专利名称：包含纤连蛋白ed－b结构域的特异抗体的缀合物和其在检测和治疗肿瘤中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及使用结合放射性核素的新肽诊断和治疗肿瘤的新方法。
背景技术：
肿瘤如果不形成新的血管(血管发生)其重量在一定程度上不能再增加，针对许多肿瘤已经报道了微血管密度与肿瘤侵染力之间的关系(Folkman(1995)，Nature Med.1，27-31)。另外，血管发生参与导致失明的大多数眼部疾病(Lee等，Surv.Ophthalmol.43，245-269(1998)；Friedlander，M.等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93，9764-9769(1996))。能选择性定向血管发生标记物的分子产生诊断和治疗肿瘤及其它的特征在于血管增殖，如糖尿病视网膜病变及年龄相关性黄斑变性的疾病的临床机会。血管发生的标记物在与肿瘤相关血管的大多数侵润性实体肿瘤中表达，并由此易于受静脉内注入的特异性结合剂影响(Pasqualini等，(1997)，Nature Biotechnol.，15，542-546；Neir等(1997)，Nature Biotechnol.15，1271-1275)。定向闭塞新血管系可使肿瘤梗死及坏死(O′Reilly等(1996)，Nature Med.2，689-692；Huang等(1997)，Science 275，547-550)。
纤连蛋白的ED-B结构域，是在小鼠，大鼠和人体内相同的一个91个氨基酸的序列，通过选择性剪接插入纤连蛋白分子中，特异性聚集在新血管结构周围(Castellani等(1994)，Int.J.Cancer 59，612-618)，可以作为分子干涉的目标。目前通过荧光技术确实已经示出抗ED-B单链Fv抗体片段(scFv)选择性聚集在携带肿瘤的小鼠的肿瘤血管周围，抗体亲和性指导了定向过程(Neri等(1997)，Nature Biotechnol.15，1271-1275；WO 97/45544)。
另外，具有亚纳摩尔解离常数的特异结合纤连蛋白ED-B结构域的抗体和抗体片段及其放射标记的衍生物于WO 99/58570中描述。这些高亲和性人抗体片段之一称为L19的125I标记的抗体片段的生物分布已经在携带肿瘤的小鼠中加以研究(Tarli等，Blood，第94卷，No.1(1999)，p.192-198)。包含L19抗体的放射标记的缀合物及其在检测和处理血管发生中的应用于WO 01/62800中揭示。
在甲醇酵母(Pichia pastoris)中与纤连蛋白的B同种型的ED-B结构域结合的功能化单链Fv抗体片段的重组生产已经加以描述(Marty等，Protein Expression and Purification 21，156-164(2001))。
另外，用99mTc通过C末端半胱氨酰肽放射标记scFv抗体片段由George等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，第92卷pp.8358-8362，1995，及Verhaar等，J.Nuc.Med.，Vol.37(5)，pp.868-872，1996加以描述。
然而，临床上仍需要提供具有改良的药物动力学性质的抗体片段，而且其可易于用放射性同位素标记，例如用锝或铼标记，因为这些放射性核素特别适合于放射性药物。
发明目的本发明的一个目的是提供具有改良的药物动力学性质的抗体片段，特别是具有靶特异性和/或体内稳定性，并可以易于结合放射性核素例如锝或铼。
发明概述本发明描述了包含一种肽的化合物，所述肽包含aa)纤连蛋白的额外结构域B(extra domain B，ED-B)的抗原结合位点的序列，包含表1所示互补决定区HCDR3和/或LCDR3或其变体，所述变体缺失，插入和/或取代HCDR3区的最多5个氨基酸及LCDR3区的最多6个氨基酸，其与SEQ ID NO1所示肽具有相同功能；ab)纤连蛋白的额外结构域B(ED-B)的抗原结合位点的序列，其包含表1所示互补决定区HCDR1，HCDR2，HCDR3，LCDR1，LCDR2和LCDR3及其变体，所述变体缺失，插入和/或取代HCDR1区的最多3个氨基酸、HCDR2区的最多8个氨基酸、HCDR3区的最多5个氨基酸、LCDR1区的最多6个氨基酸、LCDR2区的最多4个氨基酸及LCDR3区的最多6个氨基酸，其与SEQ ID NO1所示肽具有相同功能；或者ac)SEQ ID NO1(L19)的序列或SEQ ID NO1的变体，所述变体缺失，插入和/或取代最多30个氨基酸，其与SEQ IDNO1所示肽具有相同功能；及ba)一个氨基酸序列Xaa1-Xaa2-Xaa3-Cys(SEQ ID NO2)，其中Xaa1，Xaa2和Xaa3均单独代表任何天然发生的氨基酸，或者bb)一个氨基酸序列Xaa1-Xaa2-Xaa3-Cys-Xaa4(SEQ ID NO3)，其中Xaa1，Xaa2，Xaa3和Xaa4均单独代表天然发生的氨基酸，或者bc)一个氨基酸序列(His)n(SEQ ID NO4)，其中n表示4-6之间的一个整数，其中aa)，ab)或ac)的C末端通过一个肽键与SEQ ID NO2，SEQ ID NO3或SEQ ID NO4之一的序列的N末端结合。
所述化合物优选是单链抗体片段，特别是scFv片段。另外，所述化合物优选与放射性同位素缀合，例如锝放射性同位素如94mTc，99mTc，铼如186Re，188Re，或其它同位素如203Pb，67Ga，68Ga，43Sc，44Sc，47Sc，110mIn，111In，97Ru，62Cu，64Cu，67Cu，68Cu，86Y，88Y，90Y，121Sn，161Tb，153Sm，166Ho，105Rh，177Lu，72As及18F。
本发明还描述了一种药物组合物，其包含作为活性剂的上述化合物及生理学合适的佐剂，稀释剂和/或载体。
本发明还描述了一种肽的应用，所述肽包含aa)纤连蛋白的额外结构域B(ED-B)的抗原结合位点的序列，包含表1所示互补决定区HCDR3和/或LCDR3或其变体，所述变体缺失，插入和/或取代HCDR3区的最多5个氨基酸及LCDR3区的最多6个氨基酸，其与SEQ ID NO1所示肽具有相同功能；ab)纤连蛋白的额外结构域B(ED-B)的抗原结合位点的序列，其包含表1所示互补决定区HCDR1，HCDR2，HCDR3，LCDR1，LCDR2和LCDR3及其变体，所述变体缺失，插入和/或取代HCDR1区的最多3个氨基酸、HCDR2区的最多8个氨基酸、HCDR3区的最多5个氨基酸、LCDR1区的最多6个氨基酸、LCDR2区的最多4个氨基酸及LCDR3区的最多6个氨基酸，其与SEQ ID NO1所示肽具有相同功能；ac)SEQ ID NO1(L19)所示序列或者SEQ ID NO1的变体，所述变体缺失，插入和/或取代最多30个氨基酸并与SEQ IDNO1所示肽具有相同功能，及ba)一个氨基酸序列Xaa1-Xaa2-Xaa3-Cys(SEQ ID NO2)，其中Xaa1，Xaa2和Xaa3均单独代表任何天然发生的氨基酸，或者
bb)一个氨基酸序列Xaa1-Xaa2-Xaa3-Cys-Xaa4(SEQ ID NO3)，其中Xaa1，Xaa2，Xaa3和Xaa4均单独代表任何天然发生的氨基酸，或者bc)一个氨基酸序列(His)n(SEQ ID NO4)，其中n表示4-6之间的一个整数，其中aa)，ab)或ac)的C末端通过一个肽键与SEQ ID NO2，SEQID NO3或SEQ ID NO4之一的序列的N末端结合，以结合放射性同位素，例如锝或铼的放射性同位素。
抗体片段L19通过以下序列(SEQ ID NO1)阐明(VH)EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFSSFSMSWVRQA PGKGLEWVSS ISGSSGTTYYADSVKGRETI SRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAVYYCAKPF PYFDYWGQGT LVTVSS(接头)GDGSSGGSGG ASTG(VL)EIVLTQSPGT LSLSPGERAT LSCRASQSVSSSFLAWYQQK PGQAPRLLIY YASSRATGIPDRFSGSGSGT DFTLTISRLE PEDFAVYYCQQTGRIPPTFG QGTKVEIK最多30个氨基酸的缺失，插入和/或取代是SEQ ID NO1的1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，1 3，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29或30个氨基酸的缺失，插入和/或取代。然而，在互补决定区(CDR)内，所述要求保护的肽，例如SEQ ID NO1所示肽的氨基酸(aa)缺失，插入和/或取代所致的变异应不超过下表1所示的最大变异(HCDR重链的CDR；LCDR轻链的CDR)。
