专利名称：来自骨髓基质细胞的用于形成血管并产生血管生成和营养因子的物质的制作方法
发明
背景技术：
领域本发明涉及用作治疗剂的方法和组合物。更具体地，本发明涉及利用治疗剂创建血管生成并产生血管生成和营养因子。
背景技术：
中风是美国成年人口中第三个最常见的死亡原因，并且是残疾的主要致因。中风在脑区域变得梗塞，导致脑组织因脑血供应中断而死亡时发生。与急性中风相关的脑梗塞导致突然和显著的神经学损伤。其它神经学疾病也导致组织死亡和神经学损伤。
已尝试药理学干预以最大化通往有可能存活的中风侵袭脑区域的血流，然而临床效果表明难以捉摸。正如Harrison′s Principles ofInternal Medicine(第9版，1980，p.1926)中所陈述的“尽管存在......[脑血管舒张药]增加脑血流的实验证据(就如氧化亚氮法所测的那样)，但它们在处于短暂性局部缺血发作、发展中的血栓症以及建立的中风阶段的人类中风病例的精细研究中未能证明有任何益处。对于烟酸、苄唑啉(priscoline)、乙醇、罂粟碱以及5％二氧化碳的吸入，情况的确如此......反对使用这些方法的意见是血管舒张药有害而无益，因为通过降低系统血压，它们减少了颅内吻合流，或者通过在脑正常部分扩张血管，它们窃取了梗塞区的血液。”另外，心血管系统疾病是世界上死亡率和发病率的主导原因。例如，心力衰竭日益增加。心力衰竭以心脏无力向身体各器官输送足够的血液为特征。当前的估计显示超过五百万的美国人被诊断有心力衰竭，每年诊断出将近500,000个新病例，且每年有250,000例因此病的死亡。尽管在过去两年里取得了重大的治疗成果，心力衰竭发生率持续增长，达到流行病比例，并构成了发达国家的主要经济负担。
心力衰竭是以因心搏量失调或静脉压升高而引起的独特病症或征兆为特征的临床综合症。而且，心力衰竭是进行性疾病，由此，尽管不存在不利事件，心脏功能随着时间继续恶化。由于心力衰竭，造成心搏量(cardiac output)不足。
一般而言，存在两类心力衰竭。右心衰竭是指右侧心脏无力将静脉血泵至肺循环。发生体内体液回流，并导致发胀和浮肿。左心衰竭是指左侧心脏无力将血液泵至系统循环。在左心室后的回流则导致体液在肺中的积聚。
心力衰竭产生的主要影响是体液拥塞。如果作为泵心脏变得效率低下，则身体试图通过，例如，利用激素和神经信号增大血容量来弥补。
心力衰竭具有许多的致因。例如，心组织疾病产生不再行使功能的死亡心肌细胞。左心室机能障碍的发展部分地是归因于这些心肌细胞不间断的损失。
存在众多治疗和预防心力衰竭的方法。例如，在急性心脏局部缺血和/或梗塞或损伤的动物模型中已利用干细胞再生心细胞。在一个特别的实例中，将分离自供体股骨的活骨髓基质细胞培养扩增，标记，然后注射到同系成年大鼠受体的心肌中。从植入后4天起到第12周收集心脏，检查植入部位，发现植入的基质细胞在心肌环境中表现出生长潜力(Wang等)。
已经表明心肌细胞(cardiomyocytes)在体外由细胞系D3的多能胚胎干细胞(ES)通过胚样聚集物(胚状体)分化而来。在整个分化阶段通过全细胞patch-clamp技术、形态学以及基因表达模拟对细胞进行了特征描述(Maltsev等，1994)。另外，多能小鼠ES细胞能够分化成表达哺乳动物心脏主要特征的心肌细胞(Maltsev等，1993)。
干细胞不论其来源(胚胎、骨髓、骨骼肌等)如何，都具有分化为多种(如果不是所有的话)身体细胞类型的潜能。干细胞能够分化为功能性心肌细胞。因而，发展基于干细胞的治疗心力衰竭的疗法比现有疗法具有很多优点。
发明概述根据本发明，提供了用于诱导血管生成和血管发生的治疗剂。该治疗剂包括与与药学上可接受的诱导血管生成和血管发生的细胞治疗剂相结合的分离自干细胞的血管生成和血管发生诱导因子。也提供了通过将基质细胞暴露于并与增加血管生成和血管发生诱导因子产生的化合物共培养，增加分泌的血管生成和血管发生诱导因子产生的方法。也提供了从干细胞分离和纯化的治疗用血管生成和血管发生诱导因子。提供了获得如上文所示的血管生成和血管发生诱导因子的方法，该方法包括在分化前从组织中分离和纯化人类间充质干细胞，然后培养扩增所述间充质干细胞以产生用于神经学和肌与骨胳治疗的工具的步骤。公开了分离的且在必需化合物的影响下培养扩增的间充质干细胞，它能够分化并产生组织修复所需的期望细胞表型。
附图的简短说明参照以下详细说明，结合附图，更好地理解这些优点，将容易理解本发明的其它优点，其中
图1A到E是显示生长因子BDNF(图1A)、NGF(图1B)、bFGF(图1C)、VEGF(图1D)和HGF(图1E)分泌的照片；图2A和B是显示大脑中动脉闭塞前后并用静脉MSC处理或不处理的大鼠行为功能测试结果的曲线图；图3A和B是显示利用大鼠角膜新血管形成模型测试是否MSC分泌诱导体内血管生成的照片，图3A显示了没有新血管形成迹象的假手术角膜，而图3B显示了插入在角膜囊中的置于胶原水中的MSC上清，其中健壮的角膜新血管形成明显；图4显示了为支持本发明而实施的实验的图解说明，其中由动物提取骨髓并分离MSC并传代培养3-5代，将MSC注射给神经损伤的动物，并且细胞选择性地迁往受损组织，并定位在病变的边界区，然后MSC激活由MSC、实质细胞分泌物、以及生长和营养因子介导的一系列促恢复(restorative)事件，从而改善神经系统功能；图5显示了在将大鼠大脑右半球分成3个亚区和8个视野的前连合水平鉴定到的标准冠状切面；图6A和B是显示大脑中动脉闭塞前后行为功能测试结果的曲线图；图8A和B是显示大鼠脾细胞和hMSC之间的混合淋巴细胞反应的曲线图；且图9是显示大鼠脑中外源人类骨髓基质细胞(hMSC)和内源脑细胞的形态特征的显微照片。
