如下。
(i)cs-氧化剂包含未配对的电子且它的g-数值与对苯半醌的相同。
(ii)该结构相似于氢醌，区别在于它的M.P.低(162℃)&它比氢醌包含更少数量的杂原子连接的质子。在采用Na2S2O4的还原时，氧化剂转化成氢醌。
(iii)与氢醌相反，cs-氧化剂是强氧化剂。它氧化蛋白质以及抗坏血酸。
(iv)该氧化剂也包含还原基团，如由高铁细胞色素c的还原证明。
(v)高铁细胞色素c的还原和抗坏血酸的氧化是化学计量的；即该分子以化学计量比例包含一个还原基团和一个氧化基团。酚的OH致力于还原性能和具有未配对电子的氧致力于氧化性能。因此显现的是cs-氧化剂的分子结构是对苯半醌，如下所示。
对苯半醌可以不同的内消旋体形式存在，即，阴离子、中性、或阳离子形式，如图1所示，指示在包含杂原子的芳族框架内未配对电子的离域。这是为什么对苯半醌是相对稳定的自由基，它以固体结晶态从卷烟烟雾溶液分离。然而，在贮存时分离的纯氧化剂损失由氧化剂活性损失伴随的顺磁性，如以上在ESR研究下所示。当在室温下在黑暗中以固态贮存时，氧化剂的半寿期是48小时，当在pH7.4的50mM磷酸钾缓冲液中贮存时为约1.5小时。
实施例7精制的cs-氧化剂单独定量解释由整体卷烟烟雾溶液产生的蛋白质氧化使用BSA氧化作为模型系统，以上的陈述内容由如下的观察情况证明。
(i)在精制的cs氧化剂(稳定的氧化剂)中保持由羰基形成证明的由整体cs溶液产生的BSA氧化。在氧化剂分离和精制各个步骤如溶剂萃取，TLC和HPLC中抛弃的整体cs溶液组分并不产生BSA氧化。例如，在溶剂萃取阶段时，由于二氯甲烷萃取物的BSA氧化实际上为零(步骤2，在分离和精制下)(ii)冷冻干燥材料的TLC(步骤4，在分离和精制下)产生六个谱带，该六个谱带包括在Rf＝0.26的cs-氧化剂谱带，如图2所示。将所有谱带的萃取物如上所述分别收集并用于BSA氧化。BSA氧化仅由包含cs-氧化剂的相应于Rf＝0.26谱带的萃取物产生。Rf＝0.12，0.14，0.16，0.30，0.80的所有其它谱带的萃取物以及来自基线的萃取物，当单独或结合使用时，并不产生BSA氧化。
(iii)在精制过程(步骤6，在分离和精制下)的倒数第二阶段的丁醇萃取物的HPLC期间，仅有相应于cs-氧化剂的来自主峰(保留时间8.808min，图3b)的流出物产生BSA氧化。保留时间为4.55min-7.25min的其它次级峰并不产生BSA氧化。
(iv)使用二氧化硅柱的整体cs溶液的HPLC分析指示保留时间为5.717min-17.782min的几个峰的存在，这几个峰包括保留时间为8.813min的cs氧化剂主峰(图31)。当代替整体cs溶液时，使用cs的含水萃取物，在8.808min保留时间下洗脱出的氧化剂(图32)，它相同于保留时间为8.808min的cs-氧化剂峰，如由纯cs-氧化剂的HPLC分析揭示(图4)。仅有来自相应于cs-氧化剂的峰的流出物(保留时间8.813min)产生BSA氧化。来自所有其它峰的流出物单独或结合并不氧化BSA。
(v)使用ODS柱进行整体cs溶液的HPLC分析。使用的参数是柱子Shim-packCLC-ODS(M)流动溶剂水∶甲醇(95∶5)流量0.8ml/min压力147kgf/cm2温度25℃吸光度288nm(在水中cs-氧化剂的λmax)使用ODS柱的整体cs溶液的HPLC分析产生约13峰，包括在13.467min的峰(图33)，该峰是cs-氧化剂的峰，如由纯cs-氧化剂的HPLC分析证明(保留时间13.46min，图34)。也在此条件下，如以前所述使用二氧化硅柱观察到的那样，仅有来自相应于cs-氧化剂峰的流出物(保留时间13.46min)产生BSA氧化。来自其它峰的流出物单独或结合并不氧化BSA。
