重组抗骨桥蛋白抗体及其用途的制作方法

专利名称：重组抗骨桥蛋白抗体及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及重组抗骨桥蛋白(osteopontin)抗体及应用该抗体的自身免疫性疾病、风湿病乃至类类风湿性关节炎的治疗方法。
背景技术：
骨桥蛋白(以下称作OPN)是一种骨中大量存在的酸性钙结合性糖蛋白。已知，在人类，由于mRNA剪切(splicing)的不同，至少可以生成骨桥蛋白-a(以下，称作OPN-a)、骨桥蛋白-b(以下，称作OPN-b)和骨桥蛋白-c(以下，称作OPN-c)3种同种型(isoform)(Y.Saitoh等，(1995)Laboratory Investigation，72，55-63)。其中，人们认为，OPN-a的前体具有后面序列表中SEQ ID NO1中所示的氨基酸序列，分泌过程中切断信号肽，形成117-N314的成熟体OPN-a。另外，在生物体内，凝血酶可从成熟体OPN第168位的精氨酸残基的C末端进行剪切，形成N末端和C末端2种片段。
上述OPN担负着多种生理学病理学上的重要功能，例如细胞粘附、细胞迁移、肿瘤形成、免疫应答及抑制补体介导的细胞溶解等功能。这些不同的功能是由多种细胞表面的受体介导的。OPN的内部具有RGD序列(例如，OPN-a中159-161氨基酸残基)，识别该RGD序列的αVβ3、αVβ1和αVβ5等整合素(integrin)是OPN的主要受体。其中，整合素αVβ3、αVβ1和αVβ5在血管的平滑肌细胞中介导细胞粘附。此外，αVβ3与巨噬细胞、淋巴细胞、内皮细胞和平滑肌细胞等的迁移相关。
再者，到目前为止的研究表明，OPN通过SVVYGLR序列与整合素α9β1、α4β1、α4β7结合，并发现其结合方式的不同，即α4β1能与未经凝血酶剪切的OPN(非切断型OPN)及凝血酶剪切的N末端片段(切断型OPN)二者结合，而α9β1只能与凝血酶切断型OPN结合(Y.Yokosaki等，(1999)The Journal of BiologicalChemistry 274，36328-36334/P.M.Green等，(2001)FEBS Letters 503，75-95/S.T.Barry等，(2000)Experimental Cell Research 258，342-351。这些整合素的亚基α9和α4、β1和β7，彼此间氨基酸序列同源性高。整合素α4β1和α4β7主要在淋巴细胞和单核细胞中表达，但在中性粒细胞中仅微量表达。另一方面，α9β1在中性粒细胞中选择性高表达，具有VCAM-1和Tenascin-C等介导的中性粒细胞迁移所必需的功能。另外，整合素在肌肉细胞和上皮细胞、肝细胞等细胞中广泛表达。如上所述，整合素亚基α9和α4的胞质区各通过存在微妙差异的细胞内信号传导路径，相互协同促进白细胞向炎症部位的迁移和凝集，通过增强它们的浸润活性而参与各种炎症反应。
如上所述，不同种类的整合素促进白血病的迁移，参与炎症反应，所以抑制这些整合素活性的药剂有潜能作为抗炎症剂应用。例如，整合素αVβ3在破骨细胞、血管内皮细胞及平滑肌细胞等细胞中表达，通过抑制αVβ3整合素与其各种结合配体的结合，如在关节中，期待起到关节破坏抑制作用，所以抗αVβ3抗体的开发实际上是可行的。
但是，由于属于整合素家族的受体在广泛的组织中普遍表达，承担着维持生命活动所必需的功能，所以应用整合素的抗体对类风湿性关节炎和变形性关节炎进行治疗时，有可能对其它部位产生同样的抑制，恐怕产生副作用。
另外，WO01/71358中公开了抑制整合素α4和骨桥蛋白结合的物质的筛选方法及应用筛选所得物质进行炎症性疾病的治疗方法等。
类风湿性关节炎的病因有多种因素，有许多相关的报道，但均不确实。另外，其治疗方法，现在已知的方法是对症治疗，不能达到必要的满足。
因此，强烈要求明确类风湿性关节炎的病因，提供更优越的治疗法，本发明就是以解决这样的课题作为其目的。
另外，类风湿性关节炎、变形性关节炎等之间的辨别很难，本发明的另一课题是提供用于辨别的诊断方法。
本发明者们了解风湿病患者和变形性关节炎患者的关节腔液中OPN浓度增高，并且本发明者们初次发现凝血酶切断型N末端片段的比例占总OPN的比例增加，认为OPN与这些疾病的发病密切相关。于是，应用OPN基因敲除小鼠进行实验，来验证该事实。
另外，制备能区别识别用凝血酶酶切OPN产生的N末端片段和C末端片段的抗体，应用这些抗体进行实验，发现在类风湿性关节炎患者中，尤其是由凝血酶酶切产生的N末端片段在关节腔内呈现高浓度。
再者，本发明者们着眼于上述类风湿性关节炎患者中高浓度表达的N末端片段中同时存在人整合素识别的RGD序列和SVVYGLR序列，设想同时封闭这两种序列的抗体，能广泛抑制OPN与整合素的结合，是否对类风湿性关节炎和变形性关节炎的治疗有效。
上述OPN分布于肾脏、胎盘、卵巢、脑、皮肤等组织内，主要表达于骨组织。本发明者们考虑类风湿性关节炎治疗时，用特异的方法从OPN侧阻断OPN与整合素的结合。此时，考虑到前述多种不同的整合素以协同方式参与了炎症反应，所以本发明者们认为更广泛地阻断与这些不同种类整合素的结合会有效。
于是，制备了抑制人OPN的RGD序列与整合素结合及抑制人OPN的SVVYGLR序列与整合素结合的抗体，通过细胞粘附和细胞迁移试验确认其效果。还获得了与小鼠OPN的相应序列对应的合成肽的抗体，应用小鼠的关节炎疾病模型，观察该抗体作为治疗药的效果。
也就是说，由于小鼠OPN在与人OPN的氨基酸序列相同的位置上存在小鼠的整合素识别的RGD序列和SLAYGLR序列，作为同时封闭这两个序列的抗体，获得了M5抗体。包含RGD序列的GRGDSP肽可抑制M5抗体与小鼠OPN及其凝血酶消化物的结合，另外可确认M5抗体可抑制用TNF-α活化的小鼠脾细胞来源的单核细胞的迁移。用小鼠的颅盖(calvaria)器官培养体系进行研究，可观察到M5抗体具有骨破坏的抑制作用。另外，将上述抗体用于小鼠的胶原关节炎模型，显示明显的治疗效果。
以上结果提示，同时阻断RGD序列、SVVYGLR序列与人整合素结合的抗体，抑制OPN与整合素的结合，对类风湿性关节炎等的治疗有效。还提示，不仅对青年性关节性风湿病和慢性风湿病有效，而且对银屑性关节炎和银屑病的治疗有效。另外，器官移植后的慢性排斥以血管和气管支的闭塞性病变为特征，从组织学的观察考虑，T细胞和巨噬细胞的活化可引起细胞因子、增殖因子的产生，血管内皮细胞障碍，并因血管平滑肌的增殖引起纤维化等，有可能向血管闭塞发展(P.Freese等，(2001)Nephrol Dial Transplant，16，2401-2406/J.R.Waller等，(2001)British Journal of Surgery，88，1429-1441/S.R.Lehtonen等，(2001)Transplantation，72，1138-1144)。有报道说OPN作为巨噬细胞活化和血管平滑肌纤维化的必需蛋白而发挥作用(A.O’Regan等，(2000)Int J Exp Pathol，81，373-390)。本发明的OPN抑制抗体通过抑制单核细胞和中性粒细胞的迁移，有可能抑制向纤维化的过程。因此，该抗体抑制脏器移植后的慢性排斥反应，参与器官粘附，另外对全身性自身免疫性疾病、红斑、葡萄膜炎、贝赫切特疾病、多发性肌炎、丝状体增殖性肾炎、结节病等自身免疫性疾病的治疗有效。
基于以上发现，本申请人们发现了抗骨桥蛋白抗体，它能抑制识别RGD序列的整合素与骨桥蛋白或其片段的结合，且可抑制识别SVVYGLR或其相应序列的整合素与骨桥蛋白或其片段的结合。对该抗体进行了国际专利(PCT/JP02/03382)。
发明公开上述抗骨桥蛋白抗体，为小鼠来源的抗体(以下称作“小鼠抗体”)，与人的骨桥蛋白有很强的亲和性，可抑制骨桥蛋白的末梢血单核细胞或中性粒细胞的游走活性。期望该小鼠抗体可作为以人风湿病为代表的各种炎症性疾病的治疗药，但由于小鼠抗体来源于小鼠，从诱导抗原性的安全性和半衰期的缩短等有效性观点考虑，很难施用给人。
因此，本发明者们应用基因工程学方法，在不降低小鼠抗体活性的条件下对上述小鼠抗体进行了改变，获得抗原性问题更少的骨桥蛋白抗体。
也就是说，本发明提供以下[1.]-[45.]的发明。
一种抗骨桥蛋白抗体或源于该抗体的抗体片段，它能抑制识别RGD序列的整合素与骨桥蛋白或其片段的结合，且可抑制识别SVVYGLR序列的整合素与骨桥蛋白或其片段的结合。
[1.]中的抗骨桥蛋白抗体，它是用包含部分氨基酸序列RGDSVVYGLRS的肽作为抗原而获得的。
[1.]或[2.]中的抗骨桥蛋白抗体，它是用肽VDTYDGRGDSVVYGLRS作为抗原而获得的。
[1.]-[3.]任一项中的抗骨桥蛋白抗体，它是单克隆抗体。
[1.]-[3.]任一项中的抗骨桥蛋白抗体，它是嵌合抗体。
[5.]中的抗骨桥蛋白抗体，具有以下重链(a)和轻链(b)。
(a)具有鼠源重链可变区和人源重链恒定区的重链；(b)具有鼠源轻链可变区和人源轻链恒定区的轻链。
[5.]或[6.]中的抗骨桥蛋白抗体，其特征在于，其重链(a)的小鼠来源的重链可变区具有SEQ ID NO19中的氨基酸序列。
[5.]或[6.]中的抗骨桥蛋白抗体，其特征在于，其轻链(b)的小鼠来源的轻链可变区具有SEQ ID NO20中的氨基酸序列。
[5.]或[6.]中的抗骨桥蛋白抗体，其中重链(a)的重链恒定区为人Igγ1。
[5.]或[6.]中的抗骨桥蛋白抗体，其中轻链(b)的轻链恒定区为人Igκ。
[1.]-[3.]任一项中的抗骨桥蛋白抗体，它是人化抗体。
[11.]中的抗骨桥蛋白抗体具有以下重链(c)和轻链(d)(c)具有小鼠来源的重链可变区重链可变区和人源重链恒定区的重链；(d)具有小鼠来源的轻链可变区的互补性决定区域及人源轻链可变区的构架区域的轻链可变区和人源轻链恒定区的轻链。
[11.]或[12.]中的抗骨桥蛋白抗体，其特征在于，其重链(c)的小鼠来源的重链可变区的互补性决定区域具有SEQ ID NO21-23中的氨基酸序列。
[11.]或[12.]中的抗骨桥蛋白抗体，其特征在于，其轻链(d)的小鼠来源的轻链可变区的互补性决定区域具有SEQ ID NO24-26中的氨基酸序列。
[11.]或[12.]中的抗骨桥蛋白抗体，其特征在于，其重链(c)的重链可变区具有SEQ ID NO28中的氨基酸序列。
[11.]或[12.]中的抗骨桥蛋白抗体，其特征在于，其轻链(d)的轻链可变区具有SEQ ID NO30中的氨基酸序列。
[11.]或[12.]中的抗骨桥蛋白抗体，其重链(c)的重链恒定区为人Igγ1。
[11.]或[12.]中的抗骨桥蛋白抗体，其轻链(d)的轻链恒定区为人Igκ。
编码SEQ ID NO19中记载的氨基酸序列的碱基序列。
编码SEQ ID NO20中记载的氨基酸序列的碱基序列。
编码SEQ ID NO28中记载的氨基酸序列的碱基序列。
编码SEQ ID NO30中记载的氨基酸序列的碱基序列。
具有[19.]中碱基序列和人Igγ1基因的载体。
具有[20.]中碱基序列和人Igκ基因的载体。
具有[21.]中碱基序列和人Igγ1基因的载体。
具有[22.]中碱基序列和人Igκ基因的载体。
用[23.]和[24.]中记载的载体转化的宿主细胞。
用[25.]和[26.]中记载的载体转化的宿主细胞。
抗骨桥蛋白嵌合体抗体的制备方法，是[5.]或[6.]中记载的抗骨桥蛋白嵌合体抗体的制备方法，其特征在于，培养[27.]中的宿主细胞，从培养液中收集抗骨桥蛋白嵌合体抗体。
抗骨桥蛋白人源化抗体的制备方法，是[11.]或[12.]中记载的抗骨桥蛋白人源化抗体的制备方法，其特征在于，培养[28.]中的宿主细胞，从培养液中收集抗骨桥蛋白人源化抗体。
一种自身免疫性疾病的治疗剂，它包含[1.]-[6.]或[11.]或[12.]任一项中的抗体或由该抗体产生的抗体片段作有效成分。
一种风湿病的治疗剂，它包含[1.]-[6.]或[11.]或[12.]任一项中的抗体或由该抗体产生的抗体片段作有效成分。
一种类风湿性关节炎的治疗剂，它包含[1.]-[6.]或[11.]或[12.]任一项中的抗体或由该抗体产生的抗体片段作有效成分。
一种变形性关节炎的治疗剂，它包含[1.]-[6.]或[11.]或[12.]任一项中的抗体或由该抗体产生的抗体片段作有效成分。
一种自身免疫性疾病的治疗方法，其特征在于，给自身免疫性疾病的患者施用[1.]-[6.]或[11.]或[12.]任一项中的抗体或由该抗体产生的抗体片段。
一种类风湿病的治疗方法，其特征在于，给类风湿病的患者施用[1]-[6.]或[11.]或[12.]任一项中的抗体或由该抗体产生的抗体片段。
一种类风湿性关节炎的治疗方法，其特征在于，给类风湿性关节炎的患者施用[1.]-[6.]或[11.]或[12.]任一项中的抗体或由该抗体产生的抗体片段。
一种变形性关节炎的治疗方法，其特征在于，给变形性关节炎的患者施用[1.]-[6.]或[11.]或[12.]任一项中的抗体或由该抗体产生的抗体片段。
[1.]-[6.]或[11.]或[12.]任一项中的抗体或由该抗体产生的抗体片段在制备自身免疫性疾病治疗剂中的应用。
[1.]-[6.]或[11.]或[12.]任一项中的抗体或由该抗体产生的抗体片段在制备风湿病治疗剂中的应用。
[1.]-[6.]或[11.]或[12.]任一项中的抗体或由该抗体产生的抗体片段在制备类风湿性关节炎治疗剂中的应用。
[1.]-[6.]或[11.]或[12.]任一项中的抗体或由该抗体产生的抗体片段在制备变形性关节炎治疗剂中的应用。
一种自身免疫性疾病治疗剂的筛选方法，其特征在于，评价待检化合物对骨桥蛋白的RGD序列与整合素结合和/或SVVYGLR序列与整合素结合的抑制程度。
一种风湿病治疗剂的筛选方法，其特征在于，评价待检化合物对骨桥蛋白的RGD序列与整合素结合和/或SVVYGLR序列与整合素结合的抑制程度。
一种类风湿性关节炎治疗剂的筛选方法，其特征在于，评价待检化合物对骨桥蛋白的RGD序列与整合素结合和/或SVVYGLR序列与整合素结合的抑制程度。
附图简述

