专利名称：重组人糖原磷酸化酶同工酶bb和应用甲醇酵母制备的方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种应用DNA技术生产基因工程蛋白药物，尤其是设计一种应用甲醇酵母生产重组人糖原磷酸化酶同工酶BB(GPBB)及其生产方法和它的应用。
背景技术：
心血管病已成为国人首要死因之一，尤其是对高节奏工作的中老年人造成严重威胁，其中病死率最高的是急性心肌梗死(AMI)。AMI致死的重要原因是早期诊断困难而延误了治疗时期。尽管目前心电图(ECG)检查及血清酶学检测可以诊断AMI，但仍有50％的AMI因不具备典型症状，或ECG和血清酶检测无典型变化，在AMI发作的早期被漏诊而失掉抢救时机。临床生化学家一直不断寻找灵敏特异的心肌损伤指标。糖原磷酸化酶(Glycogen phosphorylase)已知有三种主要同工酶，即GPBB(脑，心肌型)，GPMM(肌型)，GPLL(肝型)。GPBB除脑细胞外，大量存于心肌细胞中。近年发现GPBB是AMI早期诊断新的灵敏特异指际，与其它目前临床应用的心肌标记物(如CK-MB、cTnT、cTnI，肌红蛋白等)比较，GPBB更具特异性和高敏感性。如AMI发作时，患者出现胸痛症状后，2-4小时内，GPBB即在外围血中明显增高，较其它心肌标记物更早出现且更敏感。GPBB还有助于不稳定心绞痛、冠状动脉搭桥术(CABG)并发症的早期诊断，尤其对于CABG并发症更是目前唯一早期增高的生化指际。现已证实GPBB对病人的病情发展过程即随诊和予后判断均有重要意义，具有良好的临床应用价值。
GPBB作为糖原分解的关键酶，是心肌细胞中肌浆网结构(SR)中糖原分解复合物的特定成分，而这种复合物的结合和分解取决于心肌的氧及血液供给状态。正常条件下，糖原磷酸化酶复合物与SR牢固结合，不易分解。但当心肌细胞缺血，缺氧时，这种糖原分解的关键酶GPBB即可加速其分解过程。糖原降解过程可被GPa(同工酶的磷酸化活性形式)和GPb(非磷酸化活性形式)及AMP依赖形式所共同催化。缺血发生后，有利于结合型GPb向GPa转化(非活性型向活性型转化)，从而加速糖原分解过程，亦是使GP成为可溶性二聚体的先决条件。GPBB的释放依赖于糖原的降解，继而随着缺血伴有的细胞膜通透性改变，大量释放入血液中。这就是AMI时GPBB快速释放入血的主要机理。此外，心肌细胞缺氧、缺血时，可影响线粒体内呼吸链酶系的活性，各种递氢体所带的氢不能通过呼吸链氧化成水，也使氧化磷酸化进程受到影响，心肌细胞内ATP的生成大为减少，而ADP与无机磷酸盐增多。但心肌活动仍继续消耗ATP，因而高能磷酸化合物的储备急剧减少。ADP与无机磷酸盐增多，将促进磷酸化酶的活性，于是心肌细胞内糖原分解和利用加速，导致GPBB加速释放入血，使血浆GPBB合量急剧增加。从人类心脏组织中直接分离到高度纯化GPBB的实验技术并不复杂，但心脏组织来源有限，所以该蛋白成品(天然抗原)的价格昂贵，无法应用于临床实际。aGPBB这种新型诊断试剂，迄今国内外尚无相关报道和相应的新产品上市。
发明内容
本发明解决了现有技术对AMI不能做到快速、准确、低成本、广谱的早期诊断的缺陷，提供一种对AMI的早期诊断具有敏感性和特异性，且使用成本低的应用甲醇酵母生产的重组人糖原磷酸化酶同工酶BB及其生产方法和它的应用。
