专利名称：骨组织再生剂的制作方法
技术领域：
本发明总的来说涉及外科实践领域的骨组织再生，尤其涉及口腔外科实践中的骨组织再生，其中，通过用可刺激和加速再生的移植材料填充骨腔来实现骨组织再生。
到目前为止，人们使用过各种移植材料，并且所用材料的性质决定了骨组织是如何再生的。
关于这一点，许多作者公开了为此目的使用不同的材料和/或组合物的研究和报告。
Yarnazaki Y、Oida S、Akimoto Y、Shiosa S在Clin Orthop Related Res(1988234；204-9)中指出，对于该类型的再生，可以使用与熟石膏(硫酸钙)结合的来自骨的形态发生蛋白质。
传统上，自体骨和脱矿质骨(DFDBA)，无论是单独使用还是与其它元素联用，都曾被用于在该技术中构建骨洞用的移植材料。
此外，这种类型的移植材料还用不同的屏蔽材料来保护，以防止附近的组织侵蚀移植材料。
人们使用过各种材料作为前述移植材料的屏蔽材料，最常用的是聚四氟乙烯薄膜，但由于它不是可生物降解的而可能会产生问题，并且在某些病例中可以引起感染。除此之外，由于它通常以固体形式使用，因此在手术过程中必须将它修整以使其适合移植物的接受部位，然后在适当的位置缝合。
US专利5,366,507具体描述了一种组合物，其是以脱矿质骨和硫酸钙的混合物为基础的移植材料与由磷酸钙组成的屏蔽材料的组合。这种组合物不能明显改进前述的技术。
各种研究显示，在血液中存在的生长因子有利于骨的形成，特别是生长因子P.D.G.F和T.G.F.B。
然而，在门诊患者环境中提取和浓缩这种生长因子的实践是未知的，而这些生长因子的临床上可观察的和可测定的效果同样也是未知的。
在本发明的一个具体实施方案中，使用富含生长因子的血浆(P.R.G.F)凝胶作为移植材料，用于填充和使洞内的骨和骨缺损得到再生。
本发明提供一种获得和制备用于门诊患者使用的富含因子的血浆的方法。
本发明还提供一种用于骨组织再生的方法和组合物，其可以改善再生的速度并且可以给患者快速施用。
在本发明的另一个实施方案中，提供了一种用于制备P.R.G.F凝胶的工具包。
有利地是，将P.R.G.F凝胶用于骨组织再生可以加速骨的再生并且给骨再生带来比目前所用技术更大的益处，以及软组织的更快和更可预知的愈合，从以下所获得的结果可以明显看到这些效果。
本发明提供了一种制备前述凝胶的方法，该方法首先在手术开始前数分钟并且在施用麻醉剂之前从正在接受治疗的患者中抽血。使用5ml的试管，从每位患者中取10-40ml血，其中放入10％柠檬酸三钠起抗凝剂作用。
将这些试管在160-800G的速度(取决于可以采用的不同方法)下在室温下离心6分钟或更短的时间(取决于速度)。血液分离成如下三种基本组分-在试管底部的红细胞。
-富含生长因子的血浆(P.R.G.F)，其在试管的中部，红色层的上面。
-贫含生长因子的血浆(P.P.G.F)，在试管的上部。
将每一5ml试管中的体积为1ml的上层P.P.G.F层丢弃。根据计数n＝10测定，此P.P.G.F中存在的血小板小于15％。
将试管中层的富含因子的血浆转移至微量离心管中并向每个含有1.2ml P.R.G.F的离心管中添加50μl的10％氯化钙，以致于随着将此状态的血浆静置，在15-25分钟后形成P.R.G.F凝胶。也可以将此血浆与人凝血酶(500单位)和氯化钙混合，以便迅速(3-10秒)获得凝胶并且可以用注射器来施用之。
此凝胶可以单独用于填充需要再生的骨洞，得到最佳结果，或者借助于常规屏障材料来提供外层保护，以下将进行解释。
可以将此凝胶与其它组分合用，例如硫酸钙、自体骨、可重吸收的羟磷灰石、磷酸三钙、碳酸钙或其它骨传导性或骨诱导性的再生材料。
为了生产P.R.G.F，制备工具包中应包含离心机、用于分离血浆层的移液管和用于抽血的系统。
患者的选择是基于不存在可能产生与治疗对抗的指征的全身性或局部疾病。得到了所有被通知进行研究的患者的同意。20位患者患有垂直牙根断裂或需要拔牙的重度牙周病，选择这些患者是因为随后能够在种植体的区域进行活组织检查而没有额外的不适。将患者随机分成P.R.G.F治疗组和对照组。P.R.G.F组的平均年龄为41岁(范围35-55)，4名男性和6名女性。对照组的平均年龄为42岁(范围38-54)，4名男性，6名女性。
