专利名称：Stat－1之抑制的制作方法
技术领域：
本发明涉及转录因子STAT-1的抑制剂在制备用于预防或治疗下述疾病的药物中的应用，所述疾病包括心血管并发症，诸如在经皮血管成形术之后的再狭窄或静脉搭桥术之后的狭窄，移植物抗宿主疾病(graft versus host disease)(GVHD)，在外科介入和器官移植范畴中局部缺血/再注入相关性损伤，免疫学过敏性反应，特别是变应性鼻炎、药物和食物变应性、特别是荨麻疹和乳糜泻(口炎性腹泻)、接触性湿疹与免疫复合物病，特别是肺泡炎(alveolitis)、关节炎、肾小球性肾炎和变应性血管炎(allergic vasculitis)，炎性软骨病和骨病，特别是关节病、痛风、骨炎和骨髓炎，多发性神经炎(polyneuritis)，以及急性或亚急性感染事件，且特别是感染后炎性疾病，特别是支气管炎、心内膜炎、肝炎、心肌炎、肾炎、心包炎、腹膜炎、和胰腺炎，包括感染性休克(septic shock)。
人类基因组密码翻译的一项主要目标在于分别鉴定出致病基因(由于它们的产物之作用方式所致)以及此等基因所具结构的致病性变化(多态性)且将它们与一疾病模式。所以，对于大部分的疾病，若它们经认为是由一经认定数目的基因产物表达得太强、太弱或不足之原因所引起时，就会达到由原因所决定的治疗法。事实上，对于一组遗传疾病(例如囊性纤维化)就已经知道通常为单一基因缺陷(单基因性疾病)，而对于其它疾病(例如高血压)则显得明显更为复杂。后者显然地不是单一而是多重基因缺陷的结果(多基因性疾病)，预先决定了罹患者会发展出与某些环境因素吻合的疾病。尽管此事实会限制对于在一或多重基因的表达中的目标导向性介入，却也提供一种以原因为基准而非以征候为基准之治疗法。
转录因子为DNA-结合蛋白质，它们会附着到在细胞核内部一或多个基因的启动子区，藉此调节它们的表达，亦即此等基因所编码的蛋白质之再生。除了控制人体内发育和分化的程序的生理重要作用之外，转录因子也显示出高度的诱发疾病之潜在性，特别为它们会在错误的时间点活化基因表达。此外(可能为相同的)转录因子可能阻断具有保护功能的基因而有使疾病易于形成之作用。于此范围内，在下面所述抗-转录因子治疗法的原理中，其目标系在致病性基因的抑制与相对的保护性基因之活化。
炎症为生物体和其组织对抗伤害性刺激的一种防卫反应，其目标在于该伤害的矫正或至少其局部性限制，与消除掉伤害的肇因(例如入侵的细菌或外来物质)。炎症的诱发物可能为微生物(细菌、病毒、真菌或寄生虫)，外来物质(花粉、石绵或硅酸盐晶体)，机械性损伤、化学有害因子和物理影响所致组织破坏，以及来自身体本身的诱发物(崩溃性肿瘤细胞、血管外血液、自体免疫反应)或体内沉淀物质的晶体(尿酸、草酸钙和磷酸钙、胆固醇)。
(组织内部的)肥大细胞或血液内的嗜碱粒细胞等的快速活化即为开动非常强的急性炎症反应之一例子且为立即型免疫学过敏性反应(I型体液变态反应(humoral allergy type I)所特具者。若生物已经在事先接触到抗原(或另外，于过敏性的情况中，接触到过敏原)，则B-淋巴细胞会被敏化作为对此的反应。B-淋巴细胞会与事先敏化的2型CD4-阳性T-辅助细胞(Th2细胞)配合而转换成为浆细胞(plasmocytes)且起始产生对抗抗原的IgE-型抗体。于此分化程序中，由表达相应配体(CD154)的Th2细胞透过CD40-受体产生的B-淋巴细胞之共-刺激具有关键重要性。当装载着抗原的IgE-抗体结合到肥大细胞上面的相应受体(Fcε型)之时，此等即开始释出不同的炎症介质，特别是组胺、白介素-8、白三烯类、和肿瘤坏死因子-α(TNFα)。其结果为吸引专职的炎性细胞特别是嗜曙红(eodiophile)和嗜中性(neutrophile)粒细胞和单核细胞以及现场的T-淋巴细胞(趋化性)。同时会发生组胺依赖性血管扩张及覆盖内部血管壁的内皮细胞所具通透性之增加。由于血管扩张，流动速度的减低有助于在受吸引的白细胞与内皮细胞之间的物理接触之建立。暴露于细胞因子(例如TNFα)且由是已经被活化的此等内皮细胞会显示出选择蛋白(selectin)(例如E-选择蛋白)在它们的血管腔表面上的强化表达，促成白细胞沿着内皮细胞滚动且藉此使其它粘着分子(整合素(integrin)；例如细胞间粘着分子-1(intercellular adhesionmolecule-1)[ICAM-1]或血管细胞粘着分子-1(vascular cell adhesionmolecule-1)[VCAM-1])活化。至此白细胞可粘附到血管壁(边缘化(margination))且组胺-相关联的通透性之增加(内皮细胞联结的松散)有利于它们移动到血管外空间中(血细胞渗出)。于此同时，增加量的富蛋白质流体(炎性泌出液)达到间质空间而形成水肿。周遭的神经末端会被组织内增加的压力与炎性细胞产生的其它媒介物所刺激并触动疼痛而意识到组织的伤害。
已经移动到炎症部位的粒细胞与已经再分化成巨噬细胞的单核细胞都尝试分别经由吞噬作用和胞溶作用消除掉炎症肇因藉以触发也可能伤害周遭组织的蛋白水解酶和氧自由基之释出。特别者，巨噬细胞的活化可能从许多方面促成(例如经由释放出其它细胞因子如白介素-1β或白介素-6)使得整个生物涉及到就急性期反应而言的基本上为局部的炎性反应之事实。急性期反应的代表性特性为疲劳、无精打采和发烧，白细胞从骨髓的释出增加(白细胞增多)，在血液内检测到急性期蛋白质(例如C-反应性蛋白质)，免疫系统的刺激以及因为改变后的新陈代谢状态所致体重减低。
若炎症的肇因可以消除，则伤口愈合的过程会与破坏组织的修复同步。最佳者为此过程会达到完整的再建立(完全恢复(restitutio adintegrum))，而较大的伤害或结缔组织(尤其是胶原蛋白)的过度产生会导致疤的形成，其可能伴随着取决于受害组织的显著障碍。若肇因(外来物质或伤口感染)不能立即消除掉，则伤口愈合会延缓，同时增加吞噬细胞的迁移和活性，造成组织的毁灭(坏死)到甚至于腔洞的形成(脓肿)。其结果几乎总是有疤的组织再结构化伴随着相应的功能损失。若对于导源于致病因子的炎症不能成功地予以局部限制，则该炎症会透过淋巴系统散布到整个生物体。其结果为可能有致命结局之败血症(感染性休克)。
若炎症和痊愈程序呈平衡情况，伤口痊愈也会受到干扰。其结果为慢性炎症，可能导致纤维变性(过多胶原蛋白合成)或肉牙肿性(炎性细胞组织化成为粒化组织)且时常会分别带来受害组织的连续性破坏与所具功能性的增加限制。
除了所述可能慢性变性的一般炎性反应之外，还有会针对根本的发病机理展现出一般基础性与各别性两种差异之炎性疾病。两种此等类型的炎症疾病为例如心脏手术介入之后的并发症与免疫过敏性反应，它们因为具有巨大的临床相关性而在本说明书中给予较多的篇幅。
以顶端球囊型插管为基础的机械扩张(经皮血管成形术)与利用静脉搭桥术的动脉粥样硬化性狭窄化动脉之搭桥术仍然分别构成分别患有冠状与周围循环疾病的患者之首选治疗法以提供对抗即将发生的梗塞或器官衰竭之保护。不过经过机械扩张过与(在大部分情况中)使用金属血管支撑器(撑开器(stent))处理的动脉之再堵塞(再狭窄)率显然高得不可接受，于6个月内达20-50％。此外，冠状主动脉和周围静脉搭桥术于5年之后50-70％的再堵塞率对于接受治疗的患者不仅是令人不满者而已，特别是分别针对有关手术的风险背景与手术后的风险而论之时。也许是因为血管壁被伤害(此处受影响者包括内皮细胞和平滑肌细胞)之故，血管造形术之后的再狭窄在早期阶段特别会显示出一种明显的炎性反应成分，其特征为，血管壁被专性炎性细胞(最重要者为单核细胞和T-淋巴细胞)所渗入。在冠状主动脉与周围静脉搭桥术之内的纤维增生性狭窄形成(血管内膜增殖(intimal hyperplasia))似乎也分别基于炎性反应，特别是由机械和物理病因所引起者。长久以来就已经知道在外科介入或器官移植范畴中的所谓局部缺血/再注入相关性损伤会伴随着以炎症为基础的组织伤害，其中在内皮细胞与专性炎性细胞(最重要者为粒细胞，不过也包括单核细胞和T-淋巴细胞)之间的相互作用以及组织伤害性物质(氧自由基，细胞因子)的释出起着十分关键性作用。