本发明的技术方案如下本发明应用DNA技术生产基因工程蛋白药物，尤其是应用甲醇酵母生产重组人糖原磷酸化酶同工酶BB(GPBB)免疫显性片段的步骤如下①按酵母嗜好的密码子人工合成糖原磷酸化酶同工酶BB免疫显性片段的编码基因，融合于酵母表达调控元件，构建甲醇酵母高表达工程菌；②甲醇酵母工程菌高密度发酵表达；③采用超滤、葡剩糖凝胶层析、离子梯度凝胶层析等纯化技术的顺序组合，纯化回收GPBB；④应用该蛋白质产生抗GPBB抗体。
基因工程和微生物工程技术的兴起为合成和生产外源蛋白展示出广阔的前景。本发明采用真核表达系统甲醇酵母(Pichia pastoris巴斯德毕赤酵母，Pp)来表达该蛋白。Pp是近年发展起来的新一代酵母表达系统，较其它蛋白表达系统如大肠杆菌表达系统、昆虫细胞和哺乳动物细胞表达系统等，均有明显的优点(1)具有强有力的乙醇氧化酶基因(AOX1)启动子，可高效严格调控外源蛋白的表达；(2)作为真核表达系统，可对表达的蛋白进行翻译后的加工和修饰，从而使表达出的蛋白具有很高的生物活性；(3)表达量高，可高密度发酵培养，且营养要求低，生长快，培养基廉价便于工业化生产；(4)表达的蛋白可分泌至胞外，而Pp自身分泌的蛋白(背景蛋白)非常少，十分有利于纯化；(5)糖基化程度适当，对人体无明显的抗原性，适合于临床治疗用途。因此，本发明从cDNA文库中筛选出GPBB序列，并针对其是真核蛋白(全长约2.5Kb)，选择采用Pp表达系统。为了更高效表达该目的蛋白，选择其分布在细胞外靠近C末端的区域即免疫显性片段(即编码具免疫原性GPBB的核苷酸序列，约占120bp)，再根据酵母基因使用密码子的嗜好性，定点突变重新构建该片段的序列，直接人工合成这个目的基因，并克隆到分泌型表达载体质粒pPIC9K多克隆位点上构建成重组表达载体质粒；再制备成能分泌具免疫原性GPBB的更高效表达的基因工程酵母菌株，高密度培养该菌株，纯化并得到重组蛋白质。
图1为GPBB基因优化设计图。
图2为核苷酸序列和氨基酸序列图谱；其中(a)为核苷酸序列，(b)为氨基酸序列。
图3为基因合成的电泳图谱；其中1为148bp基因，2为PGEM 7Z Marker。
具体实施例方式酵母密码子的嗜好性与基因表达量相关，即在酵母中表达量较高的基因往往采用的是酵母所偏爱的密码子。有研究表明在用甲醇酵母表达植酸酶时，把在酵母中使用频率为零的精氨酸密码子突变为使用频率较高的密码子，表达水平提高了37倍。为了使GPBB免疫显性片段在甲醇酵母中的更高效表达，本发明在人工合成DNA时将GPBB基因序列进行优化设计，如图1、2所示把酵母中使用频率较低的密码子改变为酵母喜爱的密码子，同时考虑整个基因序列C+G/A+T比例平衡，避免产生后续克隆操作时需要的酶切位点。然后将突变后的GPBB片段克隆到分泌型表达载体质粒pPIC9K多克隆位点上，构建人GPBB的表达载体质粒。本发明所指的基因序列设计还可以有许多变动和延伸，而不仅限于图1所示序列。将人工合成的序列连接在载体的方法是本领域专业人员所熟悉的。
本发明所指的甲醇酵母表达载体质粒特指穿梭型质粒，它包括以下各种元件(1)大肠杆菌来源的质粒复制元件，如Co1E1。
(2)大肠杆菌筛选标记，如Amplcillin抗性基因(Amp)。
(3)甲醇酵母表达调控元件，特别是指可诱导表达调控元件。如甲醇酵母来源的AOX1基因启动子5’AOX1、转录终止子(TT)3’AOX1。