表1
CDR根据E.A.Kabat等，“Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest”，U.S.Department of Health and Human Services，NationalInstitutes for Health，Bethesda，MD，5th Edition，1991阐明。
优选的肽包含SEQ ID NO1(L19)所示序列或者SEQ ID NO1的变异，所述变异为缺失，插入和/或取代最多20个氨基酸。
包含表1所示CDR序列的变异和特别是SEQ ID NO1的缺失，插入和/或取代所致的与SEQ ID NO1所示肽具有相同功能的变异的一种肽，定义为与纤连蛋白的ED-B结构域结合的一种肽，其用BIAcore测定的解离常数Kd在亚纳摩尔范围(即小于10-9)(见WO 99/58570，实施例2和表2)。
优选的氨基酸序列Xaa1-Xaa2-Xaa3-Cys(SEQ ID NO2)是序列Gly-Gly-Gly-Cys(SEQ ID NO5)及Gly-Cys-Gly-Cys(SEQ ID NO6)。最优选的是序列Gly-Gly-Gly-Cys(SEQ ID NO5)。
优选的氨基酸序列Xaa1-Xaa2-Xaa3-Cys-Xaa4(SEQ ID NO3)是序列Gly-Gly-Gly-Cys-Ala(SEQ ID NO7)及Gly-Cys-Gly-Cys-Ala(SEQ ID NO8)。最优选的是序列Gly-Gly-Gly-Cys-Ala(SEQ ID NO7)。
在包含氨基酸序列(His)n(SEQ ID NO4)的化合物中，优选其中n代表整数6的那些化合物。
优选的锝或铼的放射性同位素是同位素94mTc，99mTc，186Re和188Re。最优选的是放射性同位素99mTc。
发明详述单链抗体片段L19(SEQ ID NO1)预先用125I标记以研究这种化合物在携带肿瘤的小鼠中的生物分布(Tarli等，Blood，第94卷，No.1(1999)，p.192-198)。结果示出可以实现在体内选择性定向肿瘤血管。然而令人惊奇地发现单链抗体片段L19当与ba)，bb)或bc)肽缀合并用锝或铼的放射性同位素标记时，其药物动力学性质充分改良。同位素99mTc是常规临床SPECT的放射标记，归因于其放射化学性质(易于通过99Mo/99mTc发生器获得，激发140KeV单一γ光子，具有高光子流量，及半衰期为6小时)及其成本效率。针对治疗性应用，特别优选用化学类似的同位素186Re和188Re标记(Hsieh，B.T.等，Nucl.Med.Biol.1999，26(8)，967-972；973-976，Zamora，P.O.等，Anticancer Res.，1997，17(3B)，1803-1838)。
本发明的肽是抗纤连蛋白的胞外ED-B结构域的重组scFv抗体L19(SEQ ID NO1)的衍生物，通过
图1所示遗传工程产生。产生了以下肽L19(SEQ ID NO1)L19His1 EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SFSMSWVRQAPGKGLEWVSS51 ISGSSGTTYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAVYYCAKPF101 PYFDYWGQGT LVTVSSGDGS SGGSGGASEI VLTQSPGTLS
LSPGERATLS151 CRASQSVSSS FLAWYQQKPG QAPRLLIYYA SSRATGIPDRFSGSGSGTDF201 TLTISRLEPE DFAVYYCQQT GRIPPTFGQG TKVEIKAAALEHHHHHH(SEQ ID NO9)AP381 EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SFSMSWVRQAPGKGLEWVSS51 ISGSSGTTYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAVYYCAKPF101 PYFDYWGQGT LVTVSSGDGS SGGSGGASEI VLTQSPGTLSLSPGERATLS151 CRASQSVSSS FLAWYQQKPG QAPRLLIYYA SSRATGIPDRFSGSGSGTDF201 TLTISRLEPE DFAVYYCQQT GRIPPTFGQG TKVEIKGGGC(SEQ ID NO10)AP391 EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SFSMSWVRQAPGKGLEWVSS51 ISGSSGTTYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAVYYCAKPF101 PYFDYWGQGT LVTVSSGDGS SGGSGGASEI VLTQSPGTLSLSPGERATLS151 CRASQSVSSS FLAWYQQKPG QAPRLLIYYA SSRATGIPDRFSGSGSGTDF
201 TLTISRLEPE DFAVYYCQQT GRIPPTFGQG TKVEIKGGGC A(SEQ ID NO11)L19-GlyCysGlyCys1 EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SFSMSWVRQAPGKGLEWVSS51 ISGSSGTTYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAVYYCAKPF101 PYFDYWGQGT LVTVSSGDGS SGGSGGASEI VLTQSPGTLSLSPGERATLS151 CRASQSVSSS FLAWYQQKPG QAPRLLIYYA SSRATGIPDRFSGSGSGTDF201 TLTISRLEPE DFAVYYCQQT GRIPPTFGQG TKVEIKGCGC(SEQ ID NO12)L19-GlyCysGlyCysAla1 EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SFSMSWVRQAPGKGLEWVSS51 ISGSSGTTYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAVYYCAKPF101 PYFDYWGQGT LVTVSSGDGS SGGSGGASEI VLTQSPGTLSLSPGERATLS151 CRASQSVSSS FLAWYQQKPG QAPRLLIYYA SSRATGIPDRFSGSGSGTDF201 TLTISRLEPE DFAVYYCQQT GRIPPTFGQG TKVEIKGCGC A(SEQ ID NO13)所述肽的生产在以下实施例中详细描述(见实验部分)。
抗体片段L19最初通过在大肠杆菌中(E.coli)表达而产生(见WO 99/58570)。然而，为大规模生产scFv抗体片段，发现这种表达系统未尽如人意。对另一种表达系统，酵母表达系统，特别是甲醇酵母表达系统进行了测试。本发明人发现酵母例如甲醇酵母，其通常能表达高生物活性的抗体片段，例如片段AP39，但为生物制药的经济生产所必需的每升培养物高产量表达最多250mg抗体片段仅能通过组成型表达载体(例如pGAP)达到，用甲醇诱导的载体(例如pPIC9K)不能达到。这种组成型表达系统的另一个优势是其与可诱导的酵母表达相比发酵程序简便及充分。出乎意料地，本发明人发现只有当使用一种表达盒时才观测到抗体片段，例如片段AP39的正确信号序列加工，所述表达盒中所述片段的N末端与来自α信号序列的Kex2切割位点直接融合。
所述肽适于诊断及治疗应用，尤其诊断及治疗侵染性肿瘤及肿瘤转移。优选的诊断应用是SPECT(单光子发射计算机X线断层摄影术)及PET(正电子发射X线断层摄影术)。