应当提及尽管使用ODS柱获得的分辩率(resolution)比二氧化硅柱的分辩率更好，ODS柱不能通常用于分析卷烟烟雾溶液或cs-氧化剂。在采用整体cs溶液的，cs含水萃取物或cs-氧化剂几个运行之后，ODS柱经历退化，如由增加的背压和分辩能力的损失证明。
上述的结果指示仅有cs-氧化剂引起BSA的氧化。没有整体cs溶液的其它组分可氧化BSA。这由表3中呈现的结果进一步确认。该表显示当使用整体cs溶液时，相应于cs-氧化剂的17030×103峰面积(保留时间，8.813min)产生7.53纳摩尔羰基，它等同于4.42×10-7纳摩尔羰基每单位面积。该表(表3)进一步显示当代替整体cs溶液时，使用HPLC-精制的cs-氧化剂，保留时间为8.808min的19010×1013的峰面积产生9.56纳摩尔羰基，它等同于5.03×10-7纳摩尔羰基每单位面积。结果指示由整体cs溶液产生的BSA氧化几乎定量地由单独的纯氧化剂再现，当后者以相应于整体cs溶液中存在的数量使用时。
cs-氧化剂不仅仅定量解释由整体cs溶液引起的蛋白质的氧化损伤，而且它是卷烟烟雾的主要危险组分，如由它的含量证明。从HPLC分析(p.8，在cs-氧化剂的回收下)，观察到在1ml整体cs溶液中存在的cs-氧化剂(等同于一支卷烟)得到3.4×108的任意面积。从标准HPLC曲线，100ng的纯cs-氧化剂得到190000的面积。故在从一支卷烟得到的的整体cs溶液中的cs-氧化剂含量是约190±10μg。从12种具有或不具有标准滤嘴的不同品牌商业卷烟获得可比的收率。应当提及的是cs-氧化剂不在未点燃的烟草中存在但在卷烟的燃烧期间形成。
精制的cs-氧化剂定量解释由整体cs溶液产生的蛋白质的氧化损伤进一步由采用整体cs溶液以及cs-氧化剂处理的天竺鼠肺微粒体蛋白质的SDS-PAGE证明(图35a)。该图显示与未处理的微粒体(泳道1)相比，分别由50μl cs溶液(泳道2)和100μl cs溶液(泳道3)产生基本的损伤。当以cs溶液中存在的数量由纯cs-氧化剂替换cs溶液时，由泳道4中(10μg cs-氧化剂)和泳道5(20μg cs氧化剂)所示损伤甚至更厉害。图35b显示不同泳道(泳道1-5)的蛋白质谱带的光密度扫描，指示由cs溶液和以cs溶液中存在数量的cs-氧化剂产生的损伤对比程度的图形表示。
实施例8cs-氧化剂诱导的DNA的氧化损伤已经报导了卷烟烟雾溶液产生DNA损伤，如由单链断裂和8-羟基鸟苷的形成证明。也已知DNA损伤交织着突变和癌症。世界上约80％的肺癌由卷烟烟雾引起。现在申请人产生数据以指示卷烟烟雾诱导的DNA的氧化损伤由cs-氧化剂引起。
将2mg质粒DNA采用在pH7.4，50mM磷酸钾缓冲剂中的15μgcs-氧化剂在37℃下在200μl最终体积中培育一小时。对照培育系统保持没有cs-氧化剂。在培育之后，将DNA采用500μl乙醇沉淀，离心，采用70％乙醇洗涤到无盐，冷冻干燥，在-70℃下贮存和随后分析氧化损伤。使用GC-质谱由8-羟基鸟苷和5-羟基-6-甲基乙内酰脲的产生测量DNA损伤。结果显示cs-氧化剂对每106个DNA碱基诱导形成24纳摩尔8-羟基鸟苷和121纳摩尔5-羟基-6-甲基乙内酰脲。
实施例9由不同化合物/药剂的cs-氧化剂诱导的蛋白质氧化的预防许多化合物/药剂是已经在体外预防BSA氧化到35-97％程度的识别的那些。除抗血酸以外，化合物/药剂包括酒石酸、柠檬酸、草酸、谷胱甘肽、茶提取物和茶的单个组分(表4)。