关于所提及的心-血管并发症，重要的是要有保护机制，最重要的是在血管壁的内皮细胞和平滑肌细胞之内有保护机制，其有助于限制炎性反应的程度与随后的组织之适应性再结构化。对此方面，举例而言，有属于在内皮细胞内的由NO-合酶进行的氧化氮(NO)之合成。NO，可能起着作为氧自由基超氧化物的内源性拮抗剂之作用，因此，会抑制促炎性细胞因子(例如，单核细胞化学引诱性蛋白质-1(monocyte chemoattractant protein-1)(MCP-1)与粘着分子(例如ICAM-1)在内皮细胞内的表达，生长因子受体(例如内皮素B-受体)在平滑肌细胞内的表达以及生长因子从白细胞的释出。如此，可以容易地了解，机械性伤害就如内皮的功能性伤害(例如在此等细胞内由细胞因子诱发的NO-合酶表达之减低)会抵消形成所提及的心血管并发症的基础之炎症过程和随后的纤维增生性血管壁再结构化。
要在血管造形术之后以药剂方式验证再狭窄的所有先前尝试都不能在大部分患者体内达到合意的效果。目前，有两种局部治疗原理较有利已经认可过的血管近接放射线治疗法(brachytherapy)，一种经由对扩张血管段施以短时间放射照射以检查细胞生长之方法，以及仍然处于临床试验中的药物洗脱撑开器(drug-eluting stents)。此方法包括“浸渍着“生长抑制性药剂(细胞生长抑制剂和免疫抑制剂)且于数星期期间将该等药剂慢慢地释放出的聚合物涂覆撑开器。大部分最近的临床研究证明虽然有令人鼓舞的初始结果，但是这两种治疗做法都不能免于某些程度的严重问题(例如会带来梗塞危险的撑开器内血栓形成(in-stent-thrombosis))。
除了已经描述过的I型免疫不相容性反应之外，原则上还有四种在免疫调节上分别为变应性和障碍的其它形式。I型反应本身在变应化(allergisation)完成之后主要可分为两个阶段血管活性炎性媒介物从IgE引发(spiked)的肥大细胞快速释放出及再生，以及由被吸引的嗜曙红粒细胞和嗜中性粒细胞所介导的晚期反应。完整的I型反应可能依据对变应原的暴露而局部性或系统性发生。呼吸空气中的变应原会诱发呼吸道中的反应，典型地会并发黏膜水肿和过度分泌(变应性鼻病，干草热)以及支气管痉挛(哮喘)，而营养物中的变应原则会诱发胃肠道症状如恶心、呕吐和腹泻。皮肤对变应原的反应为发痒与荨麻疹以及特应性皮炎(atopic dermatitis)(神经性皮炎(neurodermatitis))。不过，假使变应原直接进入到血流之内(例如血液产物的注入，药疗)或假若对变应原的暴露特别地强，会导致系统性立即反应，可能招致威胁生命的血压降低(过敏性休克)。
在II型反应的情况中，是由抗原活性细胞(例如外来的血球)或细胞外蛋白质(例如在体内天然产生的细胞表面上之药剂诱导变化)起关键作用。于变应化之后，第二次接触导致IgG-和IgM-型变应原特异性抗体的产生，它们可大量地结合变应原性细胞(调理作用(opsonisation))。藉此将补体系统(膜作用性复合物之形成)和一特别的淋巴细胞亚群，天然杀伤细胞(NK-细胞)，等予以活化。其结果为变应原性细胞经由细胞溶解而破坏。当自身抗体作用到身体内天然产生的结构例如肾血管球微血管的基膜之时，也会诱发类似的反应且藉此诱发伴有切迫性肾功能不足之快速进行性肾小球性肾炎。除了1型T-辅助细胞(Th1-细胞，参看下文)之外，经活化的NK-细胞为干扰素-γ---一种细胞因子，可特别是经由将巨噬细胞活化大幅地强化炎性反应---的主要产生者。
III型反应的特征在于形成且沉积免疫复合物(抗原-抗体复合物)，随后活化补体系统与吞噬细胞(粒细胞，巨噬细胞)。它们会在血液中循环且依序地主要沉积于肾血管球的微血管之内不过也会沉积在关节内或皮肤内。由是诱发出的炎性反应可能带来(免疫复合物性)肾小球性肾炎，关节内疼痛以及荨麻疹。若免疫系统不能消除掉致病因子(例如链球菌)之时，感染也可能诱发系统性III型反应。代表性局部III型反应为接种之后皮肤内的所谓Arthus反应或于抗原-抗体-复合物在肺部内沉积的情况中发生的外源性变应性肺泡炎(例如喂鸟人肺(bird-breeder lung))。系统性红斑狼疮也是一种III型反应不过因为有自身抗体之形成而归属于自身免疫疾病。
与前面所提及的过敏性反应不同者，IV型反应不是体液性的而是细胞局限性的且经常要到七天之后才会达到其最高点(延迟型反应或延迟型过敏反应)。诱发剂主要为蛋白质、侵入的外来生物体(细菌、病毒、真菌和寄生虫)，其它外来蛋白质(例如于乳糜泻情况中的小麦衍生之麦胶蛋白(gliadin))以及半抗原(药剂、金属[例如接触性皮肤炎情况中的镍]，化妆品与植物成分)。移植器官的原发性排斥也是一种IV型反应。抗原会被(组织)巨噬细胞所吞噬、处理并呈递给原初T-辅助细胞(CD4阳性)；T-辅助细胞的变应化需要花数天之久。以此种方式第二次接触时T-辅助细胞会变更成为Th1-细胞；由是CD-154介导的抗原呈递细胞(此细胞表达CD40受体)之共刺激扮有重要角色，因为此种信号途径可触发白介素-12从巨噬细胞释放出。白介素-12可起始T-辅助细胞的分化与增生。Th1-细胞本身则经由某些生长因子(例如GM-CSF)而激发骨髓中的单核细胞形成，利用某些细胞因子(例如MIF)募集它们及经由释放IFNγ活化它们。如此产生的非常强烈的炎性反应可能大规模破坏身体内正常产生的组织(例如结核病)或移植的组织。再者，CD8-阳性胞毒性T-细胞参与移植物排斥(细胞溶解)，其中该CD8阳性胞毒性T-细胞能够辨识它们的目标(外来细胞表面)且据而像CD4阳性Th1-细胞一般仅经由事先的抗原呈递将它们“武装“起来。
类似于IV型反应的免疫调节障碍是形成例如类风湿性关节炎或多发性硬化(自身反应性Th1-细胞)以及糖尿病(自身反应性胞毒性T-细胞)的基础。除了细菌超抗原(例如TBC致病因子)和相应的遗传倾向(例如MHC-蛋白质Th1/Th2-失衡)之外，经导引针对会与自身抗原(在身体内产生，分子仿真)交叉反应的致病因子(例如链球菌)之某些抗原的T-细胞也可能对此等自身免疫疾病起作用。相异者，V型反应可能经由活化或阻断激素受体的自身抗体(例如于Basedow’s病情况中的促甲状腺激素(thyrotropin))或神经传递质受体的自体抗体(例如在重症肌无力(myasthenia gravis)情况中的乙酰胆碱)而引发。
与移植物排斥可相比但意义相反的为移植物抗宿主疾病(graftversus host disease)(GVHD)，其出现于约40％接受者的异体骨髓移植(在遗传上不相同的诸个体之间)的过程中。于持续长达三个月的急性期中，业经接受干细胞转输的供体之T-细胞会攻击宿主生物体。所造成的可能为严重之炎症反应会优先显示在皮肤、胃肠道和肝中。
为了治疗攸关假定的病因之急性炎病，经常是分别利用局部施用非类固醇性消炎药(NSAIDs，其抑制前列腺素之合成)及/或抗感染剂(毁灭细菌、真菌或寄生虫的生命)和抗病毒性治疗剂，偶然也会用到糖皮质激素(基因表达的通用抑制剂)。于严重或慢性复发性炎性疾病的情况中，系以系统方式给用糖皮质激素或免疫抑制剂(抑制T-细胞活化)或细胞生长抑制剂例如氨甲喋呤(methotrexate)。此亦分别适用于器官和骨髓的移植。虽然它们具有无可置辩的治疗效用，不过所提及的药物之系统性给用仍然可能引发严重的副作用，尤其是在永久给用之时。例如，服用氨甲喋呤达2或更多年的患者之中有多达25％会发展出严重的肝硬化。更最近的特别用于慢性复发性炎性疾病之活性剂会阻断TNFα的促炎效应(proinflammatory effect)分别针对细胞因子本身与其受体的抗体，受体的低分子量拮抗剂以及会捕捉细胞因子的经重组产生的可溶性受体蛋白质。不过在使用受体蛋白质治疗的过程中，有逐增数目的迹象显示有增加的感染疾病(例如结核病)发生率，且有约40％的患者似乎对于治疗根本没有反应(无反应者)。此外，对于经认可的人源化TNFα-抗体，在起始治疗2-4年之后，也有关于会达到败血症的感染发生之一致性警告通报。再者，此两种活性剂在紧急事件中都是禁忌使用者。此外，经认可者还有主要用于哮喘的治疗之白三烯类的低分子量受体拮抗剂，以及环加氧酶-2(cyclooxygenase-2)的抑制剂，一种新的，具有比传统NSAIDs显著减低的胃肠副作用之非类固醇性消炎药(NSAIDs)。再者，有一系列以其它---通常经人源化的---抗体或反义寡核苷酸为基础的方案分别用以对抗白细胞与内皮细胞的粘着分子、T-辅助细胞的细胞因子受体或IgE-抗体，它们正处于不同的临床试验阶段之中。为了戒除成为一组的糖皮质激素和抗感染剂，必须一致地将所提及的药剂特异地导向于对治疗有相关性之靶分子。
