专利名称：能够与金葡菌毒力因子调控蛋白结合的小分子多肽及其医药用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一组小分子肽，具体涉及一组能够与金葡菌毒力因子调控蛋白TRAP(Target of RNAIII activating protein)结合的小分子肽，该结合肽能特异抑制金葡菌的毒素产生。本发明还涉及这些小分子多肽在医药领域中的应用。
背景技术：
金黄色葡萄球菌(金葡菌)是一类常见的革兰氏阳性致病菌，是引起烧伤及战伤感染、肺炎、心内膜炎、败血症、中毒性休克等致命性疾病的主要微生物之一。每年仅医院内感染金葡菌的人数就超过数百万。目前临床上对金葡菌的治疗多采用联合使用抗生素的办法，但是效果并不理想。由于金葡菌极易产生耐药性且无好的解决方法，常用的许多抗生素对之无效，控制金葡菌感染是临床医学殛待解决的问题之一。
金葡菌的主要致病物质是毒素，包括溶血毒素、杀白细胞素、肠毒素等。最新研究表明，金葡菌这些毒力因子的合成是受一种可调节RNA分子，及RNAIII控制的。RNAIII激活毒力因子的基因转录，通过碱基互补调节毒力因子的翻译。在细菌生长的对数早期其RNAIII水平低，但到对数晚期RNAIII水平会增加40倍，而RNAIII的水平是由金葡菌自身分泌的蛋白RAP(RNAIIIactivating protein)即RNAIII激活蛋白调节的，故因子RAP又称为金葡菌毒力刺激因子。金葡菌持续分泌RAP，在RAP达到一定浓度后才有激活毒力因子产生的作用。没有RAP产生的金葡菌本身并不致病。最新研究发现，RAP激活RNAIII的转录是通过一个21KD的蛋白TRAP(Target of RNAIIIactivating protein)介导的，当TRAP蛋白的编码基因被突变失活后，RAP不能够激活RNAIII的转录。TRAP由167个氨基酸组成，具有His激酶活性。TRAP蛋白在金葡菌生长的早期开始磷酸化，在对数生长中期达到最大水平。在RAP作用后，通过自身磷酸化来进行信号传导，从而介导细胞内RNAIII水平上升，加速金葡菌外毒素的分泌(Naomi B，et al，J.Biol.Chem 2001，2762658-2667)。2001的研究发现TRAP的抗体可以有效的降低金葡菌外毒素的分泌(Oleny V.et al.Peptides 2001，221621-1627)。由此可见TRAP蛋白在金葡菌的毒素表达调控也起着关键性的作用。
发明内容
本发明的目的是提供一组能够与金葡菌毒力因子调控蛋白TRAP(Targetof RNAIII activating protein)结合的小分子肽，该结合肽能特异抑制金葡菌的毒素产生。
本发明的另一目的是提供这些小分子多肽在医药领域中的应用。
为实现本发明的第一个目的，我们根据文献报道的TRAP基因序列设计了特异性引物，从金葡菌菌株RN6390B中钓取了TRAP蛋白的编码基因，利用大肠杆菌表达系统对TRAP进行了表达。并以纯化的TRAP蛋白为靶标，利用噬菌体展示技术从随机十二肽库中筛选出能特异与TRAP蛋白结合的小分子多肽。本发明的多肽无论从来源还是从结构上都是全新的，未见任何文献报道。
本发明的能够与金葡菌毒力因子调控蛋白TRAP(Target of RNAIIIactivating protein)结合的小分子肽是具有以下氨基酸序列的多肽ATWSHHLSSAGLHWDPFSLSAYFP
ASTAHRHAFYWVSAFHHYSALADLATSHLHVRLPSKWHNEWWSPFPMDSHPWNAQRELSVDRMLLPFNLLALFAPWDTASFMLG其中大写英文字母分别代表二十一种已知天然L-型氨基酸残基或其D-型异构体的一种，即A代表丙氨酸残基，R代表精氨酸残基，N代表天冬酰胺残基，D代表天冬氨酸残基，Q代表谷氨酰胺残基，E代表谷氨酸残基，H代表组氨酸残基，W代表色氨酸残基，Y代表酪氨酸残基，F代表苯丙氨酸残基，T代表苏氨酸残基，S代表丝氨酸残基，L代表亮氨酸残基，G代表甘氨酸残基，P代表脯氨酸残基，V代表缬氨酸残基，K代表赖氨酸残基，M代表甲硫氨酸残基。