(4)甲醇酵母分泌表达信号α因子(MFα)信号肽。
(5)多克隆位点。
(6)甲醇酵母筛选标记如酵母HiS4基因，Kanamycin抗性基因。
(7)能在甲醇酵母染色体特异位点上重组整合的特异序列，如AOX1的5’、3’序列，HIS4的5’、3’序列。
(8)其它来源于大肠杆菌和酵母的连接片段。
外源基因转化酵母细胞可以用电转化方法、原生质体转化方法等。表达质粒转化大肠杆菌受体菌DH5、GS115和KM71等，筛选阳性克隆子，用于保持、扩增质粒以及用于酶切、测序等分析检测。
筛选高拷贝数转化子。转化过程有时会产生多拷贝的整合，一般占转化子的1％-10％。这是因为一个拷贝整合到染色体上以后，整合位点依然存在，则另外的拷贝又可整合上去。在一般情况下，甲醇酵母中外源基因的拷贝数越高，则表达量越大。多拷贝常产生非常高的表达量。而筛选确定高拷贝数菌株的方法中，利用表达载体带有卡那霉素(kanamycin)抗性基因，在酵母中表现为G418抗性，而非卡那霉素抗性的特点，设计出一套快速简便的筛选高拷贝的方法，其作用是可以用含有梯度浓度的G418的YPD-G418板筛选多拷贝转化子。
工程菌进行发酵生产。外源蛋白在酵母中的表达分两步，即菌体生长和蛋白诱导表达。第一阶段，先在以甘油为碳源的培养基上培养菌体，达到一定OD值后(详见实施例)，此为菌种生长阶段。第二阶段，甲醇诱导蛋白表达。离心弃上清，菌体悬浮于以甲醇为碳源的培养基中诱导表达，每隔一定时间加一次甲醇，以弥补甲醇的消耗。具体表达条件如通气状况、pH值、培养基的组成等详见实施例。
发酵结束后除去细菌体，收集上清液。甲醇酵母为分泌表达，目的蛋白质出现在上清液中。去除细菌可采用离心、压滤、超滤等方法。上清经超滤脱盐、浓缩后即可进行纯化工作。
目的蛋白质纯化可采用离子交换层析、疏水层析、分子筛层析、亲和层析等方法，以亲和层析所得到的蛋白质纯度最高。浓缩后目的蛋白质在上清液中浓度较高，可以采用亲和层析方法纯化GPBB。但是采用其它方法纯化目的蛋白质也是本领域技术人员所熟悉。
以下通过非限定性的实施例对本发明进一步的说明。
实施例一一、重组GPBB工程菌的构建1.目的基因人工合成和重组表达载体的构建选用酵母偏爱的密码子改造人GPBB基因。所改造的GPBB基因可以是其全部或者部分，在实际改造时，对其优化，我们选择GPBB与其它几个同工酶不同源，但是免疫显性片段部分进行改造。
为方便操作，在目的基因两端加上EcoR I酶切位点。其核酸和氨基酸序列见图1。将人工合成基因以EcoRI酶切处理，体外连接到同样酶切处理的甲醇酵母表达质粒pPIC9K，构建成GPBB重组表达质粒，见图2，〔图2中的图(a)中的黑体字母部分为rGPBB末端保守序列，其余部分为添加的便于处理的基因序列〕。重组质粒转化大肠杆菌受体菌DH5α，经酶切、PCR、DNA测序等验证过程，从中筛选一个结构完全正确的转化子GP1，扩增并提取GP1的重组质粒pPIC9K-GP1(如图3所示)。
2、工程菌株的制备将5-10微克的重组质粒pPIC9K-GP1体外以Sal I酶切线性化，电转化法转化甲醇酵母受体菌GS115。用MD平板筛选His4+转化子，从中筛选多拷贝整合转化子；1转化子细胞分别涂板到含0.5、1、2、4、8或16mg/mlG418的YPD平板，在16mg/mlG418的YPD平板上筛选到3个克隆；RGP1。
