专利名称：中国人基因组cDNA文库白细胞介素21的编码基因序列及其蛋白质的氨基酸序列的制作方法
技术领域：
本发明涉及一个由中国人基因组cDNA文库编码的具有潜在医药用途的细胞因子的基因及其cDNA序列，以及由此序列所决定的白细胞介素21的化学一级结构序列，属于医药生物工程技术领域。
背景技术：
人类白细胞介素是人体内细胞产生的一类具有多种生物学活性的蛋白质的总称，其中人类白细胞介素2、人类白细胞介素6已经作为免疫调节类药物使用。人类白细胞介素21是其家族中的一种蛋白质。人类白细胞介素21具有多种生物学活性，主要表现在活化人体免疫系统的NK细胞，增强机体的特异性和非特异性免疫机能，从而发挥抗肿瘤、抗病毒感染及免疫调节等作用，因此人类白细胞介素21是一种有较好开发前景的新型药物。
在国际上已经报道了来自美国人基因组的白细胞介素21的序列。目前尚无从中国人基因组cDNA文库中分离、克隆编码白细胞介素21的编码基因，并在体外经基因重组技术进行表达，从而获得中国人基因组cDNA文库编码的重组人类白细胞介素21的报道，也无有关重组白细胞介素21生物学活性的有关报道。
发明内容
本发明的目的是提供中国人基因组cDNA文库白细胞介素21的编码基因序列。
本发明的另一个目的是提供中国人基因组cDNA文库白细胞介素21的蛋白质的氨基酸序列。
本发明的第三个目的是提供中国人基因组cDNA文库白细胞介素21的基因工程表达产物制备方法，在国际上首次使用51Cr释放试验证明该基因工程重组的白细胞介素21在体外对NK细胞的激活作用，结果证实该基因工程重组的白细胞介素21有较好的免疫调节活性，可以作为免疫调节类基因工程药物。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案中国人基因组cDNA文库白细胞介素21的编码基因序列，该序列如下gctgaagtgaaaacgagaccaaggtctagctctactgttggtacttatgagatccagtcctggcaacatggaga
gggttgtcatctgtctgatggtcatcttcttggggacactggtccacaaatcaagctcccaaggtcaagatcgccacatgattagaatgcgtcaacttatagatattgttgatcagctgcataattatgtgaatgacttggtccctgaatttctgccagctccagaagatgtagagacaaactgtgagtggtcagctttttcctgttttcagaaggcccaactaaagtcagcaaatacaggaaacaatgaaaggataatcaatgtatcaattaaaaagctgaagaggaaaccaccttccacaaatggagggagaagacagaaacacagactaacatgcccttcatgtgattcttatgagaaaaaaccacccaaagaattcctagaaagattcaaatcacttctccaaaagatgattcatcagcatatctcctctagaacacacggaagtgaagattcctgaggatctaacttgcagttggacactatgttacatactctaatatagtagtgaaagtcatttctttgtattccaagtggaggagccctattaaattatataaagaaata。
中国人基因组cDNA文库白细胞介素21的氨基酸序列，该序列如下MRSSPGNMERVVICLMVIFLGTLVHKSSSQGQDRHMIRMRQLIDIVDQLHNYVNDLVPEFLPAPEDVETNCEWSAFSCFQKAQLKSANTGNNERIINVSIKKLKRKPPSTNGGRRQKHRLTCPSCDSYEKKPPKEFLERFKSLLQKMIHQHISSRTHGSEDS。
中国人基因组cDNA文库白细胞介素21的编码基因序列的衍生序列。
所述衍生序列是指包括新分离的具有同样基本结构的基因序列及使用体外DNA操作技术通过碱基的置换、或插入、或缺失获得的该基因序列的各种变构体。
所述的中国人基因组cDNA文库白细胞介素21的变构体。
所述的变构体包括在相应蛋白质的氨基酸序列基础上经过单个或多个氨基酸的置换、或插入、或缺失等形成的各种变构体。
所述的中国人基因组cDNA文库白细胞介素21用于制备免疫调节类基因工程药物的应用。
