专利名称：包含腺苷a1/a2激动剂和钠－氢离子交换抑制剂的药物组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种药物组合物，其包含具有腺苷A1/A2激动活性的化合物和钠-氢离子交换抑制化合物，该药物组合物在有此需要的患者中显示了出奇有效的心脏保护作用。本发明还涉及一种为患者提供心脏保护的方法，该方法包括施用药学有效量的具有腺苷A1/A2激动活性的化合物和钠-氢离子交换抑制化合物。
发明简述本发明涉及一种药物组合物，其包含具有腺苷A1/A2激动活性的化合物或其药学可接受之盐，以及钠-氢离子交换抑制化合物或其药学可接受之盐。本发明还涉及一种为有需要的患者提供心脏保护的方法，该方法包括施用药学有效量的具有腺苷A1/A2激动活性的化合物和钠-氢离子交换抑制化合物。
发明详述除非另有说明，上文所使用的和贯穿本发明说明书的下列术语应被理解为具有以下含义“患者”包括人和其它哺乳动物。
“有效量”是可有效产生期望治疗效果的本发明组合物的量。
“心脏保护”是指例如在缺血发作之前、期间或之后、于再灌注期间或于心脏手术之前、期间或之后防止或减轻对心肌的损伤。
“腺苷A1/A2激动剂”或“具有腺苷A1/A2激动活性的化合物”指A1和A2亚型腺苷受体的激动剂，例如AMP 579。
“钠-氢离子交换抑制化合物”或“NHE抑制剂”是钠-氢离子交换体系，即调节pH的细胞离子转运体系的抑制剂。钠-氢离子交换抑制化合物的例子包括cariporide(Aventis)、eniporide(Merck KGAA)、zoniporide(Pfizer)、BMS-284640(Bristol-Myers Squibb)、BIIB-513(Boehringer Ingelheim)、BIIB-722CI(Boehringer Ingelheim)、EMD-85131(Merck KGAA)、KB-R9032(Kanebo)、MS-31-038(Mitsui)、SL-59.1227(Sanofi)、SM20550(Sumitomo)、SMP-300(Fukushima MedicalCollege)、T-559(Takeda)和TY-12533(Toa Eiyo)。
“AMP 579”是[1S-[1α，2β，3β，4α(S*)]-4-[7-[[3-氯-2-噻吩基]甲基]丙基]氨基]-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-3-基]-N-乙基-2，3-二羟基环戊烷甲酰胺，或 “Cariporide”是4-异丙基-3-甲磺酰基苯甲酰胍甲磺酸盐，或 AMP 579，一种新型腺苷A1/A2受体激动剂，当于再灌注时施用时已显示具有心脏保护机能。用钠-氢离子交换抑制剂cariporide进行预处理或进行缺血性预处理(PC)也已证实具可减小梗死的大小。在本研究中，我们对再灌注时施用AMP 579是否可加强cariporide或PC的保护作用进行了调查。使开胸兔心局部缺血45分钟后再灌注3小时。对照组的梗死大小为55.8±3.9％。5分钟缺血+10分钟再灌注的缺血预处理使梗死大小明显降至26.0±6.7％。于再灌注发生前夕，团注AMP 579(30ug/kg)，随后输注70分钟(3ug/kg/min)。单独的AMP 579也使梗死大小明显降低(32.1±1.8％)。与单独的缺血预处理或AMP 579相比，AMP 579和缺血预处理联合使用使梗死大小减小得更加显著(5.5±2.7％)。在第二系列研究中，使所述兔心局部缺血60分钟后再灌注3小时。对照组的梗死大小为66.0±4.9％。于缺血开始前5分钟团注cariporide(0.5mg/kg)，梗死大小明显降至41.5±7.7％。当Cariporide与AMP579联合使用时，梗死被进一步减小至明显更小的尺寸(14.2±4.5％)。尽管单独使用AMP 579仅显示出心脏保护趋势(45.3±5.4％)，但这并不足以暗示AMP 579对缺血损伤的保护作用有限。然而，于再灌注发生前夕施用AMP 579外加团注cariporide，梗死大小的确明显降低(31.3±7.0％)。这些结果表明于再灌注时施用AMP579的作用与cariporide或缺血预处理所产生的保护作用具有协同效应。
当于再灌注前夕施用时，该新型腺苷A1/A2受体激动剂AMP 579可保护多种动物的心脏免受局部缺血/再灌注损伤。(Smits GJ、McVey M、CoxBF、Perrone MH、Clark KLCardioprotective effects of the novel adenosineA1/A2 receptor agonist AMP 579 in a porcine model of myocardialinfarction[一种新型腺苷A1/A2受体激动剂AMP 579在猪的心肌梗死模型中之心脏保护效应].J Pharmacol Exp Ther 1998；286611-618(下文中称作“Smits”)；McVey MJ、Smits GJ、Cox BF、Kitzen JM、Clark KL、PerroneMHCardiovascular pharmacology of the adenosine A1/A2-receptoragonist AMP 579coronary hemodynamic and cardioprotective effects inthe canine myocardium[腺苷A1/A2受体激动剂AMP 579的心血管药理学犬的心肌层冠状动脉血液动力学和心肌保护效应.J Cardiovasc Phamacol1999；33703-710(下文中称作“McVey”)；Budde JM、Velez DA、Zhao Z-Q、Clark KL、Morris CD、Muraki S、Guyton RA、Vinten-JohansenJComparative study of AMP 579 and adenosine in inhibition ofneutrophil-mediated vascular and myocardial injury during 24h ofreperfusion[对比研究AMP 579和腺苷在24小时的再灌注期间对由嗜中性粒细胞调节的血管和心肌损伤之抑制作用]。Cardiovasc Res2000；47294-305(下文中称作“Budd”)；以及Xu Z、Yang X-M、Cohen MV、Neumann T、Heusch G、Downey JMLimitation of infarct size in rabbithearts by the novel adenosine receptor agonist AMP 579 administered atreperfusion[一种新型腺苷受体激动剂AMP 579于再灌注时施用使兔心梗死减小]。