其具体步骤如下(I)转化DNA的制备(用碱性溶菌小量制备法抽提质粒DNA)①从过夜培养的菌液中取1.5ml于1.5ml离心管中，12000×g离心1分钟，弃去上清。
②加100μl溶液I使沉淀重悬于溶液I中。
③加200μl溶液II剧烈振荡5次，置冰上3min。
④加150μl溶液III温和振荡5次，置冰上10～30min⑤离心5min后去上青400μl于新的1.5ml离心管。
⑥加1ml 95％乙醇并混匀离心15min。
⑦倒去乙醇用1.5ml 70％乙醇洗涤冰风干。
⑧将所得的DNA溶于20～100μl水或TE中。
(II)质粒DNA的线性化①用Sac I酶消化处理质粒pPIC9K-rGP和表达载体pPIC9K。
②用琼脂凝胶电泳来分析一小段消化产物来检验是否完全消化③用25∶24∶1的苯酚∶氯仿∶异戊醇抽提消化产物并用乙醇沉淀消化的DNA。
④将DNA溶解于10～20μl的TE缓冲液中，保存于-20℃中备转化用。
(III)酵母细胞制备①500ml三角瓶，加入100μ1新鲜YPD培养液，分别接种100～500μl取三个GS115、KM71和SMD1168，培养过夜，直至OD＝1.3-1.5②在4℃，离心力为1500×g下，离心细胞5min。
③用200ml冰无菌水重悬沉淀。
④重复步骤②用100ml冰无菌水重悬淀淀⑤重复步骤②用20ml 1M冰山梨醇重悬沉淀⑥重复步骤②用0.3ml 1M冰山梨醇重悬沉淀直至体积约为0.5ml。
(IV)电转化①取上述细胞80μl和5～20μg的溶解于TE缓冲液中的线性DNA混合，将它们转移到0.2cm冰预冷过的电穿孔小杯中。
②让小杯中的细胞在冰上孵化5min。
③根据Bio-Rad Gene Pulser公司提供的参数充电电压1500V，电容25μF，电阻200Ω来电击细胞。
④立即往小杯中加入1ml 1M冰山梨醇，转移电击后的产物于无菌的1.5ml离心管中。
⑤将其分成200～600ul等分涂布于MD板上。
(V)筛选多拷贝①在|MD板上加1～2ml无菌水，用涂布棒将所有酵母菌落溶于水中。
②测其OD600值(1 OD60＝5×10 7个细胞/ml)。
③稀释上述菌液，分别取约105个细胞涂布于2.0、3.0的YPD-G418板上。
④将YPD-G418板置于30℃烘箱中培养，G418耐受菌将在2～5天出现。
⑤挑取G418耐受菌，纯化，并用30％甘油冷冻保存。
(VD PCR筛选甲醇酵母克隆根据Linder et al(1996)应用PCR简单直接的检验酵母的克隆。
①取10μl酵母液于1.5ml离心管。
③加5μl的5U/μl溶菌酶，并在35℃孵育10min。
③-80℃冰冻样品10min。
④建立50微升热启动PCR体系10×反应缓冲液 5μl25mM MgCl25μl25mM dNTP 1μl5′AOX1引物(10pmo1/μl)1μl3′AOX1引物(10pmol/μl)1μl无菌水 31.5μl细胞裂解液 5μl5U/μl Taq酶 0.5μl总体积 50μl混匀置于PCR仪95℃温育5min(加入0.5μl的5U/μl Taq酶)进行如下30循环95℃变性 1分钟，55℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，最终72℃延伸10分钟。琼脂糖凝胶电泳分析。