另外有三名患者(2男1女)需要在口腔的不同部位进行多处拔牙。在每位患者中，对一个部位使用P.R.G.F，但不对其它部位使用，治疗的类型对各部位随机指定。这样可以包括最好的对照组，因为两种类型的治疗均在同一患者中进行，并且采用同样的外科过程、具有相同的微生物条件和同样的外科医生。
所有患者均接受抗生素治疗；使用阿莫西林(1.5g/天)。使皮瓣升高，以便能够充分看到并且可以在第一次尝试时便闭合。
拔牙后将每个部位仔细刮擦。在实验治疗组的10位患者中，用P.R.G.F凝胶填充缺损部位。在5个病例中，将血浆与自体骨混合，以防止皮瓣萎陷。对于对照组，过程相同，但不使用P.R.G.F凝胶。在任何一组中都不使用膜，以便排除屏蔽效果对P.R.G.F可能的有益效果产生影响的可能性。
活组织检查技术在10-15周之间(取决于患者何时方便)对移植接受部位进行活组织检查。所有活组织检查均由不知道对每一缺损部位实施过哪种治疗的检查员来进行。用空心环锯牙钻在接受移植的部位的中央钻孔并且钻至3mm深，取出活组织。用在5％甲酸中的10％福尔马林溶液将骨活组织在药签上固定48小时，然后封固在石蜡中。从每个活组织中作出5mm厚的切片并且用苏木精和曙红染色。在明亮的光照下对染色的切片拍照。将所有活组织送至实验室进行分析，不具体注明哪个属于对照组并且哪个是来自测试组。
结果对所有10位用P.R.G.F处理的患者的上皮组织的形成进行了评价，评价结果为非常好或极佳(比正常情况下的好得多，并且比对照组相对较好)。有8/10的病例在治疗区域的再生几乎是完全的。用牙周探针进行再生程度的评价，并与已经拍过照的以前的缺损进行比较。这些区域的活组织检查显示有成熟的密质骨存在，其具有组织化良好并且形态正常的小梁。
其它两个用P.R.G.F处理的病例显示出部分再生，在活组织检查中表现出具有组织化较差的小梁的结缔组织。两名患者(1男1女)均为吸烟者并且在三个牙槽壁中存在严重缺损。
在第10周所取的活组织和第16周所取的活组织之间，小梁的组织化程度有明显不同，并且还取决于缺损部位的大小和形状。在具有严重缺损并用P.R.G.F联合自体移植物治疗以避免皮瓣萎陷的患者中，获得了较大的前庭-舌宽度[anchuras vestibulo-linguale]。
在对照组，在患者的活组织检查中发现了相互一致的情况结缔组织填充了缺损部位的很大部分，与用P.R.G.F处理的病例有明显差别。所有对照组的活组织检查均显示有结缔组织和含骨小梁的结缔组织存在。在任何一个病例中都没有发现成熟骨。上皮形成的状况被定级为正常，显示出与用P.R.G.F治疗有显著不同。
在具有一个以上接受移植的部位的患者中，一个部位用P.R.G.F治疗，其它部位用常规方法治疗，用P.R.G.F治疗的区域其上皮形成要快得多。P.R.G.F治疗区域的活组织检查显示有更多的成熟骨，其具有组织化良好的小梁和较大的骨的再生。
使用P.R.G.F为更快和更有效的骨再生提供了条件。这种P.R.G.F凝胶易于操作，但在使用时必须不能有任何延迟，以便保留生长因子的有效性。
虽然最佳剂量还有待确定，但使用这种技术不会给患者带来危险，其血液在抽血后短时间内(30分钟-8小时)使用并且不与任何其它来源于动物或人的组分混合。目前大约有250名患者接受了治疗，具有良好的临床结果。
通过实践发现，当在使用中用无菌生物相容性液体如水、生理盐水和局部麻醉剂溶液配制硫酸钙时有时会稠度不足，这会导致在其使用过程中产生操作上的困难，假设它趋于分解并且非常易溶的话。
此外，它在血液中很快稀释，由此可以改进其在骨组织再生中的功效。
实验室的实验结果显示，使用磷酸三钙可带来明显的优点。
首先，由于它自身的性质，磷酸三钙具有较高的钙含量。
其次，磷酸三钙(油灰，过饱和溶液)、与P.R.G.F(富含生长因子的血浆)混合的自体骨、P.R.P(富含血小板的血浆)、P.R.G.F、自体骨加磷酸三钙，其行为在以稀释状态进行治疗的过程中更为均匀，因为它提供了足够的塑性，使其容易操作。