表1.在cs-氧化剂不同精制阶段的氧化效力评估
*在扣除50μl磷酸钾缓冲溶液中存在的盐的干重量之后的实际重量。
**给出平均值，S.D＜5％(n＝10)表2.由HPLC分析测量的由cs-氧化剂对抗坏血酸的氧化
表3.由在不同精制阶段的CS-溶液级分对BSA的氧化
*当整体cs溶液由相等数量的焦油溶液替换时获得相似的结果。
表4.由不同化学药剂的cs-氧化剂诱导的白蛋白氧化的保护
在本文中描述培育系统和羰基估测。
表5.使用活性炭过滤器的主要有害cs-氧化剂的失活和卷烟烟雾中烟碱输送
*活性炭过滤器的内径是8mm。
**以从具有常规过滤器的卷烟输送的烟碱(940μg±40 S.D；n＝6)为100计算的百分比#BS44指示BS 25(-)到BS44(+)，颗粒大小为350-700μm≠BS52指示BS 44(-)到BS52(+)，颗粒大小为250-350μm的粒度·26mm BS44+9mm BS52◆常规过滤器的长度已经示于图36和37。
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权利要求
1.一种分离通式1的对苯半醌的方法 (通式I)该对苯半醌是来自卷烟烟雾的引起蛋白质和DNA氧化损伤的主要有害氧化剂，所述方法包括如下步骤(a)从点燃的常规过滤嘴卷烟收集焦油或cs(卷烟烟雾)溶液，(b)通过在浸入冰和盐混合物的玻璃烧瓶中点燃焦油含量为20-30mg每支卷烟的常规过滤嘴卷烟并且允许焦油冷凝并在烧瓶底部沉降，从而收集焦油，(c)保持以上所述烧瓶在室温下和在7.4-7.8的pH值范围内采用30-60mM磷酸钾缓冲剂萃取所述焦油，通过0.45μm微孔过滤器过滤以上溶液并通过加入NaOH溶液调节滤液的pH值范围为7.4-7.6，以获得所需的焦油溶液，(d)采用同等体积的二氯甲烷萃取以上所述焦油溶液三次，抛弃下部的二氯甲烷层并收集称为卷烟烟雾含水萃取物的上部黄色水层，(e)采用同等体积的水饱和的正丁醇萃取以上所述卷烟烟雾含水萃取物两次，在冷冻干燥器中在-50℃～-60℃的温度范围内在真空下冷冻干燥合并的黄色丁醇萃取物，随后采用HPLC级丙酮萃取冷冻干燥的材料两次，并在真空下干燥该丙酮溶液及采用HPLC级甲醇溶解所述丙酮萃取物，(f)使用非荧光二氧化硅板将以上所述甲醇溶液进行谱带TLC，使用比例为80∶20的甲苯和乙酸乙酯混合物展开所述二氧化硅板，取出该板并在约25-30℃下使用干燥器干燥该板，从该板两侧切割包含展开的材料的小条并在碘腔中保持它们以定位相应于Rf0.26的谱带，刮去该谱带和采用HPLC级丙酮萃取该谱带材料，随后收集丙酮层并在真空下干燥它，(g)通过加入同等体积的毫Q水而溶解显现为淡黄色针状物的以上所述丙酮萃取物，采用同等体积的HPLC级水饱和的正丁醇萃取获得的水溶液，随后在小玻璃管中在真空下干燥上部正丁醇层，以获得纯度为98-99％和收率为约18-22μg每支卷烟的主要卷烟烟雾(cs)氧化剂，(h)通过将其溶解在包括比例为90∶10(v/v)的二氯甲烷和甲醇混合物的流动溶剂中，并在0.5ml/min的流量下，在约25℃的温度下和在约29kgf/cm2的压力下，在294nm使用uv检测器将其注入具有正相25cm二氧化硅柱的HPLC仪器，从而精制在步骤(g)中获得的以上所述cs氧化剂，随后收集在8.808min的保留时间下显现为单峰的流出物，精制后的母焦油溶液中的总cs氧化剂纯度为100％和收率为8.4％。