图1表示对OPN的RGD依赖性细胞粘附的抑制图。
图2表示小鼠2K1抗体对α9转化的SW480细胞与nOPN的RGD依赖性及RGD非依赖性细胞粘附的抑制。
图3a表示OPN诱导细胞迁移的图。
图3b表示通过抗体抑制OPN诱导的细胞迁移的图。
图4表示给OPN基因缺陷的小鼠和正常小鼠分别施用诱发关节炎的抗体鸡尾酒/LPS时，关节炎分数随时间的变化图。
图5表示给OPN基因缺陷的小鼠和正常小鼠分别施用诱发关节炎的抗体鸡尾酒/LPS时手腕肿胀的比较图。
图6a表示以小鼠2K1抗体为分析物时，BIACORE-2000的传感器图。
图6b表示以嵌合2K1抗体为分析物时，BIACORE-2000的传感器图。
图7表示小鼠2K1抗体与模板人抗体的比较图。
图8表示小鼠2K1抗体与模板人抗体的VL氨基酸序列的比较图。
图9表示人源2K1抗体的VH氨基酸序列及编码该氨基酸序列的碱基序列。
图10表示人源2K1抗体的VL氨基酸序列及编码该氨基酸序列的碱基序列。
图11表示扩增人源2K1抗体的VH氨基酸序列时设计的引物。
图12表示扩增人源2K1抗体的VL氨基酸序列时设计的引物。
图13表示不同浓度的人源2K1抗体和嵌合2K1抗体对骨桥蛋白肽的结合活性。
图14表示小鼠OPN与NIH3T3的浓度依赖性粘附。
图15表示GRGDSP肽抑制小鼠OPN与NIH3T3的粘附。
图16表示M15抗体对小鼠OPN与NIH3T3的粘附抑制。
实施发明的最佳状态本发明的抗骨桥蛋白嵌合抗体及抗骨桥蛋白人源化抗体的获得是例如用基因工程学方法将抑制国际专利(PCT/JP02/03382)中记载的识别RGD序列的整合素与骨桥蛋白或其片段的结合，且抑制识别SVVYGLR序列及其相应序列的整合素与骨桥蛋白或其片段的结合的抗骨桥蛋白小鼠抗体(以下，称作“OPN抑制抗体”)改变成与其恒定区为治疗对象的人或动物的抗体具有相同恒定区的嵌合抗体(参照欧洲专利公开公报EP0125023)或人源化抗体(参照欧洲专利公开公报EP0239400或EP045126)。
各种类型的抗体分子有相同的基本结构，由分子量5-7万的重链和分子量2-3万的轻链构成。重链通常由含大约440个氨基酸的多肽链构成，各类具有其特征性的结构，IgG、IgM、IgA、IgD、IgE分别对应γ、μ、α、δ、ε链。IgG存在IgG1、IgG2、IgG3、IgG4 4种，分别称作γ1、γ2、γ4、γ4。轻链通常由含大约220个氨基酸的多肽链构成，有L型和K型两种，分别对应λ、κ链。抗体分子基本结构的肽构成是分别具有相同的2条重链和2条轻链，靠二硫键结合(S-S结合)和非共价结合结合而成，分子量15-19万。2种轻链可与任何重链相对应。每个抗体分子通常由2条相同的轻链和2条相同的重链组成。
链内S-S结合在重链有4个(μ、ε链5个S-S结合)，轻链两个，在100-110残基间形成一个环，这种立体结构在各环间类似，称作结构单位或功能区。位于重链、轻链N末端的功能区，即便是同种动物的同一型(亚型)的样品，其氨基酸序列也不同，称作可变区(V区，可变区)(各功能区分别用VH、VL表示)。从该功能区到C末端侧的氨基酸序列在各型或亚型基本一致，称作恒定区(C区，恒定区)(各功能区分别用CH1、CH2、CH3或CL表示)。
抗体的抗原决定部位由VH和VL构成，其结合特异性由该部位的氨基酸序列决定。另一方面，补体与各种细胞结合的生物学活性反映了各类型Ig C区结构的差异。已知，轻链和重链可变区的可变性几乎由存在于两种链中的3个小的超变区(hypervariable region)所限定，将该区域称作互补性决定区域(CDR，complementaritydetermining region)。可变区的剩余部分称作构架区(FR，frameworkregion)，比较恒定。通常，仅各可变区的互补性决定区域中的5-10个氨基酸形成抗原结合部位。
利用小鼠型的与抗原反应的可变区，其它部分利用人型的蛋白质叫做嵌合抗体。这里，还将识别骨桥蛋白及其片段的嵌合抗体叫做抗骨桥蛋白嵌合抗体。此外，将抗原特异性的小鼠单克隆抗体分子的互补性决定区域(抗原结合部位)以外的区域全部置换成人免疫球蛋白分子的氨基酸的基因重组蛋白质叫做人源化抗体。这里，还将识别骨桥蛋白及其片段的人源化抗体叫做抗骨桥蛋白人源化抗体。
用于制备本发明的抗骨桥蛋白嵌合抗体和抗骨桥蛋白人源化抗体的OPN抑制抗体，只要能抑制识别RGD序列的整合素，如αVβ3、αVβ1和αVβ5，与OPN-a、OPN-b、OPN-c或其N端片段的结合，且能抑制识别SVVYGLR序列的整合素，如α9β1、α4β1、α4β7，与OPN-a、OPN-b、OPN-c或其N端片段的结合，任何抗体都可。SVVYGLR序列或其相应序列是指人OPN162位丝氨酸到168位精氨酸间的序列，其相应序列是指其它哺乳动物中与OPN的SVVYGLR序列相应的序列，例如猪中与人相同SVVYGLR，猴中为SVAYGLR，小鼠和大鼠中为SLAYGLR，牛中为SVAYGLK，兔中为SVAYRLK。
对OPN抑制抗体的制备方法无特殊限制，只要抗体能保持上述性质即可，例如以OPN-a、OPN-b、OPN-c和其N端片段，或含氨基酸序列RGDSVVYGLR序列或其相应序列的肽(以下，将之总称为“OPN相关肽”)作抗原进行制备。这里所讲的OPN片段是指用蛋白水解酶对OPN进行水解产生的片段，例如用凝血酶水解产生的片段。
上述OPN抑制抗体，优选用含RGDSVVYGLR序列的肽作抗原制备而得。更优选，例如用连续拥有这两个序列的OPN-a的153位缬氨酸残基到169位丝氨酸残基的肽(VDTYDGRGDSVVYGLRS)作抗原，按以下方法处理而得的抗体。为了提高抗原性，优选将上述OPN相关肽与生物大分子化合物结合形成的结合物作抗原。
另外，进行与OPN相关疾病等研究时，用小鼠作实验动物，应用与小鼠OPN相对应的OPN抑制抗体，优选应用含RGDSLAYGLR序列的肽作抗原制备而得的抗体。
与上述OPN相关肽结合的生物大分子化合物的实例有匙孔虫戚血蓝蛋白(以下，称作KLH)，卵白蛋白(以下称作OVA)，牛血清白蛋白(以下，称作BSA)，兔血清白蛋白(以下，称作RSA)，甲状腺球蛋白等，其中优选KLH和甲状腺球蛋白。
上述OPN相关肽与生物大分子化合物的结合可通过众知的方法进行，如混合酸脱水物法(B.F.Erlanger等，(1954)J.Biol.Chem.，234，1090-1094)或活化酯法(A.E.Karu等，(1994)J.Agric.Food Chem.，42，301-309)等。
混合酸脱水物法中应用的混合酸脱水物的制备是将OPN相关肽进行常规的Schotten-Baumann反应，然后与生物大分子化合物进行反应，从而获得目的产物肽-大分子化合物结合体。该混合酸脱水物法中应用的卤化蚁酸酯包括，如甲基氯蚁酸、甲基溴蚁酸、乙基氯蚁酸、乙基溴蚁酸、异丁基氯蚁酸等。该方法中使用的肽和卤化蚁酸酯与高分子化合物的比例可在一宽范围内适当选择。Schotten-Baumann反应在碱性化合物的存在下进行，该反应中所应用的碱性化合物是Schotten-Baumann反应中常用的化合物，例如三乙基胺、三甲基胺、吡啶、二甲基苯胺、N-甲基吗啉、diazabicyclononene(DBN)、diazabicycloundecene(DBU)、diazabicyclooctane(DABCO)等有机盐，碳酸钙、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸氢钾等无机盐等。
上述反应通常在-20℃到100℃进行，优选0℃到50℃进行；反应时间5分钟-10小时左右，优选5分钟-2小时。
所得混合酸脱水物与生物大分子化合物进行的反应通常在-20℃到150℃进行，优选0℃-100℃进行；反应时间5分钟-10小时左右，优选5分钟-5小时。混合酸脱水物法在普通溶剂中进行，可使用混合酸脱水物法中惯用的任何溶剂，具体而言，如二氯甲烷、氯仿、二氯乙烷等卤化的碳氢化合物，苯、甲苯、二甲苯等芳香族碳氢化合物，二乙基酯、二噁烷、四氢呋喃和二甲氧基乙烷等醚类，甲基醋酸、乙基醋酸等酯类，N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、六甲基三磷酸酰胺等非质子性极性溶剂。
另一方面，活化酯法一般如下进行。首先，将OPN相关肽溶剂到有机溶剂中，在偶联剂的存在下与N-羟基丁二酰胺反应，生成N-羟基丁二酰胺活化酯。
可使用缩合反应中惯用的偶联剂作为偶联剂使用，例如二环己基碳化二亚胺、羰基二咪唑、水溶性的碳化二亚胺等。另外，作为有机溶剂可使用，例如N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜和二噁烷等。反应中使用的肽与N-羟基丁二酰胺等偶联剂的摩尔比优选1∶10-10∶1，最优选1∶1。反应温度0-50℃，优选22-27℃，反应时间为5分钟-24小时，优选1-2小时。反应温度可在各自的熔点以上沸点以下进行。
偶联反应后，将反应液加到溶解了生物大分子化合物的溶液中进行反应，例如当生物大分子化合物有游离的氨基时，该氨基与肽的羧基间生成酸酰胺键。反应温度0-60℃，优选5-40℃，更优选22-27℃，反应时间为5分钟-24小时，优选1-16小时，更优选1-2小时。
通过透析、脱盐柱等对上述OPN相关肽与生物大分子化合物的反应物进行纯化，可获得OPN相关肽与生物大分子化合物的结合物(以下，简称“结合物”)。
以下，对应用上述所得结合物作抗原的抗体的制备方法及应用该抗体进行免疫化学测定的方法进行说明。另外，可适当应用众知的方法进行抗体的制备，如续生化学实验讲座、免疫生化学研究法(日本生化学会编)中记载的方法。
使用上述结合体制备本发明的多克隆抗体时，用该结合物免疫动物，然后从动物获取抗体即可。
即，首先，如将OPN相关肽-甲状腺球蛋白结合物等结合物溶解到磷酸钠缓冲液(以下，称作“PBS”)中，然后与氟氏完全佐剂或氟氏不完全佐剂或明矾等辅助剂混合，作为免疫原，免疫哺乳动物。
可使用该技术领域中经常使用的任何动物进行免疫，如小鼠、大鼠、兔子、羊、马等。另外，免疫时免疫原的施用途径可以是皮下注射、腹腔内注射、静脉内注射、肌肉内注射等任一种途径，但优选皮下注射或腹腔内注射。可以免疫一次，也可以适当的间隔多次免疫，优选以1周-5周的间隔多次免疫。然后，按常规方法，从免疫动物中采血，分离血清，纯化出多克隆抗体级分，从而获得OPN抑制抗体。
另外，可按常规方法，将用上述结合物免疫动物而得的免疫细胞与骨髓瘤细胞融合，得到杂交瘤，从杂交瘤培养物中收集抗体，可获得OPN抑制抗体的单克隆抗体。
本发明的抗骨桥蛋白嵌合抗体和抗骨桥蛋白人源化抗体的制备，可以上述单克隆的OPN抑制抗体或该抗体的杂交瘤为基础，参照上述的欧洲专利公开公报EP0125023、欧洲专利公开公报EP0239400、EP045126等进行，但本发明中特别希望依照国际公开公报WO94/20632中记载的方法从小鼠抗体制备嵌合抗体或人源化抗体。
例如，治疗对象为人，OPN抑制抗体的产生动物为小鼠时，希望应用小鼠抗体的可变区与人抗体恒定区连接的抗体(以下称之为“嵌合抗体”)和主要将小鼠抗体可变区中互补性决定区域移植给人抗体的抗体(以下称之为“人源化抗体”)。此外，为了产生抗体，可应用导入了嵌合抗体基因或人源化抗体基因的转基因动物的方法，应用噬菌体库显示技术(phage display)的方法。
如此所得OPN抑制抗体可直接应用，也可应用这样的蛋白质-由至少有构成该抗体的重链和/或轻链的多肽的一部分，且具有抗原结合活性的多肽链构成，或可应用OPN抑制抗体产生的抗体片段，如单链抗体(scFv)、Fab和F(ab’)2等抗体片段。
具体而言，从小鼠抗体制备嵌合抗体时，首先按常规方法从产生抗体的杂交瘤(例如实施例2中的杂交瘤(FERM BP-7883))中克隆小鼠抗体的可变区基因，测定其碱基及其编码的氨基酸序列。将如此测定的小鼠抗体可变区基因与抗体的引导序列等与人抗体的适当型的恒定区基因连接，优选与IgG型抗体的恒定区基因连接，由此制备嵌合抗体基因。
接着，将该嵌合抗体基因连接到适当的表达载体中，导入培养细胞中。最后，培养该培养细胞，从培养上清中获得嵌合抗体。
用对应于小鼠抗体引导序列和J区的引物，通过PCR扩增如上确定的小鼠抗体的可变区基因，获得可变区基因片段。为了进行克隆，优选将限制性酶的识别部位连接到可变区基因片段的两端。
将上述所得基因片段于人抗体的恒定区基因连接，制备成嵌合抗体基因(以下，简称“嵌合抗体基因”)。该组合非特别地组合，只要最终能表达抗原结合活性的组合即可，根据需要可选择任何类型的恒定区(例如，γ1、γ2、γ3或γ4重链，λ或κ轻链的恒定区)。另外，可与为了增强或减低恒定区的功能而设计的恒定区基因组合。
可使用国际公开公报WO94/20632记载的AG-γ1和AG-κ等表达载体作为与上述所得嵌合抗体基因连接的表达载体，只要是能表达嵌合抗体基因即可，对其无特殊限制。若利用AG-γ1和AG-κ等已有Ig基因的表达载体的话，仅插入上述小鼠的可变区基因即可获得具有嵌合抗体基因的表达载体。