3、摇瓶表达在50ml离心管中倒入10mlBMGY培养液，挑取3.0YPD-G418板上的单克隆。在28～30℃摇床中培养，直至OD600＝2-6(大约16～18小时)。在4℃，离心力为1500g，离心9分钟。去上清，加入10ml BMGY+1％CA(酷氮氨基酸)培养液，重悬后继续培养8小时后，同前离心(离心条件4℃，离心力为1500g，离心9分钟)，去上清，加入10ml BMMY+1％CA培养液，重悬后继续培养。每培养24小时，往50ml离心管中添加5微升100％甲醇，保持诱导。培养5天后取出，同前离心(离心条件4℃，离心力为1500离心力为1500×g下，离心9分钟)，去沉淀，在-80℃储存上清，直至准备测定。
各种培养基配方YPD培养液(1L)10g yeast extract+20g trypton+20g agar+900ml H2O(高压灭菌)10×D 20g葡萄糖+100ml H2O(高压灭菌)混合摇匀。YPD-G418板配YPD 20ml，高压灭菌，若浓度为2.0，加入0.4ml G418，若浓度为3.0，加入0.6ml G418，立即倒平板。MD板(1L)15g agar+H2O 800ml，高压灭菌，冷却至60℃左右，加入用滤膜过滤灭菌的100ml 10×YNB、2ml500×B、100ml 10×D，立即倒板，密封好，可在4℃保存几个月。
BMGY和BMMY培养液取10g酵母提取物，20g胰蛋白胨于700ml水中，高压灭菌。冷却至室温后加入100ml 1MpH＝6.0磷酸缓冲液、100ml 10×YNB及2ml 500×B。
若配制BMGY，加入100ml 10×G，若配制BMMY，则加入100ml 10×M，4℃保存。
LB培养液(1L)5g酵母提取物+10g trypton+10g NaCl，加水至1000ml，高压灭菌。
实施例二高密度表达rGPBB将保存的RGP1于平板上活化，转接于YPD液体培养基，30℃、300rpm振荡培养至OD600＝20作为种子液上发酵罐。
发酵培养基为半合成培养基，配方如下六偏磷酸钠25g/L，CaSO4·2H2O 176g/L，K2SO418.2g/L，MgSO47.28g/L，EDTA0.925g/L，甘油40g/L，PTMI 4.35ml/L，(NH4)2SO49g/L，泡敌0.02％。
其中PTMI的配方为CuSO4·5H2O 6g/L，NaI 0.08g/L，MnSO4·2H2O 3g/L，Na2MoO4·2H2O 0.2g/L，硼酸0.02g/L，CoCl30.5g/L，ZnCl220g/L，FeSO4·7H2O 65g/L，生物素 0.2g/L，硫酸5ml。
发酵过程采用二步生长法。起始生长以甘油为碳源，温度30℃，pH5、0，空气流量为30L/分钟，溶氧40％，经过18～24小时培养，菌浓度达到OD600＝100，补甘油约4小时，甘油补液浓度500g/L，补液速度2ml/分钟，同时设定pH在4小时内降至pH3，补料完毕菌浓度为OD600＝160，此为甘油批培养阶段。诱导表达阶段，甲醇补料至浓度为0.5％～5％，溶氧控制为30％，诱导至54小时以上表达到达最高峰，放罐，此菌浓度OD600≥300。
菌体生长曲线及诱导表达曲线见图。
实施例三rGPPP纯化离心收集发酵上清，或以30000～50000截留量的超滤膜收集发酵上清。上清经1000～10000截留量的外压式中空纤维柱超滤浓缩、脱盐。浓缩上清直接经亲和层析纯化。应用固相化的抗体(抗GPBB抗体)，通过常规的一步法可将GPBB纯化1000～10000倍。该方法可分为三个主要步骤①抗体的固相化；③抗原与含抗体的介质结合；③洗脱抗原。
