一种具有抗肿瘤活性的水溶性杂多糖及其制备方法和用途的制作方法

文档序号:970197阅读:564来源:国知局
专利名称:一种具有抗肿瘤活性的水溶性杂多糖及其制备方法和用途的制作方法
技术领域
本发明涉及具有抗肿瘤活性的水溶性杂多糖及其制备方法和用途。属于天然高分子领域,也属于分子生物学领域。
为实现上述目的,本发明所采用的技术方案如下一种具有抗肿瘤活性的水溶性杂多糖(ac-PCM2),由下法制得采用人工培育的茯苓菌种(Poria cocos)在含玉米浆的液体培养基中深层发酵培养出茯苓菌丝体,将茯苓菌丝体依次用乙酸乙酯、丙酮进行索氏提取去除脂肪;然后浸泡在生理盐水中,离心,离心后所得沉淀用105~120℃的热水在0.12~0.20MPa下浸泡提取,离心,收集提取液;提取液浓缩后,用H2O2脱色,用Sevag法除去游离的蛋白质直至紫外检测无280nm的蛋白质吸收峰,然后逆向流水透析,最后冷冻干燥得水溶性杂多糖纯品。
上述水溶性杂多糖主要由α-D-葡萄糖、甘露糖、半乳糖和蛋白质组成。其中含蛋白质18.1%,多糖81.9%(多糖中α-D-葡萄糖占51.4%、半乳糖占29.7%、甘露糖占19.1%、岩藻糖占0.8%),重均分子量为17.0×104。以上均为重量百分比。
本发明还提供了上述水溶性杂多糖的制备方法,采用人工培育的茯苓菌种(Poria cocos;中国科学院微生物所菌种保藏中心提供,编号5.78)在含玉米浆的液体培养基中深层发酵培养出茯苓菌丝体,将茯苓菌丝体依次用乙酸乙酯、丙酮进行索氏提取去除脂肪;然后浸泡在生理盐水中,离心,离心后所得沉淀用105~120℃的热水在0.12~0.20MPa下浸泡提取,离心,收集提取液。提取液浓缩后,用20%~30%(重量百分比)H2O2脱色,用Sevag法除去游离的蛋白质直至紫外检测无280nm的蛋白质吸收峰,然后透析、冷冻干燥得所需水溶性杂多糖(ac-PCM2)纯品。
上述培养基的基本组成为1L蒸馏水含玉米浆5~15mL、D-葡萄糖20~30g、酵母膏3~3.5g、KH2PO40.8~1.2g,CaCl2·2H2O 0.04~0.08g,MnCl2·4H2O 3~7mg、MgSO4·7H2O 0.3~0.7g、ZnCl22~6mg、Fe2(SO4)33~7mg、维生素B10.08~0.12mg、蒸馏水1L。
上述茯苓菌丝体索氏提取去除脂肪时间在4~8小时,其在生理盐水中的提取时间在8~12小时;透析时间在5~10天。
上述水溶性杂多糖可用作抗肿瘤药物或提高机体免疫功能的保健品。
用红外光谱、核磁共振、气相色谱、蛋白质分析仪、粘度计及光散射仪确定了上述水溶性杂多糖化学组成和二级结构。
该水溶性杂多糖对植入小鼠体内的Sarcoma 180肿瘤抑制率的结果其抗肿瘤活性明显高于其它杂多糖,且无毒副作用,可用作保健品,作为抗肿瘤天然药物也具有应用前景。
与已有技术相比较,本发明的创新如下所提供的茯苓菌丝体水溶性杂多糖为一种结构清楚的全新物质,它具有明显的抗肿瘤活性,且无毒副作用。这种茯苓菌丝体杂多糖可望成为有开发前景的抗肿瘤药物或提高机体免疫功能的保健品。该多糖的制备方法是培养基中采用廉价的玉米浆为主要原料,利用生物工程发酵技术培养茯苓菌丝体,并从中分离出具有抗肿瘤活性的多糖。它比用麸皮为主要原料的培养基得到的菌丝体多糖具有更显著的抗肿瘤活性。不同培养基得到的菌丝体多糖其化学组成、蛋白质含量和分子量均不同,因此影响到生物活性的不同。本发明制法简单,易以工业化生产。
将茯苓菌丝体从培养基中过滤分离后,经冷冻干燥得到的粉末依次用乙酸乙酯、丙酮进行索氏提取各8小时。然后用9g/L氯化钠水溶液提取三次浸泡在9g/L氯化钠水溶液中过夜,离心,收集上清液(ac-PCM1)。残渣用热水于高压120℃下提取三次,每次半小时,离心,收集上清液(ac-PCM2)。提取液浓缩后,均用30%(重量百分比)H2O2脱色,用Sevag法除去游离的蛋白质,反复进行9次直至紫外检测无280nm处的吸收峰,然后分别用清水和二次蒸馏水透析5天和3天,浓缩,最后冷冻干燥得多糖纯品。茯苓菌丝体培养液过滤,浓缩后用30%H2O2脱色,用Sevag法除去游离的蛋白质,反复进行9次直至紫外检测无280nm处的吸收峰,然后分别用清水和二次蒸馏水透析5天和3天,浓缩,最后冷冻干燥得胞外多糖(ac-PCM0)。所得多糖均为浅黄色粉状固体。
对照组液体培养基配方为1L蒸馏水中含麸皮(200g)的提取液,D-葡萄糖(25g),酵母膏(3.2g),KH2PO4(1.0g),CaCl2·2H2O(0.06g),MnCl2·4H2O(5mg),MgSO4·7H2O(0.5g),ZnCl2(4mg),Fe2(SO4)3(5mg),维生素B1(0.1mg)。菌丝体培养方法和茯苓菌丝体水溶性杂多糖提取方法司ac-PCM0和ac-PCM1上。所得多糖为浅黄色固体粉末分别命名为ab-PCM0和ab-PCM1。
这些多糖的组成、蛋白质含量、分子量以及产率列于附表1,多糖样品经香港中文大学生物系对植入Sarcoma 180肿瘤小鼠进行体内腹腔注射试验,得出抗肿瘤活性结果列于附表2。由此表明由含玉米浆培养基培养的菌丝体多糖ac-PCM2具有明显的抗肿瘤活性。同时对本发明的水溶性杂多糖进行人体急性白血病毒细胞(HL-60)的抗增殖实验结果表明其对增殖有显著的抑制效果,而不会破坏正常猴肾细胞的增殖。该多糖可用于制备抗肿瘤药物和提高机体免疫功能的保健品。附表1.茯苓菌丝体多糖单糖组成、蛋白质含量、产率和分子量