综上所述，本发明基于下述问题提供物质以预防及/或治疗心血管并发症，诸如在经皮血管成形术之后的再狭窄与静脉搭桥术之后的狭窄，移植物抗宿主疾病(GVHD)，在外科介入和器官移植范畴中的局部缺血/再注入相关性损伤，免疫学过敏性反应，特别是变应性鼻炎、药物和食物变应性、特别是荨麻疹和乳糜泻(口炎性腹泻)、接触性湿疹与免疫复合物病，特别是肺泡炎、关节炎、肾小球性肾炎和变应性血管炎，炎性软骨病和骨病，特别是关节病、痛风、骨炎和骨髓炎，多发性神经炎，以及急性或亚急性感染事件，且特别是感染后炎性疾病，特别是支气管炎、心内膜炎、肝炎、心肌炎、肾炎、心包炎、腹膜炎、和胰腺炎，包括感染性休克，其构成一更广泛(通晓地而非单特异性地)且由是潜在更有效的治疗方法。
该问题系由本专利权利要求书所界定的主题予以解决。
附图简要说明本发明要用下面诸附图予以更详细地解说。
图1显示出在经培养的人类内皮细胞中利用相应的顺式元件诱饵(cis-element-decoy)(SEQ ID NO33)中和转录因子STAT-1以抑制经细胞因子刺激的CD40(a、b、d和e)，E-选择蛋白和MCP-1之表达(a)以及经CD40-配体-诱导的白介素-12p40的表达。(a)在经与STAT-1(SEQ ID NO33)或NF-κB顺式元件诱饵(10μM)预温育4小时且随后与100U/毫升肿瘤坏死因子-α和1000U/毫升干扰素-γ温育9小时的内皮细胞内进行的E-选择蛋白、MCP-1和CD40 mRNA-表达之代表性RT-PCR分析(此外将光密度计分析(“强度”)表示为经刺激的对照样之％且相对于内标准样rp132进行参比)。(b)在经与STAT-1顺式元件诱饵(10μM；SEQ ID NO33)预温育4小时且随后与约670000个P3xTB.A7-细胞/毫升(此等小鼠骨髓细胞瘤会稳定地表达人类CD40-配体CD154)和1000U/毫升干扰素-γ温育12小时的内皮细胞内进行的白介素-12p40 mRNA-表达之代表性RT-PCR分析(此外将光密度计分析(“强度”)表示为经刺激的对照样之％且相对于内标准样rp132进行参比)。(c)在经与STAT-1顺式元件诱饵(SEQ ID NO33)或个自的对照寡核苷酸(STAT-1-25mut)预温育4小时(浓度10μM)且随后与100U/毫升肿瘤坏死因子-α和1000U/毫升干扰素-γ温育12小时的内皮细胞内进行的CD40 mRNA-表达之代表性RT-PCR分析(此外将光密度计分析(“强度”)表示为经刺激的对照样之％且相对于内标准样EF-1进行参比)。(d)对于STAT-1顺式元件诱饵(SEQ ID NO33)对在经培养的内皮细胞中所进行的经细胞因子刺激的CD40 mRNA-表达的影响所做的5个独立实验之统计学摘要(*p＜0.05相对于经刺激的对照细胞)。(e)对于STAT-1顺式元件诱饵(SEQ ID NO33)对在经培养的内皮细胞中所进行的经细胞因子刺激的CD40蛋白质-表达24小时之后的影响之代表性Western印迹分析与光密度分析(“强度”表示为经刺激的对照样之％且相对于内标准样β-肌动蛋白进行参比)。于其它实验中也得到可相比较之结果。
图2显示出在经培养的人类内皮细胞中经由将转录因子STAT-1的表达以反义寡核苷酸为基础减量调节抑制经细胞因子诱导的CD40基因表达。(a)CD40-蛋白质和STAT-1-蛋白质分别在静止条件下以及在将细胞与100U/毫升肿瘤坏死因子-α和1000U/毫升干扰素-γ温育14小时之后的表达。图中左格显示出使用不同批细胞进行的2-4个实验之统计学摘要，图中右格显示出代表性Western印迹分析与光密度分析(“强度”表示为未经刺激的对照样之％且相对于内标准样β-肌动蛋白进行参比)(*p＜0.05相对于未经刺激的对照细胞)。(b)在使用STAT-1-反义寡核苷酸(1μM；SEQ ID NO33)预处理24小时的经刺激内皮细胞中，CD40-蛋白质和STAT-1-蛋白质的表达之可相比较抑制。2个实验的结果摘要(图中左格；*p＜0.05相对于经刺激的对照细胞)与代表性Western印迹分析(图中右格)。
图3显示出利用相应的顺式元件诱饵(SEQ ID NO33)中和转录因子STAT-1对转录因子IRF-1在单核细胞系THP-1中的表达的抑制作用(a)以及对NO-合酶的可诱导同工型(inducible isoform)在经培养的人类平滑肌细胞中的表达之抑制作用。(a)代表性Western印迹分析与光密度分析(“强度”)表示为经刺激的对照样之％且相对于内标准样β-肌动蛋白。经培养的THP-1-细胞系与顺式元件诱饵(10μM)预温育4小时且随后与100U/毫升肿瘤坏死因子-α和1000U/毫升干扰素-γ温育3小时。(b)图中左格使用与STAT-1(SEQ ID NO33)，NF-κB或GATA-2顺式元件诱饵(10μM)预温育4小时且随后与1000U/毫升干扰素-γ，60U/毫升干扰素-1β，100U/毫升肿瘤坏死因子-α和1微克/毫升细菌脂多糖温育9小时的不同批经培养的人类平滑肌细胞所进行的3个实验之统计学摘要。NO-合酶的可诱导同工型mRNA表达之RT-PCR-分析(*p＜0.05相对于经刺激的细胞＝100％)。图中右格使用不同批细胞进行的3个实验之统计学摘要及经由分别与STAT-1(SEQ ID NO33)和NF-κB顺式元件诱饵预温育以对NO-合酶蛋白质的经细胞因子-刺激的表达(暴露20小时之后)产生抑制之代表性Western印迹分析(*p＜0.05相对于经刺激的细胞＝100％)。
图4显示出使用不同的顺式元件诱饵(SEQ ID NO17、25、29、31、33、35、37、39和突变过的对照寡核苷酸STAT-1-19mut和STAT-1-25mut)对于单核细胞系THP1的细胞核萃取物中所含内源性STAT-1进行的中和。代表性EMSA分析。经培养的THP-1细胞系与100U/毫升肿瘤坏死因子-α和1000U/毫升干扰素-γ温育3小时且随后即用来制备细胞核萃取物。将细胞核萃取物分别与[32P]-标记的双链SIE寡核苷酸(Santa Cruz Biotochnologie，Heidelberg，Germany)及各个顺式元件诱饵和对照-寡核苷酸在室温下共温育20分钟且随后施以电泳迁移率变动分析。
图5显示出所选出的STAT-1顺式元件诱饵(SEQ ID NO17、31、35、37)对于E-选择蛋白和MCP-1 mRNA在得自胸腺静脉的人类平滑肌细胞中的表达之影响。培养细胞(第2代)与各个顺式元件诱饵(10μM)预温育4小时且随后与100U/毫升肿瘤坏死因子-α和1000U/毫升干扰素-γ温育9小时。代表性RT-PCR-分析，于其它实验中得到可相比较的结果。
图6以基因图示意地显示出STAT-1反义表达载体pCI/Stat1 AS的构造。
图7显示出使用不同的顺式元件诱饵(SEQ ID NO17、19、27、33和39)对于经培养的内皮细胞中所含STAT-1进行中和的结果。代表性EMSA分析，及光密度分析(“强度“)。经培养的内皮细胞与诱饵寡核苷酸(10微莫耳/升)温育4小时且随后用100U/毫升肿瘤坏死因子-α和1000U/毫升干扰素-γ刺激30分钟。对于EMSA分析，使用经刺激细胞的细胞核萃取物和[32P]-标记的双链SIE寡核苷酸(SantaCruz Biotochnologie，Heidelberg，Germany)。