J Mol Cell Cardiol 2000；322339-2347(下文中称作“Xu”)。AMP579于再灌注时的保护作用可归功于对心肌挛缩的缓解(Xu Z、DowneyJM、Cohen MVAMP 579 reduces contracture and limits infarction inrabbit heart by activating adenosine A2receptors[AMP 579通过激动腺苷A2受体而缓解兔心挛缩并减小梗死范围].J Cardiovasc Pharmacol 2001、在印刷之中(下文中称作“Xu II”))和很可能是降低再灌注时自由基的生成(XuZ、Cohen MV、Downey JM、Vanden Hoek TL、Yao ZAttenuation ofoxidant stress during reoxygenation by AMP 579 in cardiomyocytes[AMP579减小心肌细胞于再氧合期间的氧化剂应力].Am J Physiol 2001；已交稿(下文中称作Xu III))。鉴于AMP 579可于再灌注前夕施用以保护心脏，我们可以合理地推测AMP 579的保护机制从根本上有别于那些必须作为预处理的干预方法，如cariporide或缺血性预处理。
经各种试验模型证明，cariporide，一种选择性1亚型钠-氢离子交换(NHE-1)抑制剂，具有保护心脏免受局部缺血/再灌注损伤的功效(Miura T、Ogawa T、Suzuki K、Goto M、Shimamoto KInfarct size limitation by anew Na+-H+exchange inhibitor，Hoe 642difference from preconditioningin the role of protein kinase C[一种新型钠-氢离子交换抑制剂HOE-642减小心肌梗死大小与涉及蛋白激肽酶C的预处理之区别].J Am Col Cardiol1997；29693-701(下文中称作“Miura”)；Scholz W、Albus U、CounillonL、Ggelein H、Lang H-J、Linz W、Weichert A、Schlkens BAProtectiveeffects of HOE642，a selective sodium-hydrogen exchange subtype 1inhibitor，on cardiac ischaemia and reperfusion[一种选择性1亚型钠-氢离子交换抑制剂HOE642对心肌缺血和再灌注的保护效应]。Cardiovasc Res1995；29260-268(下文中称作“Scholz”)；Klein HH、Bohle RM、Pich S、Lindert-Heimberg S、Wollenweber J、Schade-Brittinger C、Nebendahl KTime-dependent protection by Na+/H+exchange inhibition in a regionallyischemic，reperfused porcine heart preparation with low residual bloodflow[钠-氢离子交换抑制对局部缺血后以低残余血流灌注的猪心之时间依赖型保护作用]。J Mol Cell Cardiol 1998；30795-801(下文中称作“Klein”)；Ito Y、Imai S、Ui G、Nakano M、Imai K、Kamiyama H、Naganuma F、Matsui K、Ohashi N、Nagai RA Na+-H+ exchange inhibitor(SM-20550)protects from microvascular deterioration and myocardial injury afterreperfusion[一种钠-氢离子交换抑制剂SM-20550对再灌注后的微血管和心肌损伤有保护作用].Eur J Pharm 1999；374355-366(以下被称作“Ito”))。Cariporide通过在心肌缺血/再灌注状况下抑制细胞内钠离子的累积以及继后的细胞内钙离子的超载来保护心脏，尽管该化合物是在缺血期间还是在再灌注时对心脏予以保护还未明确，但绝大多数研究表明作为预处理时，它具有最佳保护作用(Gumina RJ、Buerger E、Eickmeier C、Moore J、Daemmgen J、Gross GJInhibition of the Na+/H+ exchanger confersgreater cardioprotection against 90 minutes of myocardial ischemia thanischemic preconditioning in dogs.[对于心肌局部缺血90分钟的犬，抑制钠-氢离子交换的心脏保护作用强于缺血性预处理].Circulation.1999；1002519-2526(以下被称作“Gumino”)；Klein HH、Pich S、Bohle RM、Wollenweber J、Nebendahl KMyocardial protection by Na+-H+exchangeinhibition in ischemic，reperfused porcine hearts[抑制钠-氢离子交换对缺血后再灌注猪心的心肌保护作用].Circulation.1995；92912-917(下文中称作“Klein II”)；Rohmann S、Weygandt H、Minck K-OPreischaemic aswell as postischaemic application of a Na+/H+exchange inhibitor reducesinfarct size in pigs[在缺血前后施用Na+/H+交换抑制剂可减小猪的梗死大小].Cardiovasc Res 1995；30945-951(下文中称作“Rohmann”))。