序列中的有些氨基酸可以根据氨基酸的相似性进行相互替代，其中谷氨酰胺残基(Q)，谷氨酸残基(E)，天冬氨酸残基(D)或天冬酰胺残基(N)之间可以相互替代；色氨酸残基(W)，酪氨酸残基(Y)或苯丙氨酸残基(F)之间可以相互替代；赖氨酸残基(K)和精氨酸残基(R)之间可以相互替代；丝氨酸残基(S)和苏氨酸残基(T)之间可以相互替代；丙氨酸残基(A)和甘氨酸残基(G)之间可以相互替代；亮氨酸残基(L)和甲硫氨酸残基(M)之间可以相互替代。
具有上述结构模式的多肽能够与金葡菌毒力刺激因子RAP的结合蛋白TRAP特异结合，并抑制其活性。具体表现为，在体外具有上述结构模式的多肽无论是以何种形式如展示在噬菌体或其他微生物上、或体外化学合成、或用基因工程方法重组表达，都能够与TRAP特异结合，并抑制TRAP的磷酸化，降低金葡菌毒素的产生。
本发明的小分子多肽可通过现有技术中的化学合成或用基因工程重组表达的方法制得。
传统抗生素治疗产生抗药性的原因主要是用药后细菌在生存压力下产生分解抗生素中有效基团的诱导酶。本发明利用特异抑制TRAP活性的多肽建立的治疗金葡菌感染方案，由于不杀灭细菌而使细菌的致病性丧失，所以不会象传统抗生素治疗那样对细菌产生选择压力而产生抗药株，这就为一直困扰临床的抗药性金葡菌感染这一常见、多发且有致命性的疾病的治疗找到新的出路。
图1为纯化的TRAP蛋白SDS-PAGE电泳2为Western Blot鉴定TRAP蛋白图3为不同滴度的序列1噬菌体对RN6390B菌株TRAP蛋白的磷酸化水平的影响图4为不同滴度的序列1噬菌体作用后的金葡菌上清对MDBK生长影通过体内磷酸化水平的检测，发现这些小分子多肽可以有效地降低TRAP在RN6390B中的磷酸化水平，同时通过MDBK细胞模型检测发现所筛选获得的小分子多肽可以有效的降低金葡菌外毒素的分泌水平，为治疗金葡菌感染开辟了新的途径，从而实现本发明的第二个目的。本发明对研制新型抗金葡菌感染的小分子多肽药物具有重要意义，并具有广泛的应用价值及广阔的市场前景。
具体实施例方式
下面以序列1为实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例1.TRAP蛋白的基因工程表达及分离纯化将鉴定正确的大肠杆菌TRAP基因连接至表达载体，在大肠杆菌中获得表达，经SDS-PAGE电泳鉴定发现在上清和包涵体中都有目的蛋白的条带，其中上清中的目的蛋白占总量的50％以上。将带有His标签的目的蛋白通过金属螯合柱纯化，SDS-PAGE检测，分子量约23kD，纯度＞90％。用凝血酶将His标签切割下来，纯化的TRAP蛋白分子量约21kD，纯度＞95％。(见附图1，图中1表示分子量蛋白标准；2表示纯化的TRAP蛋白)。
实施例2.纯化的TRAP蛋白的鉴定通过WESTEN BLOT检测我们纯化的TRAP蛋白能与TRAP蛋白多抗发生特异性的反应(附图2)实施例3.TRAP结合肽的筛选首先用100μl纯化的TRAP蛋白包被于酶联板，置4℃过夜。经过2％的明胶封闭1h后，加入噬菌体十二肽库，室温孵育1h，用TBST(50mmol/LTris-HCl，0.1％TWEEN20，pH7.5)洗涤非特异结合的噬菌体，再用0.2mmol/L甘氨酸-HCl pH2.2洗脱特异结合的噬菌体，洗脱液用1mmol/L Tris-HCl pH9.0中和。按照试剂盒提供的方法，测定洗脱液中的噬菌体的滴度，以未包被的靶蛋白的洗脱噬菌体的滴度作为对照，测定投入产出比。同时将洗脱的与TRAP结合的噬菌体扩增，并测定其下滴度，用于下一轮的筛选。经过3轮筛选后，测定的投入产出有了明显的提高。将富集的噬菌体克隆进行ELISA鉴定，随机挑取18个阳性克隆进行测序。分析后得到包含序列1的上述9种结合肽。
实施例4.不同滴度的序列1噬菌体对RN6390B菌株TRAP蛋白磷酸化水平的影响将不同滴度的序列1噬菌体与RN6390B金葡菌共培养后，检测TRAP蛋白磷酸化的水平，结果显示序列1噬菌体能够抑制RN6390B金葡菌TRAP磷酸化水平，随着序列1克隆滴度的增加，TRAP蛋白的磷酸化水平降低(附图3，图中1表示无关噬菌体与金葡菌培养，2表示PBS与金葡菌培养，3表示1×1010序列1噬菌体和金葡菌共培养，4表示3×1010序列1噬菌体和金葡菌共培养，5表示6×1010序列1噬菌体和金葡菌共培养)。