图8显示出STAT-1顺式元件诱饵(STAT-1cons，10nmol，SEQID NO19)而非突变的对照寡核苷酸(STAT-1mut，10nmol，SEQ IDNO61)对于在雄豚鼠体内经DNCB-诱导的接触性皮肤炎的影响之组织学分析(原始x400，总共17只受检豚鼠的典型结果)。
本发明人业经鉴定出参与人类内皮细胞和平滑肌细胞中以及单核细胞中细胞因子介导的促炎性基因产物(CD40、E-选择蛋白、NO-合酶的可诱导同工型、白介素-12[p40]、MCP-1)表达的增加中之转录因子。藉此可以证明，在经培养的内皮细胞中使用TNFα和CD154分别与IFNγ组合进行刺激的情况中，于转录因子核因子κB(NF-κB)与转录信号转导子与活化子-1(signal transducer and activator of transcription-1)(STAT-1)之间存在着增效作用。相同的情形也分别发生于经培养的平滑肌细胞和单核细胞。
IFNγ单独就能够增加CD40在人类内皮细胞内的表达，但E-选择蛋白和白介素-12单独不能。对于几乎没有且非组成地在内皮细胞内分别表达的此两种基因产物之表达，有必要分别用TNFα(E-选择蛋白)和CD154(白介素-12)同时刺激细胞。再者，另一转录因子干扰素调节因子-1(IRF-1)的从头(de novo)表达为CD40但非E-选择蛋白在内皮细胞和单核细胞内的表达之IFNγ-介导的增加所需者。于此等分析的范围之内，可以证明IRF-1-蛋白质表达在使用IFNγ且特别是使用TNFα单独刺激细胞的情况中比在两种细胞因子都存在的情况中显著地较为弱。根据此点，转录因子NF-κB和STAT-1在IRF-1基因的转录情况中也会增效地作用(Ohmore et al.，J.Biol.Chem.，(1977)，272，14899)。
STAT-1(分别为GenBank Accession Number NM007315和XM010893及http//transfac.gbf.de/cgi-bin/qt/getEntry.pl？t0149)属于一组包括至少6种成员的转录因子。STAT-1基因产物由大部分细胞组成地表达，不过通常是以非活性单体型蛋白质之形式(91kDa)存在于细胞质之内。此种p91-亚基的酪氨酸-磷酸化与后续的两个此等p91-亚基的缔合(二聚体化)(称为STAT-1α)可促成从此时起为活性的转录因子运载到细胞核之内。也可以进行与STAT-1β所含p84-亚基(相同基因的不同剪接产物)的异二聚体化。以组成方式存在的亚基之磷酸化是通过细胞质janus激酶(janus-kinases)依赖刺激而发生的。所以，两种janus激酶(Jak1和Jak2)都会受IFNα所刺激(更好募集到干扰素受体)；相反，就(病理)生理学而言，对于STAT-1，IFNγ的活化最重要的刺激只刺激Jak2。不同的生长因子和肽激素(例如血管紧张肽II)也会活化STAT-1；除了固有的(生长因子)受体-酪氨酸激酶之外，还有一种促有丝分裂原活化的蛋白激酶(MAP激酶)也对此具有作用。与STAT-1α相反，STAT-1β不具有反式激活活性(transactivating activity)，亦即基因表达刺激活性。
STAT-1参与在白细胞、内皮细胞和平滑肌细胞中的一系列潜在促炎性基因产物的表达之中，其中转录因子的活化经常以IFNγ-依赖性方式发生。一项例外为，白介素-6在血管紧张肽II刺激的血管平滑肌细胞内的STAT-1-依赖性表达(Schieffer et al.，Circ.Res.(2000)，87，1195)。
本发明的一方面为涉及转录因子STAT-1的抑制剂在药剂制造中之用途，该药剂用以预防及/或治疗心血管并发症，诸如在经皮血管成形术之后的再狭窄与静脉搭桥术之后的狭窄，移植物抗宿主疾病(GVHD)，在外科介入和器官移植范畴中的局部缺血/再注入相关性损伤，免疫学过敏性反应，特别是变应性鼻炎、药物和食物变应性、特别是荨麻疹和乳糜泻(口炎性腹泻)、接触性湿疹与免疫复合物病，特别是肺泡炎、关节炎、肾小球性肾炎和变应性血管炎，炎性软骨病和骨病，特别是关节病、痛风、骨炎和骨髓炎，多发性神经炎，以及急性或亚急性感染事件，且特别是感染后炎性疾病，特别者支气管炎、心内膜炎、肝炎、心肌炎、肾炎、心包炎、腹膜炎、和胰腺炎，包括感染性休克，及用以在炎性反应范围之中减弱促炎性基因产物的STAT-1-依赖性表达。
蛋白质，也包括STAT-1，可经使用非常不同的方式来抑制它们的活性。如此，可以使用，例如，抗-STAT-1-抗体以及天然或合成的物质来减低STAT-1与DNA的相互作用，亦即，减低转录活性。再者，也可以抑制会导致STAT-1的活化之信号途径(Jak1、Jak2、受体酪氨酸激酶、MAP激酶)。要将STAT-1的活性特异性地抑制所用的较佳方法为1.使用诱饵寡核苷酸中和经活化的转录因子，2.利用反义寡核苷酸抑制STAT-1蛋白质表达，3.利用反义表达载体抑制STAT-1蛋白质表达，与4.经由施用双链RNA-寡核苷酸抑制STAT-1蛋白质表达(dsRNA干扰性)。
本文中所使用的术语“诱饵(decoy)寡核苷酸”或“顺式元件诱饵”分别指称双链DNA分子和双链DNA寡核苷酸。两条DNA链展现出互补序列。于本发明中，顺式元件诱饵展现出根据或类似于在基因组内的天然STAT-1核心结合序列的序列且其被细胞内部的转录因子STAT-1所结合。如此，顺式元件诱饵作为STAT-1竞争抑制(更佳的中和作用)所用之分子。
STAT-1活性的特异性抑制所用的一种优选方法为使用含有用于结合STAT-1的结合位点之双链DNA寡核苷酸，也称为顺式元件诱饵或诱饵寡核苷酸。从外部对细胞供给一大数目，特别是远大于基因组内所含的数目，之转录因子结合位点会产生一种状况，其中有大部分的某一种转录因子会特异地结合到相应的顺式元件诱饵而不会结合到其内源性靶结合位点。抑制转录因子对它们的内源结合位点的结合的此等途径也称为抑制(squelching)。使用顺式元件诱饵对转录因子的抑制(squelching)(或较佳者中和)可以成功地用来抑制细胞的生长。此处使用含有转录因子E2F的特异性转录因子结合位点之DNA-片段(Morishita et al.，PNAS(1995)92，5855)。
防止转录因子STAT-1结合所用的核酸序列为例如在细胞内部STAT-1天然结合之序列。STAT-1可特异地结合到具有下述序列的基序(motive)5’-NNNSANTTCCGGGAANTGNSN-3’，其中的符号为N＝A、T、C或G，S＝C或G。与底下划线的碱基之严格共有性以及此等碱基之间的距离对于STAT-1的有效结合都是极为重要的。所以，根据本发明的顺式元件诱饵可展现出下述11-聚体(11-mer)共有核心结合序列5’-NTTNCBGDAAN-3’(SEQ ID NO1)，其中的符号为下述B＝C、G或T，D＝A、G或T，N＝A、T、C或G。再者，该顺式元件诱饵可以大于该11-聚体核心结合序列且可在5’-端及/或3’-端伸长。在该核心结合序列区内的相应突变会导致STAT-1对诱饵寡核苷酸之结合的妨害。
由于顺式元件诱饵为一种双链核酸，因此根据本发明的DNA寡核苷酸不仅包括有义-或正向-序列，而且也包括互补的反义或反向序列。根据本发明较佳的DNA寡核苷酸展现为结合STAT-1的11-聚体核心结合序列5′-ATTACCGGAAG-3′(SEQ ID NO3)，5′-ATTCCGGTAAG-3′(SEQ ID NO5)，5′-ATTCCTGGAAG-3′(SEQ ID NO7)，5′-ATTCCTGTAAG-3′(SEQ ID NO9)，5′-GTTCCAGGAAC-3′(SEQ ID NO11)，5′-GTTCCCGGAAG-3′(SEQ ID NO13)，5′-GTTCCGGGAAC-3′(SEQ ID NO15)，此处没有显示出各自的互补序列。不过顺式元件诱饵也可以展现出不同于前面序列且比11-聚体更长的序列。