上述表达载体可通过，如磷酸钙法等导入培养细胞中。
可使用，如CHO-DG44细胞等培养细胞作为导入表达载体的培养细胞，按照常规方法对其进行培养。
培养后，在培养上清中累积的嵌合抗体可以被不同的层析法纯化，例如用蛋白A柱纯化。
如此所得嵌合抗体的抗原活性可通过，如应用骨桥蛋白肽等的ELISA和BIAcore(BIAcore公司)进行测定。
另外，本发明中，如按照以下说明的方法可制备出比上述嵌合抗体更接近人抗体的人源化抗体。
具体而言，从小鼠抗体制备人源化抗体时，首先按照Kabat等的分类方法确定小鼠抗体的可变区中互补性决定区域(CDR)的氨基酸(Immunological Interest 4thed.，Public Health Service，NIH，WashingtonDC，1987)。将小鼠抗体的可变区中以CDR为中心的氨基酸移植到人抗体模板中，设计出具有小鼠抗体CDR和人抗体构架的可变区氨基酸序列。设计编码该可变区氨基酸序列的DNA的碱基序列，通过PCR法及基因重组技术制备具有所设计的核酸序列的可变区基因片段。然后，将该可变区基因与人抗体的适当型的恒定区基因连接，优选与IgG型抗体的恒定区基因连接，由此制备人源化抗体基因。接着，将该人源化抗体基因连接到适当的表达载体，导入培养细胞中。最后，培养该培养细胞，从培养上清中获得人源化抗体。
上述人源化抗体的制备方法中，小鼠抗体可变区基因中的互补性决定区域的基因可在嵌合抗体的制备中明确的小鼠抗体可变区基因的基础上进行确定，根据Kabat分类，在互补性决定区域的范围内。
另外，选择与上述小鼠抗体构架区的氨基酸序列同源性高的序列，如选自人抗体种系(germline)，按常规方法制备编码该氨基酸序列的碱基序列，将之作为成为模板的人抗体构架区基因。
连接上述小鼠抗体互补性决定区域的基因和成为模板的人抗体构架区基因，与嵌合抗体的制备同样制备基因片段。将该基因片段与人源化抗体的恒定区基因连接，制备人源化抗体基因(以下，简称“人源化抗体基因”)。
制备好人源化抗体基因，随后人源化抗体基因的表达载体的导入，表达载体向培养细胞的导入，培养细胞的培养，抗体的纯化等，与上述嵌合抗体的制备同样进行。
通常，多数情况下，仅置换了互补性决定区域的氨基酸的人源化抗体其抗原结合活性比原来的小鼠抗体低。因此，原小鼠抗体及互补性决定区域周边的几个氨基酸经常一起移植。再者，为了增加结合活性、提高亲和性，不仅可改变构架区而且可改变可变区的氨基酸序列(1个或多个氨基酸置换、插入、缺失等)，如此制备的抗体也包含在本发明的人源化抗体中。
以人抗体为模板，移植小鼠抗体互补性决定区域为中心的氨基酸序列，制备表达可变区的基因，用与制备上述嵌合抗体时同样的制备方法获得人源化抗体。
上述嵌合抗体及人源化抗体(以下称作“重组OPN抑制抗体”)具有与源小鼠抗体同等的抗原活性，且解决了诱导抗原性和半衰期缩短等问题。
必要时可对所得重组OPN抑制抗体进行纯化，然后按常规方法进行制剂化，可用于类风湿性关节炎、幼年性关节风湿病和慢性风湿病等风湿病、银屑性关节炎、银屑病等的治疗，脏器移植后的慢性排斥反应的抑制，全身性自身免疫性疾病、红斑、葡萄膜炎、贝赫切特疾病、多发性肌炎、丝状体增殖性肾炎、结节病等自身免疫性疾病的治疗。
本发明的重组OPN抑制抗体优选可作为风湿病治疗剂或类风湿性关节炎治疗剂应用。风湿病治疗剂等的剂型的实例可以是注射剂、点滴剂等非经口剂，优选静脉内施用、皮下施用等(作为自身免疫性疾病治疗剂时也可参照该标准)。对于制剂化而言，可在药学允许的范围内使用与其剂型相对应的载体和添加剂。
上述制剂化中重组OPN抑制抗体的添加量根据患者症状的轻重、年龄和所使用的制剂的剂型或重组OPN抑制抗体的结合力等而有所差异，例如0.1mg/kg-100mg/kg。
如此所得本发明的治疗剂，其有效成分重组OPN抑制抗体与OPN的RGD序列和SVVYGLR序列强力结合，通过抑制OPN该部分与整合素的结合，结果能压制风湿病、类风湿性关节炎及其之外的自身免疫性疾病的症状的恶化。
因为本发明的重组OPN抑制抗体与OPN侧而非整合素侧特异性结合，所以很少抑制整合素的其它重要的功能，从而避免了整合素副作用的问题。
本发明的重组OPN抑制抗体也可用于筛选自身免疫性疾病治疗剂的目的。即，如前所述，抑制OPN的RGD序列与整合素的结合及SVVYGLR序列与整合素的结合的化合物，可成为自身免疫性疾病的治疗剂。例如，在存在一定量的重组OPN和整合素的测定体系内构成竞争性添加被筛选物质(待检物质)与重组OPN抑制抗体的反应体系，测定所使用量的重组OPN抑制抗体对OPN-整合素间结合的抑制程度，从而评价待检物质作为自身免疫性疾病治疗剂利用的可能性。
同样，抑制OPN的RGD序列与整合素的结合及SVVYGLR序列与整合素的结合的化合物可作为风湿病乃至类风湿性关节炎的治疗剂，应用重组OPN抑制抗体，构成与上面同样的反应体系，可用于风湿病乃至类风湿性关节炎的筛选。
再者，本发明的重组OPN抑制抗体可作为风湿病诊断剂利用。如前所述，已明确类风湿性关节炎患者的关节中可发现高浓度的经凝血酶酶切产生的OPN的N末端片段。因此，应用该重组OPN抑制抗体测定检测体系中OPN或其N末端片段的量，有利于风湿病的诊断。作为其检测手段，可利用放射性同位素免疫测定法(RIA法)、ELISA法(E.Engvall等，(1980)Methods in Enzymol.，70，419-439)、荧光抗体法、空斑法、斑点法、凝集法、二维双向扩散(Ouchterlony)等普通免疫化学测定法中使用的各种方法(“杂交瘤法和单克隆抗体”，R&D Planning发行，第30-53页，1982年3月5日)。
可根据不同的出发点适当选择上述方法，但从灵敏度、简便性等考虑的话，优选ELISA法。较优选的方法的具体例，如将本发明的重组OPN抑制抗体固化到载体上，通过标记识别OPN的部位不同于本发明的重组OPN抑制抗体的抗体，可检测出OPN或其N末端的片段，该方法可用于类风湿性关节炎的诊断药。
标记上述抗体所使用的标记物包括辣根过氧化物酶(以下称作“HRP”)、碱性磷酸酶(以下称作“AP”)等酶，异硫氰酸、罗丹明等荧光物质，32P、125I等放射性物质，化学发光物质等。
更具体的OPN同种型的检测方法，以夹心法为例，其程序如下。即，首先(a)将针对本发明的OPN同种型的抗体固化到载体上，接着(b)用与抗原无关的物质，如蛋白质封闭未固化上抗体的载体表面。(c)加入含各种浓度的OPN同种型的待检体，生成OPN同种型-抗体复合体后，(d)加入标记了的抗OPN同种型抗体，与固化的抗原-抗体复合体结合，最后(e)通过测定结合到载体上的标记量，根据预先制备的含量曲线来确定待检体中游离的OPN同种型的含量。
首先，步骤(a)中，对用于固化抗体所使用的载体无特殊限制，可使用免疫化学测定法中常用的任何载体。例如，聚苯乙烯制的96孔微滴度板，或氨基结合型微滴度板。另外，固化抗体时，可将含有抗体的缓冲液加到载体上，进行温育。可使用众知的缓冲液，例如10mM的PBS。缓冲液中抗体的浓度可在一宽范围内选择，通常0.01-100μg/ml，优选0.1-20μg/ml。另外，缓冲液的量，使用96孔微滴度板作载体时，每孔300μl以下，更优选20-150μl/孔。再者，对温育的条件无特殊限制，通常4℃一晚。
由于后面的步骤中添加的待检体中的OPN存在与抗原抗体反应无关的吸附到载体的部分，所以步骤(b)中封闭的目的是防止这样的非特异性吸附。作为封闭剂可使用如，牛血清白蛋白(BSA)和脱脂奶粉溶液作为封闭剂。或使用Block-Ace(Block-Ace，大日本制药，邮编UK-25B)等市售的封闭剂。具体而言，无特殊限制，例如固化抗原的过程中可适量添加Block-Ace，4℃孵育一晚后，用缓冲液洗涤。作为缓冲液无特殊限制，例如10mM PBS(pH7.2)、0.8％(w/v)NaCl、0.02％(w/v)KCl、0.02％(v/v)Tween 20构成的缓冲液。
步骤(c)中，通过让含OPN同种型的待检体与固化抗体接触，用固化抗体捕捉OPN同种型，生成固化抗体-OPN同种型复合体。反应无特殊限制，37℃大约1小时即可。反应终了后，用缓冲液洗涤载体，洗去未反应的蛋白质。该反应中所应用的缓冲液，优选由10mMPBS(pH7.2)、0.05％(v/v)Tween 20构成。
步骤(d)中，加入识别固化抗体捕捉到的OPN同种型的其它表位的标记抗体，形成固化抗体-OPN同种型-标记抗体复合体。反应终了后，用缓冲液洗涤载体，洗去未反应的蛋白质。该反应中应用的缓冲液与(c)中相同。
步骤(d)中所使用的标记抗体，要求它识别与(a)中的固化抗体不同的表位。例如，应用识别OPN同种型前半区域的多克隆抗体作为固化抗体时，优选识别OPN同种型后半区域的多克隆抗体作为结合了酶(例如HRP或AP)的标记抗体。由于应用识别不同表位的抗体，可高灵敏度且特异地测定由选择性剪切而生成的OPN同种型。
步骤(d)中所使用的标记抗体的量，大约是结合到载体上的固化抗体的5000-10000倍，优选最终测定时，最大吸光度达1.5-2.0的这样稀释度的标记抗体进行反应。稀释时可应用缓冲液，对反应无限定，大约37℃进行30分钟，反应后，用缓冲液洗涤。通过以上反应，抗体-OPN同种型-标记抗体复合体结合到载体上。
最后，步骤(e)中，加入与固化抗体-OPN同种型-标记抗体复合体的标记物质反应的显色底物溶液，测定吸光度，根据标准曲线算出OPN的含量。
使用过氧化物酶作为标记抗体的标记物时，可使用，例如含过氧化氢和3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)或邻苯二胺(OPD)的显色底物溶液。对显色反应无限定，加入显色底物溶液，25℃反应20分钟后，加入1N硫酸终止酶反应。使用TMB时，根据450nm的吸光度测定显色。另一方面，使用酶AP作为标记物时，用对硝基酚磷酸(p-NPP)作底物进行显色，加入2N NaOH终止酶反应，测定415nm的吸光度。
添加已知浓度的OPN同种型，根据反应液的吸光度预先制作出标准曲线，由此计算出待检体中的OPN同种型的浓度。
上述本发明的OPN同种型的检测方法，可用于阐明OPN的作用和OPN相关疾病的诊断、治疗。作为其使用方法的一实例列举，通过区别检测凝血酶酶切的OPN N端片段和非切断型OPN，检测出有无炎症异常，例如区别风湿病和变形性关节炎的炎症异常的检测试剂盒。
如上所述，在类风湿性关节炎患者的关节腔内有尤其是经凝血酶酶切产生的OPN N端片段浓度增高的趋势，但变形性关节炎患者中这种趋势显著性低。由于关节腔内N末端片段占OPN的比例依患者而不同，所以为了区别诊断风湿病和变形性关节炎，可测定总OPN中N末端片段所占的比例。
更具体的实例，OPN的3种同种型OPN-a、OPN-b和OPN-c中共同存在以下3种序列，分别制备与这些肽相对应的抗体。
CVDTYDGRGDSVVYGLRS(C+V153至S169) (1)KSKKFRRPDIQYPDATEC(K170至E187C) (2)IPVKQADSGSSEEKQC(117至Q31+C)(3)其中，序列(1)存在于凝血酶酶切部位的N末端侧，普遍存在于凝血酶非切断型全长OPN与N末端侧片段上。另一方面，序列(2)存在于凝血酶酶切部位的C末端侧，存在于凝血酶非切断型全长OPN中，而在N末端侧片段上不含有。另外，序列(3)对应OPN N端侧17-31氨基酸残基，普遍存在于凝血酶非切断型全长OPN与N末端侧片段上。作为鉴别风湿病患者和变形性关节炎患者的诊断试剂盒，利用与上述3种序列的肽分别相对应的抗体，由2种免疫检测试剂构成。即用与上述序列(3)和(2)代表的肽相对应的抗体作为第一种免疫检测试剂，对待检体中两种抗体共同识别的凝血酶非切断型OPN进行定量。此时，将与序列(3)的肽相对应的抗体固化到载体上，与患者来源的待检体反应，洗涤后，作为标记抗体加入与序列(2)的肽相对应的抗体，用与前面夹心法同样的方法进行检测。另外，用与上面序列(3)和(1)代表的肽相对应的2种抗体作为第二种免疫检测试剂，对待检体中两种抗体共同识别的凝血酶非切断型OPN和经凝血酶酶切而生成的N末端侧片段的总量进行定量。此时，例如将与序列(1)的肽相对应的抗体固化到载体上，与患者来源的待检体反应，洗涤后，作为标记抗体加入与序列(3)的肽相对应的抗体，用与前面夹心法同样的方法进行检测。比较同一患者待检体用上述2种免疫检测试剂检测所得结果，可表明该患者中经凝血酶酶切而生成的N末端侧片段占总OPN的比例，以区分风湿病和变形性关节炎。
实施例以下列举实施例和参考例进一步详细说明本发明，但本发明并不限定于此。本实施例中应用市售试剂盒或试剂的部分，按照所附说明书进行，除非有特殊说明。