2.一种分离通式1的对苯半醌的方法，该对苯半醌是来自卷烟烟雾的引起蛋白质和DNA氧化损伤的主要有害氧化剂，所述方法进一步包括(a)在pH值为7.4-7.8下，将从焦油含量为20-30mg每支卷烟的常规过滤嘴卷烟收集的整体卷烟烟雾通入30-60mM的钾缓冲剂，通过0.45μm微孔过滤器过滤以上溶液，通过加入NaOH溶液调节滤液的pH值为7.4-7.6以获得所需的卷烟烟雾溶液(cs溶液)；(b)采用同等体积的二氯甲烷萃取以上所述cs溶液三次，抛弃下部的二氯甲烷层和收集称为卷烟烟雾含水萃取物的上部黄色水层；(c)采用同等体积的水饱和的正丁醇萃取以上所述卷烟烟雾的水层两次，在Lyolab冷冻干燥器中在-50℃～-60℃的温度下在真空下冷冻干燥合并的黄色丁醇萃取物，随后采用HPLC级丙酮萃取冷冻干燥的材料两次，和在真空下干燥该丙酮溶液和采用HPLC级甲醇溶解所述丙酮萃取物；(d)使用非荧光二氧化硅板将以上所述甲醇溶液进行谱带TLC，使用比例为80∶20的甲苯和乙酸乙酯混合物展开所述的二氧化硅板，取出该板并在约25-30℃下使用干燥器干燥，从该板两侧切割包含展开的材料的小条并在碘腔中保持它们，以定位相应于Rf0.26的谱带，刮去所述谱带并采用HPLC级丙酮萃取该谱带材料，随后收集丙酮层并在真空下干燥它；(e)通过加入同等体积的毫Q水而溶解显现为淡黄色针状物的以上所述丙酮萃取物，采用同等体积的HPLC级水饱和的正丁醇萃取所述水溶液，随后在小玻璃管中在真空下干燥上部正丁醇层，以获得纯度为98-99％和收率为18-22μg每支卷烟的主要cs氧化剂；和(f)通过将其溶解在包括比例为90∶10(v/v)的二氯甲烷和甲醇混合物的流动溶剂中，并在0.5ml/min的流量下，在约25℃的温度下和在约29kgf/cm2的压力下，在294nm使用uv检测器将其注入具有正相25cm二氧化硅柱的HPLC仪器，从而精制在步骤e中获得的以上所述cs氧化剂，并收集在8.808min的保留时间下显现为单峰的流出物，精制后母cs溶液中的总cs氧化剂纯度为100％和收率为8.4％。
3.根据权利要求1&2所述的方法，其中所述分离的纯卷烟烟雾(cs)氧化剂具有如下性能(a)当从丙酮溶液结晶时，显现为具有相似于酸败乳脂的味道的刺激性味道的小针形微弱黄色晶体，(b)分别地，在甲醇溶液中的UV吸收畸峰是在293.4nm和223.0nm和在水溶液中的UV吸收畸峰是在288nm和221nm，(c)分别地，在甲醇溶液中在293nm下激发时，观察到的发射畸峰是在329.6nm和651.4nm，和在224nm下激发时，观察到的发射畸峰是在329.6nm和652.6nm，(d)分别地，当保持发射在330nm下监测激发扫描时，观察到的激发畸峰是在228.2nm和293.8nm和当将发射保持在651nm下并监测激发扫描时，观察到的激发畸峰是在229.2nm和294.8nm，(e)高度溶于甲醇、乙醇、丙酮、正丁醇，相当溶于水，微溶于二氯甲烷、乙醚、氯仿和不溶于苯和石油醚，(f)在4-5的酸性pH值下该化合物损失它的氧化效力和保持该溶液在9-10的碱性pH值范围内时，该化合物逐渐变成棕色，在10和之上的pH值下，立即变暗及由UV光谱证明活性和芳香性两者都损失，(g)当在固态下在25℃-30℃的温度范围内在黑暗下贮存时，所述氧化剂的半寿期由它的氧化效力确定为约48小时，但在pH值为7.4的50mM磷酸钾缓冲剂溶液中，在25℃-30℃下，该半寿期是约1小时30分钟，(h)还原高铁细胞色素C和氯化铁，(i)氧化抗坏血酸、蛋白质和DNA，和(j)熔点是162℃。