特别优选的为下列诸序列(SEQ ID NO17)5′-TGTGAATTACCGGAAGTGAGA-3′，21-聚体，2个结合位点，(SEQ ID NO19)5′-TGTGAATTACCGGAAGTG-3′，18-聚体，2个结合位点，(SEQ ID NO21)5′-AGTCAGTTCCAGGAACTGACT-3′，21-聚体，2个结合位点，(SEQ ID NO23)5′-ATGTGAGTTCCCGGAAGTGAACT-3′，23-聚体，2个结合位点，(SEQ ID NO25)5′-ACAGTTCCGGGAACTGTC-3′，19-聚体，2个结合位点，(SEQ ID NO27)5′-GACAGTTCCGGGAACTGTC-3′，19-聚体，2个结合位点，(SEQ ID NO29)5′-GTGTATTCCGGTAAGTGA-3′，18-聚体，2个结合位点，
(SEQ ID NO31)5′-TTATGTGAATTCCTGGAAGTG-3′，21-聚体，2个结合位点，(SEQ ID NO33)5′-CATGTTATGCATATTCCTGTAAGTG-3′，25-聚体，2个结合位点，(SEQ ID NO35)5′-TGTGAATTCCTGTAAGTGAGA-3′，21-聚体，2个结合位点，(SEQ ID NO37)5′-TGCATATTCCTGTAAGTG-3′，18-聚体，2个结合位点，(SEQ ID NO39)5′-ATATTCCTGTAAGTG-3′，15-聚体，2个结合位点。
“2个结合位点”在此涉及有义链和反义链。此优选序列名单不具限制性。本领域技术人员显而易知的是，有众多序列可以用为STAT-1的抑制剂，只要它们展现出先前提及的11-聚体共有核心结合序列与对STAT-1的亲和性之条件即可。
核酸序列对STAT-1的结合亲和性可以经由使用电泳迁移率变动分析法(EMSA)予以评定(Sambrook et al.(1989)，Molecular Cloning.Cold Spring Harbor Laboratory Press；Krezesz et al.(1999)，FEBS Lett.453，191)。此种检验系统适合用于预期用在本发明方法中的核酸之品质控制，或用来测定结合位点的最优长度。其亦适合用来鉴定会被STAT-1结合之其它序列。对于EMSA，打算用来分离新的结合位点时，最适当者为经纯化或经重组表达的STAT-1形式，它们可以用于数个交替PCR-扩增与EMSA选择循环之中(Thiesen and Bach(1990)，Nucleic Acids Res.18，3203)。
已知在它们的启动子区或增强子区涵盖着STAT-1结合位点之基因或于它们的表达中已经有对STAT-1具重要性的功能迹象且因而为要以本发明方法予以特异性抑制(squelching)的可能目标的基因之情况中，除了CD40-基因、E-选择蛋白基因、可诱导性NO-合酶基因、白介素-12(p40)-基因、和MCP-1-基因之外，还有其它促炎性基因，例如IFNγ本身，细胞因子白介素-6，粘着分子ICAM-1，PECAM-1(血小板内皮细胞粘着分子-1(platelet endothelial cell adhesion molecule-1))，RANTES(活化时调节，由正常T-细胞表达，可能是分泌型；由T-淋巴细胞可溶性分泌)和VCAM-1，趋化因子白介素-8、IP-10(干扰素诱导性蛋白质-10)与Mig(γ-干扰素诱导出的单核因子(monokine))以及MHC-蛋白质I和II。于此，不论此等基因的表达是否由STAT-1直接地或间接地调节都没有关系(例如通过IRF-1的STAT-1-依赖性表达)。
若在人类内皮细胞内使用根据本发明针对STAT-1的诱饵寡核苷酸而不是各自对照-寡核苷酸，则细胞因子诱导的CD40表达(包括用IFNγ单刺激者及与IFNγ和TNFα组合刺激者两种情况)会被显著地抑制超过50％。假若细胞的刺激是用IFNγ与TNFα和CD154分别进行之时，此种情况也分别发生于E-选择蛋白及MCP-1和白介素-12(p40)的表达之中。根据此点，将STAT-1活性消除掉会带来一组促炎性基因产物在人类内皮细胞内的表达之高度明显抑制。如此即可在此种治疗措施的情况中于炎性疾病范围之内构思出使内皮-白细胞相互作用(E-选择蛋白，MCP-1)的明显减低，而且也可使抗原呈递细胞(例如巨噬细胞和B-淋巴细胞)与T-淋巴细胞(CD40、白介素-12)的相互作用明显减低。类似地，此种情形也发生于业经证明的在THP-1单核细胞内的细胞因子诱导的IRF-1-表达之减低(且藉此下游IRF-1-依赖性基因的表达也减低)以及包括可诱导性NO-合酶在内的所述基因产物在人类平滑肌细胞中的细胞因子诱导表达之减低等之中。
本发明方法可调制一基因或多基因的转录，其方式为使得该基因或该多基因，例如E-选择蛋白，不表达或较低地表达。在本发明范围之内，经减低或经抑制的表达意指相对于没有使用根据本发明的双链DNA寡核苷酸处理过的细胞比较之下转录速率较为减低。此种减低可以使用，例如northern印迹分析(Sambrook et al.，1989)或RT-PCR(Sambrook et al.，1989)予以测定。通常此等减低至少为2倍，特别者至少为5倍，更特别者至少10倍的减低。活化的丧失可能经由例如若STAT-1以转录活化剂形式作用于某一基因且如此活化剂的抑制(squelching)导致该靶基因的表达丧失而达到。
再者，，其中如果以基因的表达被一组成型活性或(在重复细胞刺激之后)一经活化的转录因子阻断，则本发明方法有助于一基因表达的抑制之解除。对此的一个例子为前内皮素原-1-基因在兔子颈静脉(V.jugularis)天然内皮细胞内的表达之抑制以针对转录因子CCAAT/增强子结合蛋白质之顺式元件诱饵予以解除(Lauth et al.，J.Mol.Med.(2000)，78，441)。这意味着基因表达的抑制可被解除以使其产物产生一保护性作用例如对抗炎性疾病。如此，例如NO-合酶的内皮同工型，其产物NO对于内皮细胞内的促炎性粘着分子和趋化因子的表达之抑制起着关键性作用，可用IFNγ予以减量调节(Rosenkranz-Weiss etal.(1994)，J.Clin.Invest.93，1875)。一对抗STAT-1的顺式元件诱饵可以经由抑制STAT-1对内皮NO-合酶基因所含启动子中的相应结合位点之结合而逆反此非合意的效应。
根据本发明的顺式元件诱饵，于一优选实施方案中，含有一或多个，较优先者1、2、3、4或5个，特别较佳者1或2个被STAT-1所特异地结合之结合位点。该等核酸可以用合成方式，或酶方法或在细胞内产生。这些方法皆为本领域技术人员所熟悉的。
该双链DNA-寡核苷酸的长度至少与使用过的可特异地结合STAT-1之序列一样长。通常，所述使用过的双链DNA寡核苷酸具有在约11-65bp之间，较佳者在约13-28bp之间且特别较佳者在16-23bp之间的长度。
寡核苷酸通常会被核酸内切酶和核酸外切酶所快速降解，尤其是会被DNase和RNase在细胞内所降解。所以，DNA寡核苷酸可经修饰以稳定化它们而对抗降解使得在细胞内可以长时期地维持住一高浓度的寡核苷酸。通常此种稳定化可以经由导入一或多种经修饰的核苷酸间键而得到。
一经成功地稳定化之DNA-寡核苷酸不一定在每一核苷酸间键都含有一修饰。较佳者是将在顺式元件诱饵的两寡核苷酸之各自末端处的核苷酸间键予以修饰。其中可以将最后六、五、四、三、二个或最后一个或在最后六个核苷酸间键中的一或多个核苷酸间键予以修饰。另外，在核酸中可以插置经不同修饰的核苷酸间键且由此产生的双链DNA寡核苷酸可以经由使用例常性EMSA-检验系统检定对STAT-1的序列特异性结合。此检验系统可以用来测定顺式元件诱饵的结合常数及因而测定其亲和性是否因该修饰而改变。可以选择仍然显示出充足的结合作用之经修饰顺式元件诱饵，其中充分的结合意指为未修饰核酸的结合之至少约50％或至少约75％，且特别较佳者为约100％。