缺血性预处理(PC)是通过心肌短时缺血和再灌注而使继后长时间缺血所造成的组织坏死明显降低的过程(Murry CE、Jennings RB、Reimer KAPreconditioning with ischemiaa delay of lethal cell injury in ischemicmyocardium[缺血性预处理延迟缺血心肌中的致命细胞损伤]。Circulation.1986；741124-1136)。缺血预处理为短时缺血期间释放的物质所触发，包括腺苷(Liu GS、Thornton J、Van Winkle DM、Stanley AWH、Olsson RA、Downey JMProtection against infarction afforded by preconditioning ismediated by A1 adenosine receptors in rabbit heart[预处理对兔心梗死的防范作用以腺苷A1受体为中介]。Circulation.1991；84350-356(下文中称作“Liu”))、缓激肽(Goto M、Liu Y、Yang X-M、Ardell JL、Cohen MV、Downey JMRole of bradykinin in protection of ischemic preconditioningin rabbit hearts[缓激肽在兔心缺血性预处理中所起的作用].Circ Res1995；77611-621(下文中称作“Goto”))和类鸦片(Schultz JEJ、Rose E、YaoZ、Gross GJEvidence for involvement of opioid receptors in ischemicpreconditioning in rat hearts[大鼠心缺血性预处理涉及类鸦片受体之证据].Am J Physiol 1995；268H2157-H2161)。据察，这些物质在持续缺血期间将激活蛋白激酶C(PKC)(Ytrehus K、Liu Y、Downey JMPreconditioningprotects ischemic rabbit heart by protein kinase C activation[预处理通过激活蛋白激酶C保护缺血兔心].Am.J.Physiol.1994；266H1145-H1152(在下文中称作“Ytrehus”)；Weinbrenner C、Liu G-S、Cohen MV、Downey JMPhosphorylation of tyrosine 182 of p38 mitogen-activated protein kinasecorrelates with the protection of preconditioning in the rabbit heart[兔心中的p38有丝分裂原激活蛋白激酶的酪氨酸182之磷酸化与预处理的保护作用相关]，J Mol Cell Cardiol 1997；292383-2391)。PKC之后的连锁反应至今尚未明确。根据定义，缺血预处理只有在作为预处理时才具有保护作用。
以上三种干预方法(AMP 579、cariporide和PC)的机制可能各异。若的确如此，那么，将这些药物联合使用应可能取得协同效应。因此，本研究的目标是调查AMP 579于再灌注时的作用是否对cariporide或PC的保护作用具有协同效应。
组成本发明药物组合物的一些具有腺苷A1/A2激动活性或钠-氢离子交换抑制活性的化合物属碱性物质，这些化合物的有用形式为游离碱或其药学可接受之酸加成盐。
可用以制备酸加成盐的酸优选是那些与游离碱结合而生成药学可接受之盐的酸，亦即，当以药学可接受之剂量施用时，该盐的阴离子于患者无毒，从而游离碱所固有的有益作用不为阴离子的副作用所降低。本发明范畴内的药学可接受之盐包括自无机酸和有机酸衍生的盐，并包括氢卤化物(例如氢氯化物和氢溴化物)、硫酸盐、磷酸盐、硝酸盐、氨基磺酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、酒石酸盐、丙二酸盐、草酸盐、水杨酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐、马来酸盐、亚甲基-二-b-羟基萘甲酸盐、龙胆酸盐、羟乙基璜酸盐、二-对-甲苯酰酒石酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对-甲苯磺酸盐、环己基氨基磺酸盐和奎尼酸盐。
材料与方法本研究按照Guide for the Care and Use of Laboratory Animals《实验室用动物的喂养和使用指南》(National Academy Press，Washington，DC，1996)进行。
手术准备用戊基巴比妥(30mg/kg静脉注射)麻醉体重2.0-2.5千克的新西兰雌、雄白兔，以气管造口术插管并通过正压呼吸器(MD industries，Mobile，AL)通100％的氧气。调节输氧率和换气量，将动脉血气维持在生理范畴。使体温保持在38至39℃。将一条导管插入左颈动脉以便监测血压。将另一条导管插入右颈静脉以便药物灌输。在第四肋间处实施左胸切开术，打开心包，暴露心脏。用锥形弯针走带2-0丝制缝合线穿过心肌并缠绕于左冠状动脉的主干。线头穿过一小段软聚氯乙烯管形成套索。拉套索，然后用一个小止血钳紧固套索，造成局部缺血。青紫出现则表示局部缺血发生。松开套索再灌注，心室表面可见充血则肯定再灌注的进行。
再灌注3小时后，给兔子注射过量的戊基巴比妥并迅速将心脏取出胸腔并置于Langendoff仪上，用盐水灌注以冲出血液。然后重新封闭冠状动脉，并将1ml 0.25％的荧光聚合物微球体(直径2-9μm，Duke Scientific Corp，Palo Alto，CA)注入灌注液，将无荧光的组织区域划分为危险区。称重、冷冻心脏并将其切成2.5mm厚的切片。将切片放入37℃的1％氯化三苯基四唑(TTC)的磷酸钠缓冲液中恒温处理20分钟。然后将切片浸入10％的甲醛水溶液以突显染色(活)和无染色(坏死)组织，并将切片挤入间距整2mm的玻璃板间。用紫外灯照射切片以鉴别心肌危险区。用透明的醋酸纤维纸绘出梗死区和危险区，然后由不明本研究的研究人员采用测面仪进行定量。将所得面积乘以切片厚度而换算成体积。梗死大小以危险区的百分比表示。试验方案45分钟缺血模型使7组兔子局部缺血45分钟后再灌注3小时(图1)。缺血性预处理的引发方式是在持续缺血前让兔心局部缺血5分钟后再灌注10分钟。对接受AMP 579治疗的各组进行静脉团注(30μg/kg)然后以3μg/kg/min输注70分钟。对于PC+AMP(L)组，心脏经缺血性预处理并于再灌注时接受70分钟的AMP 579治疗。对于AMP(L)组，于再灌注时施以70分钟的单独AMP579治疗。对于AMP(E&L)组，在缺血前5分钟开始对心脏施用AMP 579，施用期为120分钟。Cariporide静脉团注在缺血发作前5分钟(Cariporide(E))或再灌注发生前5分钟(Cariporide(L))进行。