实施例1GST-OPN融合蛋白的克隆、构建、纯化及试剂基本上按照文献(S.Kon等，(2000)J.Cell.Biochem.，77，487-498)中记载的方法进行克隆和蛋白纯化。如下获得人OPN的同种型a，b的cDNA。以从人肾癌细胞株NRC-12细胞制备的RNA为模板合成cDNA，以它为模板，应用下面的OPN-5、OPN-3引物进行PCR，分别获得编码包括信号肽区域的人OPN-a、OPN-b全长的cDNA。
接着，按文献中记载的方法，将如此克隆出的OPN-a、OPN-b cDNA插入到pGEX4T载体(Amersham Pharmacia Biotech)中，使其与GST(谷光甘肽S-转移酶，EC2.5.1.18)基因的读码框一致，用大肠杆菌JM109表达GST融合蛋白(以下，将如此而得的GST-OPN融合蛋白分别叫做GST-OPN-a、GST-OPN-b)。
OPN-55′-CGGGATCCACTACCATGAGAATTGCAGTGATTTGC-3′OPN-35′-CCGCTCGAGTTAATTGACCTCAGAAGATGCACTATC-3′以上述OPN-a cDNA为模板，通过二步PCR制备编码人OPN-c同种型cDNA。第一步用OPN-5和下面的OPNct-3引物，下面的OPNct-5和OPN-3引物分别进行PCR，将两种PCR产物混合，加热，缓慢冷却退火，加入酶使之延长。第二步，用OPN-5和OPN-3引物进行PCR，获得编码包括信号肽区域的人OPN-c全长的cDNA。用与同种型a，b相同的方法，将同种型c cDNA重组到pGEX4T载体，制备GST融合蛋白(以后叫做GST-OPN-c)。
OPNc t-35′-ACACAGCATTCTTTTCCACAGAACTTCCAGAATCAGC-3′OPNc t-55′-TGAGGAAAAGAATGCTGTGTCCTCTGAAGAAAACC-3′以上述OPN-a cDNA为模板，用OPN-5和下面的OPNnh-3引物进行PCR，可获得编码OPN-a凝血酶断开部位到氨基端部分(M1-R168)的cDNA。用与同种型a，b相同的方法，将其重组到pGEX4T载体，制备GST融合蛋白(以后叫做GST-Nhalf)。
OPNn h-35′-GCCTCGAGTTACCTCAGTCCATAAACCACACT-3′以OPN-a cDNA为模板，通过二步PCR制备OPN-a凝血酶断开部位到羧基侧的骨桥蛋白(hOPN Chalf)。第一步用OPN-5和下面的OPNch-3引物，下面的OPNch-5和OPN-3引物分别进行PCR。第二步，用OPN-5和OPN-3引物进行PCR，制备羧基侧的OPN蛋白质。用与同种型a，b相同的方法，将其重组到pGEX4T载体，制备GST融合蛋白(以后叫做GST-Chalf)。
OPNc h-35′-TCTTAGATTTGGCACAGGTGATGCCTAGGAG-3′OPNc h-55′-CACCTGTGCCAAATCTAAGAAGTTTCGCAGA-3′按常规方法从大肠杆菌制备各种重组的GST-OPN融合蛋白，按上述文献中记载的方法，使用谷光甘肽-葡聚糖柱进行纯化。其中，GST-Nhalf蛋白，通过用预切裂蛋白酶(PreScission，AmershamPharmacia Biotech)切开连接部分，可去除GST蛋白部分，获得仅由OPN氨基端部分(I17-R168)构成的蛋白(以后叫做nOPN)。
另一方面，将编码OPN-a全长(M1-N314)的cDNA插入到pcDNA3.1(+)载体(Invitrogen)中，转化CHO-K1细胞(大日本制药(株)社)(以下叫做CHO/OPN-a细胞)。由该细胞得到糖链结合型OPN-a(以下叫做CHO/OPN-a)，如下进行纯化。即，应用DEAE-葡聚糖CL-6B柱(Amersham Pharmacia Biotech)的离子交换色谱，应用MLTROGEL Ac44柱(BioSepra SA)的凝胶过滤色谱，然后应用RESOURCE PRC柱(Amersham Pharmacia Biotech)的逆相色谱，对CHO/OPN-a细胞的培养上清进行纯化。
用于免疫致敏和结合研究的各种肽可从Sigma Genosis Japan购买，或用肽合成仪(432A型，PerkinElmer Life Science，Inc.)按照Fmoc(N-(9-芴基)甲氧碳酰)法进行化学合成，然后用C18逆相色谱进行纯化获得。
实施例2小鼠单克隆抗体的制备准备与如下所示的人OPN内部序列对应的合成肽，用于免疫。
肽1CVDTYDGRGDSVVYGLRS(C+V153至S169)肽2CIDSQELSKVSREFHSH(C+I261至H276)其中，肽1具有分别识别αvβ3和α9β1整合素受体的RGD序列和SVVYGLR序列。
将这些肽与甲状腺球蛋白(thyroglobulin)结合，按常规方法免疫小鼠。然后，从免疫小鼠分离出脾细胞(splenocytes)，用聚乙二醇介导与小鼠骨髓瘤细胞P3-X63-Ag8-653的细胞融合。然后，按文献(M.Kinebuchi等，(1991)J.Immunol.，146，3721-3728)中叙述的方法筛选出与免疫时使用的肽反应的杂交瘤。
从用肽1和肽2免疫的小鼠中分别获得命名为2K1和4C1的单克隆抗体。生产单克隆抗体2K1的杂交瘤以FERM BP-7883保藏于独立行政法人产业技术综合研究所特许生物保藏中心(305-8566日本国茨城县つくば市东1丁目1番地1中央第6)。另外，单克隆抗体53(mAb53)是用全长重组人OPN免疫而得的抗体(D.S.Bautista等，(1994)JBC，269，23280-23285)。
实施例3OPN及其凝血酶消化物与小鼠单克隆抗体的反应性
用Western Blotting法试验实施例2中所得小鼠单克隆抗体2K1(以下叫做小鼠2K1抗体)和4C1对OPN及其凝血酶消化物的结合能力。发现小鼠2K1抗体可与GST-OPN-a、GST-OPN-b、GST-OPN-c和GST-Nhalf反应。另外，4C1抗体与GST-OPN-a、GST-OPN-b、GST-OPN-c和GST-Chalf反应。此外，这些单克隆抗体不仅可与大肠杆菌生产的糖链非结合型重组OPN结合，而且可与糖链结合型CHO/OPN-a蛋白及其凝血酶消化物(以下叫做凝血酶剪切OPN)反应。
实施例4小鼠单克隆抗体对OPN的细胞粘附作用的抑制用以下方法研究小鼠单克隆抗体是否抑制OPN的细胞粘附作用。首先，将各种浓度的CHO/OPN-a铺到96孔板中，4℃一晚，然后37℃条件下，用5％BSA的PBS处理10分钟，以封闭非特异性吸附。将用人成纤维细胞TIG-7或整合素α9亚基cDNA转化的SW480细胞(以下叫做α9转化SW480细胞)悬浮到含0.25％BSA的D-MEM中，将200μl细胞悬液(细胞浓度为5×104细胞/孔)加到各种浓度的单克隆抗体或合成肽存在或不存在下的条件下，用CHO/OPN-a或nOPN包被的96孔板中，37℃孵育1小时。
从板中去除培养基，用含0.25％BSA的D-MEM将各孔洗涤2次。接着固定细胞，用0.5％溶于20％甲醇的结晶紫溶液染30分钟。
用水将各孔洗3次，用20％的醋酸溶解粘附的细胞。用immunoreader分析各孔所得结果物的上清，测定590nm的吸收，以求出各孔粘附的细胞的相对数目。所有的测定进行3次，至少进行3个独立的实验。所显示的数值至少是3次独立实验的平均值。
已知TIG-7能很好地粘附到OPN上，如图1A所示，GRGDSP肽(100μg/ml)可明显抑制这种粘附，对照肽(OPN的C末端部分K296-N314)(100μg/ml)没有抑制，表明其粘附是RGD依赖性的。另外，如图1B所示，200μg/ml的小鼠2K1抗体抑制对OPN的细胞粘附。如图1C所示，小鼠2K1的细胞粘附抑制效果可与mAb53相媲美，是浓度依赖性的。小鼠2K1及mAb536不抑制TIG-7在玻基粘连蛋白(VN)和纤粘连蛋白(FN)上的粘附。
图2表示单克隆抗体对α9转化SW480细胞与nOPN和玻基粘连蛋白间粘附的抑制。如图2A所示，200μM的GRGDSP肽(RGD)可抑制1μg/ml玻基粘连蛋白与α9转化SW480细胞间的粘附，所以粘附是RGD依赖性的。200μM的GRGDSP肽(RGD)与抗α9β1单克隆抗体Y9A2(A.Wang等，(1996)Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.，15，664-672)联合应用可抑制3μg/ml nOPN与α9转化SW480细胞间的粘附，所以是RGD依赖性和非依赖性粘附。另外，图2B表示小鼠2K1抗体对α9转化SW480细胞与nOPN和玻基粘连蛋白间粘附的影响。小鼠2K1抗体不能抑制α9转化SW480细胞与玻基粘连蛋白间的粘附，但可抑制与nOPN间的粘附。该结果表明小鼠2K1抗体具有抑制RGD依赖性粘附的能力。
实施例5小鼠单克隆抗体对OPN诱导的单核细胞迁移的抑制应用ChemoTx101-8系统(Neuro Probe Inc.)进行应用U937细胞的细胞迁移试验。用含0.1％BSA的DMEM将细胞调整为2×106细胞/ml，加到滤膜(孔径8μm)的上层，将OPN蛋白质加到下层。
ChemoTx板37℃、5％CO2条件下静置4小时。然后，用甲醇固定膜，用苏木精和伊红(H-E)染色。显微镜下，400倍放大的条件下，计算迁移到滤膜里面的细胞数。进行3次实验，其均值作为数据。其结果如图3所示。
图3a表示在所示浓度下，U937细胞对CHO/OPN-a、凝血酶剪切OPN和GST-Nhalf的细胞迁移。另外，图3b表示在50μg/ml抗原特异性纯化小鼠2K1抗体、mAb53或小鼠IgG对照存在或不存在的条件下，应用10μg/ml的各OPN的抑制测定。
如图3a和3b所示，CHO/OPN-a、凝血酶剪切OPN和GST-Nhalf浓度依赖性诱导人单核细胞U937的迁移(A)。小鼠2K1抗体明显抑制CHO/OPN-a、凝血酶剪切OPN和GST-Nhalf诱导的单核细胞迁移。与此相对，mAb53仅抑制全长OPN诱导的单核细胞迁移(B)。
参考例1OPN与关节炎的诱发为了证明OPN在关节炎中的作用，按常规方法人工制备OPN基因缺陷小鼠(S.R.Rittling等，(1998)J.Bone Mminer.Res.，13(7)，1101-1111)，与正常小鼠比较。
应用市售的诱发关节炎药剂-诱发关节炎用单克隆抗体鸡尾酒(商品名关节炎用鸡尾酒，Arthrogen-CIAmAb，Arthritogenic mAbcocktail，岩井化学药品社制)，按照产品说明书，分别施用给OPN基因缺陷小鼠(OPN-/-)和正常小鼠(OPN+/+)，诱发关节炎，观察其程度。给两种小鼠施用生理盐水作为对照。
如下用关节炎分数、施用10天后腕部的肿胀比较关节炎的程度。其结果示于图4和图5中。
图4表明，施用关节炎用鸡尾酒/脂多糖(以下记做LPS)的正常小鼠，从第4天开始关节炎分数上升，到第10天达到最高(12以上)。与此相对，OPN基因缺陷小鼠从第5天开始关节炎分数上升，但最高达4以下。另外，施用生理盐水的任何组中均未见关节炎分数上升。
如图所示，OPN基因缺陷小鼠的腕部肿胀(手腕肿胀)明显弱于正常小鼠，这表明OPN与关节炎相关。
实施例6小鼠2K1抗体对人末梢血白细胞迁移的抑制活性按以下方法检验小鼠2K1抗体对细胞因子活化的人末梢血白细胞迁移的抑制活性。对中性粒细胞迁移的抑制活性的结果示于表1中，对单核细胞迁移的抑制活性的结果示于表2中。
<实验方法>
用Ficoll法从健康人的末梢血分离出单核细胞和中性粒细胞(P.M.Dafatrian等，(1996)Journal of Immunology，157，12-20)。收集Ficoll和血清中间层的细胞，放到培养瓶中，37℃培养1小时后，应用粘附的细胞作为单核细胞。将5倍体积的3％葡聚糖-PBS加到收集单核细胞后余下的红细胞层，使红细胞凝集，150×g、4℃离心5分钟。
凝集的红细胞沉淀，中性粒细胞悬浮于上清中，将该级分500×g、室温离心20分钟，获得中性粒细胞。将如此得到的单核细胞和中性粒细胞在人TNFα(20ng/ml)中培养一晚，应用活化的细胞进行迁移试验。
用48孔微量趋化性小室(micro chemotaxis chamber)(Neuro ProbeInc.)进行迁移试验。向凝血酶剪切的OPN中添加各种浓度的小鼠2K1抗体，在37℃预先放置15分钟，然后加入到低层小室(LowerChamber)中(人OPN的终浓度为10μg/ml)。其上面加载聚碳酸酯的滤器(孔径5μm)，再将50μl细胞悬液(2×106细胞/ml)加到上层小室(Upper Chamber)。
37℃、5％CO2条件下培养2小时，取下聚碳酸酯滤器，除去滤器上表面的细胞，用Diff-Quick(Baxter)对浸润到里侧的细胞进行染色。在40倍放大率下计算着色的细胞数。该结果用6孔的平均细胞数(细胞/mm3)±SD表示。
<实验结果>
小鼠2K1抗体抑制TNFα活化的人末梢血单核细胞和中性粒细胞向凝血酶剪切的OPN的迁移。
中性粒细胞迁移抑制[表1]