可以检定仍然显示出充分的结合作用之具有经修饰的核苷酸间键之顺式元件诱饵在细胞内是否比未修饰顺式元件诱饵更为稳定。对使用根据本发明的顺式元件诱饵”转染过”的细胞检定在不同的时间点仍然可利用的顺式元件诱饵之量。其中，优选使用经使用荧光性染料(例如得克萨斯红(Texas-red))标记的顺式元件诱饵或经放射性(例如32P)标记的顺式元件诱饵，随后分别施以数字荧光显微术和放射自显影术或闪烁造影术(scintigraphy)。一经成功修饰的顺式元件诱饵在细胞内具有比未经修饰的顺式元件诱饵更长的半寿期，优选至少约48小时，更佳者至少约4天，且最佳者至少约7天。
适当的修饰核苷酸间键综述于Uhlmann and Peyman((1990)Chem.Rev.90，544)之中。可以用于本发明方法之中的在核酸内的修饰的核苷酸间-磷酸-残基及/或非磷-桥联包括例如甲基膦酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、磷酸酯，而非磷核苷酸间类似物包括例如硅氧烷桥联、碳酸酯桥联、羧甲基酯桥联、乙酰胺酸酯-桥联、及/或硫醚桥联。于使用经硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键的情况中，它们优选不要位于胞嘧啶碱基与鸟嘌呤碱基之间，因为若如此之时，它们可能导致顺式元件诱饵的靶细胞活化。
本发明另一具体实例为经由在核酸中插置结构特定性所得核酸之稳定化，此举可以增长该核酸的半寿期。含有发夹型和钟型DNA的此等结构经揭示于US 5,683,985之中。同时，可以将经修饰的核苷酸间-磷酸-残基及/或非磷-桥联与所提的结构一起导入。接着可以对如是所得核酸在上文所述检验系统中检定结合作用与稳定性。
核心结合序列不仅可以存在于顺式元件诱饵之中而且可以存在于载体之中。一优选实施方案之中，该载体为一质粒载体且特别是一种能够自体复制藉以增加所导入的双链核酸所具稳定性之质粒载体。
本发明顺式元件诱饵可以迅速地被摄取到细胞之内。足够的摄取之特征在于一或多种会受STAT-1所控制的基因的表达之调制现象。本发明顺式元件诱饵优选系在与细胞接触约4小时之后，更优选在约2小时之后，在约1小时之后，约30分钟之后且最佳者在约10分钟之后调制一基因或多基因的转录。在此等实验中使用的典型混合物含有10微摩尔/升的该顺式元件诱饵。
再者，本发明也有关一种在参与炎性事件的细胞，特别是在内皮细胞、表皮细胞、白细胞、平滑肌细胞、角质细胞或纤维母细胞之内调制至少一基因的转录之方法，包括下述步骤将所提及的细胞与一混合物接触，该混合物含有一或多种能够以序列特异性方式结合到转录因子STAT-1的一或多种根据本发明之双链核酸。一较佳方法为，例如，对含有T-淋巴细胞的骨髓捐赠体在将其导到接受者身体内之前给予体外处理(ex vivo treatment)。
另外，根据本发明的顺式元件诱饵也可以置于一组合物中给患者施用或用于根据本发明的方法之中。含有根据本发明的顺式元件诱饵之组合物(于后文中称为混合物)即可与靶细胞(例如，内皮细胞、表皮细胞、白细胞、平滑肌细胞、角质细胞或纤维母细胞)接触。此接触的目的为将结合STAT-1的顺式元件诱饵转移到该靶细胞(亦即，以STAT-1依赖性方式表达促炎性基因产物之细胞)之内。所以，已知可以改善膜的穿透性之核酸修饰及/或添加剂或辅助物质都可以用于本发明的范围之内(Uhlmann and Peyman(1990)，Chem.Rev.90，544)。
于一优选实施方案中，本发明的混合物只含有核酸和缓冲液。适当的顺式元件诱饵之浓度在至少0.1至100μM的范围之内，优选10μM，于其中加入一或多种适当的缓冲剂。此等缓冲液的一例子为林格氏溶液(Ringer’s solution)，其中含有145毫摩尔/升的Na+、5毫摩尔/升的K+、156毫摩尔/升的Cl-、2毫摩尔/升的Ca2+、1毫摩尔/升的Mg2+、10毫摩尔/升的HEPES、10毫摩尔/升的D-葡萄糖、pH7.4。
于本发明另一实施方案中，该混合物另外含有至少一种添加剂及/或辅助物质。诸如脂质、阳离子脂质、聚合物、微脂粒、纳米粒子、核酸-适合体(nucleic acid-aptameres)、肽类和蛋白质等经DNA-结合者或合成的肽-DNA分子等之添加剂及/或辅助物质都为预期使用者以期(i)例如，增加核酸导入到细胞之内，以期(ii)仅将混合物导引到一亚组细胞，以期(iii)在细胞内抑制核酸的降解，以期(iv)在使用之前帮助核酸混合物的贮存。肽类和蛋白质或合成的肽-DNA分子之例子有例如抗体、抗体片段、配体、粘着分子等，它们全部都可以经修饰或可以不经修饰。
可以将顺式元件诱饵稳定化在细胞内部的添加剂为例如核酸浓缩物质诸如阳离子性聚合物、聚-L-赖氨酸或聚乙烯亚胺。
本发明方法中所使用的混合物优选经由注射、插管、栓药、气雾剂(分别经鼻和经口喷入，吸入)、套管针、投射(projectile)、pluronic凝胶、可将药剂持续释放的聚合物、或有助于局部进入的任何其它装置等进行局部施用。将本发明方法中所使用的混合物进行体外施用也可以促成局部进入。
不过，STAT-1活性的抑制可以不仅是在前述方法中于蛋白质层次上予以抑制，而且可以在转录因子蛋白质的转译之前或之中就予以完成。所以本发明的另一方面为提供一种作为治疗剂的STAT-1蛋白质表达之抑制剂。此抑制剂较优先者为单链核酸分子，所谓的反义寡核苷酸。反义寡核苷酸可以在三个不同的层次上抑制靶基因的合成，亦即，在转录之过程中(防止hnRNA-合成)，于hnRNA的加工(减接)导致mRNA之过程中及在mRNA在核糖体上转译成蛋白质之过程中。利用反义寡核苷酸来抑制基因表达所用的方法是一种现有技术且为本领域技术人员所熟知。具有任何序列的单链核酸分子都可用为该反义寡核苷酸，只要该反义寡核苷酸能够抑制STAT-1蛋白质表达即可。较优先者，在根据本发明方法中所使用的针对STAT-1之反义寡核苷酸具有序列5′-TACCACTGAGACATCCTGCCAC-3′(SEQ IDNO41)且桥联着起始密码子。其它较佳的反义寡核苷酸之序列为5′-AACATCATTGGCACGCAG-3′(SEQ ID NO42)和5′-GTGAACCTGCTCCAG-3′(SEQ ID NO43)。反义寡核苷酸可为单链DNA分子，RNA分子或为单链DNA-RNA杂种分子。该反义寡核苷酸更可展现一或多个经修饰的核苷酸间键，例如前面对顺式元件诱饵所述及者。于经由硫代磷酸修饰核苷酸间键予以稳定化的反义寡核苷酸之情况中，特别要考虑到在胞嘧啶碱基与鸟嘌呤碱基之间不要插置硫代磷酸修饰的核苷酸间键，因为如此可能导致特别是免疫活性细胞(例如内皮细胞)之似IFNγ活化且因而会至少部分地挫折合意的治疗效果。
根据本发明的反义寡核苷酸也可以置于一组合物中给患者施用。该组合物可包括稳定化添加剂或辅助物质以帮助，例如，将该反义寡核苷酸导入到细胞内，将组合物仅定向到一亚组的细胞，防止例如该反义寡核苷酸在细胞内部的降解，或帮助例如在使用之前该反义寡核苷酸的贮存。
该反义寡核苷酸不仅可以用单链核酸分子之形式给用而且可以用包含在一载体内的形式给用。于一较佳实施方案中，该载体为一质粒载体且特别是一种能够自体复制藉以增加所导入的单链核酸所具稳定性之质粒载体。
本发明的另一方面因而为一种反义寡核苷酸载体，于转染之后其本身要在靶细胞内部表达且会特异地抑制STAT-1的表达。于此，可以考虑根据现有技艺可得到的任何真核生物表达载体。优选为考虑Promega公司的pCI-质粒(目录编号No.E1731，GenBank AccessionNumber U47119)，其中系将包括STAT-1基因节段的2350 bp(-121至+2229，GenBank Accession Number XM010893)以相反方向(3’→5’)克隆。此STAT-1基因节段侧接着两个EcoRI限制位点且含有一个XhoI限制位点。其表达受CMV-启动子的控制。整个质粒(称为pCI/Stat1 AS)包括6365bp。