60分钟缺血模型对于45分钟的缺血发作，cariporide预处理的疗效是如此卓著以至于其它保护作用可能会失之以察。因此，在本研究系列中，我们选择了60分钟的缺血模型。如图2所示，五组兔子经60分钟的局部缺血后再灌注3小时。对照组未接受药物治疗。对接受AMP 579治疗的各组进行静脉团注30μg/kg，然后以3μg/kg/min输注70分钟。对于Cariporide(E)组，心脏在缺血发作前5分钟接受0.5mg/kg cariporide团注。对于cariporide(E)+AMP(L)组，除了cariporide预处理之外，心脏于再灌注开始时还接受AMP 579治疗。对于cariporide(L)+AMP(L)组，心脏于再灌注开始时接受cariporide(0.5mg团注)和AMP 597两项处理。对于AMP(L)组，于再灌注开始时施用单独的AMP 579。
化学品将来自Aventis Pharma的AMP 579和cariporide溶解于少量的二甲亚砜(DMSO)中，二甲亚砜对梗死没有单独的影响。
统计分析所有数据均以平均值±平均标准误差(S.E.M)表示。单向ANOVA和Scheffé事后检定法联合使用以检定各组间基线血液动力学和梗死大小的差异。重复进行ANOVA检验以检定试验期间各组内血液动力学之变化。若p值小于0.05，则表示有显著差异。
结果45分钟缺血模型在此模型中，我们的试验目的是确定AMP 579是否对缺血性预处理的保护作用有加合效应。图3显示一次缺血性预处理可将梗死大小从对照组的危险区的55.8±3.9％明显降至危险区的26.0±6.7％。自再灌注开始单独施用AMP 579也将梗塞大小明显降至危险区的32.1±1.8％。若缺血预处理和于再灌注时施用AMP 579联合，梗死大小则进一步降至危险区的5.5±2.7％，这比单独使用缺血预处理或AMP 579的都要小得多。由此可见，AMP 579和缺血预处理具有加合效应。我们还评估了cariporid在45分钟的缺血模型中对梗死大小的影响。Cariporide预处理将梗死大小明显降至危险区的8.5±3.7％，也小于在对照组心脏中所观察到的梗死大小。然而，当于再灌注前夕施用cariporide时，其未能表现出心脏保护作用(梗死大小为危险区的53.4±3.5％)。5组间的基线心率和平均动脉压无差异(表1)。各组间兔子的体重、心重和危险区大小也无显著差异(表1)。
60分钟缺血模型鉴于在45分钟模型中，单独的cariporide表现出如此显著的保护效应，因此，我们在cariporide+AMP 579的试验方案中选用了60分钟缺血模型。5组间的基线心率和平均动脉压无差异(表3)。各组间兔子的体重、心重和危险区大小也无显著差异(表4)。对照组的梗死大小为危险区的66.0±4.9％(图4)。用cariporide进行早期治疗使梗死大小明显降至危险区的41.5±7.7％。当早期施用cariporide和再灌注发生时施用AMP 579联合时，梗塞大小则进一步降至危险区的14.2±4.5％，表明cariporide和AMP579对心肌梗死的保护作用具有协同效应。于再灌注时单独施用AMP 579也显示减小梗塞大小的趋势(危险区的45.3±5.4％)，然而统计分析显示当与对照组对比时，该差异并不显著。引人注意的是当于再灌注发生前夕联合施用AMP 579和cariporide时，梗死大小的确明显降至危险区的31.3±7.0％，这又意味着甚至于再灌注时联合施用cariporide和AMP 579也具有协同效应。
讨论本研究的主要发现是于再灌注时施用AMP 579所起到的保护作用可与缺血发作前施用的cariporide的保护作用有协同效应，以致保护效应明显加强。当AMP 579与缺血性预处理联合使用也具有协同效应。这些发现暗示AMP 579的作用机制有别于cariporide或缺血性预处理。另外，这些药物的联用似乎在临床条件下对心肌梗死可提供高度保护作用，且在心脏手术中尤其有用。
经验证，于再灌注时施用AMP 579可保护心脏免受缺血和再灌注损伤(Smits；McVey；Budde；Xu)，这暗示了AMP 579可防止再灌注损伤。在这些研究中，使心脏缺血30分钟，并于3小时的再灌注发生前10分钟或发生时施用AMP 579。在本研究中，单独施用AMP在45分钟模型中具有保护作用，但在60分钟的模型中，这种保护作用却未得到证实，这暗示了AMP的保护作用受缺血严重程度的限制。尽管于再灌注时施用AMP 579所起到的保护作用明显小于cariporide预处理的保护作用，但二者联合使用所产生的效果却非常显著，由此可见它们之间具有协同效应。
在本研究的45分钟缺血模型中，晚期单独施用cariporide(于再灌注时)对心脏没有任何保护作用(图4)。这肯定了其它人对再灌注时施用cariporide不具保护作用的观察(Klein II；Klein HH、Pich S、Bohle RM、Lindert-Heimberg S、Nebendahl KNa(+)/H(+)exchange inhibitorcariporide attenuates cell injury predominantly during ischemia and not atonset of reperfusion in porcine hearts with low residual blood flow[Na(+)/H(+)交换抑制剂在猪心缺血期间可显著减少细胞损伤，但于低残余血再灌注开始时却无此效果]。Circulation.2000；1021977-1982(在下文中称作“Klein III”)。值得注意的是，当于再灌注时联合施用cariporide和AMP579时，观察到梗死大小与对照组相比显著降低。尽管这种保护作用远远不及cariporide作为预处理施用时观察到的效果，但却暗示了于再灌注时施用cariporide确实产生了较小的保护效应。然而，cariporide和AMP 579联合使用所获得的保护作用究竟是“相互促进”还是加合效应，则尚不明确。