**p＜0.01(单方ANOVA，Dunnett’s检验)单核细胞迁移抑制

**p＜0.01(单方ANOVA，Dunnett’s检验)实施例7嵌合2K1抗体表达质粒的构建参照国际公开号WO94/20632国际公开中记载的抗HIV单克隆抗体(C25抗体)嵌合抗体的制备方法，将实施例2中所得小鼠2K1抗体的重链可变区(VH)基因与人Igγ1基因连接，轻链可变区(VL)基因与人Igκ基因连接，制备嵌合2K1抗体(以下称作嵌合2K1抗体或C2K1抗体)。
首先，用ISOGEN试剂(Nippo Gene)从产生小鼠2K1抗体的杂交瘤中提取mRNA，以此为模板，用pd(N)6 Random Hexamer和Ready-To-Go You-Prime First-Strand Beads(均为Amersham Biosciences公司产品)合成cDNA。
然后，以该cDNA为模板，应用按照Kabat的V区和J区核酸序列分类(Immunogical Interest 4thed.，Public Health Service，NIH，Washington DC，1987)设计的如下所示的与小鼠2K1抗体VH基因引导序列相对应的引物和与VH基因的J区相对应的引物，用ExTaqDNA聚合酶(宝酒造)扩增VH区。
引导序列引物(VH)5’-TTCGAAGCTTGCCGCCACCATGGAATGGAGCTGGATCTTT-3’
J区引物(VH)5’-GAAGATCTGGATCCACTCACCTGAGGAAACTGTGA-3’为了进行克隆，这里所用的对应引导序列的引物和对应J区的引物分别包含限制性内切酶HindIII的识别序列和BamHI的识别序列。
与VH基因同样，用如下所示的与VL基因引导序列相对应的引物和与J区相对应的引物，获得两端具有HindIII识别序列和BamHI识别序列的VL基因片段。
引导序列引物(VL)5’-CTTAAGCTTGCCGCCACCATGAAGTTGCCTGTTAGGCTG-3’J区引物(VL)5’-CTAGATCTGGATCCACTTACGTTTCAGCTCCAGCTT-3’用HindIII和BamHI(均为宝酒造)消化所得VH、VL基因片段，分别重组到表达载体AG-γ1、AG-κ(国际公开WO94/20632)中。其中，AG-γ1具有β-肌动蛋白启动子，人免疫球蛋白恒定区γ1链的基因及选择性标志新霉素耐性基因(neo)，将γ1基因上游的HindI识别序列和BamHI识别序列间插入小鼠2K1抗体VH基因，获得能表达嵌合抗体重链的质粒。另外，AG-κ具有β-肌动蛋白启动子，人免疫球蛋白恒定区κ链的基因及选择性标志二氢叶酸还原酶基因(dhfr)，同样，将小鼠2K1抗体VL基因插入到κ基因上游的HindIII识别序列和BamHI识别序列间，获得能表达嵌合2K1抗体轻链的表达载体。
用常规方法将这些表达质粒导入大肠杆菌HB101中，大量培养，用EndoFree Plasmid Mega Kit(QIAGEN)进行纯化。
实施例8嵌合2K1抗体的表达混和上述实施例7中纯化的嵌合2K1抗体重链、轻链的表达载体，通过常规的磷酸钙法转染CHO-DG44细胞株。用添加了0.5mg/mlGeneticin(Invitrogen)和10％通过透析除去核苷酸的FCS(Invitrogen)的MEM培养基进行筛选，获得产生嵌合2K1抗体的转化细胞。
在500ml添加了2％透析了的FCS的MEM培养基中培养该细胞，将所得培养上清过Protein A柱(Amersham Bioscience)，然后对PBS进行透析，获得纯化的嵌合2K1抗体。用DC蛋白质测定方法(BIO-RAD)测定纯化嵌合2K1抗体的浓度。最终获得1.4mg的纯化抗体。
实施例9嵌合2K1抗体对人末梢血单核细胞迁移的抑制活性如下检测实施例8中所得纯化嵌合2K1抗体对细胞因子活化的末梢血单核细胞迁移的抑制活性。
首先，用RPMI1640培养基2倍稀释用肝素从健康人所采血液。将稀释的血液重悬到Ficoll-Paque(Ficoll-Paque，Pharmacia)中，400×g室温离心30分钟。回收血浆与Ficoll-Paque交界面可见的白色层，作为单核细胞。将所得单核细胞与人TNFα(20ng/ml)共培养一晚，应用活化的细胞进行迁移试验。
用48孔微量趋化性小室(micro chemotaxis chamber)(Neuro ProbeInc.)进行迁移试验。人OPN与牛凝血酶(Sigma)一起37℃反应2小时，进行消化。将添加各种浓度的2K1嵌合抗体在37℃预先放置15分钟，然后加入到下层小室中(人OPN的终浓度为10μg/ml)。其上面加载聚碳酸酯的滤器(孔径5μm)，再将50μl细胞悬液(2×106细胞/ml)加到上层小室。
37℃、5％CO2条件下培养2小时，取下聚碳酸酯滤器，除去滤器上侧表面的细胞，用Diff-Quick(Baxter)进行染色。在40倍放大率下计算上侧滤器表面的细胞数，结果用6孔的平均细胞数(细胞/mm3)±SD表示。
结果如表3所示，嵌合2K1抗体抑制TNFα活化的末梢血单核细胞对凝血酶单侧切断型OPN的迁移。
单核细胞迁移抑制[表3]