实施例5.利用细胞模型检测序列1噬菌体克隆活性选择不同滴度的序列1噬菌体克隆，利用了MDBK细胞模型测定其对金葡菌外毒素分泌水平的影响。结果显示随着噬菌体滴度的增加，金葡菌的培养上清对MDBK细胞的杀伤作用在逐渐降低，这表明该噬菌体能够有效的抑制金葡菌外毒素的分泌(附图4，图中0表示正常金葡菌培养上清，1表示1×1010序列1噬菌体和金葡菌共培养上清，2表示3×1010序列1噬菌体和金葡菌共培养上清，3表示6×1010序列1噬菌体和金葡菌共培养上清)。
序列表<110> 中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所海南通用同盟药业有限公司<120> 能够与金葡菌毒力因子调控蛋白结合的小分子多肽及其医药用途<130>
<160> 9<170> PatentIn version 3.1<210> 1<211> 12<212> PRT<213>
<400> 1Ala Thr Trp Ser His His Leu Ser Ser Ala Gly Leu1 5 10<210> 2<211> 12<212> PRT<213>
<400> 2His Trp Asp Pro Phe Ser Leu Ser Ala Tyr Phe Pro1 5 10<210> 3<211> 12<212> PRT<213>
<400> 3Ala Ser Thr Ala His Arg His Ala Phe Tyr Trp Val1 5 10<210> 4<211> 12<212> PRT
<213>
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<400> 5Ala Thr Ser His Leu His Val Arg Leu Pro Ser Lys1 5 10<210> 6<211> 12<212> PRT<213>
<400> 6Trp His Asn Glu Trp Trp Ser Pro Phe Pro Met Asp1 5 10<210> 7<211> 12<212> PRT<213>
<400> 7Ser His Pro Trp Asn Ala Gln Arg Glu Leu Ser Val1 5 10<210> 8<211> 12<212> PRT<213>
<400> 8Asp Arg Met Leu Leu Pro Phe Asn Leu Leu Ala Leu
1 5 10<210> 9<211> 12<212> PRT<213>
<400> 9Phe Ala Pro Trp Asp Thr Ala Ser Phe Met Leu Gly1 5 10
权利要求
1.能够与金葡菌毒力因子调控蛋白TRAP结合的小分子肽，具有下述(1)或(2)所述氨基酸序列(1)包含序列表所示氨基酸序列之一的氨基酸序列；(2)对(1)序列中的一个或几个氨基酸残基进行替换而成的氨基酸序列。
2.权利要求1所述的小分子肽，其特征在于它具有序列表所示氨基酸序列之一的氨基酸序列。
3.权利要求1或2所述的小分子肽在制备抗金葡菌感染药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及一组能够与金葡菌毒力因子调控蛋白TRAP结合的小分子肽，这些小分子肽具有序列表所示氨基酸序列。本发明的多肽可用于制备新型抗金葡菌感染药物。
文档编号A61K38/00GK1569891SQ0315020
公开日2005年1月26日 申请日期2003年7月21日 优先权日2003年7月21日
发明者邵宁生, 杨光, 柳川, 高亚萍, 董洁, 丁红梅, 沈倍奋 申请人:中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所, 海南通用同盟药业有限公司