专利名称：一种溶解血栓的重组蛋白及其工程菌的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种应用基因工程方法改造尿激酶原，生产溶解血栓的重组蛋白及其工程菌。
背景技术：
血栓病已成为危害现代人类健康的重大疾病之一，仅我国每年就至少新增500万患者。血栓类疾病不仅发病率高，而且死亡率与致残率也很高，溶栓治疗是血栓性疾病的安全而有效的手段，因此溶栓和溶栓辅助药物的研制进展迅速。
几十年来，从溶栓剂开始作为药物使用到现在，溶栓药物已经发展了三代第一代为尿激酶(u-PA)和链激酶(SK)，优点是溶栓效果强烈，缺点在于无纤维蛋白特异性，纤溶亢进。第二代为尿激酶原(pro-urokinase，pro-UK)、组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)、乙酰化纤溶酶原链激酶复合物(APSAC)等，具有纤维蛋白亲和性，出血副作用少，再通率高。但是容易再栓塞，且t-PA治疗颅内出血发生率较高。第三代为导向溶栓剂(抗体导向、磁导向、小肽导向等)，该类溶栓剂血栓特异性高、半衰期长、可减少用药量和副作用，正在开发和研制中。第二代尿激酶原的生物工程生产方法复杂，成本高。近年来，我国主要使用的溶栓药物还是以尿激酶为主。而尿激酶的生产依然停留在由人尿中提取，生产工艺非常繁琐，而且存在各种病原的潜在危险性。因此，利用基因工程技术，大量生产稳定高效具有导向性的溶栓药物，对于提高疗效和安全性、延长药物半衰期，以及降低生产成本有重要意义。
技术内容为了降低成本，获得与天然尿激酶原活性相同，而生产工序简化的溶解血栓药物，本发明提供一种溶解血栓的重组蛋白，其特征在于T H C F I D Y P K K E D Y T V Y L G R S
R L N S N T Q G E M K F E V E N L I L HK D Y S A D T L A H H N D I A L L K I RS K E G R C A Q P S R T I Q T I C L P SM Y N D P Q F G T S C E I T G F G K E NS T D Y L Y P E Q L K M T V V K L I S HR E C Q Q P H Y Y G S E V T T K M L C AA D P Q W K T D S C Q G D S G G P L V CS L Q G R M T L T G I V S W G R G C A LK D K P G V Y T R V S H F L P W I R S HT K E E N G L A L上述溶解血栓的重组蛋白的基因编码序列为ACACACTGCTTCATTGATTACCCAAAGAAGGAGGACTACATCGTCTACCTGGGTCGCTCAAGGCTTAACTCCAACACGCAAGGGGAGATGAAGTTTGAGGTGGAAAACCTCATCCTACACAAGGACTACAGCGCTGACACGCTTGCTCACCACAACGACATTGCCTTGCTGAAGATCCGTTCCAAGGAGGGCAGGTGTGCGCAGCCATCCCGGACTATACAGACCATCTGCCTGCCCTCGATGTATAACGATCCCCAGTTTGGCACAAGCTGTGAGATCACTGGCTTTGGAAAAGAGAATTCTACCGACTATCTCTATCCGGAGCAGCTGAAAATG ACTGTTGTGAAGCTGATTTCCCACCGGGAGTGTCAGCAGCCCCACTACTACGGCTCTGAAGTCACCACCAAAATGCTGTGTGCTGCTGACCCACAGTGGAAAACAGATTCCTGCCAGGGAGACTCAGGGGGACCCCTCGTCTGTTCCCTCCAAGGCCGCATGACTTTGACTGGAATTGTGAGCTGGGGCCGTGGATGTGCCCTGAAGGACAAGCCAGGCGTCTACACGAGAGTCTCACACTTCTTACCCTGGATCCGCAGTCACACCAAGGAAGAGAATGGCCTGGCCCTCTGATAG上述溶解血栓的重组蛋白可以采取以下方法获得由人细胞提取总RNA，根据尿激酶原分子活性中心两端的保守氨基酸序列，设计一对简并引物，Uf15’CTGTCACCTACGTGTGTGGAGGCAG 3’、Uf25’GAGAATCGTGCGGCCGCCTATCAGAGGGCCAGGCCAT 3’其中GCGGCCGC为Not I酶切位点，通过RT-PCR扩增获取在尿激酶原分子中去掉了N端143个氨基酸，以及151-157、179-184位氨基酸编码序列的sPA序列。选择性地保留了尿激酶原分子活性部位的氨基酸序列，使之由原来的12对二硫键减少为6对，但同样保持空间结构的稳定性。改造后的分子缺失了尿激酶原基因的生长因子类似区(EGF-LIKE DOMAIN)、环柄区(KRINGLE)、连接区、PAI-1因子(可以结合尿激酶使之失活，引起全身纤溶激活)结合位点，但保留了尿激酶原的活性区(sPA)。