所述的中国人基因组cDNA文库白细胞介素21的变构体用于制备免疫调节类基因工程药物的应用。
本发明的有益效果是，根据本发明的中国人基因组cDNA文库白细胞介素21编码基因的cDNA序列，可以从人类CD3+细胞的cDNA文库中克隆人类白细胞介素21的编码基因，该编码基因通过基因重组技术，可以在真核表达系统(如酵母细胞或动物细胞)或原核表达系统(如大肠杆菌)中获得重组表达，本发明提供了中国人基因组cDNA文库白细胞介素21的基因工程表达产物制备方法，在国际上首次使用51Cr释放试验证明该基因工程重组的白细胞介素21在体外对NK细胞的激活作用，结果证实该基因工程重组的白细胞介素21有较好的免疫调节活性，可以作为免疫调节类基因工程药物。重组人类白细胞介素21在人体内具有多种生物学活性，可以发挥抗肿瘤、抗病毒感染及免疫调节等作用，是新的基因工程药物。
图1为本发明的技术流程图。
具体实施例方式
中国人基因组cDNA文库白细胞介素21编码基因的DNA(mRNA)序列和氨基酸序列的获得如图1所示，该操作包括如下步骤(1)CD3+细胞的分离和活化手术取一位健康中国男子的扁桃体，置75％乙醇中浸泡消毒，在平皿中用Hanks液洗净血液，在盛有5mlRPMI-1640细胞培养液的平皿中剪碎扁桃体组织制成细胞悬液，通过200目的金属细胞筛，分离单个细胞悬液。将单个细胞悬液转入试管中，在上层小心加入2ml淋巴细胞分离液(上海生化二厂生产)，室温静止3min后，用吸管将细胞层和淋巴细胞分离液的交界处的细胞层取出。用Hanks液反复冲洗后，计数使细胞悬液为1×107/ml，加入10％的PHA放置37℃，5％CO2培养孵育24h后收获细胞。
(2)活化的CD3+细胞的总RNA提取将上述得到的细胞悬液3000rpm离心，沉淀加入1ml Trizol液，充分吹打至细胞完全溶解，室温放置5-10分钟。加入0.2ml氯仿，冰浴放置2min。12000rpm离心15分钟，将上层水相转入一干净管中，加入等量异丙醇混匀，12000rpm离心10min，弃上清，室温干燥10min，用50μl无RNA酶的纯水溶解。
(3)RT-PCR扩增国人白细胞介素21的编码基因使用Promega公司的ReverseTranscription System(Cat.No.A3500)，以Olig(dT)6为引物对总RNA进行反转录合成cDNA。根据国际上已报道的来自美国人基因组的白细胞介素21的序列设计克隆引物序列(上游P15`GCTGAAGTGAAAACGAG 3`；下游5`TGGAATACA AAGAAATGAC3`)。PCR反应总体系为200μl，其中上下游引物各1μmol/L，4种dNTPs各0.2μmol/L，10×buffer 20μl，1.5mol/L Mgcl2，Taq DNA聚合酶10U，cDNA模板10μl，充分混匀后置DNA扩增仪进行反应。反应条件为94℃预变性4分钟，然后94℃30秒，60℃30秒，72℃30秒进行35个循环，最后72℃延伸5分钟。PCR扩增出642 bp的白细胞介素21编码基因。
(4)将PCR产物插入Promega公司生产的pGEM-T Easy Vector System I(Cat.No.A1360)中构建重组克隆载体转入大肠杆菌JM109中，通过限制性内切酶EcoRI酶切鉴定阳性重组克隆。将阳性重组克隆用T7通用引物进行DNA序列测定(使用ABIDNA自动序列测定仪)，得到本发明的中国人基因组cDNA文库白细胞介素21编码基因的DNA(mRNA)序列gctgaagtgaaaacgagaccaaggtctagctctactgttggtacttatgagatccagtcctggcaacatggagagggttgtcatctgtctgatggtcatcttcttggggacactggtccacaaatcaagctcccaaggtcaagatcgccacatgattagaatgcgtcaacttatagatattgttgatcagctgcataattatgtgaatgacttggtccctgaatttctgccagctccagaagatgtagagacaaactgtgagtggtcagctttttcctgttttcagaaggcccaactaaagtcagcaaatacaggaaacaatgaaaggataatcaatgtatcaattaaaaagctgaagaggaaaccacc+tccacaaatggagggagaagacagaaacacagactaacatgcccttcatgtgattcttatgagaaaaaaccacccaaagaattcctagaaagattcaaatcacttctccaaaagatgattcatcagcatatctcctctagaacacacggaagtgaagattcctgaggatctaacttgcagttggacactatgttacatactctaatatagtagtgaaagtcatttctttgtattccaagtggaggagccctattaaattatataaagaaata通过比较，该基因序列与国际上已报道的来自美国人基因组cDNA文库白细胞介素21的编码基因序列有5个碱基的差异，其碱基变化及位点如表1所示表1、人基因组的白细胞介素21的基因序列比较
(5)使用DNASATR软件，根据这个中国人基因组cDNA文库白细胞介素21编码基因的DNA(mRNA)序列，得出人类白细胞介素21的蛋白质的化学一级结构(氨基酸序列)MRSSPGNMERVVICLMVIFLGTLVHKSSSQGQDRHMIRMRQLIDIVDQLHNYVNDLVPEFLPAPEDVETNCEWSAFSCFQKAQLKSANTGNNERIINVSIKKLKRKPPSTNGGRRQKHRLTCPSCDSYEKKPPKEFLERFKSLLQKMI
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该氨基酸序列与国际上已报道的来自美国人基因组cDNA文库白细胞介素21的编码基因序列决定的氨基酸的一级序列有3个氨基酸的变异，其氨基酸变化及位点如表2所示表2、白细胞介素21的序列决定的氨基酸的一级序列比较
(6)白细胞介素21的原核表达体系的建立将白细胞介素21的PCR扩增产物和原核表达质粒pGEX4T-2(Promega公司)用限制性核酸内切酶BamHI和EcoRI(Promega公司)37℃水浴酶切4h后，在T4连接酶(Promega公司)的作用下连接构建成重组质粒。把插入白细胞介素21的pGEX4T-2重组质粒转化宿主菌大肠杆菌BL21构建原核表达体系。
(7)白细胞介素21的原核表达和初步纯化挑取含插入白细胞介素21的pGEX4T-2重组质粒的宿主菌BL21接种于500mlLB培养液中(含100μg/ml氨苄青霉素)，37℃振荡培养至OD600约为0.2。加诱导剂IPTG至终浓度1mmol/L，37℃继续培养4h。收集诱导表达的宿主菌，6000rpm离心5min收集菌斑后加10ml无菌双蒸水重悬菌斑，在冰浴中用超声细胞破碎仪进行超声破碎细菌，频率为15kHz，每次时间为1min，重复4次，12000rpm离心10min，收集上清。用PIERCE公司生产的B-PER@GST Fusion Protein Purification Kit(Lot# D156592)纯化蛋白。所得的融合蛋白加入凝血酶原(Sigma公司)切割融合蛋白。
(8)51Cr释放试验白细胞介素21对NK细胞的活性检测1)、靶细胞的制备取经24-48h培养的靶细胞(体外传代细胞株K562)，用RPMI-1640培养液洗涤1次，1000r/min离心6min。去上清，用RPMI-1640培养液重悬后计数，将细胞数调整至4×106/ml。取上述靶细胞0.5ml，加入150μCi51Cr，置37℃水浴90min，每隔15min震摇一次。然后用含5％胎牛血清的RPMI-1640培养液洗涤三次，除去游离的51Cr。计数活细胞，用RPMI-1640培养液调整细胞浓度至1×105/ml。检测靶细胞的51Cr标记率为0.3cpm/细胞。
2)、效应细胞的制备用淋巴细胞分层液常规方法分离人外周血单个核细胞(PBMC)，用RPMI-1640培养液配制成1×107/ml的细胞悬液。
3)、效应细胞和靶细胞的作用无菌取效应细胞和靶细胞各0.1ml(E/T＝100∶1)，加入24孔培养板的前4列中，每列3个复孔，在前3列中分别加入不同稀释度的白细胞介素21，每孔5μl，其稀释度分别为1∶10、1∶100、1∶1000，第4列为不加白细胞介素21的空白对照孔，放置37℃，5％CO2培养孵育4h。同时设立自然释放对照孔(0.1ml靶细胞+0.1ml RPMI-1640培养液)和最大释放孔(0.1ml靶细胞+0.1ml 2％SDS)，取出后用微量移液器吸出各孔上清液0.1ml，加入小塑料管中，用γ计数仪测量cpm值。