*p＜0.05，**p＜0.01(单方ANOVA，Dunnett’s检验)实施例10嵌合2K1抗体的KD值测定如下测定嵌合2K1抗体的KD值。首先，用生物素化试剂盒((株)同仁化学研究所)对骨桥蛋白部分肽GRGDSVVYGLR进行生物素化。将传感器芯片装到BISCORE-2000中，使23RU结合配体(Bin-GRGDSVVYGLR)。然后，小鼠2K1抗体作为分析物流过，得到图6a所示的传感器图。另外，嵌合2K1抗体作为分析物流过，获得图6b所示的传感器图。这里，各图的横轴表示时间，纵轴表示相对反应(Relative response，RU)。用BISCORE公司的分析软件BIAEvaluation Version3.0在global fitting 1∶1的条件下分析传感器图中的数据。结果如图6所示。图6a为各种浓度的小鼠2K1抗体的传感图；图6b为各种浓度的嵌合2K1抗体的传感图。
测定结果是，小鼠2K1抗体的KD值为1.2×10-10M；嵌合2K1抗体的KD值为9.2×10-11M。未看到因小鼠2K1抗体的嵌合化而造成嵌合2K1抗体亲和力的降低。
实施例11人源化2K1抗体基因的制备移植小鼠2K1抗体的VH和VL中互补性决定区域(CDR)氨基酸的人模板抗体选自其氨基酸序列与小鼠2K1抗体的VH和VL构架(FR)的氨基酸序列高度同源的人抗体种系。具体而言，选择整合了JH6(Accession No.X69866)的DP-88(Accession No.Z49804)作为人VH模板，整合了Jκ2(Accession No.AJ399904)的DPK-18(Accession No.X93635)及整合了Jκ2的DPK-13(AccessionNo.X93631)作为人VL模板。小鼠2K1抗体的VH氨基酸序列(SEQID NO19)和VL氨基酸序列(SEQ ID NO20)与人模板抗体的VH和VL氨基酸序列的比较分别示于图7和图8。CDR的范围按Kabat等的分类方法显示。
VH的CDR具有下述氨基酸序列。
CDR1(SEQ ID NO21)DYEMHCDR2(SEQ ID NO22)AIHPGRGGTAYNQKFKGCDR3(SEQ ID NO23)ITGYFDVVL的CDR具有下述氨基酸序列。
CDR1(SEQ ID NO24)RSSQSIVHSNGNTYLECDR2(SEQ ID NO25)KVSNRFSCDR3(SEQ ID NO26)FQGSHVPLT将小鼠2K1抗体的VH、VL必要的氨基酸序列移植到上述人模板抗体中，制备出人源化抗体。具体而言，用小鼠2K1抗体的CDR氨基酸序列置换CDR氨基酸序列，设计编码该氨基酸序列的DNA碱基序列，然后，如下所述，应用PCR及基因重组技术制备具有设计的核酸序列的基因片段。VL中仅FR2采用与小鼠2K1抗体的同源性更高的DPK-13氨基酸序列，其它的FR部分采用DPK-18。VH中仅FR4采用JH6的氨基酸序列，其它FR部分采用DP-88。
上面制备的人源化抗体(以下有时称作R2K1抗体)的VH、VL氨基酸序列及编码它们的碱基序列，分别记载于图9(SEQ ID NO27和28)和图10(SEQ ID NO29和30)中。这里使用与PCT国际公开号WO94/20632中记载的人源化抗HIV单克隆抗体(RC25抗体)相同的抗体诱导序列(图9和图10中下划线部分)。另外，编码VH、VL的碱基序列的两端添加了HindIII识别序列和BamHI识别序列，以利于克隆。
实际上，为了获得具有图9和图10所示碱基序列的DNA片段，可全部以oligo-DNA为材料，通过PCR进行合成。具体而言，针对VH，如图11所示，设计合成6条oligo-DNA(SEQ ID NO31-36)以覆盖图9中VH碱基序列的全长；应用它们按如下顺序进行PCR。即，混和6种oligo-DNA作为模板，各10pmol，应用Pyrobest DNA聚合酶(宝酒造)，按96℃20秒、55℃30秒、72℃3分钟的步骤，进行10个循环。然后，以1μl PCR产物为模板，以具有图11中下划线部分序列的oligo-DNA(SEQ ID NO37-38)为引物，应用PyrobestDNA聚合酶，按96℃20秒、72℃3分钟的步骤，进行25个循环，由此扩增出全长VH。应用Zero Blunt PCR Cloning kit(Invitrogen)将所得DNA片段连接到pCR-Blunt载体上，然后导入大肠杆菌进行克隆。用QIAprep Spin Miniprep Kit(QIAGEN)从所得大肠杆菌中制备质粒DNA，以此为模板，用M13-M4引物和M13-RV引物(均为宝酒造)和CEQ DTCS-Quick Start Kit(BECKMAN COULTER)进行测序反应，通过CEQ 2000自动测序仪(BECKMAN COULTER)解读克隆出的DNA的碱基序列，得到与图9中设计的碱基序列一致的克隆。
VL时，应用图12中所示的6条oligo-DNA(SEQ ID NO39-44)，进行与上面同样的10个循环的PCR后，用其扩增产物作模板，以有图12中下划线部分序列的oligo-DNA(SEQ ID NO45和46)为引物，进行与上面同样的25个循环的PCR。其后，进行与VH同样的操作，得到与图10中设计的碱基序列一致的克隆。
实施例12人源化2K1抗体表达质粒的制备与实施例7中记载的制备嵌合2K1抗体表达载体同样，制备人源化2K1抗体表达质粒。用常规方法，从实施例11中制备的具有人源化2K1抗体VH、VL基因的克隆中提取质粒DNA，用HindIII和BamHI消化，得到VH、VL的DNA片段，分别装到前述的表达载体AG-γ1、AG-κ中。将所得人源化2K1抗体重链、轻链的表达载体导入大肠杆菌，大量培养，以此为基础，纯化转染用的重链、轻链的表达质粒DNA。
实施例13人源化2K1抗体的表达混和实施例12制备的人源化2K1抗体重链、轻链的表达质粒，通过磷酸钙法转染CHO-DG44细胞株。用添加了0.5mg/ml Geneticin和10％透析过的FCS的MEM培养基培养3天，获得培养上清，用ELISA法确认其中所含人源化2K1抗体的抗原结合活性。首先，用来源于兔的抗人IgG Fc抗体(CAPPEL)和protein A-HRP(ZYMED)进行夹心ELISA，测定培养基中所含人源化2K1抗体的浓度。此时，可制备市售人IgG1抗体(Biogenesis)的系列稀释液，以此作为标准品。另外，也可应用上述ELISA对前面的嵌合2K1抗体进行浓度测定。
实施例14嵌合2K1抗体及人源化2K1抗体与骨桥蛋白肽结合性的确认以实施例13中测定的人源化2K1抗体及嵌合2K1抗体的浓度为基础，参照今等的ELISA法(Journal of Cellular Biology，88420-432(2002))，比较人源化2K1抗体及嵌合2K1抗体对骨桥蛋白肽(CVDTYDGRGDSVVYGLRS)的结合活性。
将BSA交联的骨桥蛋白肽(BSA-CVDTYDGRGDSVVYGLRS)固定到微滴度板上，系列稀释的人源化2K1抗体及嵌合2K1抗体与之反应，结合了BSA-CVDTYDGRGDSVVYGLRS的抗体与proteinA-HRP反应，最后与TMB(同仁化学研究所)反应，在450nm处测定吸光度。
另外，用只固定了BSA的板上的反应作为阴性对照，进行同样地测定。结果如图13所示。
图13中，横轴为抗体浓度，纵轴为吸光度。●表示嵌合2K1抗体对BSA-CVDTYDGRGDSVVYGLRS的结合性；■表示人源化2K1抗体对BSA-CVDTYDGRGDSVVYGLRS的结合性。另外，作为阴性对照，○表示嵌合2K1抗体对BSA的结合性；□表示人源化2K1抗体对BSA的结合性。
结果，人源化2K1抗体和嵌合2K1抗体对BSA无结合性，只对BSA-CVDTYDGRGDSVVYGLRS显示结合活性，由此可以判断这些抗体的结合活性是骨桥蛋白肽特异的。另外，两种抗体对BSA-CVDTYDGRGDSVVYGLRS的结合活性在同一水平。
如前所述，嵌合2K1抗体与源小鼠2K1抗体具有同等的抗原结合活性，这表明按本发明制备的人源化2K1抗体与源小鼠2K1抗体具有同等的抗原结合活性。
实施例15M5抗体的制备准备下面与小鼠OPN内部序列(C+V138-153)相对应的肽，用于免疫。
M5肽CVDVPNGRGDSLAYGLR将该肽与甲状腺球蛋白结合，按常规方法免疫兔子。收集免疫兔的抗血清，应用通过二硫键而结合了M5肽N末端半胱氨酸与巯基葡聚糖珠(Amersham Pharmacia Biotech)的柱子制备M5抗体。
实施例16OPN及其凝血酶消化物与M5抗体的反应性应用Western Blotting方法进行实施例15中所得M5抗体与OPN及其凝血酶消化物结合能力的实验。应用CHO细胞产生的糖基化形式的重组小鼠OPN。M5抗体与OPN及其凝血酶消化物反应。
实施例17M5抗体对细胞对OPN粘附的抑制用文献(S.Kon等，(2002)J.Cell.Biochem.，84(2)，420-432)中叙述的方法检测M5抗体是否抑制细胞对OPN的粘附。使用经PreScission蛋白酶(Amersham Pharmacia Biotech)除去了GST的全长小鼠OPN(以下记做mOPN/de-GST)。使用小鼠NIH3T3细胞。
如图14所示，NIH3T3细胞对mOPN/de-GST的粘附呈浓度依赖性。另外，如图15所示，GRGDSP肽(100μg/ml)明显抑制这种粘附，表明是RGD依赖性的。图16表明，200μg/ml的M5抗体抑制细胞对OPN的粘附。
实施例18M5抗体对小鼠脾脏来源的单核细胞迁移的抑制活性按以下方法检测M5抗体对细胞因子活化的小鼠脾脏来源的单核细胞迁移的抑制活性。结果示于表4中。
<实验方法>
在载玻片上研磨C57BL/6小鼠的脾脏细胞，以制备单个细胞，在培养瓶中37℃培养1小时，粘附的细胞用作单核细胞。将单核细胞与人TNFα(20ng/ml)共培养一晚，用活化的细胞进行迁移试验。用与前面实施例6中人同样的方法进行迁移试验。
<实验结果>
M5抗体抑制TNFα活化的小鼠脾脏来源的单核细胞对用牛凝血酶(Sigma)消化全长小鼠OPN(Genzyme)而得到的凝血酶切断型小鼠OPN的迁移。


*p＜0.05(单方ANOVA，Dunnett’s检验)实施例19
M5抗体的骨破坏抑制作用按以下方法检测M5抗体在小鼠颅盖器官培养体系中的骨破坏抑制作用。结果示于表5中。
<实验方法>
切下出生后第1天的新生鼠的颅盖骨，调整大小后，将其一半加入到24孔板的各孔中。向其中加入添加了终浓度为10nM的人甲状旁腺激素(Parathyroid hormone，PTH)的DMEM培养基(添加10％牛血清)，引起骨破坏。添加终浓度达200μg/ml的M5抗体。37℃培养1周后，从骨头释放到培养液中的钙含量用Calcium E TestWAKO(和光纯药)对从骨头释放到培养液中的钙含量进行定量。
<实验结果>
未添加PTH时，钙值为7.02mg/ml，添加PTH后达9.11mg/ml，可以看出PTH的添加促进了骨钙的游离。可以确认，添加200μg/ml的M5抗体，可70％抑制骨吸收。


**p＜0.01(单方ANOVA，Dunnett’s检验)实施例20M5抗体在小鼠胶原性关节炎模型中的效果按以下方法检测M5抗体在小鼠胶原性关节炎模型中的效果。对关节炎分数的结果如表6所示，对腿浮肿的结果如表7所示，对体重变化的结果如表8所示，对摄食变化的结果如表9所示。
<实验方法>
用识别胶原特异的4个表位的关节炎诱发抗体鸡尾酒(商品名关节炎用鸡尾酒，Arthrogen-CIAmAb，Arthritogenic mAb cocktail，岩井化学药品社制)诱发关节炎。静脉内施用该关节炎用鸡尾酒，3天后腹腔内施用LPS(100μg)，诱发小鼠关节炎。施用LPS后第3天开始观察到关节炎，到第6天达最大。
施用LPS之前和施用3天后，静脉内施用M5抗体，用量为40μg、对照组中应用兔IgG(400μg)。另外，施用LPS之前和施用3天后，静脉内施用抗TNF-α抗体，用量为200μg/只。对照组中应用大鼠IgG(200μg)。另外，从LPS施用日开始施用MTX，每天一次(3.2mg/kg)。此时，MTX溶解到5ml 0.5％甲基纤维素溶液中。对照组应用5ml 0.5％甲基纤维素溶液。
进行与关节炎分数、腿浮肿、体重变化、摄食量4项相关的评价，每组5只。
<实验结果>
如表6-9所示，在小鼠关节炎模型(治疗效果)中，M5抗体明确抑制关节炎分数的改善、发病延迟和腿浮肿的改善等。对关节炎发病呈用量依赖性抑制，其程度超过了施用抗TNF-α抗体(施用量200μg/只)的效果。而MTX几乎无药效。
本模型的正常组中，在施用LPS后3天，观察到体重显著减轻约3g，该倾向持续到第3-6天，虽然减少率比较缓和。与此相对，M5抗体施用组(150μg，400μg)和抗TNF-α抗体施用组组中可看到体重减少明显改善。另外，对于摄食量，施用LPS后第3天，任何药剂均可看到体重快速减少，但到3-6天，M5抗体施用组和抗TNF-α抗体施用组中可看到改善。对关节炎分数的结果如表6所示，对腿浮肿的结果如表7所示，对体重变化的结果如表8所示，对摄食变化的结果如表9所示。


**P＜0.01，*P＜0.05(无参数Mann-Whitney检验)

*P＜0.05(无参数Mann-Whitney检验)