上述肽特别适于用上述放射性同位素标记，例如锝和铼的放射性同位素，优选放射性核素94mTc，99mTc，186Re和188Re。为标记所述肽，首先将所述肽用合适的还原剂还原，所述还原剂例如氯化亚锡或Tris(2-羧乙基)磷化氢(TCEP)。所得还原的肽呈现SH基团，所述SH基团能与99mTc发生器洗脱物或188Re发生器洗脱物及氯化亚锡反应为本发明化合物(详见以下实施例)。间接标记通过预先缀合一种螯合配体及随后络合放射性同位素如铟，钇，镧系元素等而进行。所述鳌合配体优选衍生自乙二胺四乙酸(EDTA)，二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)，环己基1，2-二胺四乙酸(CDTA)，乙二醇-O，O′-双(2-氨基乙基)-N，N，N′，N′-双乙酰(HBED)，三亚乙基四胺六乙酸(TTHA)，1，4，7，10-四氮杂环十二烷-N，N′，N-四乙酸(DOTA)，1，4，7-三氮杂环壬烷-N，N′，N″-三乙酸(NOTA)及1，4，8，11-四氮杂环十四烷-N，N′，N″，N-四乙酸(TETA)，所述肽化合物的胺或硫羟基团。所述鳌合配体具有合适的偶联基团，例如活性酯，马来酰亚胺，硫代氨基甲酸盐或α-卤代乙酰胺部分。为将螯合配体与氨基基团例如赖氨酸残基的ε-NH2基团缀合，不需要预先还原所述肽化合物。放射标记的肽适于放射性诊断及放射性治疗应用。
所得放射标记的肽在动物实验中示出未曾预料的优势。例如，在裸鼠中出现标记的肽，例如99mTc-标记的AP39(SEQ ID NO11)的排泄达到70％或更多，例如在24小时内通过肾排泄80.63％，而针对用125I标记的L19(SEQ ID NO1)，在裸鼠中在24小时内通过肾的排泄仅为67.79％。标记的肽例如99mTc-标记的AP39的肿瘤与血液比率为5∶1或更多，优选8∶1或更多，例如在5小时后为大约10∶1，而针对用125I标记的L19，这个比率仅为大约3∶1。这是与用99mTc标记的其它scFv抗体相比的一个未曾预料的特性，所述99mTc标记的其它scFv抗体通常示出较少有利的生物分布特性。例如，Verhaar等，J.Nuc.Med.，Vol.37(5)，pp.868-872，1996报道了一种99mTc-标记的scFv抗体，其示出在24小时后肿瘤与血液比率仅为4∶1，在24小时后肾蓄积为9％，这与本发明所述肽的数值相比非常高，例如针对99mTc-标记的AP39为1.3％(见以下实施例13)。
另外，本发明标记的肽例如99mTc-标记的AP39的体内稳定性与用125I标记的L19的体内稳定性相比更高。本发明人发现在注射一种肽例如99mTc-标记的AP39之后2小时，由于代谢物所致，血清中放射活性仅为10％或更低，例如为3％，而在注射用125I标记的L19之后2小时，由于代谢物所致，血清中放射活性为49％，所述代谢物可以是游离碘。所述肽例如99mTc-标记的AP39的改良的体内稳定性也可以通过其与靶ED-B的结合能力延长所反映。本发明人发现在注射所述肽例如99mTc-标记的AP39之后2小时，血清中50％或更多例如74％的放射活性能结合ED-B，而在注射125I标记的L19之后2小时，血清内仅27％的放射活性可结合ED-B。本发明的化合物还示出高度肿瘤蓄积。例如，Tc-99m-AP39和In-111-MX-DTPA-ε-HN(Lys)-AP39在注射后1小时呈现高度肿瘤蓄积，分别为10.7％(Tc-99m)或12.9％(In-111)注射剂量每克(ID/g)。由此，肿瘤吸收与其它已知In-111或Tc-99m标记的抗体片段相比明显较高(例如Kobayashi等，J.Nuc.Med.，Vol.41(4)，pp.755-762，2000；Verhaar等，J.Nuc.Med.，Vol.37(5)，pp.868-872，1996)。
所述化合物适于诊断和治疗应用。它们优选通过肠胃外给予，更优选通过静脉内注射而应用于患者。针对放射诊断应用，人体剂量优选在0.1-1mg/人，针对放射治疗应用为0.1-100mg/人。
生产及标记本发明化合物的方法在以下实施例中更充分举例示出。这些实施例只是举例示出了本发明而无限制之意。
实施例实施例1产生L19衍生物抗纤连蛋白剪接变体的额外结构域B(ED-B)的一种重组抗体(scFvL19，简称L19)作为起始物。scFv L19已经通过噬菌体展示选择从合成的人抗体全部组成成分中分离(Neri等，1997，Nature Biotechnol.151271；Pini等1998，J.Biol.Chem.27321769)。这种重组抗体片段是所谓的单链抗体片段形式(scFv)并由通过接头序列连接的VH和VL区域组成(见SEQ ID NO1)。这种scFv L19对ED B具有特别高的亲和性(Kd5.4×10-11M)。
通过遗传操纵产生L19的多种衍生物(见图1)。为修饰L19，将scFv编码DNA通过PCR(聚合酶链反应)扩增，使用编码额外序列的引物进行，并克隆入表达载体中。
L19衍生物L19无额外末端修饰L19 HisC-末端His6结构域(His标签)，用于Ni鳌合层析及结合放射性同位素
AP38C-末端GlyGlyGlyCys结构域，用以(通过Cys)结合可以用于治疗和诊断中的物质(例如放射性同位素)AP39C-末端GlyGlyGlyCysAla结构域，用以(通过Cys)结合可以用于治疗和诊断的物质(例如放射性同位素)L19-GlyCysGlyCysC-末端GlyCysGlyCys结构域，用以(通过Cys)结合可以用于治疗和诊断的物质(例如放射性同位素)L19-GlyCysGlyCysAlaC-末端GlyCysGlyCysAla结构域，用以(通过Cys)结合可以用于治疗和诊断的物质(例如放射性同位素)L19衍生物的重组生产所述L19衍生物在原核及真核表达系统中生产。
a)在大肠杆菌中生产L19将编码多种L19衍生物(AP38，AP39，L19-GlyCysGlyCys，L19-GlyCysGlyCysAla，L19，L19His)的DNA序列克隆入具有IPTG可诱导启动子及氨苄青霉素抗性标记的原核表达载体中(pDN5，Pini等，1997，J.Immunol.Methods 206171；Pini等，1998，J.Biol.Chem.27321769；pET，Novagen)。为使重组蛋白可能分泌入周质中，使用该载体生产一种表达盒，其中scFv的N末端与Pel B信号序列融合。通过用这种表达载体转化大肠杆菌(TG1，BL21 DE3和HB2151)，随后进行氨苄青霉素选择，可以确定稳定的生产菌株。为生产scFv，将这些菌株在存在1％葡萄糖的情况下在生长相(37℃)培养以阻抑启动子。培养物中scFv的表达通过加入IPTG及在30℃孵育最多16小时而诱导。可溶的及抗原结合scFv物质可以分离自大肠杆菌的完整提取物，分离自周质部分或者，分离自培养上清，这被证实在纯化和生产中特别有效。在培养体积为最多10升的摇瓶及发酵罐中进行生产。
b)在甲醇酵母中生产L19衍生物将L19His，AP38，AP39，L19-GlyCysGlyCys和L19-GlyCysGlyCysAla编码DNA序列通过PCR扩增并克隆入大肠杆菌和表达载体pPIC9K和pGAP(Invitrogen)中，以在甲醇酵母中进行生产。为表达异源基因，pPIC9K含有一个甲醇可诱导的启动子(AOX1)，pGAP含有GAPDH酶的组成型启动子。另外，这些载体分别含有一个遗传霉素抗性基因和一个zeocin抗性基因以选择/扩增外源基因，及一个信号序列(来自酵母α因子)以表达和分泌重组产物。AP39表达盒用于编码一个融合蛋白(α因子信号序列+L19衍生物)，其仅含有用于消除信号序列的一个Kex2切割位点，不含天然α因子加工的其它切割位点。稳定转染的PP克隆通过将线性化载体电穿孔入甲醇酵母株(例如将pPIC9K-AP39电穿孔入GS115中，将pGAP-AP39电穿孔入X33)中及随后经遗传霉素或zeocin选择而确定。可以使用这些克隆生产所述可溶的分泌蛋白L19衍生物。将克隆在BMGY培养基或基本矿物质培养基中于30℃培养。针对基于pPIC的克隆，在表达相期间加入甲醇以诱导启动子。重组产物具有正确加工的末端及高抗原结合活性。根据培养条件和加工控制，可以达到的产量(每升培养上清未纯化的生物活性产物) 是例如pPIC9K-AP39/GS115(摇瓶5mg/l，发酵罐10-15mg/))；pGAP-AP39/X33(摇瓶30-40mg/l，发酵罐100-250mg/l)。
使用亲和性层析(rProtein A，Streamline Pharmacia或ED B抗原层析柱)及随后的大小排阻层析从甲醇酵母或大肠杆菌培养上清中纯化L19衍生物。纯化的AP39级分用于进一步加工，其具有同源二聚体结构(具有大部分共价连接的亚单位)和高抗原结合活性。