(I)基质固相化抗体的制备①抗体溶液对0.1mol/L pH7.4磷酸缓冲液透析，4℃，过夜；②将20ml湿润的凝胶小珠移入烧结玻璃漏斗；用3～5个柱体积的重蒸馏水洗，然后再以0.1mol/L pH7.4磷酸缓冲液洗两次；③将凝胶移入适当的烧杯中，在通风橱内，分别加入50ml重蒸馏水，10ml 1mol/L磷酸缓冲液(pH7.4)，及20ml 25％戊二醛；④烧杯加盖，放入37℃恒温振荡器中，缓慢振荡过夜；⑤将凝胶转移到烧结玻璃漏斗中，用20～40倍于凝胶体积的0.1mol/L pH7.4磷酸缓冲液充分洗涤，以除去多余的戊二醛，得到活化的凝胶；⑥每10ml活化的凝胶，加入含10-20mg抗体的10ml 0.1mol/L pH7.4磷酸缓冲液；⑦上述混合物在37℃，用搅拌器缓慢搅拌18h；⑧混合物转入50ml离心管中，离心(4℃，300×g离心20分)，收集凝胶，再加10-20ml PBS离心洗涤，直至其上清液的A280nm＜0.05；⑨取凝胶，加入50ml含0.1mol/L甘氨酸的0.1mol/L磷酸缓冲液，室温放置2小时，以中和残余的醛基。然后在300×g离心20分，弃上清；⑩将含有固相化抗体的凝胶装入适当的层析柱中，依次用洗脱缓冲液及PBS洗涤，开始使用。也可以在含0.1g/L叠氮钠的PBS中，4℃长期保存。
(II)rGPBB与含抗体的固相化介质结合①将层析柱与蠕动泵及部分收集器连接，如无此类设备可用手工操作；②将含待纯化rGPBB的混合物缓慢上样(大约10ml/h)，如果混合物的体积大于柱体积，可将混合物过柱后再循环上样；③室温或4℃孵育1～2小时，参照抗原的稳定性来选择温度；④在4℃，用PBS洗柱。直至其流出液A280nm＜0.05。
(III)rGPBB洗脱①在4℃，用0.2mol/L pH2.8盐酸-甘氨酸缓冲液洗脱rGPBB，按1～2ml/管收集洗脱液。测定每一管的A280nm；②当A280nm＜0.05时，先后用2mol/L pH2.2盐酸-甘氨酸缓冲液及含0.1g/L叠氮钠的PBS洗柱；③含有rGPBB组分的各管，每管按100～200μl/ml加入1mol/L K2HPO4，以中和其酸性；④用SDS-PAGE或功能检测法(如RIA，ELISA)检测，以确定各管有无rGPBB的存在；⑤将含有rGPBB的各管合并，在4℃对PBS透析。如果需要，可对rGPBB液进行浓缩。
4.亲和层析条件的选择(1)支持物与抗原或抗体结合后，还可能有多余的活性基团，为了封闭这些残留基团，必须用无关蛋白质或三乙醇胺过一次柱，以封闭活性基团。
(2)去掉未结合及结合不牢固的蛋白质。先用0.2mol/L NaHCO3(含0.1mol/LNaCl，pH9.0)洗脱2～3个柱体积，再用解脱剂处理一次亲和层析柱。
(3)解脱剂有许多种。常用的有0.2mol/L pH2.8甘氨酸-盐酸缓冲液、0.1mol/L pH2.4甘氨酸缓冲液、7mol/L脲、5mol/L NaI、3mol/L硫氰酸钾(或钠)、1mol/L乙酸、6mol/L盐酸胍、0.2mol/L KCL等。作为抗原抗体解脱剂，最多用的是3mol/L硫氰酸钾(或钠)及0.1mol/L pH2.4甘氨酸缓冲液。