发明内容
一般地，本发明提供了来自骨髓基质细胞或其它干细胞的血管生成和血管发生诱导因子作为细胞疗法的一部分诱导血管生成和血管发生中的应用。更具体地，本发明提供了增加由基质或其它干细胞分泌的治疗用血管生成和血管发生诱导因子(例如，血管生成因子、营养因子及生长因子)产生的方法，所述因子在给药后诱导血管生成或其它的有益生长。所述增加随着将所述细胞暴露于并与脑提取物和/或与钙共培养发生。
术语“血管生成”被定义为组织血管形成的过程，它涉及新生和/或发育中的血管生长进入组织，并且也被称之为新血管形成。该过程由内皮细胞和平滑肌细胞浸润介导。该过程能够以三种方式之一进行血管可从既有血管中萌发出，血管的重新发育可起源于前体细胞(血管发生)和/或现有小血管直径能够扩大。
如本文所用的术语“促进”或“增强”旨在包括，但不限于通过对物质添加某些期望的特质或者增加其数量而使之富集或者更丰足。
如本文所用的短语“脑提取物”旨在包括，但不限于脑细胞或者从脑中获得的其它类似细胞。这些细胞也可以用培养基培养，并且上清可用作为脑提取物。
如本文所用，术语“损伤”旨在包括，但不限于物理学或生物学损伤，包括遗传病症、疾病以及随年龄发作的病症。例如，患者在中风、CNS损伤和神经变性疾病之后经受神经学和功能性缺陷。
如本文所用的术语“细胞疗法”包括，但不限于干细胞的治疗用途。干细胞为广义的母细胞，其子代特化为多种细胞类型。干细胞具有多种来源，包括但不限于，胚胎、骨髓、肝、基质、脂肪组织及本领域技术人员公知的其它干细胞来源。这些干细胞可置于它们天然存在的目的区域，或者可以本领域技术人员公知的任何方式改造。因而，通过多种基因工程方法(包括但不限于，转染、缺失等)，可以改造干细胞以便提高它们生存的可能性，或者用于任何其它期望目的。
当在体内提供给人类受试者时，干细胞能够自我再生，并且能够变成谱系限制性(lineage-restricted)祖细胞，其进一步分化并扩增为特定的谱系(lineage)。如本文所用，“干细胞”是指人类髓基质细胞而非其它细胞类型的干细胞。优选地，“干细胞”是指人类髓基质细胞。
术语“干细胞”或者“多能”干细胞互换使用，是指具有(1)产生所有定义的造血系子代的能力的干细胞，以及(2)通过自我更新能够完全重建严重无免疫应答(immunocomprmised)宿主的所有血细胞类型及其子代的干细胞，包括多能造血干细胞。
骨髓是占据长骨髓腔、某些哈弗斯管(haversian canal)以及松质骨或骨松质小梁之间的间隙的软组织。骨髓有两类红色，见于生命早期的所有骨中，以及成年期的有限场所(即骨松质中)并与血细胞(即造血作用)和血红蛋白(故而呈红色)的产生有关；以及黄色，主要地是由脂肪细胞(故而呈黄色)和结缔组织组成。
就整体而言，骨髓是复杂的组织，包括造血干细胞、红和白细胞及其前体、间充质干细胞、基质细胞及其前体，以及包括成纤维细胞、网织红细胞、脂肪细胞和内皮细胞在内的一组细胞，它们构成称之为“基质”的结缔组织网络。来自基质的细胞通过经由细胞表面蛋白的直接相互作用和分泌生长因子在形态学上调控造血细胞的分化，并参与骨结构的建立和支持。
利用动物模型的研究提示骨髓含有“前基质”细胞，它们具有分化呈软骨、骨及其它结缔组织细胞的能力(Beresford，J.N.OsteogenicStem Cells and the Stromal System of Bone and Marrow，Clin.Orthop.，240270，1989)。最近的证据显示称之为多能基质干细胞或者间充质干细胞的这些细胞，在激活后具有产生数种不同类型的细胞系(例如，骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等)的能力。然而，间充质干细胞非常小量地存在于组织中，伴有大量的其它细胞(即，红细胞、血小板、嗜中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱细胞、脂肪细胞等)，而且，与年龄呈反相关，取决于许多生物活性因子的影响，它们能够分化为一类结缔组织。
本发明的目的是利用骨髓基质细胞、来自骨髓基质细胞的上清或者由骨髓基质细胞与其它干细胞相互作用产生的分泌物治疗疾病。这些分泌物包括，但不限于，一系列生长、营养及血管生成因子。本发明的方法通过增大治疗效果如血管生成，或者通过增加血管自未有或既有脉管系统的产生，促进神经元损伤或其它损伤恢复结果的改善。本发明也可用来提供增强脑补偿机制的手段，以改善CNS损伤或变性的功能。另外，本发明的方法和组合物可增加细胞疗法的功效。
通过移植分化为损伤细胞的干细胞富集和/或再募集受损细胞提高了功能。例如，当这种疗法用于心脏时，该疗法可增加心脏的收缩单位。收缩单位的增加提高了心脏的功能。另外，干细胞也可以引起多种物质，例如营养因子的释放。因而，例如，营养因子的释放诱导血管生成(增加血管数目)，以提高心脏功能和/或治疗心力衰竭。因此，干细胞发挥提高心脏功能和/或治疗心力衰竭的作用是通过多种机制而并非仅仅是分化为功能性心肌细胞。
营养因子、生长因子及血管生成因子的生成通常是昂贵和困难的过程。本发明的方法和组合物仅仅通过给药本发明的疗法而提供了生成纯的营养因子、生长因子及其它有关因子的便宜和简单的方法。这些因子可用于治疗患者。例如，所述因子可用于诱导血管生成、血管发生以及在体内和体外增强组织功能和修复。因此它对于确定怎样的骨髓基质细胞可用作为细胞工厂生产和分泌营养、生长及血管生成因子大有益处。这些因子可包括，但不限于VEGF、HGF、BDNF、NGF、bFGF等。本发明的方法允许通过培养条件操纵这些因子的生产。例如，培养条件可通过共培养细胞与组织和/或培养基中不同的钙浓度操纵。