尽管AMP 579和cariporide具有协同效应的确凿原因还不明确，但我们推测，这种协同效应的原因可能在于这两种药物具有完全不同的作用机制。于再灌注时施用AMP 579所产生的保护作用似乎是通过激活腺苷A2受体而介导的(McVey；Xu II；Nakamura M、Zhao Z-Q、Clark KL、VelezDV、Guyton RA、Vinten-Johansen JA novel adenosine analog、AMP579，inhibits neutrophil activation，adherence and neutrophil-mediated injuryto coronary vascular endothelium[一种新型腺苷类似物抑制嗜中性粒细胞的活化和粘附于冠状动脉内皮以及以嗜中性粒细胞为介导的冠脉血管内皮损伤]。Eur J Pharmacol 2000；397197-205(下文中称作“Nakamura”))。我们最近的资料也表明AMP 579是通过减轻心肌挛缩(Xu II)并抑制再灌注时自由基的生成来保护心脏免受再灌注损伤(Xu III)。Nakamura等(Nakamura)提出AMP 579的作用涉及对嗜中性粒细胞活化的抑制。然而，我们发现AMP 579对经缓冲液灌注而无嗜中性粒细胞的兔心也一样具有保护作用(Xu)。因此，AMP 579的保护作用的确切机制仍不明确。Cariporide是一种选择性NHE-1抑制剂(Scholz)。在缺血期间，质子积累将Na+/H+交换系统激活，Na+/H+交换系统随后以质子来换取Na+。在缺血期间，Na+的积累会干扰容量调节而Na+于再灌注时与Ca++交换使细胞溶质内的钙离子超载。再灌注时，若pH得到校正，NHE-1则应尤其有活性。尽管抑制NHE-1是一种广为认可的心脏保护方法(Gumina；Klein III；Rupprecht HJ、Dahl JV、Terres W、Seyfarth KM、Richardt G、SchultheibHP、Buerke M、Sheehan FH、Drexler HCardioprotective effects of theNa(+)/H(+)xchange inhibitor cariporide in patients with acute anteriormyocardial infarction undergoing direct PTCA[Na(+)/H(+)交换抑制剂Cariporide对急性心肌梗死患者在进行直接冠状动脉扩张术期间的心脏保护作用]。Circulation.2000；1012902-2908；Stromer H、de Groot M、HornM、Faul C、Leupold A、Morgan JP、Scholz W、Neubauer SNa+/H+exchange inhibition with HOE642 improves postischemic recoverydue to attenuation of Ca2+overload and prolonged acidosis onreperfusion[用HOE642抑制Na+/H+交换由于缓解了Ca2+超载和再灌注时长时间的酸中毒而促进缺血后的恢复]。Circulation 2000；1012749-2755)，但仍不清楚这种保护究竟是在缺血期间(Miura；Klein；Klein II)还是在再灌注时发挥(Rohmann；Linz W、Albus U、Crause P、Jung W、WeichertA、Scholkens BA、Scholz WDose-dependent reduction of myocardialinfarct mass in rabbits by the NHE-1 inhibitor cariporide(HOE642)[NHE-1抑制剂Cariporide(HOE)可剂量依赖型地降低兔心肌梗死大小]。Clin Exp Hypertens 1998；20733-749)。在最近的一份报告中，Klein等已指出cariporide的心肌保护作用主要通过于缺血期间而非再灌注期间抑制NHE-1而发挥(Klein III)。于此同见，我们也发现在45分钟的缺血模型中，于再灌注时施用cariporide不能保护心脏免受缺血/再灌注损伤。因此，可以合理地假设AMP 579和cariporide具有不同的作用机制。而两种药物机制上的差异很可能就是其协同效应的基础。
在本研究的45分钟缺血模型中，AMP 579的保护作用对PC的作用也具有协同效应。缺血性预处理由短期缺血期间所释放的物质引发，包括腺苷、缓激肽和类阿片(Liu；Goto)，据信这些物质继而在持续缺血期间激活蛋白激酶C(PKC)(Ytrehus)。据证明，使用一些特定的拮抗药物已充分证实A1和A3而非A2腺苷受体能够引发缺血性预处理的保护作用(Thornton JD、Liu GS、Olsson RA、Downey JMIntravenous pretreatmentwith A1-selective adenosine ahalogues protects the heart againstinfarction[选择性A1腺苷类似物的静脉施用预处理防止心肌梗死]。Circulation.1992；85659-665；Liu GS、Richards SC、Olsson RA、MullaneK、Walsh RS、Downey JMEvidence that the adenosine A3receptor maymediate the protection afforded by preconditioning in the isolated rabbitheart[预处理对兔心的保护作用是通过腺苷A3受体而发生的证据]。Cardiovasc Res 1994；281057-1061)。当于再灌注时施用时，AMP 579是通过激活A2而非A1受体来保护心脏免受缺血/再灌注损伤(Xu；Nakamura)，这表明AMP 579和PC具有不同的作用机制。因此，于再灌注时施用AMP579所提供的保护作用与PC的保护作用具有协同效应也不足为怪了。
若在缺血前给予AMP 579，我们曾推测其可能是通过激活腺苷A1受体并引发PC机制而发挥其保护作用(McVey)。若的确如此，那么自缺血发作前开始施用AMP 579直到再灌注后70分钟所产生的保护效果应预期相当于PC加AMP 579的保护效果。然而，在45分钟的缺血模型中，我们没有观察到此“预期”效果(图4)。这也许是因为AMP 579的施用浓度不够高，不足以激活足够的腺苷A1受体以对心脏进行预处理。
总之，我们已证明新型腺苷A1/A2受体激动剂AMP 579与cariporide或缺血性预处理联合作用可显著减少开胸兔心的心肌梗死范围。上述三种治疗途径在机制上的区别也许是其协同效应的原因所在。另外，在可选用预处理的心脏手术期间，本研究的发现可提供一种高效的心脏保护途径。
图1 45分钟缺血模型的试验方案。
图2 60分钟缺血模型的试验方案。
图3 缺血性预处理和AMP 579对心肌梗死大小的影响，梗死大小以危险区的百分比表示。梗死大小经三苯基四唑(TTC)染色以定量。空心圈代表单独试验，实心圈代表具有S.E.M.的组平均值。*与对照组相比，p＜0.05；#与PC加AMP(L)相比，p＜0.05。