-未检测到;+痕量附表2.茯苓菌丝体多糖的抗肿瘤活性

-对小鼠体内的Sarcoma 180肿瘤的生长没有明显的抑制作用*p<0.0权利要求
1.一种具有抗肿瘤活性的水溶性杂多糖,由下法制得采用人工培育的茯苓菌种(Poriacocos)在含玉米浆的液体培养基中深层发酵培养出茯苓菌丝体,将茯苓菌丝体依次用乙酸乙酯、丙酮进行索氏提取去除脂肪;然后浸泡在生理盐水中,离心,离心后所得沉淀用105~120℃的热水在0.12~0.20MPa下浸泡提取,离心,收集提取液;提取液浓缩后,用H2O2脱色,用Sevag法除去游离的蛋白质直至紫外检测无280nm的蛋白质吸收峰,然后透析、冷冻干燥得水溶性杂多糖纯品。
2.权利要求1所述水溶性杂多糖的制备方法,其特征在于采用人工培育的茯苓菌种(Poriacocos)在含玉米浆的液体培养基中深层发酵培养出茯苓菌丝体,将茯苓菌丝体依次用乙酸乙酯、丙酮进行索氏提取去除脂肪;然后浸泡在生理盐水中,离心,离心后所得沉淀用105~120℃的热水在0.12~0.20MPa下浸泡提取,离心,收集提取液;提取液浓缩后,用20%~30%(重量百分比)H2O2脱色,用Sevag法除去游离的蛋白质直至紫外检测无280nm的蛋白质吸收峰,然后透、冷冻干燥得多糖纯品。
3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于所述培养基的基本组成为1L蒸馏水含玉米浆5~15mL、D-葡萄糖20~30g、酵母膏3~3.5g、KH2PO40.8~1.2g、CaCl2·2H2O 0.04~0.08g、MnCl2·4H2O 3~7mg、MgSO4·7H2O 0.3~0.7g、ZnCl22~6mg、Fe2(SO4)33~7mg、维生素B10.08~0.12mg。
4.根据权利要求2或3所述的方法,其特征在于上述茯苓菌丝体索氏提取去除脂肪时间在4~8小时,其在生理盐水中的提取时间在8~12小时;透析时间在5~10天。
5.权利要求1所述的水溶性杂多糖用作抗肿瘤药物或提高机体免疫功能的保健品。
全文摘要
本发明公开了具有抗肿瘤活性的人工培养菌种的茯苓菌丝体水溶性杂多糖及其制备方法和用途。用玉米浆为主要成分配制成培养基,由野生茯苓菌种深层发酵培养出茯苓菌丝体。分别用生理盐水和热水从菌丝体中提取水溶性杂多糖。所得该杂多糖主要由α-D-葡萄糖、甘露糖、半乳糖和蛋白质组成。体内活性实验表明,该水溶性杂多糖对植入小鼠体内的Sarcoma180肿瘤的生长具有明显的抑制作用,而且无毒副作用。体外活性实验表明,该类多糖对人体急性白血病毒细胞(HL-60)的增殖有显著的抑制效果,而且不会破坏正常猴肾细胞的增殖。上述水溶性杂多糖可用作抗肿瘤药物或提高机体免疫功能的保健品。
文档编号A61K31/715GK1425694SQ0311841
公开日2003年6月25日 申请日期2003年1月6日 优先权日2003年1月6日
发明者张俐娜, 陈莉, 金勇 , 林雨露, 张玫, 张志强 申请人:武汉大学
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