本发明以细胞疗法治疗疾病的应用为基础。尽管干细胞具有不同的来源(胚胎、骨髓、肝、脂肪组织等)，它们重要的共有特征在于它们具有分化为多种(如果不是所有的话)身体细胞类型的潜能。如先前所提及的，干细胞已经被证明能够分化为心肌细胞(Maltsev等，1993；1994)。
申请人发展了在从分化前组织中分离和纯化人类间充质干细胞，然后培养扩增所述间充质干细胞以生产用于神经学和肌与骨骼治疗的有价值的工具的方法。此处理的目的在于极大地提高间充质干细胞的数目并利用这些细胞重新指导和/或加强身体的正常修复能力。收集大量数目的间充质干细胞并施用于组织损伤区域，以促进或刺激体内生长用于再生和/或修复，通过随后的激活和分化改善植入物粘附于各种假器官装置(prosthetic device)，提高造血细胞产量等。
本发明涉及各种方法用于在修复、植入等部位转移、固定并激活所述培养扩增的纯化的间充质干细胞，包括在骨骼缺陷部位注入所述细胞，温育细胞和假器官(prosthesis)，并植入假器官等。因而，通过在分化前分离、纯化并极大地扩增细胞数目，然后通过将它们置于组织损伤部位或者通过移植前在体外预处理主动地控制其分化过程，所述培养扩增的未分化的间充质干细胞可用于多种治疗目的，例如阐释多种神经学疾病、神经损伤、代谢性骨病、骨骼发育不良、软骨缺陷、韧带和肌腱损伤以及其它肌肉骨骼和结缔组织病症中的细胞、分子和遗传病症。
本发明涉及各种方法通过使用各种多孔陶瓷工具或载体用于在修复、植入等部位转移、固定并激活所述间充质干细胞或前体细胞，包括在缺陷部位注入细胞。
人类间充质干细胞可从许多不同的来源获得，包括在髋部或膝盖替换手术期间由关节变性病的患者获得的股骨头松质骨片塞，以及从正常供体和被收集骨髓用于将来骨髓移植的肿瘤患者抽取的骨髓。尽管制备收集的骨髓用于根据收集髓的来源(即骨碎片、外周血等的存在)通过许多不同的机械分离方法的细胞培养分离，但该分离方法中涉及的关键步骤是使用专门制备的培养基，所述培养基中含有不仅允许间充质干细胞无分化地生长，而且允许只有间充质干细胞才能直接粘附于培养皿的塑料或玻璃表面区域的物质。通过生产允许非常小量地存在于髓样品中的目的间充质干细胞选择性粘附的培养基，有可能从存在于骨髓中的其它细胞(即，红和白细胞、其它分化的间充质干细胞等)中分离间充质干细胞。
如上文所指出的，完全培养基可用在许多不同的分离过程中，视用于制备用于细胞培养分离收集的骨髓的初始分离方法的具体类型而定。当使用松质骨塞骨髓时，将骨髓添加到完全培养基中，并振荡形成分散液，然后离心从骨片中分离骨髓细胞，等等。然后使含骨髓细胞的完全培养基通过配有16、18和20系列标准针头的注射器，使骨髓细胞(主要地由红和白细胞以及非常小量的间充质干细胞等组成)解离为单细胞。据信相对于酶学分离方法，通过使用机械分离方法所产生的优势在于机械方法产生很少的细胞变化，而酶学方法可能产生细胞损伤，尤其是培养粘附和选择性分离所必需的蛋白结合位点和/或产生所述间充质干细胞特异性的单克隆抗体所必需的蛋白位点的损伤。随后将单细胞悬液(它由大约50-100×106有核细胞构成)置于100mm皿中，目的是从悬液中发现的其余细胞中选择性分开和/或分离间充质干细胞。
当利用抽出的骨髓作为人类间充质干细胞的来源时，向完全培养基中添加骨髓干细胞(它含很少或者没有骨碎片，但含大量血液)，并由下文更特别描述的Percoll(Sigma，St.Louis，Mo.)梯度分级。Percoll梯度自含来源于骨髓的间充质干细胞的低密度血小板级分中分离大百分比的红细胞和单核造血细胞。血小板级分含大约30-50×106细胞，是由未定量的血小板细胞、30-50×106有核细胞以及视骨髓供体年龄而定的仅约50-500间充质干细胞构成。随后将所述低密度血小板级分置于培养皿中，根据细胞粘附性进行选择性分离。
根据下文所列条件，在完全培养基中培养从松质骨或髂骨抽出物获得的骨髓细胞(即原代培养物)1到7天，并使之粘附到培养皿的表面上。由于在第三天后观察到细胞粘附的不增加，因此选择三天作为通过用新鲜完全培养基替换原始完全培养基而从培养物中除去非粘附细胞的标准时间长度。后来的培养基改变每四天进行一次，直至培养皿铺满，这通常需要14-21天。这代表了未分化人类间充质干细胞103-104倍的增加。
然后利用释放剂如含EDTA(乙二胺四乙酸)的胰蛋白酶(0.25％胰蛋白酶，1mM EDTA(1次)，Gibco，Grand Island，N.Y.)或者螯合剂如EGTA(乙二醇-二-(2-氨基乙醚)N，N′-四乙酸，Sigma Chemical Co.，St.Louis，Mo.)从培养皿中脱离细胞。较之于胰蛋白酶，通过利用螯合剂产生的优势在于胰蛋白酶可能会切割间充质干细胞的许多结合蛋白。由于这些结合蛋白含识别位点，当试图产生单克隆抗体时，利用螯合剂如EGTA而非胰蛋白酶作为释放剂。然后失活释放剂，并用完全培养基洗涤分离的培养的未分化间充质干细胞备随后之用。
在某些条件下，培养扩增的间充质干细胞在作为移植物于多孔磷酸钙陶瓷中温育时具有分化为骨的能力。尽管影响间充质干细胞分化为骨而不是软骨细胞的内部因子是众所周知的，但似乎间充质干细胞与多孔磷酸钙陶瓷而非扩散腔中的维管系统所提供的生长和营养因子的直接可接近性影响间充质干细胞分化为骨。此外，脑提取物导致干细胞产生额外的营养因子进一步增强干细胞的作用。
所以，分离的且培养扩增的间充质干细胞可在某些特定条件下和/或在某些因子的影响下使用，以分化并产生组织修复所需的期望细胞表型。