图4 60分钟缺血模型中Cariporide和AMP 579对心肌梗死大小的影响，梗死大小以危险区的百分比表示。梗死大小经三苯基四唑(TTC)染色以定量。空心圈代表单独试验，实心圈代表具有S.E.M.的组平均值。缩写见表1。*与对照组相比，p＜0.05；#与cariporide(E)组相比，p＜0.05。
表1 45分钟缺血模型的血液动力学数据基线 缺血 重复30次 重复90次 重复180次HR(跳动次数/分钟)对照 260±10 265±13 253±10 247±14 248±15PC 278±10 280±10 273±9 275±10 270±11PC+AMP(L) 276±9 269±8 240±12 233±5 246±10AMP(L) 267±6 265±6 230±7 247±13 247±8AMP(E&L) 288±8 247±11 238±12 233±10 257±11Cariporide(E) 290±9 275±9 273±8 267±8 260±7Cariporide(L) 277±10 263±11 258±9 257±8 248±6MAP(mmHg)对照 96.3±4.581.4±5.079.1±4.978.6±4.878.0±3.1PC 100±3.9 88.1±2.588.1±2.786.9±3.480.0±2.5PC+AMP(L) 101±3.9 87.9±3.070.5±7.773.3±7.282.2±7.9AMP(L) 92.8±5.672.2±2.658.9±4.667.8±6.267.3±4.9AMP(E&L) 93.9±4.665.8±4.962.8±4.367.2±3.877.2±4.9Cariporide(E) 95.6±3.784.2±5.783.9±4.383.4±4.678.2±5.3Cariporide(L) 93.9±2.775.5±4.173.6±3.277.5±2.371.9±4.5平均值±S.E.M.。
缩写PC＝缺血性预处理；PC+AMP(L)＝缺血性预处理+于再灌注时开始施用AMP 579持续70分钟；AMP(L)＝于再灌注时开始施用AMP 579持续70分钟；AMP(E&L)＝于缺血前5分钟开始施用AMP 579持续120分钟；Cariporide(E)＝于缺血前5分钟团注Cariporide；Cariporide(L)＝于再灌注前5分钟团注cariporide；HR＝心率；MAP＝平均动脉压。
表2 45分钟局部缺血模型的梗死大小数据n体重心重危险区大小 梗塞大小(kg)(g) (cm3) (cm3)对照组 62.3±0.17.2±0.30.97±0.04 0.54±0.06PC 62.3±0.17.4±0.11.02±0.24 0.32±0.14*PC+AMP(L)72.1±0.06.9±0.31.13±0.08 0.07±0.04*#AMP(L) 62.1±0.07.1±0.11.1 5±0.110.37±0.03*AMP(E&L) 62.2±0.17.4±0.11.17±0.12 0.26±0.05*、 62.3±0.17.2±0.21.35±0.15 0.13±0.07*Cariporide(L)62.1±0.06.9±0.21.13±0.14 0.60±0.08平均值±S.E.M.。
*与对照组相比，p＜0.05；#与PC+AMP组相比，p＜0.05缩写见表2和表3。
表3 60分钟局部缺血模型的血液动力学数据基线 局部缺血 重复30次重复90次 重复180次HR(跳动次数/分钟)对照组 275±6 2273±9 260±9 263±9 258±8Cariporide(E) 286±8 267±26 274±11 272±7 263±11Cariporide(E)+AMP(L)277±12 269±12 238±12 239±13 246±15Cariporide(L)+AMP(L)272±11 260±12 235±9 240±10 243±10AMP(L) 289±12 274±11 235±10 253±12 268±10平均动脉压(mmHg)对照组 94.3±2.383.5±3.778.2±4.177.7±4.375.3±4.6Cariporide(E) 94.2±1.586.7±2.182.8±2.279.7±2.279.0±3.3Cariporide(E)+AMP(L)93.8±2.182.6±2.268.6±5.173.0±2.774.8±3.0Cariporide(L)+AMP(L)93.9±2.380.0±3.563.9±4.867.8±2.572.8±3.8AMP(L) 102.1±2.5 93.4±2.973.3±2.883.6±4.085.0±2.9平均值±S.E.M.。
缩写cariporide(E)＝在缺血前5分钟团注cariporide；Cariporide(E)+AMP(L)＝在缺血前5分钟团注cariporide，随后自再灌注开始施用AMP 579持续70分钟；Cariporide(L)+AMP(L)＝于再灌注前5分钟团注cariporide，随后于再灌注时开始施用AMP 579持续70分钟；AMP(L)＝自再灌注开始施用AMP 579持续70分钟；HR＝心率；MAP＝平均动脉压。
表4 60分钟缺血模型的梗死大小数据n体重心重危险区大小梗死大小(kg)(g) (cm3)(cm3)对照组 10 2.3±0.07.9±0.21.14±0.130.77±0.11Cariporide(E)62.4±0.07.6±0.31.17±0.110.47±0.08*Cariporide(E)+AMP72.3±0.07.4±0.11.03±0.110.15±0.05*#Cariporide(L)+AMP62.4±0.07.5±0.21.09±0.080.36±0.09*AMP 82.3±0.07.5±0.21.25±0.120.59±0.09平均值±S.E.M.。
*与对照组相比，p＜0.05；#与Cariporide(E)组和cariporide(L)+AMP组相比，p＜0.05。
缩写见表1；n＝各组兔子的数目。
本发明的一个实施方案是药学有效量的具有腺苷A1/A2激动活性的化合物和具有钠-氢离子交换抑制活性的化合物在制备为有此需要的患者提供心脏保护的药物中的用途。
本发明的一个优选实施方案是一种药物组合物，其包含药学可接受之载体以及药学有效量的具有腺苷A1/A2激动活性的化合物和钠-氢离子交换抑制化合物，其中的具有腺苷A1/A2激动活性的化合物是AMP 579或其药学可接受之盐。