实施例2a合成还原的AP38[还原的L19-(Gly)3-Cys-OH]向240μg(4.29nmol)的S-S-二聚AP38于156μl PBS(磷酸盐缓冲盐水)/10％甘油中的溶液中加入50μl TCEP-溶液(14.34mg TCEP×HCl/5ml Na2HPO4水溶液，0.1M，pH＝7.4)。将该反应混合物在室温轻轻摇动1小时。SH-单体AP38通过凝胶层析纯化，使用NAP-5层析柱(Amersham，洗脱液PBS)进行。经SDS-PAGE分析分离的产物检验S-S-二聚体-AP38向SH-单体AP38的定量转化。
产量79.4μg/220μl PBS(33.1％)。
实施例2b合成Tc-99m-AP3 8[Tc-99m-L19-(Gly)3-Cys-OH]将2.37mg的L-酒石酸二钠置于一个小瓶中，随后加入于220μlPBS中的79.4μg还原的AP38，并将该溶液用100μl的Na2HPO4-缓冲液(1M，pH＝10.5)稀释。加入50μl Tc-99m发生器洗脱物(24小时)和10μl SnCl2溶液(5mg SnCl2/1ml 0.1M HCl)。将该反应混合物在37℃摇动0.5小时。Tc-99m标记的AP38使用NAP-5层析柱(Amersham，洗脱液PBS)通过凝胶层析纯化。
放射化学产量39.7％。
放射化学纯度92.5％(SDS-PAGE)。
比活性17.7 MBq/nmol。
免疫反应性88.7％。
实施例3a合成还原的AP39[还原的L19-(Gly)3-Cys-Ala-OH]向240μg(4.29nmol)S-S-二聚体AP39于135μl PBS的/10％甘油中的溶液中加入50μl TCEP-溶液(14.34mg TCEP×HCl/5mlNa2HPO4水溶液，0.1M，pH＝7.4)。将该反应混合物在室温轻轻摇动1小时。SH-单体AP39通过凝胶层析纯化，使用NAP-5层析柱(Amersham，洗脱液PBS)进行。经SDS-PAGE分析分离的产物检验S-S-二聚体AP39向SH-单体AP39的定量转化。
产量135.9μg/180μl PBS(56.2％)。
实施例3b合成Tc-99m-AP39[Tc-99m-L19-(Gly)3-Cys-Ala-OH]将4.2mg L-酒石酸二钠置于一个小瓶中，随后加入于180μl PBS中的135.9μg还原的AP39，并将该溶液用100μl Na2HPO4-缓冲液(1M，pH＝10.5)稀释。加入100μl Tc-99m发生器洗脱物(24小时)和10μlSnCl2溶液(5mg SnCl2/1ml 0.1M HCl)。将该反应混合物在37℃摇动0.5小时。Tc-99m标记的AP39使用NAP-5层析柱(Amersham，洗脱液PBS)通过凝胶层析纯化。
放射化学产量50.1％。
放射化学纯度91.5％(SDS-PAGE)。
比活性21.4MBq/nmol。
免疫反应性96.4％。
实施例4合成Re-188-AP38[Re-188-L19-(Gly)3-Cys-OH]将2.37mg L-酒石酸二钠置于一个小瓶中，随后加入于310μlPBS中的112μg还原的AP38，并将该溶液用100μl Na2HPO4缓冲液(1M，pH＝10.5)稀释。加入100μl Re-188发生器洗脱物和50μl SnCl2溶液(5mg SnCl2/1ml 0.1M HCl)。将该反应混合物在37℃摇动1.5小时。Re-188标记的AP38使用NAP-5层析柱(Amersham，洗脱液PBS)通过凝胶层析纯化。
放射化学产量28.3％。
放射化学纯度91.1％(SDS-PAGE)。
比活性15.3MBq/nmol。
免疫反应性89.9％。
实施例5合成Re-1 88-AP39[Re-188-L19-(Gly)3-Cys-Ala-OH]将2.37mg L-酒石酸二钠置于一个小瓶中，随后加入于303μlPBS中的112μg还原的AP39，并将该溶液用100μl Na2HPO4缓冲液(1M，pH＝10.5)稀释。加入100μl Re-188发生器洗脱物和50μl SnCl2溶液(5mg SnCl2/1ml 0.1M HCl)。将该反应混合物在37℃摇动1.5小时。Re-188标记的AP39使用NAP-5层析柱(Amersham，洗脱液PBS)通过凝胶层析纯化。
放射化学产量33.5％。
放射化学纯度92.3％(SDS-PAGE)。
比活性18.5 MBq/nmol。
免疫反应性92.5％。
实施例6a合成还原的L19-Gly-Cys-Gly-Cys-OH向240μg(4.29nmol)S-S-二聚体L19-Gly-Cys-Gly-Cys-OH于160μl PBS/10％甘油中的溶液中加入75μl TCEP-溶液(14.34mgTCEP×HCl/5ml Na2HPO4，0.1M，pH＝7.4)。将该反应混合物在室温轻轻摇动1小时。SH-单体L19-Gly-Cys-Gly-Cys-OH使用NAP-5层析柱(Amersham，洗脱液PBS)通过凝胶层析纯化。经SDS-PAGE分析分离的产物检验S-S-二聚体L19-Gly-Cys-Gly-Cys-OH向SH-单体L19-Gly-Cys-Gly-Cys-OH的定量转化。
产量80.4μg/210μl PBS(33.5％)。
实施例6b合成Tc-99m-L19-Gly-Cys-Gly-Cys-OH将2.37mg L-酒石酸二钠置于一个小瓶中，随后加入于210μlPBS中的80.4μg还原的L19-Gly-Cys-Gly-Cys-OH，并将该溶液用100μl Na2HPO4缓冲液(1M，pH＝10.5)稀释。加入50μl Tc-99m发生器洗脱物(24小时)和10μl SnCl2溶液(5mg SnCl2/1ml 0.1M HCl)。将反应混合物在37℃摇动0.5小时。Tc-99m标记的L19-Gly-Cys-Gly-Cys-OH使用NAP-5层析柱(Amersham，洗脱液PBS)通过凝胶层析纯化。
放射化学产量37.7％。
放射化学纯度91.5％(SDS-PAGE)。
比活性19.7MBq/nmol。
免疫反应性89.7％。
实施例7a合成还原的L19-Gly-Cys-Gly-Cys-Ala-OH向240μg(4.29nmol)S-S-二聚体L19-Gly-Cys-Gly-Cys-Ala-OH于155μl PBS/10％甘油中的溶液中加入75μl TCEP-溶液(14.34mgTCEP×HCl/5ml Na2HPO4，0.1M，pH＝7.4)。将该反应混合物在室温轻轻摇动1小时。SH-单体L19-Gly-Cys-Gly-Cys-Ala-OH使用NAP-5层析柱(Amersham，洗脱液PBS)通过凝胶层析纯化。经SDS-PAGE分析分离的产物检验S-S-二聚体L19-Gly-Cys-Gly-Cys-Ala-OH向SH-单体L19-Gly-Cys-Gly-Cys-Ala-OH的定量转化。
产量81.2μg/215μl PBS(33.8％)。
实施例7b合成Tc-99m-L19-Gly-Cys-Gly-Cys-Ala-OH将2.37mg L-酒石酸二钠置于一个小瓶中，随后加入于215μlPBS中的81.2μg还原的L19-Gly-Cys-Gly-Cys-Ala-OH，并将该溶液用100μl Na2HPO4缓冲液(1M，pH＝10.5)稀释。加入50μl Tc-99m发生器洗脱物(24小时)和10μl SnCl2溶液(5mg SnCl2/1ml 0.1M HCl)。将该反应混合物在37℃摇动0.5小时。Tc-99m标记的L19-Gly-Cys-Gly-Cys-Ala-OH使用NAP-5层析柱(Amersham，洗脱液PBS)通过凝胶层析纯化。
放射化学产量35.6％。
放射化学纯度93.5％(SDS-PAGE)。
比活性19.1MBq/nmol。
免疫反应性88.7％。
实施例8a合成还原的AP39以将EDTA，CDTA，TETA，DTPA，TTHA，HBED，DOTA，NOTA和DO3A型螯合剂特异性缀合于半胱氨酸-SH基团将50μl TCEP溶液(14.34mg TCEP×HCl/5ml Na2HPO4，0.1M，pH＝7.4)加入于450μl PBS中的400μg(7.1nmol)AP39溶液中。将反应混合物在37℃轻轻摇动1小时。还原的AP39使用NAP-5层析柱(Amersham，洗脱液乙酸钠缓冲液，0.1M，pH 5.0)通过凝胶层析纯化。经SDS-PAGE分析分离的产物检验AP39完全转化为还原的AP39的情况。
产量140μg/200μl(35％)。