4.一种定量测定通式1的对苯半醌的方法，该对苯半醌是来自卷烟烟雾的引起蛋白质和DNA氧化损伤的主要有害氧化剂，该方法包括如下步骤(a)从点燃的常规过滤嘴卷烟收集焦油或cs(卷烟烟雾)溶液，(b)通过在浸入冰和盐混合物中的玻璃烧瓶中点燃焦油含量为20-30mg每支卷烟的常规过滤嘴卷烟和并允许该焦油冷凝和在烧瓶底部沉降，从而收集焦油，(c)保持以上所述烧瓶在室温下并在7.4-7.8的pH值下采用30-60mM磷酸钾缓冲剂萃取所述焦油，通过0.45μm微孔过滤器过滤以上溶液并通过加入NaOH溶液调节滤液的pH值范围为7.4-7.6，以获得所需的焦油溶液，(d)采用同等体积的二氯甲烷萃取以上所述焦油溶液三次，抛弃下部的二氯甲烷层和收集称为卷烟烟雾含水萃取物的上部黄色水层，(e)采用同等体积的水饱和的正丁醇萃取以上所述卷烟烟雾含水萃取物两次，在冷冻干燥器中在-50℃～-60℃的温度下在真空下冷冻干燥合并的黄色丁醇萃取物，随后采用HPLC级丙酮萃取冷冻干燥的材料两次，并在真空下干燥所述丙酮溶液和采用HPLC级甲醇溶解所述丙酮萃取物，(f)使用非荧光二氧化硅板将以上所述甲醇溶液进行谱带TLC，使用比例为80∶20的甲苯和乙酸乙酯混合物展开所述二氧化硅板，取出该板和在约25-30℃下使用干燥器干燥该板，接着从该板两侧切割包含展开的材料的小条并在碘腔中保持它们以定位相应于Rf0.26的谱带，刮去该谱带并采用HPLC级丙酮萃取该谱带材料，随后收集丙酮层并在真空下干燥它，(g)通过加入同等体积的毫Q水而溶解显现为淡黄色针状物的以上所述丙酮萃取物，采用同等体积的HPLC级水饱和的正丁醇萃取获得的水溶液，随后在小玻璃管中在真空下干燥上部正丁醇层，以获得纯度为98-99％和收率为约18-22μg每支卷烟的主要卷烟烟雾(cs)氧化剂，和(h)通过将其溶解在包括比例为90∶10(v/v)的二氯甲烷和甲醇混合物的流动溶剂中，并在0.5ml/min的流量下，在约25℃的温度下和在约29kgf/cm2的压力下，在294nm使用uv检测器将其注入具有正相25cm二氧化硅柱的HPLC仪器，从而精制在步骤(g)中获得的以上所述cs氧化剂，随后收集在8.808min的保留时间下显现为单峰的流出物，精制后的在母焦油溶液中存在的总cs氧化剂纯度为100％和收率为8.4％。
5.一种定量测定通式1的对苯半醌的方法，该对苯半醌是来自卷烟烟雾的引起蛋白质和DNA氧化损伤的主要有害氧化剂，该方法进一步包括(a)在pH值为7.4-7.8下，将从焦油含量为20-30mg每支卷烟的常规过滤嘴卷烟收集的整体卷烟烟雾通入30-60mM的钾缓冲剂，通过0.45μm微孔过滤器过滤以上溶液，通过加入NaOH溶液调节滤液的pH值为7.4-7.6以获得所需的卷烟烟雾溶液(cs溶液)；(b)采用同等体积的二氯甲烷萃取以上所述cs溶液三次，抛弃下部的二氯甲烷层和收集称为卷烟烟雾含水萃取物的上部黄色水层；(c)采用同等体积的水饱和的正丁醇萃取以上所述卷烟烟雾的水层两次，在Lyolab冷冻干燥器中在-50℃～-60℃的温度下在真空下冷冻干燥合并的黄色丁醇萃取物，随后采用HPLC级丙酮萃取冷冻干燥的材料两次，并在真空下干燥所述丙酮溶液和采用HPLC级甲醇溶解该丙酮萃取物；(d)使用非荧光二氧化硅板将以上所述甲醇溶液进行谱带TLC，使用比例为80∶20的甲苯和乙酸乙酯混合物展开所述二氧化硅板，取出该板和在约25-30℃下使用干燥器干燥，从该板两侧切割包含展开的材料的小条并在碘腔中保持它们以定位相应于Rf0.26的谱带，刮去该谱带和采用HPLC级丙酮萃取该谱带材料，随后收集丙酮层并在真空下干燥它；(e)