给药单次剂量的间充质干细胞可有效地降低或消除针对与T细胞异源的组织或者针对“非自身”组织的T细胞应答，尤其是在T淋巴细胞在与间充质干细胞分离之后保留了其对异源细胞的非应答特征(即耐受或无反应性)的情况下。
将干细胞和脑提取物一起移植到心肌中的一般方法以下列操作进行。向患者给药干细胞和脑提取物。给药可以是皮下，肠胃外，包括静脉内、动脉内、肌内、腹膜内和鼻内给药，以及利用鞘内和输注技术给药。
间充质干细胞的剂量在很广的界限内变化，且在每个特殊病例中与个体需求相适应。一般而言，在肠胃外给药情况下，惯常给药约0.01到约5百万细胞/kg受体体重。所用细胞的数目取决于受体的体重和病情、给药次数或频率以及本领域技术人员公知的其它变量。所述间充质干细胞可以经由适合于待移植的组织、器官或细胞的途径给药。它们可以系统给药，即肠胃外通过静脉内注射给药，或者可以靶向特定的组织或器官如骨髓。人类间充质干细胞可经由皮下植入细胞，或者通过将干细胞注入结缔组织如肌肉中给药。
细胞可以悬浮在合适的稀释剂中，浓度从约0.01到约5×106细胞/ml。用于注射液的合适的赋形剂是那些与细胞且与受体在生物学上和生理学上相容的赋形剂，例如缓冲盐溶液或者其它合适的赋形剂。给药的组合物必须根据符合完全的无菌性和稳定性的标准方法配制、生产和贮存。
虽然本发明不限于此，间充质干细胞可以(优选从骨髓)分离、纯化并在培养中(即在体外)扩增，以获得足够数目的细胞用于本文所述的方法中。间充质干细胞，在骨中发现的形成多能母细胞，通常地以非常低的频率存在于骨髓(1∶100,000)和其它间充组织中。参见Caplan和Haynesworth，美国专利No.5,486,359。间充质干细胞的基因转导公开在Gerson等的美国专利No.5,591,625中。
除非另行指出，基因操作如Sambrook和Maniatis，MOLECULAR CLONINGA LABORATORY MANUAL，第2版；Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)中所述实施。
本发明是有价值的，因为已经充分清楚在任何病因的心力衰竭中功能恶化的一个机制部分地是归因于心肌细胞不间断的死亡(Sabbah，2000)。这个问题的解决方案就是为心肌富集和/或再募集新的心脏细胞，它们将取代丧失的细胞或者为当前发挥作用的心脏细胞提供附加的强化，由此改善衰竭心脏的泵送功能。
本发明比所有当前已有的治疗都具有优势，因为没有已知的副作用，而且治疗是相对非侵入性的。例如，治疗心力衰竭目前主要地是基于干预神经体液系统的药物的利用。另外，存在包括心脏移植以及利用心室或双心室辅助装置的外科手术治疗。本发明提供的优势在于通过直接指向该病的主要致因，也就是收缩单位的丧失治疗心力衰竭的能力。因此，为心肌再募集分化为促成衰竭心脏的总体功能的收缩单位的干细胞，是新颖的且直达问题的中心。其它优势包括没有通常与利用药物疗法相伴的副作用，和没有困扰心脏移植或其它器官移植的免疫排斥，以及增加由干细胞产生的营养因子的能力。
本发明具有取代许多当前的手术治疗和可能甚至是药物治疗的潜力。目前已存在允许利用基于导管的方法向衰竭心脏递送联合脑提取物的干细胞的装置，因而消除了开胸手术的必要。另外，本发明在人类医学环境和兽医背景下都适用。
本发明的方法和组合物在本文包括的实施例中例证。尽管本文公开了具体的实施方案，它们不是详尽的，并且可包括在本领域技术人员公知的设计和方法学中变化的其它合适的设计。基本上，本领域技术人员公知的任何不同的设计、方法、结构及材料都可以使用而不偏离本发明的精神。
实施例方法分子生物学一般方法本领域公知的并且不具体描述的标准分子生物学技术一般依Sambrook等，Molecular CloningA LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York(1989)、和Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley andSons，Baltimore，Maryland(1989)、和Perbal，A Practical Guide toMolecular Cloning，John Wiley & Sons，New York(1988)、和Watson等，Recombinant DNA，Scientific American Books，New York以及Birren等(编辑)Genome AnalysisA Laboratory Manual Series，Vols.1-4 Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York(1998)以及美国专利4,666,828、4,683,202、4,801,531、5,192,659和5,272,057中所列的方法学进行，并特此并入作为参考。聚合酶链式反应(PCR)一般如PCR ProtocolsA Guide To Methods And Applications，AcademicPress，San Diego，CA(1990)中实施。原位(细胞中)PCR结合流式细胞仪可用于检测含特定DNA和mRNA序列的细胞(Testoni等，1996，Blood 873822)。
免疫学一般方法本领域公知的并且不具体描述的标准免疫学技术一般依Stites等(编辑)，Basic and Clinical Immunology(第8版)，Appleton & Lange，Norwalk，CT(1994)以及Mishell和Shiigi(编辑)，Selected Methods in Cellular Immunology，W.H.Freeman and Co.，New York(1980)进行。