实施例8b合成MX-DTPA-马来酰亚胺(1，4，7-三氮杂-2-(N-马来酰亚氨基亚乙基对氨基)苄基-1，7-二(羧甲基)-4-羧甲基6-甲基庚烷)将512mg(1mmol)的{[3-(4-氨基-苯基)-2-(二-羧甲基-氨基)-丙基]-[2-(二-羧甲基-氨基)-丙基]-氨基}-乙酸(Macrocyclics Inc.Dallas，TX，U.S.A.)和707mg(7mmol)三乙胺溶解于3ml无水DMF中。向1ml无水DMF中滴加400mg(1.5mmol)的3-(2，5-二氧-2，5-二氢-吡咯-1-基)-丙酸2，5-二氧-吡咯烷-1-基酯(Aldrich)。将该溶液在50℃搅动5小时。缓慢加入30ml二乙醚。将反应混合物进一步搅动30分钟。通过过滤收集沉淀(Principate)。粗产物通过RP-HPLC(乙腈∶水∶三氟乙酸/3∶96.9∶0.1→99.9∶0∶0.1)纯化。
产量61％(405mg，0.61mmol)。
MS-ESI664＝M++1。
实施例8c合成In-111-MX-DTPA-马来酰亚胺-S(Cys)-AP39-R(R＝还原的)将于200μl乙酸钠缓冲液(0.1M，pH 5)中的140μg(5nmol)AP39-R与50μl溶解的1，4，7-三氮杂-2-(N-马来酰亚氨基亚乙基对氨基)苄基-1，7-二(羧甲基)-4-羧甲基6-甲基庚烷(于500μl，0.1M pH 5乙酸钠缓冲液中的0.25mg DTPA-马来酰亚胺)在37℃反应3小时。将该反应混合物用200ml乙酸钠缓冲液(0.1M，pH-6)透析2次，每次1小时，应用Slide-A-Lyzer 10,000 MWCO(Pierce Inc.，Rockford，IL，U.S.A.)进行。
加入80μl[In-111]InCl3溶液(HCl，1N，40MBq，Amersham Inc.)，并将反应混合物在37℃加热30分钟。In-111标记的DTPA-马来酰亚胺-S(Cys)-AP39-R使用NAP-5层析柱(Amersham，洗脱液PBS)通过凝胶层析纯化。
放射化学产量54％。
放射化学纯度94％(SDS-PAGE)。
比活性6.2MBq/nmol。
免疫反应性86％。
实施例9合成In-111-MX-DTPA-ε-HN(Lys)-AP39将于111μl PBS中的200μg(3.6nmol)非还原的AP39用300μl四硼酸钠缓冲液(0.1M，pH 8.5)稀释，并用200ml四硼酸钠缓冲液(0.1M，pH 8.5)透析2次，每次1小时，使用Slide-A-Lyzer 10,000 MWCO(Pierce Inc.，Rockford，IL，U.S.A.)进行。加入50μl的1，4，7-三氮杂-2-(对异硫氰酸根合)苄基-1，7-二(羧甲基)-4-羧甲基-6-甲基庚烷(MX-DTPA)溶液(溶解于500μl四硼酸钠缓冲液(0.1M，pH 8.5)中的0.33mg MX-DTPA)，并将反应混合物在37℃加热3小时。将该反应混合物用200ml乙酸钠缓冲液(0.1M，pH 6.0)透析2次，每次1小时，及1次17小时(过夜)，均使用Slide-A-Lyzer 10,000 MWCO(Pierce Inc.，Rockford，IL，U.S.A.)进行。
加入80μl[In-111]InCl3溶液(HCl，1N，40 MBq，Amersham Inc.)并将反应混合物在37℃加热30分钟。In-111标记的MX-DTPA-ε-HN(Lys)-AP39使用NAP-5层析柱(Amersham，洗脱液PBS)通过凝胶层析纯化。
放射化学产量70％。
放射化学纯度85％(SDS-PAGE)。
比活性7.6MBq/nmol。
免疫反应性74％。
实施例10合成In-111-DOTA-C-苄基-对-NCS-ε-HN(Lys)-AP39将于114μl PBS中的200μg(3.6nmol)非还原的AP39用300μl四硼酸钠缓冲液(0.1M，pH 8.5)稀释，并用200ml四硼酸钠缓冲液(0.1M，pH 8.5)透析2次，每次1小时，应用Slide-A-Lyzer 10,000MWCO(Pierce Inc.，Rockford，IL，U.S.A.)进行。将50μl的1，4，7，10-四氮杂-2-(对-异硫氰酸根合)苄基环十二烷-1，4，7，10-四乙酸(苄基-对-SCN-DOTA，Macrocyclics Inc.，Dallas TX，U.S.A.)溶液(溶解于5ml四硼酸钠缓冲液(0.1M，pH 8.5)中的1.5mg苄基-对-SCN-DOTA)加入所述溶液中，将反应混合物在37℃加热3小时。将反应混合物用200ml乙酸钠缓冲液(0.1M，pH 6.0)透析2次，每次1小时，及1次17小时(过夜)，均应用Slide-A-Lyzer 10,000 MWCO(Pierce Inc.，Rockford，IL，U.S.A.)进行。
加入80μl[In-111]InCl3溶液(HCl，1N，40 MBq，Amersham Inc.)并将反应混合物在37℃加热30分钟。In-111标记的DOTA-C-苄基-对-NCS-ε-HN(Lys)-AP39使用NAP-5层析柱(Amersham，洗脱液PBS)通过凝胶层析纯化。
放射化学产量74％。
放射化学纯度94％(SDS-PAGE)。
比活性12.3MBq/nmol。
免疫反应性73％。
实施例11合成Y-88-MX-DTPA-ε-HN(Lys)-AP39将于115μl PBS中的200μg(3.6nmol)非还原的AP39用300μl四硼酸钠缓冲液(0.1M，pH 8.5)稀释，并用200ml四硼酸钠缓冲液(0.1M，pH 8.5)透析2次，每次1小时，应用Slide-A-Lyzer 10,000 MWCO(Pierce Inc.，Rockford，IL，U.S.A.)进行。加入50μl的MX-DTPA溶液(0.33mg MX-DTPA溶解于500μl四硼酸钠缓冲液(0.1M，pH 8.5)中)，并将反应混合物在37℃加热3小时。应用Slide-A-Lyzer 10,000MWCO(PierceInc.，Rockford，IL，U.S.A.)将反应混合物用200ml乙酸钠缓冲液(0.1M，pH 6.0)透析2次，每次1小时，及1次17小时(过夜)。
加入100μl[Y-88]YCl3溶液(HCl，1N，75 MBq，Oak RidgeNational Lab.)并将反应混合物在37℃加热30分钟。Y-88标记的MX-DTPA-ε-HN(Lys)-AP39使用NAP-5层析柱(Amersham，洗脱液PBS)通过凝胶层析纯化。
放射化学产量65％。
放射化学纯度93％(SDS-PAGE)。
比活性10.2MBq/nmol。
免疫反应性72％。
实施例12合成Lu-177-DOTA-C-苄基-对-NCS-ε-HN(Lys)-AP3将于110μl PBS中的200μg(3.6nmol)非还原的AP39用300μl四硼酸钠缓冲液(0.1M，pH 8.5)稀释，并应用Slide-A-Lyzer 10,000MWCO(Pierce Inc.，Rockford，IL，U.S.A.)用200ml四硼酸钠缓冲液(0.1M，pH 8.5)透析2次，每次1小时。加入50μl的苄基-对-SCN-DOTA溶液(1.5 mg溶解于5ml四硼酸钠缓冲液(0.1M，pH 8.5)中)，将反应混合物在37℃加热3小时。应用Slide-A-Lyzer 10,000MWCO(Pierce Inc.，Rockford，IL，U.S.A.)将该反应混合物用200ml乙酸钠缓冲液(0.1M，pH6.0)透析2次，每次1小时，及1次17小时(过夜)。
加入200μl[Lu-177]LuCl3溶液(HCl，1N，80MBq，NRH-Petten，Netherlands)并将反应混合物在37℃加热30分钟。Lu-177标记的DOTA-C-苄基-对-NCS-ε-HN(Lys)-AP39使用NAP-5层析柱(Amersham，洗脱液PBS)通过凝胶层析纯化。
放射化学产量74％。
放射化学纯度95％(SDS-PAGE)。
比活性19MBq/nmol。
免疫反应性71％。
实施例13在单次静脉内注射进携带肿瘤的裸鼠后，在甲醇酵母中表达的Tc-99m-AP39的器官分布和排泄将本发明的物质以大约74 kBq的剂量经静脉内注射入携带F9(畸胎癌)的动物体内(体重为大约25g)。所述物质在不同器官中的放射活性浓度及在排泄物中的放射活性，使用一种γ计数器在施用所述物质后的不同时间测定。另外，基于本发明物质在肿瘤和血液中的浓度在不同时间确定肿瘤与血液比率。
Tc-99m-AP39在携带F9(畸胎癌)的裸鼠中的生物分布示于表2(平均值±SD，n＝3)。
表2
Tc-99m-AP39在携带F9(畸胎癌)的裸鼠中的排泄示于表3(平均值±SD，n＝3)。
表3
Tc-99m-AP39在携带F9(畸胎癌)的裸鼠中的肿瘤血液比率示于图2(平均值±SD，n＝3)。
这项研究结果示出本发明物质在实体肿瘤中积累的极佳潜力，同时伴有极佳的排泄。