本发明的另一个优选实施方案是一种药物组合物，其包含药学可接受之载体以及药学有效量的具有腺苷A1/A2激动活性的化合物和钠-氢离子交换抑制化合物，其中的钠-氢离子交换抑制化合物是cariporide、eniporide、zoniporide、BMS-284640、BIIB-513、BIIB-722CI、EMD-85131、KB-R9032、MS-31-038、SL-59.1227、SM20550、SMP-300、T-559和TY-12533。
本发明的一个更优选的实施方案是一种药物组合物，其包含药学可接受之载体以及药学有效量的具有腺苷A1/A2激动活性的化合物和钠-氢离子交换抑制化合物，其中的钠-氢离子交换抑制性化合物是cariporide。
本发明的一个特殊实施方案是一种药物组合物，其包含药学可接受之载体、AMP 579或其药学可接受之盐以及cariporide。
本发明的另一个优选的实施方案提供了保护有此需要的患者免受再灌注损伤的方法，该方法包括向所述患者施用药学有效量的具有腺苷A1/A2激动活性的化合物和钠-氢离子交换抑制化合物。
本发明的另一个优选实施方案提供了保护有此需要的患者免受缺血损伤的方法，该方法包括向所述患者施用药学有效量的具有腺苷A1/A2激动活性的化合物和钠-氢离子交换抑制化合物。
本发明的另一个优选实施方案提供了心脏手术之前、期间或之后为有此需要的患者提供心脏保护的方法，该保护方法包括向所述患者施用药学有效量的具有腺苷A1/A2激动活性的化合物和钠-氢离子交换抑制化合物。
本发明的另一个优选实施方案提供了在缺血发作之前、期间或之后为有此需要的患者提供心脏保护的方法，该保护方法包括向所述患者施用药学有效量的具有腺苷A1/A2激动活性的化合物和钠-氢离子交换抑制化合物。
在本发明的心脏保护方法中，腺苷A1/A2激动化合物和钠-氢离子交换抑制化合物可以以不同的方式施用，诸如在任选采用医疗手术的组合治疗中。例如，可同时或不同时向患者施用腺苷A1/A2激动化合物和钠-氢离子交换抑制化合物，条件是它们的施用使得在某些时段内患者体内存有药学有效量的这两种化合物以达本发明的疗效。
本发明的进一步目标是提供用于为有此需要的患者提供心脏保护的药箱，该药箱包含多个独立的容器，其中至少一个所述容器含有具有腺苷A1/A2激动活性的化合物，且至少另一个所述容器含有钠-氢离子交换抑制剂，且所述容器任选含有药物载体，该药箱可有效地用以实施本发明的组合治疗。有关药箱的进一步的实施方案是所述容器中至少有一个所述容器应含有具有腺苷A1/A2激动活性的化合物但不含钠-氢离子交换抑制化合物，且至少另一个所述容器应含有钠-氢离子交换抑制化合物但不含具有腺苷A1/A2激动活性的化合物。
在实际应用中，腺苷A1/A2激动化合物和钠-氢离子交换抑制化合物可经胃肠外、局部、直肠、经皮、肺内或口服施用。但优选经胃肠外和/或经口服施用。
含有本发明所使用的化合物的适宜的药物组合物可按照常规方法配制。例如，可将本发明所使用的化合物溶解或混悬于适宜的载体中。
本发明所使用的化合物之存在形式应能实现最恰当的施用方式。本发明还涉及一种药物组合物，其含有适用于作为人药或兽药中的、本发明所使用的化合物。该组合物可使用一种或多种药学可接受的、包含佐剂或赋形剂的载体以常规方法配制。该佐剂尤其包括稀释剂、无菌水介质和各种无毒有机溶剂。该组合物可被制成片剂、丸剂、胶囊、锭剂(Loaenge，troch)、硬糖、颗粒剂、粉剂、水溶液或混悬液、注射液、酏剂或糖浆、适于肺内施用的粉剂、溶液或混悬液，并可含有一种或多种选自甜味剂、矫味剂、着色剂或稳定剂的物质以获得药学可接受的制剂。
载体以及所述载体中本发明所使用的化合物的含量一般是根据这些化合物的溶解性和化学性质、具体的施用方式以及药学实践中应遵守的原则来选择。例如，制备片剂可使用赋形剂，诸如无菌水、林格氏溶液、乳糖、柠檬酸钠、等渗盐溶液(磷酸二氢钠或磷酸氢二钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙或氯化镁，或这些盐的混合物)、碳酸钙以及崩解剂，诸如淀粉、海藻酸和某些复杂硅酸盐，以及润滑剂，诸如硬脂酸镁、月桂基硫酸钠和滑石。乳糖和高分子量的聚乙二醇有助于制备胶囊。当使用水性混悬液时，其可含乳化剂或促悬浮剂。还可使用稀释剂，诸如蔗糖、乙醇、聚乙二醇、丙二醇、甘油和氯仿或这些物质的混合物。
对于胃肠外施用，可采用本发明所使用的化合物于植物油(例如芝麻油、花生油或橄榄油)或水-有机溶液(诸如水和丙二醇)、可注射有机酯(诸如油酸乙酯)中的乳化液、混悬液或溶液以及其药学可接受之盐的无菌溶液。本发明所使用的化合物之盐溶液尤其可用于肌内、静脉内、动脉内或皮下注射或输注技术施用。水溶液、还包括所述盐在纯蒸馏水中的溶液可用于静脉内施用，条件是其pH得到适当调节、合理缓冲并经足量的葡萄糖或氯化钠配成等渗，并经加热、辐射或微滤灭菌。
本发明的具有腺苷A1/A2激动活性的化合物和钠-氢离子交换抑制化合物也可以以一定方式配制，所述方式可对抗因对流及/或扩散而导致的透过血管(动脉或静脉)壁的快速清除，从而增加药物组合物在希望作用点的停留时间。根据本发明的有用贮库(Depot)可被纳入共聚物基质，诸如乙烯-乙酸乙烯酯中或由硅橡胶外壳包围的聚乙烯醇凝胶之中。另外一种方式是自植入外膜的硅氧烷聚合物来局部输送具有腺苷A1/A2激动活性的化合物和钠-氢离子交换抑制化合物。
减小具有腺苷A1/A2激动活性的化合物和钠-氢离子交换抑制化合物在经皮、经血管输送过程中流失的另一个方法包括使用非扩散性药物涂层(drug-eluting)微粒。该微粒可包含各种合成聚合物诸如聚交酯，或天然物质，包括蛋白质或多糖。这样的微粒可使得能够对变量进行有策略的操纵，所述变量包括药物的总剂量和该药物的释放动力学。该微粒可通过带孔隙球囊导管或球囊支片被有效地注进血管壁并在动脉或静脉壁和外膜周围的组织内至少保留约两周。用于局部、血管内定位输送治疗剂的制剂和方法在例如Reissen等人的撰文(J.Am.Coll.Cardiol.1994；231234-1244)中述及，该文献的全部内容特此引入本文作为参考。
用于具有腺苷A1/A2激动活性的化合物和钠-氢离子交换抑制化合物的介质还可以是水凝胶，该水凝胶可由任何生物兼容的或无胞毒(均相或异相)的聚合物诸如可作为药物吸收海绵的亲水性聚丙烯酸聚合物制成。此聚合物已例如在专利申请WO93/08845中述及，该文献的全部内容特此引入本文作为参考。它们中的一些如特别是自环氧乙烷和/或环氧丙烷制备的那些在市面有售。
另外，具有腺苷A1/A2激动活性的化合物和钠-氢离子交换抑制化合物可以借助涂有亲水性薄膜(例如水凝胶)的血管成形术球囊，或借助带有所述化合物输注腔的任何其它导管直接施用于血管壁，由此可以以精确方式施用于待治疗部位。