药剂递送本发明的细胞按照良好的医学实践给药和配量，考虑个体患者的临床病情、给药部位和方法、给药时间表、患者年龄、性别、体重及医学从业者公知的其它因素。从而本文目的之用的药学上的“有效量”是由本领域公知的此类因素决定的。所述量应当有效地实现改善，包括但不限于改善的生存率或者更迅速的康复，或者改善或消除症状及本领域技术人员选择作为合适的度量标准的其它指征。
在本发明的方法中，本发明的细胞可以多种方式给药。应当指出它可以作为细胞或者药学上可接受的盐给药，并且可以单独或者作为活性成分联合药学上可接受的载体、稀释剂、助剂和赋形剂(vehicle)给药。细胞可以口服、皮下或者肠胃外给药，包括静脉内、动脉内、肌内、腹膜内，以及鼻内给药，以及鞘内和输注技术。细胞植入物也是有用的。待治疗患者是温血动物，并且尤其是哺乳动物包括人。药学上可接受的载体、稀释剂、助剂和赋形剂以及植入物载体一般是指不与本发明的活性成分反应的惰性无毒固体或液体填料、稀释剂或者胶囊材料。
引人注意的是人类一般要比小鼠或本文例证的其它实验动物治疗得更长，该治疗具有与病程长度和药效相称的长度。剂量可以是单次剂量或数天时期内的多次剂量，但优选单次剂量。
剂量可以是单次剂量或数天时期内的多次剂量。治疗通常具有与病程长度和药效以及待治疗患者的物种相称的长度。
当肠胃外给药本发明的细胞时，它一般配制成单位剂量的可注射形式(溶液、悬液、乳剂)。适于注射的药物制剂包括无菌水溶液或者分散液以及无菌粉末用以重建无菌可注射溶液或分散液。载体可以是溶剂或者分散介质，含有例如，水、乙醇、聚醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)、它们合适的混合物以及植物油。
适当的流动性可以，例如，通过使用包衣如卵磷脂、在分散液的情况下通过维持所需的粒径以及通过使用表面活性剂维持。非水性运载工具例如棉花籽油、芝麻油、橄榄油、大豆油、玉米油、向日葵油或花生油以及酯类如十四酸异丙酯，也可用作为细胞组合物的溶剂系统。另外，可以添加增强所述组合物稳定性、无菌性和等渗性的多种添加剂，包括抗菌防腐剂、抗氧化剂、螯合剂以及缓冲液。微生物作用的预防可通过多种抗细菌和抗真菌剂确保，例如，对羟基苯甲酸酯类、氯代丁醇、石炭酸、山梨酸等。在许多情况下，可能期望包括等渗剂，例如糖、氯化钠等。可注射药物形式的延迟吸收可通过使用延迟吸收剂，例如，单硬脂酸铝和明胶实现。根据本发明，所用的任何运载工具、稀释剂或添加剂应当与细胞相容。
根据期望，无菌注射液可通过在所需量的具有各种其它成分的合适溶剂中掺入实施本发明所用的细胞制备。
本发明的药理学制剂能够以含任何相容载体如各种赋形剂、助剂、添加剂和稀释剂的可注射制剂形式给药患者；或者本发明所用的细胞能够以缓释的皮下植入物或者靶向递送系统(例如单克隆抗体、载体递送、离子电渗(iontophoretic)、聚合物基质、脂质体和微球体)的形式肠胃外给药。可用于本发明的递送系统的实例包括5,225,182、5,169,383、5,167,616、4,959,217、4,925,678、4,487,603、4,486,194、4,447,233、4,447,224、4,439,196和4,475,196。许多其它此类植入物、递送系统和单元(module)是本领域技术人员熟知的。
本发明使用的细胞的药理学制剂可经口服给药患者。常规方法例如以片剂、悬液、溶液、乳剂、胶囊、粉末、糖浆等给药所述细胞是可用的。优选经口服或者静脉内递送细胞且保留其生物活性的已知技术。
在一个实施方案中，本发明的细胞最初可以通过静脉内注射给药，以使血液水平达到合适的水平。然后通过口服剂量的形式维持患者的水平，尽管可以根据患者的病情并且如上文所指出的那样利用其它给药形式。给药的量将因待治疗的患者而不同，且从每天约100ng/kg体重到100mg/kg体重变化，并且优选每天约10mg/kg体重到10mg/kg体重。
实施例1用骨髓基质细胞(MSC)治疗外伤性脑损伤(TBI)改善大鼠的功能结果(outcome)。组织替代不是细胞移植疗法中唯一的补偿途径。因为已证明多种生长因子介导损伤组织的修复和替代，MSC提供了在损伤组织治疗中起作用的营养支持。研究和测验了人类MSC(hMSC)对来自TBI的脑提取物的应答，以确定是否TBI环境诱导hMSC分化和分泌生长因子。用TBI提取物在体外培养hMSC，并进行免疫细胞化学和定量夹心酶联免疫吸附测定(ELISA)。结果显示TBI条件(conditioned)hMSC表达特异性细胞蛋白标志神经元核的NeuN(总hMSC的0.2-0.5％)、早期神经元分化和神经突生长的Tuj-1(6-10％)、星型胶质细胞的GFAP(4-7％)以及少突神经胶质细胞的MBP(3-5％)。另外，由TBI提取物处理的hMSC通过以时间依赖性的方式上调脑源神经营养因子(BDNF)、神经生长因子(NGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血管内皮生长因子(VEGF)以及肝细胞生长因子分泌。这些数据证明TBI提取物推动hMSC表达神经形态和脑组织的蛋白表型。此外，ELISA数据显示移植的hMSC通过应答性分泌系列可促进神经保护和血管生成的生长因子而提供治疗益处。