实施例14在单一静脉内注射入携带肿瘤的裸鼠后，In-111-MX-DTPA-ε-HN(Lys)-AP39器官分布将本发明的物质以大约48kBq剂量经静脉内注射入携带F9(畸胎癌)的动物中(体重为大约25g)。所述物质在不同器官中的放射性浓度及在排泄物中的放射性，使用一种γ计数器在施用所述物质后的不同时间测定。
In-111-MX-DTPA-ε-HN(Lys)-AP39在携带F9(畸胎癌)的裸鼠中的生物分布示于表4(平均值±SD，n＝3)。
表4
In-111-MX-DTPA-ε-HN(Lys)-AP39在携带F9(畸胎癌)的裸鼠中的肿瘤血液比率示于表5(平均SD，n＝3)。
表5
这项研究结果示出本发明物质在实体肿瘤中积累的极佳潜力，及同时有极佳的生物分布及肿瘤血液比率。
实施例15在单次静脉内注射入携带肿瘤的裸鼠后，在甲醇酵母中表达的Tc-99m-AP39的成像(imaging)将本发明的物质以大约9.25MBq剂量经静脉内注射入携带F9(畸胎癌)的动物体内(体重为大约25g)。在施用所述物质后不同时间进行γ相机成像(Gamma-camera imaging)。
携带F9(畸胎癌)的裸鼠中Tc-99m-AP39的平面闪烁扫描结果示于图3和图4。图3示出在注射所述物质后5小时的闪烁扫描图，图4在注射所述物质24小时后的闪烁扫描图。
这项研究的结果示出本发明的物质具有成像实体肿瘤的极佳潜力。
序列表<110>舍林股份公司<120>包含纤连蛋白ED-B结构域的特异抗体的缀合物和其在检测和治疗肿瘤中的应用<130>27041P_WOAS<140>
<141>
<150>EP02 000 315.8<151>2002-01-03<150>US60/358702<151>2002-02-25<160>13<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>238<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<221>SITE<222>(1)..(116)<223>VH<220>
<221>SITE<222>(117)..(130)<223>Linker<220>
<221>SITE<222>(131)..(238)<223>VL<220>
<221>VARIANT<222>(1)..(238)<223>deletion，insertion and/or substitution of up to30 amino acids<220>
<223>Description of Artificial Sequencerecombinantantibody fragment<400>1Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe20 25 30Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Lys Pro Phe Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val100 105 110Thr Val Ser Ser Gly Asp Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala Ser115 120 125Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser130 135 140Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser145 150 155 160Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg165 170 175Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg180 185 190Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg195 200 205Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Gly Arg210 215 220Ile Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys225 230 235<210>2<211>4<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>Description of Artificial Sequencerecombinantantibody fragment<220>
<221>VARIANT<222>(1)..(3)<223>xaa each independently represent any naturallyoccuring amino acid<400>2Xaa Xaa Xaa Cys1
<210>3<211>5<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>Description of Artificial Sequencerecombinantantibody fragment<220>
<221>VARIANT<222>(1)..(3)<223>Xaa each independently represent any naturallyoccuring amino acid<220>
<221>VARIANT<222>(5)<223>Xaa represents any naturally occuring amino acid<400>3Xaa Xaa Xaa Cys Xaa1 5<210>4<211>1<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>Description of Artificial Sequencerecombinantantibody fragment<220>
<221>REPEAT<222>(1)<223>His＝(His)n，wherein n stands for an integer from 4to 6<400>4His1<210>5<211>4<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>Description of Artificial Sequencerecombinantantibody fragment<400>5Gly Gly Gly Cys1
<210>6<211>4<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>Description of Artificial Sequencerecombinantantibody fragment<400>6Gly Cys Gly Cys1<210>7<211>5<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>Description of Artificial Sequencerecombinantantibody fragment<400>7Gly Gly Gly Cys Ala1 5<210>8<211>5<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>Description of Artificial Sequencerecombinantantibody fragment<400>8Gly Cys Gly Cys Ala1 5<210>9<211>247<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>Description of Artificial Sequencerecombinantantibody fragment<400>9Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe20 25 30Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ser Ser Ile Ser Gly Ser Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Lys Pro Phe Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val100 105 110Thr Val Ser Ser Gly