再者，如在Fire(1999)，Trends Genet.15，358，和Elbashir et al.(2001)，Nature 411，494中所述，dsRNA干扰为一种较佳的在mRNA转译成转录因子蛋白质的层次上抑制STAT-1活性之方法。于此种方法的情况中，在细胞内导入正好包括21个核苷酸---其序列相同于编码标的蛋白质(STAT-1)的mRNA之节段---的RNA双链。随后形成一种其细节至今尚未知晓得蛋白质复合物，其可特异地切断靶mRNA，藉此阻止其转译。其中不能使用更长的RNA双链，因为它们会在靶细胞内诱发反应，该反应可比拟细胞对(病毒)感染的反应且因而会挫折合意的治疗效果。通常该dsRNA干扰性寡核苷酸会展现出一或多个核苷酸间键，例如前面对顺式元件诱饵所述及者。
将含有根据本发明的dsRNA干扰性寡核苷酸之混合物经与靶细胞(例如，内皮细胞、表皮细胞、白细胞、平滑肌细胞、角质细胞或纤维母细胞)接触。于此，已知可以改善膜的穿透之添加剂或辅助物质都可以使用(Uhlmann and Peyman(1990)，Chem.Rev.90，544)。
下面的附图和实施例仅用来示范说明之用而不是要用来于任何方面限制本发明的范围。
1.细胞培养经由用1.6U/毫升的分散酶/HEPES-修改的蒂罗德溶液(tyrode-solution)在37℃下处理30分钟而从脐带静脉分离出人类内皮细胞且置于经明胶涂覆(2毫克/毫升明胶/0.1N HCl，在室温下30分钟)的6孔组织培养皿上于1.5毫升M199培养基(Gibco Life Technologies，Karlsruhe，Germany)中培养，其中含有20％胎牛血清，50U/毫升青霉素，50微克/毫升链霉素，10U/毫升制霉菌素(nystatin)，5mM HEPES和5mM TES，1微克/毫升肝素和40微克/毫升内皮生长因子。它们以它们的典型铺路石形态，对von Willebrandt-因子(vWF)的阳性免疫染色及用荧光计检测(FACS)PECAM-1(CD31)以及对平滑肌α-肌动蛋白(α-actin)的阴性免疫染色予以鉴定(Krzesz et al.(1999)，FEBS Lett.453，191)。
人类单核细胞系THP-1(ATCC TIB 202)在RPMI 1640培养基(Life Technologies)培养，该培养基含有10％胎牛血清，50U/毫升青霉素，50微克/毫升链霉素，和10U/毫升制霉菌素。人类平滑肌细胞系从切下的胸腺静脉利用移植体技术(the explant-technology)分离出(Krzesz et al.(1999)，FEBS Lett.453，191)且置于经明胶涂覆(参阅上文)的6孔组织培养皿上于1.5毫升Dulbecco’s修改的Eagle培养基中培养，其中含有15％胎牛血清，50U/毫升青霉素，50微克/毫升链霉素，和10U/毫升制霉菌素。它们是以对平滑肌α-肌动蛋白的阳性免疫染色予以鉴定。
2.RT-PCR-分析内皮总RNA使用Qiagen RNeasy kit(Qiagen，Hilden，Germany)分离出且着进行DNA合成，其中根据制造商的实验程序使用最大量3微克RNA和200U SuperscriptTMII反转录酶(reverse transcriptase)(LifeTechnologies)，总体积为20微升。为了调整cDNA-装载率，于50微升总体积中使用5微升(约75纳克cDNA)所得cDNA-溶液和延伸因子-1(EF-1)-PCR的引物对(Gibco)及1U Taq DNA聚合酶(Gibco)。EF-1用作PCR的内标准。在含有0.1％溴乙锭的1.5％琼脂糖凝胶上分离PCR-产物并使用一CCD-摄影机系统与Scanalytics的One-Dscan凝胶分析软件(Billerica，MA，USA)经由光密度法测定分离带的强度以调整在下列PCR-分析中的cDNA体积。
所有PCR反应都是在Hybaid OmnE Thermocycler(AWG；Heidelberg，Germany)中针对每一引物对分开地实施。针对得自脐带静脉的人类内皮细胞之cDNA所用的PCR条件为下面所述者CD40(产物大小381bp，25循环，退火温度60℃ ，(正向引物)5’□CAGAGTTCACTGAAACGGAATGCC-3’(SEQ ID NO44)，(反向引物)5’-TGCCTGCCTGTTGCACAACC-3’(SEQ ID NO45))；E-选择蛋白(产物大小304bp，33循环，退火温度60℃，(正向引物)5’-AGCAAGGCATGATGTTAACC-3’(SEQ ID NO46)，(反向引物)5’-GCATTCCTCTCTTCCAGAGC-3’(SEQ ID NO47))；EF-1(产物大小220bp，22循环，退火温度55℃ ，(正向引物)5’-TCTTAATCAGTGGTGGAAG-3’(SEQ ID NO48)，(反向引物)5’-TTTGGTCAAGTTGTTTCC-3’(SEQ ID NO49))；IL-12p40(产物大小281bp，30循环，退火温度62℃ ，(正向引物)5’-GTACTCCACATTCCTACTTCTC-3’(SEQ ID NO50)，(反向引物)5’-TTTGGGTCTATTCCGTTGTGTC-3’(SEQ ID NO51))；rp132(产物大小368bp，20循环，退火温度60℃ ，(正向引物)5’-GTTCATCCGGCACCAGTCAG-3’(SEQ ID NO52)，(反向引物)5’-ACGTGCACATGAGCTGCCTAC-3’(SEQ ID NO53)；MCP-1(产物大小330bp，22循环，退火温度63℃ ，(正向引物)5’-GCGGATCCCCTCCAGCATGAAAGTCTCT-3’(SEQ ID NO54)，(反向引物)5’-ACGAATTCTTCTTGGGTTGTGGAGTGAG-3’(SEQID NO55)。
3.电泳迁移率变动分析(EMSA)按照Krzesz et al.(1999)，FEBS Lett.453，191中所述实施对细胞核萃取物和[32P]-标记的双链共有寡核苷酸(Santa Cruz Biotechnologie，Heidelberg，Germany)的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，放射自显影术和超变动分析(supershift-analysis)。于此是使用具有下示单链序列(核心结合序列为底下划线者)的双链DNA-寡核苷酸SIE，5’-GTGCATTTCCCGTAAATCTTGTC-3‘(SEQ ID NO56)。为分析使用各种顺式元件诱饵对经细胞因子刺激的THP-1-细胞(前单核细胞人类细胞系(pre-monocytous human cell line))的细胞核萃取物中所含内源性STAT-1之挤出作用，在RMSA-结合途径中选用30∶1(STAT-1顺式元件诱饵∶[32P]-标记的SIE的聚核苷酸(11fmol))之比例。
4.诱饵寡核苷酸技术按照Krzesz et al.(1999)，FEBS Lett.453，191中所述使用互补的单链硫代磷酸键连寡核苷酸(Eurogentec，Kln，Germany)产生双链诱饵寡核苷酸。将培养的人类内皮细胞与浓度为10μM的个别诱饵寡核苷酸预温育4小时。此为事先根据EMSA和RT-PCR分析予以最优化的条件。于此之后，通常将含有诱饵寡核苷酸的培养基用新鲜培养基予以更换。该寡核苷酸的单链序列为下面所示者(底下划线的字母表经硫代磷酸键连的碱基，它们都是按5’→3’之方向显示)GATA-2，CACTTGATAACAGAAAGTGATAACTCT(SEQ ID NO57)；NF-κB，AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC(SEQ ID NO58)；STAT-1，CATGTTATGCATATTCCTGTAAGTG(SEQ ID NO33)；STAT-1-19mut，GACAGTGCAGTGAACTGTC(SEQ ID NO59)；STAT-1-25mut，CATGTTATGCAGACCGTAGTAAGTG(SEQ ID NO60)。