本发明所使用的具有腺苷A1/A2激动活性的化合物和钠-氢离子交换抑制性化合物的百分比可以不同。这些化合物所占有的比例应当可获得适当的剂量。显然，也可施用几个单位剂量形式。所施用的剂量由医生根据期望的治疗效果、施用途径和疗程以及患者的状况而定。在各个特定的情况下，剂量将根据待治疗对象的特定因素，诸如年龄、体重、总体健康状况和其它可影响药物疗效的因素决定。
对于成年人，腺苷A1/A2激动化合物的剂量，若经吸入则一般为每天约0.00001至约0.5、优选约0.0001至约0.05mg/kg体重；若经口服则一般为每天约0.0001至约1、优选0.001至0.5mg/kg体重；若经静脉施用则一般为每天约0.00001至约0.1、优选0.0001至0.01mg/kg体重。钠-氢离子交换抑制化合物的剂量，若经吸入则一般为每天约0.0001至约5、优选约0.001至约0.5mg/kg体重；若经口服则一般为每天约0.001至约10、优选0.01至5mg/kg体重；若经静脉施用则一般为每天约0.0001至约1、优选0.001至0.1mg/kg体重。
具有腺苷A1/A2激动活性的化合物和钠-氢离子交换抑制化合物之施用剂量可以是各化合物的药学有效剂量，或亚临床剂量，即低于各化合物的药学有效剂量，或这些情况的组合，只要经组合的剂量是药学有效的即可。
本发明所使用的具有腺苷A1/A2激动活性的化合物和钠-氢离子交换抑制化合物的施用频率可根据期望疗效所需而定。实施本发明方法的剂量方案是保障最大的治疗响应直到达到病情缓解，然后采用可减轻病情的最低有效剂量。一些患者可能对较高或较低的剂量反应迅速，因此，可发现用低得多的维持剂量就足够了。本发明对长期和短期的治疗方案均予以了策划。根据特定患者的生理需求而实施的每天约1至约4剂的治疗方案也在本发明的策划之中，当然也考虑到在任何具体情况下选择适当剂量时必须参考患者的体重、总体健康状况、年龄和其他可影响药物响应的因素。连续进行胃肠外输注以使血液中保持治疗有效水平的具有腺苷A1/A2激动活性的化合物和钠-氢离子交换抑制性化合物，也在本发明的策划范围之内。
本发明的化合物可于再狭窄治疗的血管成形术(采用任何装置如球囊、切除或激光技术)期间使用，以减小或防止再灌注损伤。
本发明的化合物可在再狭窄治疗期间与任何抗凝血剂、抗血小板剂、抗血栓形成剂或血纤蛋白溶酶原剂联合使用以减轻或避免再灌注损伤。这类活性剂往往于干涉性手术之前、期间或之后与本发明的化合物并用对患者进行治疗，以使干涉性手术安全实施或避免血栓形成所产生的有害影响。已知的这类抗血凝剂、抗血小板剂、抗血栓形成剂或血纤蛋白溶酶原剂的一些实例包括凝血酶抑制剂或VIIa因子抑制剂的任何制剂。已知的这类抗血凝剂、抗血小板剂、抗血栓形成剂或血纤蛋白溶酶原剂的一些实例包括阿斯匹林、凝血酶直接抑制剂、Xa因子直接抑制剂或VIIa因子抑制剂的任何制剂。
本发明可以以其它形式实施，只要不违背本发明的要领和基本属性即可。
权利要求
1.一种药物组合物，其包含药学可接受之载体以及药学有效量的具有腺苷A1/A2激动活性的化合物和钠-氢离子交换抑制化合物。
2.权利要求1的药物组合物，其中的具有腺苷A1/A2激动活性的化合物是以下通式的化合物或其药学可接受之盐。
3.权利要求1的药物组合物，其中的钠-氢离子交换抑制化合物选自cariporide、eniporide、zoniporide、BMS-284640、BIIB-513、BIIB-722CI、EMD-85131、KB-R9032、MS-31-038、SL-59.1227、SM20550、SMP-300、T-559和TY-12533。
4.权利要求1的药物组合物，其中的钠-氢离子交换抑制化合物是cariporide。
5.权利要求1的药物组合物，其包含药学可接受之载体和药学有效量的AMP579和cariporide。
6.一种为有此需要的患者提供心脏保护的方法，该方法包括向所述患者施用药学有效量的具有腺苷A1/A2激动活性的化合物和钠-氢离子交换抑制化合物。
7.一种保护有此需要的患者免受再灌注损伤的方法，该方法包括向所述患者施用药学有效量的具有腺苷A1/A2激动活性的化合物和钠-氢离子交换抑制化合物。
8.一种保护有此需要的患者免受缺血损伤的方法，该方法包括向所述患者施用药学有效剂的具有腺苷A1/A2激动活性的化合物和钠-氢离子交换抑制化合物。
9.一种在心脏手术之前、期间或之后为有此需要的患者提供心脏保护的方法，该方法包括向所述患者施用药学有效量的具有腺苷A1/A2激动活性的化合物和钠-氢离子交换抑制化合物。
10.一种在缺血发作之前、期间或之后为有此需要的患者提供心脏保护的方法，该方法包括向所述患者施用药学有效量的具有腺苷A1/A2激动活性的化合物和钠-氢离子交换抑制化合物。
11.药学有效量的具有腺苷A1/A2激动活性的化合物和钠-氢离子交换抑制化合物在制备用于为有此需要的患者提供心脏保护的药物中的用途。
12.一种为有此需要的患者提供心脏保护的药箱，所述药箱包含多个独立的容器，其中至少一个所述容器含有具有腺苷A1/A2激动活性的化合物，且至少另一个所述容器含有钠-氢离子交换抑制化合物，且所述容器任选含有药物载体。
13.权利要求12的药箱，其中所述容器中至少有一个所述容器应含有具有腺苷A1/A2激动活性的化合物但不含钠-氢离子交换抑制性化合物，且至少另一个所述容器应含有钠-氢离子交换抑制化合物但不含具有腺苷A1/A2激动活性的化合物。
14.一种药物组合物，其包含药学可接受之载体和药学有效量或低于药学有效量的具有腺苷A1/A2激动活性的化合物以及药学有效量或低于药学有效量的钠-氢离子交换抑制化合物，条件是所述组合物在药学上是有效的。
15.一种药物组合物，其包含药学可接受之载体和药学有效量的具有腺苷A1/A2激动活性的化合物或其药学可接受之盐，以及钠-氢离子交换抑制化合物或其药学可接受之盐。
全文摘要
本发明涉及一种药物组合物，该药物组合物包含具有A1/A2腺苷激动活性的化合物、钠－氢离子交换抑制化合物以及药学可接受之载体。本发明还涉及在有需要的患者中进行心脏保护的方法，该方法包括向所述患者施用药学有效量的具有腺苷A1/A2激动活性的化合物和钠－氢离子交换抑制化合物。本发明还涉及药学有效量的具有腺苷A1/A2激动活性的化合物和钠－氢离子交换抑制化合物在制备用于向有此需要的患者提供心脏保护的药物中的用途。本发明还涉及为有此需要的患者提供心脏保护的药箱，所述药箱包含多个独立的容器，其中至少一个所述容器含有具有腺苷A1/A2激动活性的化合物，且至少另一个所述容器含有钠－氢离子交换抑制化合物，所述容器任选含有药物载体。
文档编号A61P31/10GK1585634SQ02821422
公开日2005年2月23日 申请日期2002年11月1日 优先权日2001年11月2日
发明者J·M·唐尼, 徐哲龙, U·舒克拉 申请人:安万特药物公司