4)、结果计算根据公式计算51Cr自然释放率和NK细胞的活性 检测结果为51Cr自然释放率为7.3％，第4列不加白细胞介素21的空白对照孔NK细胞的活性为34％，第一列加1∶10白细胞介素21的NK细胞的活性为46％，第二列加1∶100白细胞介素21的NK细胞的活性为42％，第三列加1∶1000白细胞介素21的NK细胞的活性为37％。
序列表<110>北京博泰迪生物工程科技开发有限公司<120>中国人基因组cDNA文库白细胞介素21的编码基因序列及其蛋白质的氨基酸序列<130>
<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>642<212>DNA<213>人属，人种(Homo sapiens，human)<400>1gctgaagtga aaacgagacc aaggtctagc tctactgttg gtacttatga gatccagtcc 60tggcaacatg gagagggttg tcatctgtct gatggtcatc ttcttgggga cactggtcca 120caaatcaagc tcccaaggtc aagatcgcca catgattaga atgcgtcaac ttatagatat 180tgttgatcag ctgcataatt atgtgaatga cttggtccct gaatttctgc cagctccaga 240agatgtagag acaaactgtg agtggtcagc tttttcctgt tttcagaagg cccaactaaa 300gtcagcaaat acaggaaaca atgaaaggat aatcaatgta tcaattaaaa agctgaagag 360gaaaccacct tccacaaatg gagggagaag acagaaacac agactaacat gcccttcatg 420tgattcttat gagaaaaaac cacccaaaga attcctagaa agattcaaat cacttctcca 480aaagatgatt catcagcata tctcctctag aacacacgga agtgaagatt cctgaggatc 540taacttgcag ttggacacta tgttacatac tctaatatag tagtgaaagt catttctttg 600tattccaagt ggaggagccc tattaaatta tataaagaaa ta 642<210>2<211>162<212>PRT
<213>人属，人种(Homo sapiens，human)<400>2Met Arg Ser Ser Pro Gly Asn Met Glu Arg Val Val Ile Cys Leu Met1 5 10 15Val Ile Phe Leu Gly Thr Leu Val His Lys Ser Ser Ser Gln Gly Gln20 25 30Asp Arg His Met Ile Arg Met Arg Gln Leu Ile Asp Ile Val Asp Gln35 40 45Leu His Asn Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro Glu Phe Leu Pro Ala Pro50 55 60Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala Phe Ser Cys Phe Gln65 70 75 80Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Ash Ash Glu Arg Ile Ile85 90 95Ash Val Ser Ile Lys Lys Leu Lys Arg Lys Pro Pro Ser Thr Asn Gly100 105 110Gly Arg Arg Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro Ser Cys Asp Ser Tyr115 120 125Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe Lys Ser Leu Leu130 135 140Gln Lys Met Ile His Gln His Ile Ser Ser Arg Thr His Gly Ser Glu145 150 155 160Asp Ser