通过加入同等体积的毫Q水而溶解显现为淡黄色针状物的以上所述丙酮萃取物，采用同等体积的HPLC级水饱和的正丁醇萃取所述水溶液，随后在小玻璃管中在真空下干燥上部正丁醇层，以获得纯度为98-99％和收率为约18-22μg每支卷烟的主要cs氧化剂；和(f)通过将其溶解在包括比例为90∶10(v/v)的二氯甲烷和甲醇混合物的流动溶剂中，并在0.5ml/min的流量下，在约25℃的温度下和在约29kgf/cm2的压力下，在294nm使用uv检测器将其注入具有正相25cm二氧化硅柱的HPLC仪器，从而精制在步骤e中获得的以上所述cs氧化剂，随后收集在8.808min的保留时间下显现为单峰的流出物，提纯的存在于母焦油溶液中的总cs氧化剂纯度为100％和收率为8.4％。
6.根据权利要求1-4所述的方法，其中使用25cm反相ODS柱和使用水和甲醇(95∶5v/v)的混合物作为流动相，在288nm的波长，0.8ml/min的流量下，在约25℃的温度下和在约147kgf/cm2的压力下和其保留时间为13.46min，由具有UV检测器的HPLC定量检测cs溶液中存在的对苯半醌。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述对苯半醌是从整体cs溶液分离的引起蛋白质氧化损伤的主要原因。
8.根据权利要求1所述的方法，其中对苯半醌，所述cs氧化剂引起DNA的氧化损伤。
9.根据权利要求1所述的方法，其中通过使所述蛋白质与从所述cs溶液获得的对苯半醌反应，随后与2，4二硝基苯肼(DNPH)反应和最后测量在390nm波长下的吸光度，测量蛋白质羰基形成，从而定量测定由cs溶液中存在的对苯半醌引起的蛋白质损伤。
10.根据权利要求1所述的方法，其中通过使所述蛋白质与cs溶液中存在的对苯半醌反应，随后由SDS-PAGE和光密度扫描，测量天竺鼠组织微粒体蛋白质的氧化降解，从而定量测定由cs溶液中存在的对苯半醌引起的蛋白质损伤。
11.根据权利要求10所述的方法，其中用于蛋白质氧化损伤测定的蛋白质选自BSA和天竺鼠肺微粒体蛋白质。
12.根据权利要求10所述的方法，其中由所述cs溶液中存在的对苯半醌进行由整体cs溶液产生的BSA氧化。
13.根据权利要求12所述的方法，其中与由所述整体cs溶液产生的7.53±0.34比较，由所述cs氧化剂产生的BSA氧化是9.56±0.14，该氧化由每mg BSA形成的羰基纳摩尔数证明。
14.根据权利要求12所述的方法，其中与由所述卷烟烟雾含水萃取物产生的8.16±0.24比较，由所述cs氧化剂产生的BSA氧化是9.56±0.14，该氧化由每mg BSA形成的羰基纳摩尔数证明。
15.根据权利要求12所述的方法，其中与由所述TLC精制的卷烟烟雾含水萃取物产生的9.23±0.14比较，由所述cs氧化剂产生的BSA氧化是9.56±0.14，该氧化由每mg BSA形成的羰基纳摩尔数证明。
16.根据权利要求11所述的方法，其中由SDS-PAGE证明的所述对苯半醌溶液产生的天竺鼠组织微粒体蛋白质的氧化降解，可比于由所述整体cs溶液产生的氧化降解。
17.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法用于卷烟中cs氧化剂对苯半醌的定量测定，以特定商业品牌卷烟的焦油含量计。
18.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法用于卷烟中cs氧化剂对苯半醌的定量测定，以特定商业品牌卷烟的毒性水平计。