为了实现第三代导向溶栓剂，本发明可以这样进行在sPA序列5’端加上一段GZ1序列GGCCCCGTGGTGATTCTGGTTTGAAATTCCAGTGTGGTCAGGGTCCACGTCCATCTAAAATCATCGGT
GGTGAATTCACCACCATTGAAAACCAGCCATGGTTCGCTGCTATCTACCGTGTTACCTACGTTTGCGGTGGTTCTTTGATCTCTCCATGCTGGGTGATCAGCGCC。
该GZ1序列的功能为(1)可以识别、结合和活化血小板上最丰富的膜糖蛋白GP IIb/IIIa，所以它可以通过抑制纤维蛋白原与膜糖蛋白GP IIb/IIIa的结合从而抑制血小板的凝集，理论上在体内表现为抗凝，起到防止灌注后再栓塞的作用。(2)对纤维蛋白有亲和力，血栓中富含纤维蛋白，所以重组蛋白GZ1-sPA在体内对血栓亲和力较高。
上述溶解血栓的重组蛋白序列的基因编码序列中的GZ1序列之氨基酸序列，其特征在于G P R G D S G L K F Q C G Q G P R P S K I I GG E F T T I E N Q P W F A A I Y R V T Y V C GG S L I S P C W V I S A通过基因工程方法获得了重组蛋白GZ1-sPA，该重组蛋白具有对纤维蛋白的高亲和力以及溶栓能力，因此有望成为新一代血栓导向溶栓药物。并且该重组蛋白在原核表达系统能稳定大量表达，其表达量远远高于其他表达系统中尿激酶原的表达量，因此通过基因工程能够工业化大量生产重组蛋白。
本发明的重组蛋白GZ1-sPA的基因编码序列为GGGCCCCGTGGTGATTCTGGTTTGAAATTCCAGTGTGGTCAGGGTCCACGTCCATCTAAAATCATCGGTGGTGAATTCACCACCATTGAAAACCAGCCATGGTTCGCTGCTATCTACCGTGTTACCTACGTTTGCGGTGGTTCTTTGATCTCTCCATGCTGGGTGATCAGCGCCACACACTGCTTCATTGATTACCCAAAGAAGGAGGACTACATCGTCTACCTGGGTCGCTCAAGGCTTAACTCCAACACGCAAGGGGAGATGAAGTTTGAGGTGGAAAACCTCATCCTACACAAGGACTACAGCGCTGACACGCTTGCTCACCACAACGACATTGCCTTGCTGAAGATCCGTTCCAAGGAGGGCAGGTGTGCGCAGCCATCCCGGACTATACAGACCATCTGCCTGCCCTCGATGTATAACGATCCCCAGTTTGGCACAAGCTGTGAGATCACTGGCTTTGGAAAAGAGAATTCTACCGACTATCTCTATCCGGAGCAGCTGAAAATGACTGTTGTGAAGCTGATTTCCCACCGGGAGTGTCAGCAGCCCCACTACTACGGCTCTGAAGTCACCACCAAAATGCTGTGTGCTGCTGACCCACAGTGGAAAACAGATTCCTGCCAGGGAGACTCAGGGGGACCCCTCGTCTGTTCCCTCCAAGGCCGCATGACTTTGACTGGAATTGTGAGCTGGGGCCGTGGATGTGCCCTGAAGGACAAGCCAGGCGTCTACACGAGAGTCTCACACTTCTTACCCTGGATCCGCAGTCACACCAAGGAAGAGAATGGCCTGGCCCTCTGATAG将重组蛋白的基因编码序列接入质粒pTRX中。首先通过两次PCR反应的方法人工合成GZ1序列。然后将GZ1序列用KpnI+BclI双酶切，sPA用BclI+NotI双酶切，以T4DNA连接酶在16℃下连接得到长度约为850bp的GZ1-sPA编码序列片段，与表达载体pTRX相连，构建重组质粒pTRX-GZ1-sPA。
将重组质粒pTRX-GZ1-sPA转化大肠杆菌BL21(DE3)，通过IPTG的诱导获得包含体形式的分子量为43KD的融合蛋白TRX-GZ1-sPA。经过变复性和纯化等步骤，用3C蛋白酶切割后，除去TRX，得到分子量为32KD的重组蛋白GZ1-sPA。该重组蛋白不仅具有血栓高亲和力，而且具有天然尿激酶原的纤溶活性，是一种新型的导向性溶血栓药物。