**p＜0.01，*p＜0.05(单方ANOVA，Dunnett’s检验)


表8



表9



实施例21OPN相关片段肽的获得从Auspep(Auspep Inc.，Parkiville，Australia)购买HPLC色谱纯化的OPN相关片段肽。其氨基酸序列如下面(1)-(3)所示。
hOPN5CVDTYDGRGDSVVYGLRS(C+V153至S169) (1)hOPN3KSKKFRRPDIQYPDATDEC(K170至E187+C) (2)hOPN1IPVKQADSGSSEEKQC(I17至Q31+C)(3)实施例22免疫用抗原的制备按EMCS(N-(6-maleimidocaproyloxy)-琥珀酰亚胺)法，如下制备OPN相关片段肽与甲状腺球蛋白的结合体，作为免疫原。制作结合体时，甲状腺球蛋白与OPN相关片段肽和EMCS的摩尔比为1∶300∶400。
将实施例21中的各OPN相关片段肽4mg分别溶解到1ml蒸馏水中。另一方面，将5mg的甲状腺球蛋白溶解到1ml 0.01M磷酸缓冲液(pH7.0)中，与80μg/μl用二甲基亚砜溶解的EMCS分别按上述摩尔比混和，制备甲状腺球蛋白-EMCS复合体溶液。将该复合体溶液分成3份，按上述摩尔比分别加入OPN相关片段肽溶液，制备EMCS交联的OPN相关片段肽与甲状腺球蛋白的结合体溶液。
用PBS透析该结合体溶液，将结合体的浓度调整为10/μl。用所得OPN相关片段肽与甲状腺球蛋白的结合体作为免疫原。
实施例23用于筛选的抗原的制备分别按照实施例1中所述方法制备GST与OPN相关片段肽的融合蛋白GST-OPN-a、GST-OPN-b、GST-OPN-c、凝血酶断裂部位氨基侧的OPN片段(GST-Nhalf)及羧基侧的OPN片段(GST-Chalf)，作为筛选用OPN蛋白质，用于抗血清对OPN的反应性。
实施例24免疫致敏用实施例22中所得OPN相关片段肽与甲状腺球蛋白的结合体作为免疫原免疫兔子。每1周或2周施用结合体溶液100μl(100μg)进行免疫。初次免疫时抗原与氟氏完全佐剂混和，第二次与氟氏不完全佐剂混和。免疫8次后，采血，分离血清作为抗血清。
实施例25抗血清对OPN的反应性将实施例21中制备的OPN相关片段肽稀释到0.1M碳酸缓冲液中(pH9.5)，浓度达10μg/ml，50μl/孔固化到96孔培养板中。
用PBS洗涤，用0.1％BSA/0.05％NaN3溶液封闭，然后将实施例24中所得抗血清的100倍稀释液顺次2倍稀释，50μl/孔，37℃反应30分钟。
反应终止后，用0.05％Tween 20-PBS洗涤4次，加入HRP标记的抗兔IgG(IBL)，50μl/孔，37℃反应30分钟。反应终止后，加入含0.4mg/ml邻苯二胺(OPD)和0.03％过氧化氢的0.05M柠檬酸缓冲液(pH49.5)，100μl/孔，室温避光放置15分钟，进行显色反应。显色后，每孔加入100μl 1N硫酸以终止反应，测定492nm的吸光度。
另一方面，用实施例23中制备的OPN蛋白质，通过WesternBlotting检测抗血清的反应性。结果，针对OPN相关片段肽hOPN1和hOPN5的抗血清与GST-OPN-a、GST-OPN-b、GST-OPN-c和GST-Nhalf反应，但不与GST-Chalf反应。另一方面，针对OPN相关片段肽hOPN3的抗血清与GST-OPN-a、GST-OPN-b、GST-OPN-c和GST-Chalf反应，但不与GST-Nhalf反应。
实施例26抗OPN相关片段肽抗体与HRP的结合体的制备OPN相关片段肽hOPN3和hOPN1的抗体与HRP的结合体的制备如下。用胃蛋白酶消化各种抗OPN相关片段肽抗体20mg，通过凝胶过滤纯化抗OPN相关片段肽抗体的F(ab’)2片段，用2-巯基乙醇将F(ab’)2片段还原为Fab’片段。HRP与EMCS37℃反应60分钟，通过凝胶过滤制备HRP-EMCS结合体，再与抗OPN相关片段肽抗体Fab’片段4℃反应一晚，通过凝胶过滤制备EMCS交联的抗OPN相关片段肽抗体与HRP的结合体。
实施例27夹心ELISA体系的构建根据夹心ELISA所用板与标记抗体的组合，制作1-3、5-1两种体系。1-3体系的构建如下。将10μg/ml的针对OPN相关片段肽hOPN1的抗体加到96孔ELISA板中，100μl/孔。4℃反应一晚后，用10％BSA/PBS/0.05％NaN3溶液封闭，该状态下作为夹心ELISA用板。将实施例26中制备的针对OPN相关片段肽hOPN3的抗体与HRP的结合抗体作为标记抗体。如此，用hOPN1的抗体固化板子，用hOPN3的抗体作为酶标抗体的组合作为体系1-3。
同样，以针对hOPN5的抗体固化板子，用hOPN1的抗体作为酶标抗体的组合作为体系5-1。
实施例28用夹心ELISA测定被验者中的骨桥蛋白OPN蛋白质的测定如下进行。将100μl包含从被验者采集的血浆和关节腔液样品的溶液加入到1-3体系和5-1体系的夹心ELISA所用板中，37℃反应1小时。反应后，用0.05％Tween20-PBS洗涤4次，各体系中加入100μl特异性标记抗体，4℃反应30分钟。反应后，用0.05％Tween20-PBS洗涤6次，加入100μl TMB(四甲基联苯胺)溶液，室温避光放置30分钟。用1N硫酸终止反应，测定450nm的吸光度。
用上述方法测定的风湿病患者关节腔液(13例)的OPN值如表10所示，变形性关节炎患者的关节腔液(12例)的OPN值如表11所示。另外，风湿病患者血浆(16例)的OPN值如表12所示，变形性关节炎患者的血浆(7例)的OPN值如表13所示，正常人血浆(6例)的OPN值如表14所示。
结果表明，比较血浆中的OPN值，在1-3体系中，类风湿性关节炎患者、变形性关节炎患者和健康人间未看到显著性差异。但是，在5-1体系，与健康人间相比类风湿性关节炎患者、变形性关节炎患者中其测定值均有显著性增高，类风湿性关节炎患者增高更明显。这提示5-1体系反映的总OPN量对关节炎整体诊断的有效性。
另一方面，类风湿性关节炎患者和变形性关节炎患者的关节腔液中OPN值比血浆中OPN值升高，这提示局部的OPN产生增强。
另外，在类风湿性关节炎患者和变形性关节炎患者间比较关节腔液中的OPN值，无论1-3体系还是5-1体系，与变形性关节炎患者相比，类风湿性关节炎患者的OPN值显著性增高。
作为新指标，对1-3体系/5-1体系间的OPN值比进行检测。该指标可比较凝血酶断开的OPN的比例。类风湿性关节炎患者的血浆和关节腔液的OPN值1以下，变形性关节炎患者2以上，有显著性差异。因此，利用1-3体系/5-1体系间的OPN值可区别风湿病患者和变形性关节炎患者，可作为早期的检测方法应用。
表10