当将骨髓基质细胞(MSC)静脉内移植到遭受外伤性脑损伤(TBI)的大鼠中时，促进神经功能的恢复(Lu等，2001a)。在移植后，MSC优先迁往受损组织的场所，并且有些细胞表达脑内源样细胞的蛋白表型(Lu等，2001b；Lu等，2001a；Mahmood等，2001)。虽然由干细胞群替代受损组织的长期策略是治疗神经损伤直接了当的方法，但TBI模型的急性和短期治疗移植中低水平的MSC分化不可能提供功能性益处(Lu等，2001b；Lu等，2001a；Mahmood等，2001)，而且提供益处的机制仍然未知。
MSC天然地产生大量细胞因子和生长因子(Takai等，1997；Labouyrie等，1999；Bjorklund和Lindvall，2000；Dormady等，2001)，它们的分泌特性受其微环境的影响(Dormady等，2001)。神经营养蛋白例如脑源神经营养因子(BDNF)和神经生长因子(NGF)在体内和体外都增加受损CNS组织的存活(Hefti，1986；Kromer，1987；Koliatsos等，1993；Bullock等，1999；Gage，2000)。在临床前研究中广泛研究的生长因子是碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)(Ay等，1999)。在缺血发作后数小时内静脉内给药的bFGF降低梗塞大小，推测是由于直接保护处于脑梗塞边缘(半影区)的细胞(Ay等，1999)。血管内皮生长因子(VEGF)的表达也促进血管生成和神经修复(Papavassiliou等，1997)。用VEGF治疗中风改善功能结果(Zhang等，2000b)。损伤后脑中肝细胞生长因子(HGF)的表达自然上调并且在体外对脑神经元表现出抗凋亡效果(Zhang等，2000a)。
材料和方法试剂Hank′s平衡盐溶液(HBSS)、Dulbecco′s改良Eagle′s培养基(DMEM)、剔除(Knockout)DMEM、剔除血清替代品、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶和乙二胺四乙酸(EDTA)购于GIBCO(Grand Island，NY.)。Ficoll购于Pharmacia(Piscataway，NJ)。针对单克隆神经元核抗原(NeuN)、多克隆β-微管蛋白同型1(Tuj-1)、胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)和髓磷脂碱性蛋白(MBP)的抗体购于CHEMICON(Temecula，CA)。用于BDNF、bFGF、VEGF和HGF的夹心酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒由R & D systems(Minneapolis，MN)获得。NGF ELISA试剂盒由实验室制备。抗-β(2.5S，7S)NGF单克隆抗体、抗-β(2.5S，7S)NGF-β-gal、NGF-β标准购于Roche Molecular Biochemicals(Indianapolis，IN)。除非另行指出，试剂由Sigma Chemical Co.(St.Louis，MO)获得。
原代hMSC培养从15-16ml来自3个正常人类供体髂嵴的抽出物(aspirates)中获得初级骨髓。每个抽出物用HBSS按1∶1稀释，并铺在大约10ml Ficoll上。在2,500×g离心30分钟后，从界面上取出单核细胞层，并悬于HBSS中。细胞在1000×g离心10分钟，并将5×106细胞重悬于各100-mm组织培养皿(Falcon，Becton-Dickinson，NJ)中的补充有10％FBS的完全DMEM中。细胞于37℃5％CO2中在培养瓶中培育3天，并通过替换培养基除去未粘附细胞。在培养物铺满后，通常是在2-3周，细胞用处于磷酸缓冲盐溶液(PBS，pH7.4)中的0.05％w/v胰蛋白酶和0.02％w/v EDTA于37℃5分钟收集，重新涂板并再次培养2周并收集。然后冷冻细胞备稍后之用。这些实验中所用的细胞从第3到5代收集。
外伤性损伤脑的提取物对体重250到350g的雄性Wistar大鼠进行实验(n＝21)。通过腹膜内给药水合氯醛(35mg/100g体重)致使大鼠麻醉。利用反馈调控的水热系统在整个手术操作中将直肠温度维持在37℃。将大鼠置于立体框架中。通过用具有一6mm直径尖端的气动活塞以4m/秒的速率和2.5mm的压力击打左侧皮层(同侧皮层)诱发损伤(Dixon等，1991)。对照动物经历颅骨切开术，但未受损伤。在术后第1、4和7天处死大鼠(每个时间点n＝6)。立即从实验和正常对照(n＝3)大鼠中获取脑组织提取物。将实验大鼠和对照大鼠的左半球切片置于冰上，并迅速测量湿重克数。随后，通过添加DMEM(150mg组织/ml DMEM)使组织碎片均质化，并于冰上温育10分钟。匀浆以10,000×g于4℃离心10分钟。收集上清，并贮存于-80℃用以处理hMSC。
细胞分化通过将1.0×106细胞种植在35-mm皿中，并用具有20％剔除(Rnockout)血清替代品的、含10％、20％或40％TBI组织提取物上清的新鲜剔除DMEM处理它们进行蛋白表型研究。所有细胞温育7天。免疫反应性神经样细胞的估计是基于对最少3次不同实验中的3个培养皿中的10个随机视野(10×物镜)的细胞计数。由总细胞数目计算表型神经细胞的百分比。