Asp Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala Ser115 120 125Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly130 135 140Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser145 150 155 160Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu165 170 175Ile Tyr Tyr Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser180 185 190Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu195 200 205Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Gly Arg Ile Pro210 215 220Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ala Ala Ala Leu225 230 235 240Glu His His His His His His245<210>10<211>240<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>Description of Artificial Sequencerecombinantantibody fragment<400>10Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe20 25 30Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ser Ser Ile Ser Gly Ser Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Lys Pro Phe Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val100 105 110Thr Val Ser Ser Gly Asp Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala Ser115 120 125Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly130 135 140Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser145 150 155 160Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu165 170 175Ile Tyr Tyr Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser180 185 190Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu195 200 205Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Gly Arg Ile Pro210 215 220Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Cys225 230 235 240<210>11<211>241<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>Description of Artificial Sequencerecombinantantibody fragment<400>11Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe20 25 30Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ser Ser Ile Ser Gly Ser Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Lys Pro Phe Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val100 105 110Thr Val Ser Ser Gly Asp Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala Ser115 120 125Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly130 135 140Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser145 150 155 160Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu165 170 175Ile Tyr Tyr Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser180 185 190Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu195 200 205Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Gly Arg Ile Pro210 215 220Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Cys225 230 235 240Ala<210>12<211>240<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>Description of Artificial Sequencerecombinantantibody fragment<400>12Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe20 25 30Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ser Ser Ile Ser Gly Ser Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Lys Pro Phe Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val100 105 110Thr Val Ser Ser Gly Asp Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala Ser115 120 125Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly130 135 140Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser145 150 155 160Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu165 170 175Ile Tyr Tyr Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser180 185 190Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu195 200 205Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Gly Arg Ile Pro210 215 220Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Cys Gly Cys225 230 235 240<210>13<211>241<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>Description of Artificial Sequencerecombinantantibody