表11

表12

表13

表14

序列表<110>Immuno-Biological Laboratkries Co.，Ltd.
Fujisawa Pharmaceutical Co.，Ltd.
<120>重组的抗骨桥蛋白抗体及其用途<130>PF-020016-WO<140>
<141>
<150>JP 2001-290700<151>2001-09-25<160>50<170>PatentIn Ven 2.1<210>1<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>InventorUEDE，Toshimitsu；KON，Shigeyuki；YAMAMOTO，Nobuchika；HIGUCHI，Hirofumi；TORIKAI，Masaharu；TOKIEDA，Yoshiyuki；NAKASHIMA，Toshihiro；MAEDA，Hiroaki<220>
<223>人工序列的描述(1)hOPN5<400>1Cys Val Asp Thr Tyr Asp Gly Arg Gly Asp Ser Val Val Tyr Gly Leu1 5 10 15
Arg Ser<210>2<211>19<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述(2)hOPN3<400>2Lys Ser Lys Lys Phe Arg Arg Pro Asp Ile Gln Tyr Pro Asp Ala Thr1 5 10 15Asp Glu Cys<210>3<211>16<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述(3)hOPN1<400>3Ile Pro Val Lys Gln Ala Asp Ser Gly Ser Ser Glu Glu Lys Gln Cys1 5 10 15<210>4<211>35
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述OPN-5<400>4cgggatccac taccatgaga attgcagtga tttgc 35<210>5<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述OPN-3<400>5ccgctcgagt taattgacct cagaagatgc actatc 36<210>6<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述OPNct-3<400>6acacagcatt cttttccaca gaacttccag aatcagc37<210>7<211>35
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述OPNct-5<400>7tgaggaaaag aatgctgtgt cctctgaaga aaacc 35<210>8<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述OPNnh-3<400>8gcctcgagtt acctcagtcc ataaaccaca ct 32<210>9<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述OPNch-3<400>9tcttagattt ggcacaggtg atgcctagga g 31<210>10<211>31
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述OPNch-5<400>10cacctgtgcc aaatctaaga agtttcgcag a 31<210>11<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述肽1<400>11Cys Val Asp Thr Tyr Asp Gly Arg Gly Asp Ser Val Val Tyr Gly Leu1 5 10 15Arg Ser<210>12<210>17<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述肽2<400>12Cys Ile Asp Ser Gln Gln Leu Ser Lys Val Ser Arg Glu Phe His Ser
1 5 10 15His<210>13<211>17<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述M5肽<400>13Cys Val Asp Val Pro Asn Gly Arg Gly Asp Ser Leu Ala Tyr Gly Leu1 5 10 15Arg<210>14<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述肽片段<400>14Ser Val Val Tyr Gly Arg Leu1 5<210>15
<211>11<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述肽片段<400>15Arg Gly Asp Ser Val Val Tyr Gly Leu Arg Ser1 5 10<210>16<211>17<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述肽片段<400>16Val Asp Thr Tyr Asp Gly Arg Gly Asp Ser Val Val Tyr Gly Leu Arg1 5 10 15Ser<210>17<211>11<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述肽片段
<400>17Arg Gly Asp Ser Leu Ala Tyr Gly Len Arg Ser1 5 10<210>18<211>17<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述肽片段<400>18Val Asp Thr Tyr Asp Gly Arg Gly Asp Ser Leu Ala Tyr Gly Leu Arg1 5 10 15Ser<210>19<211>116<212>PRT<213>小鼠<220>
<223>小鼠抗体2K1 VH区<400>19Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala1 5 10 15Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Leu Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr20 25 30
Glu Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Val His Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Ala Ile His Pro Gly Arg Gly Gly Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe50 55 60Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Thr Arg Ile Thr Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val100 105 110Thr Val Ser Ser115<210>20<211>113<212>PRT<213>小鼠<220>
<223>小鼠抗体2K1 VL区<400>20Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly1 5 10 15Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser20 25 30Asn Gly Asn Thr Thr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro50 55 60Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile65 70 75 80Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly85 90 95Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys100 105 110Arg<210>21<211>5<212>PRT<213>小鼠<220>
<223>CDR1(VH)<400>21Asp Tyr Glu Met His1 5<210>22<211>17<212>PRT<213>小鼠<220>
<223>CDR2(VH)<400>22Ala Ile His Pro Gly Arg Gly Gly Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe Lys1 5 10 15Gly<210>23<211>7<212>PRT<213>小鼠<220>
<223>CDR3(VH)<400>23Ile Thr Gly Tyr Phe Asd Val1 5<210>24<211>16<212>PRT<213>小鼠<220>
<223>CDR1(VL)<400>24Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu1 5 10 15
<210>25<211>7<212>PRT<213>小鼠<220>
<223>CDR2(VL)<400>25Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser1 5<210>26<211>9<212>PRT<213>小鼠<220>
<223>CDR3(VL)<400>26Phe Gln Gly Ser His Val Pro Leu Thr1 5<210>27<211>441<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人抗休2K1 VH区<220>
<221>CDS
<222>(20)..(424)<400>27cacgaagctt gccgccacc atg gac tgg acc tgg cgc gtg ttt tgc ctg ctc 52Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Cys Leu Leu1 5 10gcc gtg gct cct ggg gcc cac agc cag gtg cag ctg gtg cag tct ggg 100Ala Val Ala Pro Gly Ala His Ser Gln Val Glu Leu Val Gln Ser Gly15 20 25gct gag gtg aag aag cct ggg tcc tcc gtg aag gtc tcc tgc aag gct 148Ala Gln Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala30 35 40tct gga ggt acc ttc agc gac tat gaa atg cac tgg gtg cga cag gcc 196Ser Gly Gly Thr Phe Ser Asp Tyr Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala45 50 55cct gga caa ggg ctt gag tgg atg gga gct att cat cca gga aga ggt 244Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Ala Ile His Pro Gly Arg Gly60 65 70 75ggt act gcc tac aat cag aag ttc aag ggc aga gtc acg att acc gcg 292Gly Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala80 85 90gac aaa tcc act agt aca gcc tac atg gag ctg agc agc ctg aga tct 340Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser95 100 105gag gac acg gcc gtg tat tac tgt gcg aga att act ggg tac ttc gat 388Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ile Thr Gly Tyr Phe Asp110 115 120gtc tgg ggg caa ggg acc acg gtc acc gtc tcc tca ggtgagtgga434
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser125 130 135tccgcga 441<210>28<211>135<212>PRT<213>人工序列<223>人工序列的描述人抗体2K1 VH区<400>28Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Cys Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly1 5 10 15Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys20 25 30Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe35 40 45Ser Asp Tyr Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu50 55 60Glu Trp Met Gly Ala Ile His Pro Gly Arg Gly Gly Thr Ala Tyr Asn65 70 75 80Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser85 90 95Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val100 105 110Tyr Tyr Cys Ala Arg Ile Thr Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly115 120 125
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser130 135<210>29<211>455<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人抗体2K1 VL区<220>
<221>CDS<222>(20)..(415)<400>29cacgaagctt gccgccacc atg gga tgg agc tgt atc act ctc ttc ttg gta 52Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val1 5 10gca aca gct aca ggt gtc cac tcc gat gtt gtg atg act cag tct cca 100Ala Thr Ala Thr Gly Val His Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro15 20 25ctc tcc ctg ccc gtc acc ctt gga cag ccg gcc tcc atc tcc tgc agg 148Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg30 35 40agc tct caa agc att gta cat agt aat gga aac acc tat ttg gaa tgg 196Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp45 50 55tac ctg cag aag cca ggg cag tct cca cag ctc ctg atc tat aaa gtt 244
Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val60 65 70 75tcc aac cga ttt tct ggg gtc cca gac aga ttc agc ggc agt ggg tca292Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Aso Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser80 85 90ggc act gat ttc aca ctg aaa atc agc agg gtt gaa gct gaa gac gtc340Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val95 100 105gga gtt tat tac tgc ttt caa ggt tca cat gtt ccg ctc acg ttt ggc388Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly110 115 120cag ggg acc aag ctg gag atc aaa cgt gagtagaatt taaactttgc 435Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg125 130ttcctcagtt ggatccgcga 455<210>30<211>132<212>PRT<213>人工序列<223>人工序列的描述人抗体2K1 VL区<400>30Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly1 5 10 15Val His Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val20 25 30Thr Leu Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile
35 40 45Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro50 55 60Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser65 70 75 80Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr85 90 95Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys100 105 110Phe Gln Gly Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu115 120 125Glu Ile Lys Arg130<210>31<211>97<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述VH区引物1<400>31cacgaagctt gccgccacca tggactggac ctggcgcgtg ttttgcctgc tcgccgtggc 60tcctggggcc cacagccagg tgcagctggt gcagct 97<210>32
<211>88<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述VH区引物2<400>32tcgctgaagg tacctccaga agccttgcag gagaccttca cggaggaccc aggcttcttc 60acctcagccc cagactgcac cagctgca88<210>33<211>103<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述VH区引物3<400>33ttctggaggt accttcagcg actatgaaat gcactgggtg cgacaggccc ctggacaagg 60gcttgagtgg atgggagcta ttcatccagg aagaggtggt act 103<210>34<211>90<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述VH区引物4<400>34catgtaggct gtactagtgg atttgtccgc ggtaatcgtg actctgccct tgaacttctg 60attgtaggca gtaccacctc ttcctggatg 90
<210>35<211>95<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述VH区引物5<400>35tccactagta cagcctacat ggagctgage agcctgagat ctgaggacac ggccgtgtat 60tactgtgcga gaattactgg gtacttcgat gtctg95<210>36<211>69<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述VH区引物6<400>36tcgcggatcc actcacctga ggagacggtg accgtggtcc cttgccccca gacatcgaag 60tacccagta 69<210>37<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述VH区引物(1)
<400>37cacgaagctt gccgccacca tggactggac ctggcgcgtg 40<210>38<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述VH区引物(2)<400>38tcgcggatcc actcacctga ggagacggtg accgtggtcc 40<210>39<211>82<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述VL区引物1<400>39cacgaagctt gccgccacca tgggatggag ctgtatcatc ctcttcttgg tagcaacagc 60tacaggtgtc cactccgatg tt 82<210>40<211>102<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述VL区引物2
<400>40aatgctttga gagctcctgc aggagatgga ggccggctgt ccaagggtga cgggcaggga 60gagtggagac tgagtcatca caacatcgga gtggacacct gt102<210>41<211>113<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述VL区引物3<400>41tgcaggagct ctcaaagcat tgtacatagr aatggaaaca cctatttgga atggtacctg 60cagaagccag ggcagtctcc acagctcctg atctataaag tttccaaccg att113<210>42<211>114<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述VL区引物4<400>42tccgacgtct tcagcttcaa ccctgctgar tttcagtgtg aaatcagtgc ctgacccact 60gccgctgaat ctgtctggga ccccagaaaa tcggttggaa actttataga tcag 114<210>43<211>64<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述VL区引物5<400>43gttgaagctg aagacgtcgg agtttattac tgctttcaag gttcacatgt tccgctcacg 60tttg64<210>44<211>90<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述VL区引物6<400>44tcgcggatcc aactgaggaa gcaaagttta aattctactc acgtttgatc tccagcttgg 60tcccctggcc aaacgtgagc ggaacatgtg90<210>45<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述VL区引物(1)<400>45cacgaagctt gccgccacca tgggatggag ctgtatcatc40<210>46<211>40
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述VL区引物(2)<400>46ctcgcggatc caactgagga agcaaagttt aaattctact 40<210>47<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述VH区引导序列引物<400>47ttcgaagctt gccgccacca tggaatggag ctggatcttt 40<210>48<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述VH区的J区的引物<400>48gaagatctgg atccactcac ctgaggaaaac tgtga 35<210>49<211>39
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述VL区的引导序列的引物<400>49cttaagcttg ccgccaccat gaagttgcct gttaggctg 39<210>50<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述VL区的J区的引物<400>50ctagatctgg atccacttac gtttcagctc cagctt 3权利要求
1.一种抗骨桥蛋白抗体或源于该抗体的抗体片段，它能抑制识别RGD序列的整合素与骨桥蛋白或其片段的结合，且可抑制识别SVVYGLR序列的整合素与骨桥蛋白或其片段的结合。
2.权利要求1中的抗骨桥蛋白抗体，它是用包含部分氨基酸序列RGDSVVYGLRS的肽作为抗原而获得的。
3.权利要求1或2中的抗骨桥蛋白抗体，它是用肽VDTYDGRGDSVVYGLRS作为抗原而获得的。
4.权利要求1-3任一项中的抗骨桥蛋白抗体，它是单克隆抗体。
5.权利要求1-3任一项中的抗骨桥蛋白抗体，它是嵌合抗体。
6.权利要求5中的抗骨桥蛋白抗体，具有以下重链(a)和轻链(b)(a)具有小鼠来源的重链可变区和人源重链恒定区的重链；(b)具有小鼠来源的轻链可变区和人源轻链恒定区的轻链。
7.权利要求5或6中的抗骨桥蛋白抗体，其特征在于，其重链(a)的小鼠来源的重链可变区具有SEQ ID NO19中的氨基酸序列。
8.权利要求5或6中的抗骨桥蛋白抗体，其特征在于，其轻链(b)的小鼠来源的轻链可变区具有SEQ ID NO20中的氨基酸序列。
9.权利要求5或6中的抗骨桥蛋白抗体，其中重链(a)的重链恒定区为人Igγ1。
10.权利要求5或6中的抗骨桥蛋白抗体，其中轻链(b)的轻链恒定区为人Igκ。
11.权利要求1-3任一项中的抗骨桥蛋白抗体，它是人化抗体。
12.权利要求11中的抗骨桥蛋白抗体，具有以下重链(c)和轻链(d)(c)具有小鼠来源的重链可变区的互补性决定区域及人源重链可变区的构架区域的重链可变区和人源重链恒定区的重链；(d)具有小鼠来源的轻链可变区的互补性决定区域及人源轻链可变区的构架区域的轻链可变区和人源轻链恒定区的轻链。
13.权利要求11或12中的抗骨桥蛋白抗体，其特征在于，其重链(c)的小鼠来源的重链可变区的互补性决定区域具有SEQ ID NO21-23中的氨基酸序列。
14.权利要求11或12中的抗骨桥蛋白抗体，其特征在于，其轻链(d)的小鼠来源的轻链可变区的互补性决定区域具有SEQ ID NO24-26中的氨基酸序列。
15.权利要求11或12中的抗骨桥蛋白抗体，其特征在于，其重链(c)的重链可变区具有SEQ ID NO28中的氨基酸序列。
16.权利要求11或12中的抗骨桥蛋白抗体，其特征在于，其轻链(d)的轻链可变区具有SEQ ID NO30中的氨基酸序列。
17.权利要求11或12中的抗骨桥蛋白抗体，其重链(c)的重链恒定区为人Igγ1。
18.权利要求11或12中的抗骨桥蛋白抗体，其轻链(d)的轻链恒定区为人Igκ。
19.一种碱基序列，它编码SEQ ID NO19中记载的氨基酸序列。
20.一种碱基序列，它编码SEQ ID NO20中记载的氨基酸序列。
21.一种碱基序列，它编码SEQ ID NO28中记载的氨基酸序列列。
22.一种碱基序列，它编码SEQ ID NO30中记载的氨基酸序列。
23.一种载体，它具有权利要求19中碱基序列和人Igγ1基因。
24.一种载体，它具有权利要求20中碱基序列和人Igκ基因。
25.一种载体，它具有权利要求21中碱基序列和人Igγ1基因。
26.一种载体，它具有权利要求22中碱基序列和人Igκ基因。
27.一种宿主细胞，它是用权利要求23和24中记载的载体转化的。
28.一种宿主细胞，它是用权利要求25和26中记载的载体转化的。
29.一种权利要求5或6的抗骨桥蛋白嵌合体抗体的制备方法，其特征在于，培养权利要求27中的宿主细胞，从培养液中收集抗骨桥蛋白嵌合体抗体。
30.一种权利要求11或12的抗骨桥蛋白人源化抗体的制备方法，其特征在于，培养权利要求28中的宿主细胞，从培养液中收集抗骨桥蛋白人源化抗体。
31.一种自身免疫性疾病的治疗剂，它包含权利要求1-6或11或12任一项中的抗体或由该抗体产生的抗体片段作有效成分。
32.一种风湿病的治疗剂，它包含权利要求1-6或11或12任一项中的抗体或由该抗体产生的抗体片段作有效成分。
33.一种类风湿性关节炎的治疗剂，它包含权利要求1-6或11或12任一项中的抗体或由该抗体产生的抗体片段作有效成分。
34.一种变形性关节炎的治疗剂，它包含权利要求1-6或11或12任一项中的抗体或由该抗体产生的抗体片段作有效成分。
35.一种自身免疫性疾病的治疗方法，其特征在于，给自身免疫性疾病的患者施用权利要求1-6或11或12任一项中的抗体或由该抗体产生的抗体片段。
36.一种类风湿病的治疗方法，其特征在于，给类风湿病的患者施用权利要求1-6或11或12任一项中的抗体或由该抗体产生的抗体片段。
37.一种类风湿性关节炎的治疗方法，其特征在于，给类风湿性关节炎的患者施用权利要求1-6或11或12任一项中的抗体或由该抗体产生的抗体片段。
38.一种变形性关节炎的治疗方法，其特征在于，给变形性关节炎的患者施用权利要求1-6或11或12任一项中的抗体或由该抗体产生的抗体片段。
39.权利要求1-6或11或12任一项中的抗体或由该抗体产生的抗体片段在制备自身免疫性疾病治疗剂中的应用。
40.权利要求1-6或11或12任一项中的抗体或由该抗体产生的抗体片段在制备风湿病治疗剂中的应用。
41.权利要求1-6或11或12任一项中的抗体或由该抗体产生的抗体片段在制备类风湿性关节炎治疗剂中的应用。
42.权利要求1-6或11或12任一项中的抗体或由该抗体产生的抗体片段在制备变形性关节炎治疗剂中的应用。
43.一种自身免疫性疾病治疗剂的筛选方法，其特征在于，评价待检化合物对骨桥蛋白的RGD序列与整合素结合和/或SVVYGLR序列与整合素结合的抑制程度。
44.一种风湿病治疗剂的筛选方法，其特征在于，评价待检化合物对骨桥蛋白的RGD序列与整合素结合和/或SVVYGLR序列与整合素结合的抑制程度。
45.一种类风湿性关节炎治疗剂的筛选方法，其特征在于，评价待检化合物对骨桥蛋白的RGD序列与整合素结合和/或SVVYGLR序列与整合素结合的抑制程度。
全文摘要
一种重组抗骨桥蛋白抗体，至少其重链和轻链的恒定区转换成人源区域的抗体，它能抑制识别RGD序列的整合素与骨桥蛋白或其片段的结合，且能抑制识别SVVYGLR序列或其相当序列的整合素与骨桥蛋白或其片段的结合。该抗体作为自身免疫疾病治疗剂、风湿病治疗剂乃至类类风湿性关节炎的治疗剂的应用；提供治疗自身免疫性疾病、风湿病乃至类类风湿性关节炎的方法。另外，所讲骨桥蛋白抗体在风湿病的诊断药及诊断方法中应用。
文档编号A61P37/02GK1688604SQ0282341
公开日2005年10月26日 申请日期2002年9月25日 优先权日2001年9月25日
发明者上出利光, 今重之, 山本宣哉, 樋口浩文, 鸟饲正治, 时枝养之, 中岛敏博, 前田浩明 申请人:株式会社免疫生物研究所, 藤泽药品工业株式会社