双重和三重染色免疫细胞化学利用上文指出的不同处理方法，将hMSC以1.0×106的密度置于35-mm皿中的玻璃盖片(18×18mm2)上。玻璃盖片上的细胞用于免疫细胞化学分析。培养基上清如下文所述用于定量ELISA测量。细胞用PBS(pH7.4)洗涤，并用4％低聚甲醛固定10分钟。非特异性结合位点用4％正常马血清、2％牛血清白蛋白和0.1％Triton X-100封闭1小时。盖玻片用PBS洗涤，并与针对Tuj-1、GFAP或MBP的一抗温育1小时。它们用PBS再次洗涤，并与荧光素-异硫氰酸盐(FITC)缀合的羊抗鼠或抗兔IgG二抗温育1小时。Tuj-1染色的hMSC盖玻片再洗涤一次，并与另一初级抗体NeuN温育过夜，然后用PBS洗涤，并与花色素甙-5.18(Cy5)缀合的抗-鼠IgG二抗温育1小时。利用4′b-二脒-2-苯基吲哚二盐酸化物(DAPI)染料通过计数视野中的核确定细胞数目。然后用glycergel封固剂固定盖玻片。
ELISA利用ELISA检测在由TBI和正常脑提取物上清条件培养物中在第1、4和7天由hMSC分泌的BDNF、NGF、bFGF、VEGF和HGF。简要地，所有的试剂和工作标准按照厂商的指导制备，并向96孔板的每个孔中添加50-150μl标准或测定稀释液。温和地混合孔，并在室温下温育2-4小时。吸干并洗涤每个孔，重复该过程3次。在末次洗涤后，通过吸干或者倾倒孔除去残留缓冲液，并向每孔添加200μl各种生长因子缀合物。然后于室温下将板温育2-4小时。重复吸干和洗涤。向每孔添加200μl底物溶液并于室温下温育15-30分钟。添加50μl终止液并温和混合。在30分钟内利用设置在450-620nm的微板读数机测定每孔的光密度。
统计学分析利用Student′s t-测验评价刺激样品及其相应对照之间的形态学差异。时间反应的显著性通过重复测量的方差分析(ANOVA)评价。通过将各种生长因子浓度的对数对光密度的对数绘图使ELISA数据线性化，并通过回归分析法确定最佳拟合线。对每个标准、对照和样品进行平均双份读数，并减去平均零标准光密度。所有数值表达为均值±SD。p＜0.05被认为有统计学意义。
结果hMSC到神经样细胞的形态学分化相差显微镜检显示了在补充有10％FBS的完全DMEM中培养的成纤维细胞样hMSC的正常形态。在暴露于具有20％剔除血清替代品的剔除DMEM 7天后，有些反光细胞表现出短突起(process)。在培养于正常脑提取物上清的hMSC中，少数(～总细胞的2-3％，表1)细胞表现出神经元样形态。不过，与培养在具有20％剔除血清替代品的剔除DMEM中培养的hMSC(1.24×104±0.5×104/ml)相比，正常脑提取物诱使hMSC增殖(1.56×104±0.2×104/ml)(p＜0.05)。在培养于20％～40％TBI提取物上清的hMSC中，检测到多种形态，但典型地为具有长分枝突起(突起长度＞10μm)和生长锥样末端结构(总细胞中～13-30％的神经元样细胞，表)的折反光细胞，以及具有小和多极突起的星形细胞。存在TBI提取物培养物中总细胞数目(1.08×104±0.3×104/ml)下降的趋势，但这未达到统计学意义。所有各种浓度的TBI组织提取物诱使hMSC在形态学上类似于神经样细胞。
hMSC表达神经标志在具有20％剔除血清替代品且含10％、20％或40％TBI组织提取物的剔除DMEM中培养7天后，处理hMSC进行免疫细胞荧光分析。这允许对hMSC用DAPI(用于核鉴定的紫蓝色)、FITC(绿色)双标记或三标记CY5(红色)，以确定是否骨髓来源的细胞表达神经元(NeuN，Tuj-1)、星形胶质细胞(GFAP)以及少突神经细胞(MBP)的神经特异性标志。细胞核由DAPI染色。在免疫反应性染色的培养物中，0.2到0.5％的hMSC表达NeuN蛋白，而6到10％的hMSC标记为Tuj-1表型。NeuN和Tuj-1免疫反应性共定位于相同的细胞中(粉红色)。4到7％hMSC来源的细胞表达GFAP免疫反应性。3到5％来源的细胞表达MBP免疫反应性。检测的所有各种浓度的TBI提取物都诱使hMSC表达神经表型免疫反应性。
用TBI组织提取物上清处理的hMSC的生长因子分泌在具有20％剔除血清替代品培养基且含20％TBI组织提取物上清的剔除DMEM中培养1、4和7天后hMSC分泌的生长因子示于图1。正常脑和TBI组织提取物在体外影响hMSC分泌BDNF(图1a)、NGF(图1b)、bFGF(图1c)、VEGF(图1d)和HGF(图1e)。与仅有培养基的对照相比，正常脑组织提取物在体外提高所有检测的生长因子的分泌。在每个试验组中，BDNF、NGF和HGF分泌在条件TBI提取物中从第1天增加到第7天。VEGF分泌对于正常脑和外伤性脑损伤后脑组是相似的。VEGF的分泌在培养4天和7天的持续时间内一致地比培养1天的更大。BFGF的分泌特点不同于其它营养因子。培养为期1天的bFGF分泌值，与其它生长因子相反，超过或者等于4天和7天的数值。这些数据显示TBI在体外促进hMSC分泌NGF和BDNF，并且与血清替代培养基中hMSC的相比，正常脑培养基中hMSC分泌的所有营养蛋白和生长因子表现出显著增长。
讨论用TBI提取物处理的人类骨髓基质细胞在形态学上能够分化为神经样细胞并表达脑实质细胞的蛋白表型。HMSC分泌BDNF、NGF、bFGF、VEGF、HGF，而且分泌水平既取决于在培养中暴露于TBI提取物的时间，也取决于TBI组织提取的时间。
数据证明hMSC在体外能够通过暴露于TBI组织提取物而被驱使形成类似于形态学上的神经样细胞亚群。处理的hMSC也表达特异性脑蛋白标志，例如NeuN(神经元)、Tuj-1(早期分化和突触生长)、GFAP(星形胶质细胞)和MBP(少突神经胶质细胞)。因而，hMSC能够沿多细胞谱系分化。研究已经报道MSC能够在培养物中由试剂(Sanchez-Ramos等，2000；Woodbury等，2000；Deng等，2001)和受损CNS中(Azizi等，1998；Kopen等，1999；Chopp等，2000；Li等，2000；Chen等，2001；Lu等，2001b；Lu等，2001a；Mahmood等，2001)驱动分化为神经元样细胞。本文数据首次证明当某些hMSC在体外置于含TBI组织提取物的特定微环境中时，通过呈现脑实质的形态学以及表型特征作出应答。在治疗移植中，这些细胞能够为TBI损伤大脑提供细胞替代品的来源。