fragment<400>13Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe20 25 30Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ser Ser Ile Ser Gly Ser Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Lys Pro Phe Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val100 105 110Thr Val Ser Ser Gly Asp Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala Ser115 120 125Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly130 135 140Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser145 150 155 160Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu165 170 175Ile Tyr Tyr Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser180 185 190Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu195 200 205Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Gly Arg Ile Pro210 215 220Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Cys Gly Cys225 230 235 240Ala
权利要求
1.包含一种肽的化合物，所述肽包含aa)纤连蛋白的额外结构域B(ED-B)的抗原结合位点，其包含表1所示互补决定区HCDR3和/或LCDR3或其变体，所述变体缺失，插入和/或取代HCDR3区的最多5个氨基酸及LCDR3区的最多6个氨基酸，其与SEQ ID NO1所示肽具有相同功能；ab)纤连蛋白的额外结构域B(ED-B)的抗原结合位点，其包含表1所示互补决定区HCDR1，HCDR2，HCDR3，LCDR1，LCDR2和LCDR3及其变体，所述变体缺失，插入和/或取代HCDR1区的最多3个氨基酸、HCDR2区的最多8个氨基酸、HCDR3区的最多5个氨基酸、LCDR1区的最多6个氨基酸、LCDR2区的最多4个氨基酸及LCDR3区的最多6个氨基酸，其与SEQ ID NO1所示肽具有相同功能；或者ac)SEQ ID NO1(L19)的序列或SEQ ID NO1的变体，所述变体缺失，插入和/或取代最多30个氨基酸，其与SEQ IDNO1所示肽具有相同功能；及ba)一个氨基酸序列Xaa1-Xaa2-Xaa3-Cys(SEQ ID NO2)，其中Xaa1，Xaa2和Xaa3均单独代表任何天然发生的氨基酸，或者bb)一个氨基酸序列Xaa1-Xaa2-Xaa3-Cys-Xaa4(SEQ ID NO3)，其中Xaa1，Xaa2，Xaa3和Xaa4均单独代表任何天然发生的氨基酸，或者bc)一个氨基酸序列(His)n(SEQ ID NO4)，其中n表示4-6之间的一个整数，其中aa)，ab)或ac)的C末端通过一个肽键与SEQ ID NO2，SEQID NO3或SEQ ID NO4之一的序列的N末端结合。
2.权利要求1的化合物，其中氨基酸序列Xaa1-Xaa2-Xaa3-Cys(SEQ ID NO2)是序列Gly-Gly-Gly-Cys(SEQ ID NO5)或者Gly-Cys-Gly-Cys(SEQ ID NO6)。
3.权利要求1的化合物，其中氨基酸序列Xaa1-Xaa2-Xaa3-Cys-Xaa4(SEQ ID NO3)是序列Gly-Gly-Gly-Cys-Ala(SEQ ID NO7)或者Gly-Cys-Gly-Cys-Ala(SEQ ID NO8)。
4.权利要求1的化合物，其中氨基酸序列(His)n(SEQ ID NO4)中的n是6。
5.权利要求1-4任一项的化合物，其与一种放射性同位素缀合。
6.权利要求6的化合物，其所缀合的放射性同位素选自锝的放射性同位素如94mTc，99mTc，铼的放射性同位素如186Re，188Re，或其它同位素如203Pb，67Ga，68Ga，43Sc，44Sc，47Sc，110mIn，111In，97Ru，62Cu，64Cu，67Cu，68Cu，86Y，88Y，90Y，121Sn，161Tb，153Sm，166Ho，105Rh，177Lu，72As及18F。
7.权利要求6的化合物，其中所述放射性同位素是99mTc或188Re。
8.权利要求1-7任一项的化合物，其中所述肽是还原形式。
9.一种药物组合物，其包含权利要求1-8任一项的化合物作为活性剂，及生理学可接受的佐剂，载体和/或稀释剂。
10.权利要求9的组合物，其在小鼠体内在24小时内通过肾排泄70％或更多。
11.权利要求9或10的组合物，其在小鼠体内施用后5小时的肿瘤血液比率为5∶1或更多。
12.权利要求9-11任一项的组合物，其用于诊断性应用。
13.权利要求9-11任一项的组合物，其用于治疗性应用。
14.一种肽在结合放射性同位素中的应用，所述肽包含aa)纤连蛋白的额外结构域B(ED-B)的抗原结合位点，其包含表1所示互补决定区HCDR3和/或LCDR3或其变体，所述变体缺失，插入和/或取代HCDR3区的最多5个氨基酸及LCDR3区的最多6个氨基酸，其与SEQ ID NO1所示肽具有相同功能；ab)纤连蛋白的额外结构域B(ED-B)的抗原结合位点，其包含表1所示互补决定区HCDR1，HCDR2，HCDR3，LCDR1，LCDR2和LCDR3及其变体，所述变体缺失，插入和/或取代HCDR1区的最多3个氨基酸、HCDR2区的最多8个氨基酸、HCDR3区的最多5个氨基酸、LCDR1区的最多6个氨基酸、LCDR2区的最多4个氨基酸及LCDR3区的最多6个氨基酸，其与SEQ ID NO1所示肽具有相同功能；或者ac)SEQ ID NO1(L19)的序列或SEQ ID NO1的变体，所述变体缺失，插入和/或取代最多30个氨基酸，其与SEQ IDNO1所示肽具有相同功能；及ba)一个氨基酸序列Xaa1-Xaa2-Xaa3-Cys(SEQ ID NO2)，其中Xaa1，Xaa2和Xaa3均单独代表任何天然发生的氨基酸，或者bb)一个氨基酸序列Xaa1-Xaa2-Xaa3-Cys-Xaa4(SEQ ID NO3)，其中Xaa1，Xaa2，Xaa3和Xaa4均单独代表天然发生的氨基酸，或者bc)一个氨基酸序列(His)n(SEQ ID NO4)，其中n表示4-6之间的一个整数，其中aa)，ab)或ac)的C末端通过一个肽键与SEQ ID NO2，SEQID NO3或SEQ ID NO4之一的序列的N末端结合。
15.权利要求14的应用，其中所述放射性同位素选自锝的放射性同位素如94mTc，99mTc，铼的放射性同位素如186Re，188Re，或其它同位素如203Pb，67Ga，68Ga，43Sc，44Sc，47Sc，110mIn，111In，97Ru，62Cu，64Cu，67Cu，68Cu，86Y，88Y，90Y，121Sn，161Tb，153Sm，166Ho，105Rh，177Lu，72As及18F。
16.权利要求15的应用，其中所述放射性同位素是99mTc或188Re。
17.生产权利要求1-4任一项的肽的生产方法，特征在于所述肽在真核细胞中尤其在酵母细胞中表达。
18.权利要求17的方法，其中所述真核细胞是甲醇酵母(Pichiapastoris)细胞。
19.权利要求17或18的方法，其中所述肽组成型表达。
20.权利要求17-19任一项的方法，其中所述肽的N末端与来自α信号序列的Kex2切割位点直接融合。
21.用于生产放射性药物的试剂盒，其包含权利要求1-8任一项的肽，任选地包含生理学可接受的佐剂。
全文摘要
本发明涉及用结合放射性核素的肽诊断和治疗肿瘤的方法。所述肽包含纤连蛋白的额外结构域B(ED－B)的抗原结合位点。
文档编号A61K9/00GK1612895SQ03801943
公开日2005年5月4日 申请日期2003年1月2日 优先权日2002年1月3日
发明者克里斯托夫-斯特凡·希尔格, 迪特马尔·贝恩多夫, 鲁德格尔·丁克尔博格, 迪特尔·英斯迈尔, 乔瓦尼·内里 申请人:舍林股份公司