19.根据权利要求1所述的方法，其中从不同商业品牌的燃烧的卷烟的烟雾分离的对苯半醌数量用于确定特定品牌卷烟的毒性指数，以存在的对苯半醌数量计。
20.一种预防体外卷烟烟雾诱导蛋白质氧化的方法，所述方法包括使用选自如下的化合物或药剂抑制BSA氧化抗坏血酸、连二亚硫酸钠、酒石酸、柠檬酸、草酸、琥珀酸、组氨酸、赖氨酸、硫脲、谷胱甘肽、红茶提取物、绿茶提取物、儿茶素、表没食子儿茶素和表儿茶素。
21.根据权利要求20所述的方法，其中在约100μM的浓度下抗坏血酸抑制BSA氧化直到76％。
22.根据权利要求20所述的方法，其中在约2mM的浓度下连二亚硫酸钠抑制BSA氧化直到97％。
23.根据权利要求20所述的方法，其中在约500μM-1mM的浓度范围下酒石酸抑制BSA氧化直到75％。
24.根据权利要求20所述的方法，其中在约500μM-1mM的浓度范围下柠檬酸抑制BSA氧化直到75％。
25.根据权利要求20所述的方法，其中在约500μM的浓度下草酸抑制BSA氧化直到53％。
26.根据权利要求20所述的方法，其中在约1mM的浓度下琥珀酸抑制BSA氧化直到60％。
27.根据权利要求20所述的方法，其中在约1mM的浓度下组氨酸抑制BSA氧化直到67％。
28.根据权利要求20所述的方法，其中在约2.5mg的浓度下红茶提取物抑制BSA氧化直到50％。
29.根据权利要求20所述的方法，其中在约750μg的浓度下儿茶素抑制BSA氧化直到54％。
30.根据权利要求20所述的方法，其中在约140μg的浓度下表没食子儿茶素抑制BSA氧化直到95％。
31.根据权利要求20所述的方法，其中在约50μg的浓度下表儿茶素抑制BSA氧化直到50％。
32.根据权利要求20所述的方法，其中在约2.5mg的浓度下绿茶提取物抑制BSA氧化直到50％。
33.根据权利要求20所述的方法，其中在约1mM的浓度下赖氨酸抑制BSA氧化直到35％。
34.根据权利要求20所述的方法，其中在约10mM的浓度下硫脲抑制BSA氧化直到52％。
35.根据权利要求20所述的方法，其中在约1mM的浓度下glutanthione抑制BSA氧化直到37％。
36.选自抗坏血酸、连二亚硫酸钠、酒石酸、柠檬酸、草酸、琥珀酸、组氨酸、赖氨酸、硫脲、谷胱甘肽、红茶提取物、绿茶提取物、儿茶素、表没食子儿茶素和表儿茶素的化合物或药剂作为由所述卷烟烟雾氧化剂引起的有害效果解毒剂的用途。
37.在实验室条件下，化合物对苯半醌用于研究氧化损伤诱导的变性性疾病和由对分离的蛋白质、DNA、培养细胞或对试验模型产生氧化损伤的卷烟烟雾引起的癌症机理的用途。
38.一种定量评估有害氧化剂对苯半醌的方法，该方法有助于配制要用于卷烟、雪茄、卷烟烟斗和任何其它常规吸烟器具的吸烟材料数量和性质。
全文摘要
直到目前已知的卷烟烟雾的组分，并不解释吸烟的压倒性危险效果；本发明描述了卷烟烟雾中存在的相对稳定主要有害氧化剂(cs－氧化剂)的分离，识别和结构测定过程，性能和检测，该氧化剂的含量是约190±10mg每支卷烟；cs－氧化剂单独几乎定量地解释由整体卷烟烟雾的含水萃取物产生的蛋白质氧化损伤，它也引起DNA的氧化损伤；由于cs－氧化剂是相对稳定的，它进一步解释侧流烟雾和被动吸烟的有害影响；已经发现包括维生素C的许多化合物/药剂体外预防cs－氧化剂诱导的蛋白质氧化。
文档编号A61K31/4172GK1555487SQ02816215
公开日2004年12月15日 申请日期2002年1月31日 优先权日2001年6月22日
发明者I·B·查特吉, I B 查特吉 申请人:科学和工业研究会