第三，磷酸三钙在血液中的稀释更为有限，低于硫酸钙，使得它可以更有效地作为屏蔽材料。
如上所指出的，用于骨洞的填充材料可以基本上是与富含生长因子的血浆凝胶相混合的磷酸三钙，或者是其它组合，条件是用作屏蔽的材料是磷酸三钙。
在本发明的具体实施方案中，测试了填充材料的其它组合，例如如下的组合(所有的都与磷酸三钙合用)-富含血小板的血浆-自体骨-冷冻干燥的骨-上述的混合物本发明所提出的组合使得骨组织再生的手术更易控制且更易完成，并且更重要的是，再生的过程比目前已知的方法和制品更快。
权利要求
1.一种可应用于口腔手术过程的用于骨组织再生的组合物及其制备方法，其中，在所述手术过程中向接受移植的部位填充移植材料，所述移植材料由自体骨或其它填充材料的混合物组成，其中可含或不含屏蔽材料，并且其特征在于填充材料中所用的基本组分是直接从患者血液中获得的富含生长因子的血浆(P.R.G.F)的凝胶，其中所述的凝胶至少部分地充满所要再生的洞。
2.权利要求1所述的用于骨组织再生的组合物及其制备方法，其中所述的血浆凝胶单独完全充满整个洞。
3.权利要求1所述的用于骨组织再生的组合物及其制备方法，其中将所述的血浆凝胶与自体骨单独混合，或与硫酸钙一起和自体骨混合。
4.权利要求1所述的用于骨组织再生的组合物及其制备方法，其中将所述的血浆凝胶与其它骨传导性或骨诱导性再生材料、硫酸钙、碳酸钙、磷酸三钙、可重吸收的羟磷灰石等混合。
5.一种组合物的制备方法，包括以下步骤(a)在临近开始手术前并且在施用麻醉剂之前，从患者中抽血至加有10％柠檬酸三钠的试管中；(b)室温下将试管在160-800G的速度下离心6-7分钟，以便将血液分离成如下组分在底层的红细胞；在中层的富含生长因子的血浆(P.R.G.F)和在上层的贫含生长因子的血浆(P.R.G.F)；(c)抽取离心产物中的富含生长因子的血浆(P.R.G.F)部分并且转移至微量离心管或玻璃试管中，添加10％氯化钙，并且静等一段时间待凝胶形成。
6.权利要求5所述的组合物的制备方法，其中所述的从离心产物中抽取的部分可以包括红细胞层的上层部分。
7.权利要求1和5所述的制备方法，其中所述的抽血量为10-50ml，所述的离心用5-10ml的管离心6-8分钟，转移至微量离心管中的所述P.R.G.F的量是1ml，并且在添加氯化钙之后形成所述凝胶所需的时间为2-20分钟。
8.权利要求1和5所述的制备方法，还包括和所述氯化钙一起添加人凝血酶。
9.一种用于制备权利要求1和5所述的组合物的工具包，其中包含离心机、用于抽取分离的血浆层的移液管、用于抽血的系统以及试管、微量离心管、移液管的管尖和在37℃下加热的装置。
10.一种使骨组织再生的方法，该方法以填充接受移植部位的移植材料和另外的在移植材料上面的屏蔽材料为基础，该方法包括以下步骤(a)用移植材料填充骨洞，所述的移植材料含有富含生长因子的血浆凝胶和各种颗粒粒度的磷酸三钙的混合物，(b)在移植材料的至少一部分上面放一层屏蔽材料，其中所述的屏蔽材料由与P.R.G.F、与从P.R.G.F中提取的因子或与骨材料混合的磷酸三钙组成。
11.权利要求10所述的使骨组织再生的方法，所述的移植材料是富含血小板的血浆和磷酸三钙的混合物。
12.权利要求10所述的使骨组织再生的方法，所述的移植材料是自体骨和磷酸三钙的混合物，其中含或不含P.R.G.F。
13.权利要求10所述的使骨组织再生的方法，所述的移植材料是冷冻干燥的骨和磷酸三钙的混合物。
14.权利要求10、11、12和13所述的使骨组织再生的方法，所述的移植材料包括磷酸三钙和其它所述组分的组合。
全文摘要
一种主要、但不仅仅是在口腔手术实践中应用的、用于使骨组织再生的组合物及其制备方法。该组合物使用从接受治疗的患者抽取的血液中获得富含生长因子的血浆(P.R.G.F)凝胶，相比目前已知的材料和技术，其有助于移植部位的再生并且可使再生更快且更有效。
文档编号A61L27/00GK1565646SQ03149439
公开日2005年1月19日 申请日期2003年6月13日 优先权日2003年6月13日
发明者阿尔德科亚 爱德华多·阿尼图亚 申请人:阿尔德科亚 爱德华多·阿尼图亚