纯化后的目的蛋白质因含量低，失去保护作用，应及时冻干保存，亦可放-20℃保存。
实施例四抗体制备抗体分单克隆抗体和多克隆抗体两种。本实施例以多克隆抗体制备为例说明，但是制备单克隆抗体的技术也是本专业领域的技术人员所熟悉的。
(1)抗原是rGPBB纯化品，该纯品在12.5％的PAG电泳后，仅出现一条区带，即认为可用于免疫抗原纯品。
(2)免疫 动物的选择通常选择壮年、成熟且健壮的豚鼠、鸡、兔、山羊、绵羊、马等动物。一般多用大白兔。免疫时，取完全佐剂3份加入含抗原的缓冲液1份，混匀，振摇或研磨，使其成为乳化状态，因为含SDS很易促使其乳化成油包水抗原乳化复合物，注射入动物体内时一定要保持乳化状态。抗原用量视抗原分子量不同及免疫原性及免疫动物不同而有一定差异，无统一标准和固定模式。一般是每兔(约2kg重)或每羊(约20kg重)第1次注射抗原1mg，以后逐次增加抗原量，最多每次不超过3mg。
(3)免疫途径及方法免疫部位可分别选用皮内、皮下或淋巴结。第1次免疫采用皮内结合皮下多点注射，常注射在背部或腿部。许多作者介绍在后足蹠皮下或皮内注射，因为四足落地的关系很易造成感染，使第1次免疫失效，并使动物行走不便，造成伤害。整个免疫过程以2～3个月为宜。一般是第1次免疫后的3～4周再进行第2次免疫，不完全佐剂为乳化剂。2周后加强1次(不完全佐剂)，2周后又加强1次(不完全佐剂或完全佐剂)，1周后再免疫1次。待最后一次免疫后的7～10天，取静脉血测试抗体效价(试血)，效价达到要求后即可一次性放血，采用颈动脉放血，得抗血清。
(4)抗血清的保存免疫成功的动物放血过程，所有用具均严格消毒，并按无菌操作方式进行放血。抗血清的防腐剂以0.05％叠氮钠为宜；也可采用加入20％～30％无菌甘油保存的方法。若时间较长，不用可采用-20℃低温保存。一般在0～8℃保存1年，抗体效价几乎无改变，保存2年，其效价稍有降低。抗体切忌反复冻融，否则抗体效价很快降低，以颈动脉一次性放血为宜。
权利要求
1.一种应用甲醇酵母制备重组人糖原磷酸化酶同工酶BB的方法，其特征在于①按酵母使用频率高的密码子人工合成糖原磷酸化酶同工酶BB的编码基因，融合于酵母表达调控元件，构建甲醇酵母高表达工程菌；②甲醇酵母工程菌高密度发酵表达；③采用超滤、葡聚糖凝胶层析、离子梯度凝胶层析、亲和层析等纯化技术的顺序组合，纯化回收GPBB。
2.根据权要求1所述的应用甲醇酵母制备重组人糖原磷酸化酶同工酶BB的方法，其特征在于重组人糖原磷酸化酶同工酶BB构建甲醇酵母高表达工程菌的方法为人工合成优化的重组人糖原磷酸化酶同工酶BB编码基因，构建重组表达载体，选用酵母使用频率较高的密码子改造人GPBB基因。
3.根据权要求2所述的应用甲醇酵母制备重组人糖原磷酸化酶同工酶BB的方法，其特征在于在人工合成DNA时将GPBB基因序列进行优化设计，把酵母中使用频率较低的密码子突变为酵母使用频率较高的密码子，然后将突变后的GPBB片段克隆到表达载体质粒的多克隆位点上，构建人GPBB的表达载体质粒。
4.根据权要求3所述的应用甲醇酵母制备重组人糖原磷酸化酶同工酶BB的方法，其特征在于将人工合成基因以限制性内切酶酶切处理，体外连接到同样酶切处理的甲醇酵母表达质粒，构建成GPBB重组表达质粒。