5.反义寡核苷酸(ODN)技术对于反义途径，于100毫升OPTI-MEMI培养基中定加15微升lipofectin(Gibco Life Technologie，Karlsruhe，Germany)且在室温(RT)下温育45分钟(溶液A)。随后在100微升OPTI-MEMI培养基中添加反义ODN(Eurogentec，Kln，Germany)到0.5μM之最后浓度(溶液B)。在将溶液A和溶液B合并之后，于室温下再度温育15分钟。于实验起始之时，于装有lipofectin-反义ODN-复合物的Eppendorf-管内添加0.8毫升内皮细胞培养的常规细胞培养基(不含肝素和内皮生长因子)并将内皮细胞培养的细胞培养基更换为反义lipofectin-培养基。于4小时之后取出反义lipofectin-培养基并用新鲜细胞培养基(含有肝素和内皮生长因子)予以更换。STAT-1-反义ODN的序列为5′-T*A*CCA*C*T*G*A*G*A*C*A*T*CC*T*GCC*A*C-3‘(*硫代磷酸修饰的碱基；SEQ ID NO41)。
6.Western印迹分析将得自脐带静脉的人类内皮细胞与得自胸腺静脉的平滑肌细胞经由接续的在液态氮中之冷冻与在37℃(Thermoblock，Kleinfelden，Germany)下5分钟的解冻予以碎裂。按照Hecker et al.(1994)，Biochem J.299，247中所述制备蛋白质萃取物。采用标准实验程序利用10％聚丙烯酰胺凝胶电泳在变性条件下于SDS存在中分离出20-30微克蛋白质且转移到BioTraceTM聚偏二氟乙烯转移膜之上(polyvinylidene fluoride transfer membrane)(Pall Corporation，Roβdorf，Germany)。使用下面的初级抗体进行免疫学蛋白质检测CD40(多克隆，1∶2000稀释率，Research Diagnostics Inc.，Flanders NJ，USA)，STAT-1蛋白质(单克隆，1∶5000稀释率，BD TransductionLaboratories，Heidelberg，Germany)，IRF-1蛋白质(多克隆，1∶2000稀释率，Santa Cruz Biotechnology，Heidelberg，Germany)，iNOS蛋白质(多克隆，1∶3000稀释率，BD Transduction Laboratories，Heidelberg，Germany)。于分别添加过氧化物酶缀合抗兔IgG与---在使用单克隆初级抗体的情况中---添加各自的抗小鼠IgG(1∶3000，Sigma，Deisenhofen，Germany)之后利用化学发光法(SuperSignal Chemiluminescent Substrate；Pierce Chemical，Rockford，IL，USA)与后续的放射自显影术(HyperfilmTMMP，Amersham Pharmacia，Biotech，Buckinghamshire，England)检测蛋白质分离带。于“洗涤”转移膜(5分钟，0.2NNaOH，接着用H2O洗涤3×10分钟)之后经由用单克隆初级抗体和过氧化物酶缀合的抗小鼠IgG(两者皆得自Sigma-Aldrich，1∶3000稀释率)检测β-肌动蛋白的相等蛋白质分离带而显示出同等蛋白质量的装载率和转移。
7.统计学分析除非另有说明，附图和文中的所有数据都为n个实验的平均值±SEM。统计评估采用Student’s t-检验对未配对的数据实施的，以p＜0.05视为具有统计意义。
8.经由动物实验检测诱饵寡核苷酸的影响8.1小鼠为了检测本申请所开发出的以诱饵寡核苷酸为基础的治疗法所具效率，对每组8-10只动物的小鼠针对抗原诱发的关节炎进行验证概念研究(有关所用模型可参阅Henzgen et al.，Exp.Toxicol.Pathol.(1996)，48，255)。将单份0.25纳摩尔的STAT-1-诱饵寡核苷酸(SEQ ID NO33)直接施加到关节(关节内注射)可以在3-14天期间内高度明显地减低关节的抗原诱发的肿胀(减低35％)，炎性反应的强度(减低70％)，关节破坏(减低80％)，总关节炎计分(减低70％)以及血清中的促炎性细胞因子浓度(例如白介素-6，减低80％)。与此相异者，各对照寡核苷酸都没有治疗效用。
再者，于此研究中值得注意者，在关节炎诱发14天之后，于皮肤中引发的接触性皮炎(IV型反应)---其是将抗原再度经皮注射到动物体内一次---也在经诱饵寡核苷酸处理的小鼠体内获得高度明显的抑制(减低35％)。
8.2豚鼠于7天中将豚鼠(Hartley，雄鼠，体重350克)变应化两次(于第一天在一个耳朵中，于第二天在另一个耳朵中，每次都使用50微升的10％DNCB在50％丙酮/50％橄榄油中的溶液；于第七天，使用15微升的2％DNCB在95％丙酮/5％橄榄油中的溶液在颈部皮肤中加强)之后，经由在第13天于动物刮过毛的背部一或多个大小约1平方厘米的部位上分别再施加2，4-二硝基氯苯(DNCB；10微升0.5％DNCB在95％丙酮/5％橄榄油中的溶液)并于24小时之后以肉眼和组织学方式评估之。以此种方式诱发的接触性皮炎的组织学特征(Giemsa染色)为在表皮部位中明显形成浮肿和海绵层水肿(spongiosis)，凋亡细胞的增加以及白细胞大量渗入(图8)。于最后DNCB-暴露1小时之前皮内施用STAT-1诱饵寡核苷酸(SEQ ID NO19)而非经突变的对照寡核苷酸(5’-TGTGGACCGTAGGAAGTG-3’，SEQ ID NO61)可导致所提及的组织学参数之明显减低，亦即总的说来达到炎性反应的明显衰减。
序列表<110>亚文塔克有限公司<120>STAT-1之抑制<130>TKFIN0018<150>DE 101 48 886.6<151>2001-10-04<160>61<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>11<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>顺式元件诱饵<400>61tgtggaccgt aggaagtg18
权利要求
1.一种用以抑制STAT-1活性的抑制剂在制备药物中之用途，其中所述药物用以预防及/或治疗心血管并发症，诸如在经皮血管成形术之后的再狭窄与静脉搭桥术之后的狭窄，移植物抗宿主疾病(GVHD)，在外科介入和器官移植范畴中局部缺血/再注入相关性损伤，免疫学过敏性反应，特别是变应性鼻炎、药物和食物变应性、特别是荨麻疹和乳糜泻(口炎性腹泻)、接触性湿疹与免疫复合物病，特别是肺泡炎、关节炎、血管球性肾炎和变应性血管炎，炎性软骨病和骨病，特别是关节病、痛风、骨炎、骨髓炎，多发性神经炎，以及急性或亚急性感染事件，且特别是感染后炎性疾病，特别是支气管炎、心内膜炎、肝炎、心肌炎、肾炎、心包炎、腹膜炎、和胰腺炎，包括感染性休克。
2.根据权利要求1之用途，其中该抑制剂为双链DNA寡核苷酸、单链反义寡核苷酸、反义表达载体、或双链RNA干扰性寡核苷酸。
全文摘要
本发明涉及转录因子STAT－1的抑制剂，以及它们在制备药物中之用途，所述药物用以预防及/或治疗心血管并发症，诸如在经皮血管成形术之后的再狭窄与静脉搭桥术之后的狭窄，移植物抗宿主疾病(GVHD)，在外科介入和器官移植范畴中局部缺血/再注入相关性损伤，免疫学过敏性反应，特别是变应性鼻炎、药物和食物变应性、特别是荨麻疹和乳糜泻(口炎性腹泻)、接触性湿疹与免疫复合物病，特别是肺泡炎、关节炎、肾小球性肾炎和变应性血管炎，炎性软骨病和骨病，特别是关节病、痛风、骨炎和骨髓炎，多发性神经炎，以及急性或亚急性感染事件，且特别是感染后炎性疾病，特别者支气管炎、心内膜炎、肝炎、心肌炎、肾炎、心包炎、腹膜炎、和胰腺炎，包括感染性休克。
文档编号A61P9/10GK1630535SQ02819704
公开日2005年6月22日 申请日期2002年10月2日 优先权日2001年10月4日
发明者马库斯·海克, 安德烈·H.·华格纳 申请人:亚文塔克有限公司