权利要求
1.中国人基因组cDNA文库白细胞介素21的编码基因序列，该序列如下gctgaagtgaaaacgagaccaaggtctagctctactgttggtacttatgagatccagtcctggcaacatggagagggttgtcatctgtctgatggtcatcttcttggggacactggtccacaaatcaagctcccaaggtcaagatcgccacatgattagaatgcgtcaacttatagatattgttgatcagctgcataattatgtgaatgacttggtccctgaatttctgccagctccagaagatgtagagacaaactgtgagtggtcagctttttcctgttttcagaaggcccaactaaagtcagcaaatacaggaaacaatgaaaggataatcaatgtatcaattaaaaagctgaagaggaaaccaccttccacaaatggagggagaagacagaaacacagactaacatgcccttcatgtgattcttatgagaaaaaaccacccaaagaattcctagaaagattcaaatcacttctccaaaagatgattcatcagcatatctcctctagaacacacggaagtgaagattcctgaggatctaacttgcagttggacactatgttacatactctaatatagtagtgaaagtcatttctttgtattccaagtggaggagccctattaaattatataaagaaata。
2.中国人基因组cDNA文库白细胞介素21的氨基酸序列，该序列如下MRSSPGNMERVVICLMVIFLGTLVHKSSSQGQDRHMIRMRQLIDIVDQLHNYVNDLVPEFLPAPEDVETNCEWSAFSCFQKAQLKSANTGNNERIINVSIKKLKRKPPSTNGGRRQKHRLTCPSCDSYEKKPPKEFLERFKSLLQKMIHQHISSRTHGSEDS。
3.根据权利要求1所述的中国人基因组cDNA文库白细胞介素21的编码基因序列的衍生序列。
4.根据权利要求3所述的衍生序列，其特征在于所述衍生序列是指包括新分离的具有同样基本结构的基因序列及使用体外DNA操作技术通过碱基的置换、或插入、或缺失获得的该基因序列的各种变构体。
5.根据权利要求2所述的中国人基因组cDNA文库白细胞介素21的变构体。
6.根据权利要求5所述的中国人基因组cDNA文库白细胞介素21的变构体，其特征在于所述的变构体包括在相应蛋白质的氨基酸序列基础上经过单个或多个氨基酸的置换、或插入、或缺失等形成的各种变构体。
7.根据权利要求2所述的中国人基因组cDNA文库白细胞介素21用于制备免疫调节类基因工程药物的应用。
8.根据权利要求5或6所述的中国人基因组cDNA文库白细胞介素21的变构体用于制备免疫调节类基因工程药物的应用。
全文摘要
本发明涉及中国人基因组cDNA文库白细胞介素21的编码基因序列及其蛋白质的氨基酸序列，属于医药生物工程技术领域。该白细胞介素21的基因序列和氨基酸序列如序列表所示。本发明的有益效果是，该编码基因通过基因重组技术，可以在真核表达系统(如酵母细胞或动物细胞)或原核表达系统(如大肠杆菌)中获得重组表达，本发明提供了中国人基因组cDNA文库白细胞介素21的基因工程表达产物制备方法，在国际上首次使用51Cr释放试验证明该基因工程重组的白细胞介素21在体外对NK细胞的激活作用，结果证实该基因工程重组的白细胞介素21有较好的免疫调节活性，可以作为免疫调节类基因工程药物，可以发挥抗肿瘤、抗病毒感染及免疫调节等作用，是新的基因工程药物。
文档编号A61P37/02GK1513993SQ0312306
公开日2004年7月21日 申请日期2003年4月29日 优先权日2002年12月31日
发明者王斌, 钱冬萌, 阎志勇, 李方, 王 斌 申请人:北京博泰迪生物工程科技开发有限公司