5.根据权要求4所述的应用甲醇酵母制备重组人糖原磷酸化酶同工酶BB的方法，其特征在于甲醇酵母表达载体质粒，穿梭型质粒，它包括以下各种元件(1)大肠杆菌来源的质粒复制元件，(2)大肠杆菌筛选标记，(3)甲醇酵母表达调控元件，特别是可诱导表达调控元件，(4)甲醇酵母分泌表达信号α因子信号肽，(5)多克隆位点，(6)甲醇酵母筛选标记，(7)能在甲醇酵母染色体特异位点上重组整合的特异序列，(8)其它来源于大肠杆菌和酵母的连接片段。
6.根据权要求5所述的应用甲醇酵母制备重组人糖原磷酸化酶同工酶BB的方法，其特征在于利用表达载体带有抗生素的抗性基因，设计出一套快速简便的筛选高拷贝的方法，用含有梯度浓度的抗生素培养筛选多拷贝转化子。
7.根据权要求6所述的应用甲醇酵母制备重组人糖原磷酸化酶同工酶BB的方法，其特征在于外源蛋白在酵母中的表达分两个阶段，第一阶段，菌种生长阶段，先在以甘油为碳源的培养基上培养菌体，达到一定OD值；第二阶段，发酵阶段，离心弃上清，菌体悬浮于以甲醇为碳源的培养基中诱导表达，每隔一定时间加一次甲醇，以弥补甲醇的消耗；发酵结束后采用离心或压滤或超滤的方法除去细菌体，收集上清液；上清液经超滤脱盐、浓缩后采用离子交换层析或疏水层析或分子筛层析或亲和层析的方法进行纯化处理。
8.根据权要求4所述的应用甲醇酵母制备重组人糖原磷酸化酶同工酶BB的方法，其特征在于重组质粒转化大肠杆菌受体菌，经限制性内切酶酶切、PCR、DNA测序验证过程，从中筛选一个结构完全正确的转化子，扩增并提取含转化子的重组质粒。
9.根据要求2所述的应用甲醇酵母制备重组人糖原磷酸化酶同工酶BB的方法，其特征在于将人GPBB基因3’末端与肌型和肝型两种同工酶不同源部分进行改造。
10.根据上述权利要求所述的方法制备的重组人糖原磷酸化酶同工酶BB，其特征在于基因片段是人GPBB基因3’末端，包含111个核苷酸，其所编码的氨基酸序列为IRNIACSGKFSSDRTITEYAREIWGVEPSDLQIPPPNIPRD。
11.一种重组人糖原磷酸化酶同工酶BB的应用，其特征在于将权利要求1-10所述的应用甲醇酵母所制备的重组人糖原磷酸化酶同工酶BB应用于生产抗GPBB抗体。
全文摘要
本发明涉及应用甲醇酵母生产重组人糖原磷酸化酶同工酶BB及其生产方法和它的应用。提供一种对AMI的早期诊断具有敏感性和特异性，且使用成本低的应用甲醇酵母生产的重组人糖原磷酸化酶同工酶BB及其生产方法和它的应用。本发明的方法为①按酵母嗜好的密码子人工合成糖原磷酸化酶同工酶BB免疫显性片段的编码基因，融合于酵母表达调控元件，构建甲醇酵母高表达工程菌；②甲醇酵母工程菌高密度发酵表达；③采用超滤、葡聚糖凝胶层析、离子梯度凝胶层析等纯化技术的顺序组合，纯化回收GPBB；④应用该蛋白质产生抗GPBB抗体。本发明的优点(1)具有强有力的乙醇氧化酶基因(A0X1)启动子，可高效严格调控外源蛋白的表达；(2)作为真核表达系统，可对表达的蛋白进行翻译后的加工和修饰，从而使表达出的蛋白具有很高的生物活性；(3)表达量高，可高密度发酵培养，且营养要求低，生长快，培养基廉价便于工业化生产；(4)表达的蛋白可分泌至胞外，而Pp自身分泌的蛋白(背景蛋白)非常少，十分有利于纯化；(5)糖基化程度适当，对人体无明显的抗原性，适合于临床治疗用途。
文档编号A61P9/10GK1456664SQ03128128
公开日2003年11月19日 申请日期2003年6月6日 优先权日2003年6月6日
发明者高健民, 王滔 申请人:福建师范大学