图1尿激酶原活性部位sPA氨基酸序列图2前导肽序列GZ1基因及其氨基酸序列图3重组质粒pTRX-GZ1-sPA构建的示意4重组质粒pTRX-GZ1-sPA酶切的电泳结果图5重组融合蛋白TRX-GZ1-sPA表达的电泳结果实施方案本发明通过以下实施例进一步阐述。
实施例一 尿激酶原活性中心基因片段sPA的获取用试剂盒Oligo(dT)提取人脐带静脉上皮细胞总RNA，逆转录合成cDNA。根据尿激酶原分子活性中心两端的保守氨基酸序列，设计简并引物Uf1、Uf2(由上海生工合成)，进行PCR扩增，得到长度约为650bp的尿激酶原活性中心基因片段sPA，其编码的氨基酸序列见图1。
引物Uf15’CTGTCACCTACGTGTGTGGAGGCAG 3’Uf25’GAGAATCGTGCGGCCGCCTATCAGAGGGGCCAGGCCAT 3’NotI实施例二 GZ1-sPA序列通过两次PCR反应合成前导序列GZ1，分别以P1、P2、P3、P4为引物，在5’端引入kpnl酶切位点和3C蛋白酶切割位点，在3’端引入BclI酶切位点，合成后的GZ1序列接在sPA片段的5’端。第一次PCR是利用P1和P2引物合成107bp的序列，第二次PCR则以第一轮PCR产物为模板，利用P3和P4引物合成200bp的序列，并导入KpnI酶切位点。以下为四个引物的序列P1(正向)5’-AA TTC CAG TGT GGT CAG GGT CCA CGT CCA TCT AAA ATCATC GGT GGT GAA TTC ACC ACC-3’P2(反向)5’-AAC GTA GGT AAC ACG GTA GAT AGC AGC GAA CCA TGG CTGGTT TTC AAT GGT GGT GAA TT-3’P3(正向)5’-GGT ACC CTG GAA GTT CTG TTC CAG GGG CCC CGT GGT GATTCT GGT TTG AAA TTC CAG TGT GGT-3’。其中GGTACC为KpnI酶切位点，CTGGAAGTTCTGTTCCAGGGGCCC为3C蛋白酶切割位点。
P4(反向)5’-GGC GCT GAT CAC CCA GCA TGG AGA GAT CAA AGA ACC ACCGCA AAC GTA GGT AAC ACG GT-3’。其中TGATCA为BclI酶切位点。
实施例三 重组表达质粒的构建将GZ1序列用KpnI+BclI双酶切。sPA序列用BclI+NotI双酶切，两个片段用T4DNA连接酶连接后，插到中间载体pBluescript的NotI-KpnI双酶切窗口。转化宿主菌并筛选重组质粒，经酶切电泳鉴定无误后，进行序列分析。
利用GZ1-sPA片段5’端的KpnI酶切位点，3’端的NotI酶切位点，将测序结果证明序列正确的GZ1-sPA片段从载体pBluescript-GZ1-sPA切下，插入pTRX表达载体的KpnI+NotI酶切窗口，构建融合表达质粒pTRX-GZ1-sPA(图3)。将之转化宿主菌BL21(DE3)并筛选重组质粒，挑出单克隆，进行酶切鉴定，电泳结果表明其大小与目标分子一致，长度约为850bp(见图4，图中“1”为DNA分子量参照，“2”为质粒pTRX/KpnI+NotI，“3”为重组质粒pTRX-GZ1-sPA/KpnI+NotI)。
实施例四 重组蛋白的表达与纯化上述含有重组质粒pTRX-GZ1-sPA的大肠杆菌已保存在“中国典型培养物保藏中心(武汉)”，保存号为CCTCC NOM203008将含有重组质粒pTRX-GZ1-sPA的大肠杆菌接种到20ml普通LB培养液中，37℃震摇12～20小时，转接到100ml加富LB培养基中，37℃震摇生长到OD600＝0.5～1.5时，在20～30C使用IPTG诱导7-15小时，获得大量包含体形式的融合蛋白(见图5中的“3、5”)，与预期约43KD的分子量大小一致。离心弃上清，超声法破碎细胞后离心收集沉淀。洗涤杂蛋白后，12,000rpm离心10分钟收集沉淀。变性剂溶解包含体蛋白后收集上清。2.5M尿素对上清进行复性。为了纯化重组尿激酶原，利用了融合蛋白上的6个组氨酸亲和位点，采用了Ni2+的亲和层析填料来进行纯化。经10～500mmol/L咪唑洗脱可得到目的蛋白。纯化后的融合蛋白纯度达到90％以上。
重组蛋白GZ1-sPA的获得经上述纯化后获得的融合蛋白TRX-GZ1-sPA，在3C蛋白酶切割缓冲液中用3C蛋白酶进行切割以除去TRX部分。然后以SephadexG-75纯化，获得分子量32KD的重组蛋白GZ1-sPA。
3C蛋白酶，又称PreScission蛋白酶，是GST(谷胱甘肽S-转移酶)和人鼻病毒3C蛋白酶的融合蛋白，切割位点在专一性的识别序列(N)LEVLFQ↓GP(C)中的QG之间，采用此蛋白酶进行切割，酶切后的重组尿激酶原蛋白N端会多出GP两个氨基酸残基(设计时将之包含在GZ1序列中)。
权利要求
1.一种溶解血栓的重组蛋白的氨基酸序列，其特征在于T H C F I D Y P K K E D Y I V Y L G R SR L N S N T Q G E M K F E V E N L I L HK D Y S A D T L A H H N D I A L L K I RS K E G R C A Q P S R T I Q T I C L P SM Y N D P Q F G T S C E I T G F G K E NS T D Y L Y P E Q L K M T V V K L I S HR E C Q Q P H Y Y G S E V T T K M L C AA D P Q W K T D S C Q G D S G G P L V CS L Q G R M T L T G I V S W G R G C A LK D K P G V Y T R V S H F L P W I R S HT K E E N G L A L
2.一种权利要求1所述溶解血栓的重组蛋白的基因编码序列ACACACTGCTTCATTGATTACCCAAAGAAGGAGGACTACATCGTCTACCTGGGTCGCTCAAGGCTTAACTCCAACACGCAAGGGGAGATGAAGTTTGAGGTGGAAAACCTCATCCTACACAAGGACTACAGCGCTGACACGCTTGCTCACCACAACGACATTGCCTTGCTGAAGATCCGTTCCAAGGAGGGCAGGTGTGCGCAGCCATCCCGGACTATACAGACCATCTGCCTGCCCTCGATGTATAACGATCCCCAGTTTGGCACAAGCTGTGAGATCACTGGCTTTGGAAAAGAGAATTCTACCGACTATCTCTATCCGGAGCAGCTGAAAATG ACTGTTGTGAAGCTGATTTCCCACCGGGAGTGTCAGCAGCCCCACTACTACGGCTCTGAAGTCACCACCAAAATGCTGTGTGCTGCTGACCCACAGTGGAAAACAGATTCCTGCCAGGGAGACTCAGGGGGACCCCTCGTCTGTTCCCTCCAAGGCCGCATGACTTTGACTGGAATTGTGAGCTGGGGCCGTGGATGTGCCCTGAAGGACAAGCCAGGCGTCTACACGAGAGTCTCACACTTCTTACCCTGGATCCGCAGTCACACCAAGGAAGAGAATGGCCTGGCCCTCTGATAG
3.根据权利要求2所述溶解血栓的重组蛋白的基因编码序列，其特征在于在序列5’端加上一段GZ1序列GGCCCCGTGGTGATTCTGGTTTGAAATTCCAGTGTGGTCAGGGTCCACGTCCATCTAAAATCATCGGTGGTGAATTCACCACCATTGAAAACCAGCCATGGTTCGCTGCTATCTACCGTGTTACCTACGTTTGCGGTGGTTCTTTGATCTCTCCATGCTGGGTGATCAGCGCC。
4.一种权利要求3所述溶解血栓的重组蛋白的基因编码序列中的GZ1序列之氨基酸序列，其特征在于G P R G D S G L K F Q C G Q G P R P S K I I G GE F T T I E N Q P W F A A I Y R V T Y V C G G SL I S P C W V I S A
5.一种含有权利要求2或3所述的溶解血栓的重组蛋白基因编码序列的重组质粒，其特征在于将重组蛋白的基因编码序列接入质粒pTRX中。
6.一种含有权利要求5所述的重组质粒的大肠杆菌，其特征在于将重组质粒转化大肠杆菌。
全文摘要
本发明涉及一种应用基因工程方法改造尿激酶原，生产溶解血栓的重组蛋白及其工程菌。如右式该重组蛋白选择性地保留了尿激酶原分子活性部位的氨基酸序列，使之由原来的12对二硫键减少为6对，但同样保持空间结构的稳定性和溶栓能力。
文档编号A61P7/00GK1534094SQ03114009
公开日2004年10月6日 申请日期2003年3月28日 优先权日2003年3月28日
发明者吴文言, 杨晓仪, 林键 申请人:中山大学