骨髓基质细胞是正常造血作用所必需的。已描述了许多由MSC分泌的介导造血作用的可溶因子的特征(Berezovskaya等，1995；Majumdar等，1998；Majumdar等，2000)。MSC产生IL-6、IL-7、IL-8、IL-11、IL-12、IL-14、IL-15和Flt-3配体，并诱导稳态水平的M-CSF、G-CSF、GM-CSF和SCF。然而，这些因子单独不可能提供引起MSC治疗TBI的治疗益处的机制。业已推断了其它仍然未知的基质因子的存在。在这里提供的实验中，定量ELISA数据证明用TBI组织提取物处理的hMSC以既取决于培养时间又取决于获得TBI组织提取物的时间的方式同时分泌BDNF、NGF、bFGF、VEGF和HGF。静脉内给药BDNF降低大鼠TBI后的受损体积，因而支持BDNF在脑损伤中的神经保护作用(Koliatsos等，1993；Bullock等，1999)。NGF注射后、或者通过植入产生NGF的成纤维细胞以及NGF转基因小鼠的神经保护潜力，已在脑损伤实验的不同范例中证明了(Hefti，1986；Kromer，1987；Caneva等，1995；Gage，2000)。在大鼠、小鼠和猫局部脑缺血模型中，静脉内给药bFGF降低梗塞体积(Sugimori等，2001)。VEGF为血管生成的强启动子，也刺激轴突生长、神经细胞存活以及Schwann细胞增殖(Sondell等，1999)。坐骨神经挤压伤后VEGF的增长提示VEGF在神经再生中起作用(Sondell和Kanje，2001)。用VEGF治疗大鼠实验性中风显著降低功能缺陷(Zhang等，2000b)。hMSC组成型地产生HGF(Takai等，1997)，且HGF是组织修复的重要分子(Mizuno等，2000)。因此，本发现强有力地证明hMSC对正常脑和TBI环境敏感，且通过显著增加许多因子的产生作出应答。考虑到移植的MSC在外伤性损伤的神经组织中的存活(Lu等，2001b；Lu等，2001a；Mahmood等，2001)，MSC在受损组织的局部水平持续地和在微环境性应答分泌神经保护和血管生成因子是MSC移植所提供的功能益处的关键。
本数据证明成年MSC能够被诱导克服其间充质定型(commitment)，并构成丰富和易得的治疗各种神经学疾病的脑细胞和分子储库。本文的结果显示移植的MSC在TBI之后提供功能益处(Lu等，2001b；Lu等，2001a；Mahmood等，2001)。尤其是，MSC能够容易地自患者自身髂嵴的小量骨髓中获得，并在培养中扩增。因此，MSC提供了移植用自体同源细胞的易得和可补充性来源。在受损组织中的这些细胞为受损大脑的修复和可塑性(plasticity)提供重要生长因子的持续来源。
图1显示了来自用TBI组织提取物上清处理的hMSC的生长因子BDNF(图1A)、NGF(图1B)、bFGF(图1C)、VEGF(图1D)和HGF(图1E)的分泌。分泌物由ELISA定量。与仅有培养基的对照相比，正常脑组织提取物在体外提高所有检测的生长因子的分泌。在每个试验组中，BDNF、NGF和HGF分泌在条件TBI提取物中从第1天增加到第7天。VEGF分泌对于正常脑和TBI后脑组是相似的。VEGF的分泌在培养4天和7天的持续时间内一致地比培养1天的更大。bFGF的分泌特点不同于其它营养因子。培养为期1天的bFGF分泌值，与其它生长因子相反，超过或者等于4天和7天的数值。
实施例2方法使大鼠经受瞬时大脑中动脉闭塞并在中风后1天静脉内注射3×106hMSC。在中风前以及中风后1、7和14天测量功能结果。混合淋巴细胞反应和细胞毒性T淋巴细胞的形成衡量hMSC的免疫排斥。利用人类细胞核特异性的单克隆抗体(mAb1281)鉴定hMSC并检测神经表型。ELISA分析来自hMSC治疗或未治疗的大鼠脑组织中的神经营养蛋白水平。利用溴脱氧尿苷注射鉴定新形成的细胞。结果与缺血对照大鼠相比，在由hMSC治疗14天的大鼠中发现显著的功能恢复。少数(1到5％)hMSC表达脑实质细胞的蛋白表型。脑源神经营养因子和神经生长因子显著增加，并且缺血边界区的凋亡细胞显著下降；在由hMSC治疗的大鼠缺血半球的心室下区域检测到显著更多的溴脱氧尿苷反应性细胞。HMSC诱导淋巴细胞增殖而不诱导细胞毒性T淋巴细胞。
结论由hMSC治疗大鼠中风产生的神经学益处可源于缺血组织中生长因子的增加、损伤半影区细胞凋亡的降低以及心室下区域内源细胞的增殖。
骨髓基质细胞(MSC；也被称之为间充质干细胞和祖细胞)是多能的，并且能够在体外和体内帮助组织修复。MSC通常产生骨、软骨以及间充质细胞，且MSC可分化为肌细胞、肝细胞、神经胶质细胞和神经元。MSC能够通过血-脑屏障并在整个前脑和小脑中迁移。系统输注到雌性缺血大鼠的雄性来源的骨髓细胞优先迁往缺血性皮质。向受辐射的雌性小鼠给药的雄性小鼠骨髓细胞在数天到数周的时间内进入大脑并分化为小神经胶质细胞和星形神经胶质细胞。
没有改善中风后结果的神经保护性试剂。人类MSC(hMSC)对于大鼠心肌缺血和心脏病的治疗益处似乎源于组织替换以及血管生成和血管发生的诱导。MSC分泌许多生长因子和细胞因子，它们通常支持造血祖细胞增殖和分化。骨髓含分泌若干血管生成生长因子(包括VEGF和bFGF)的各种初级细胞。因而，MSC可开发为治疗神经学疾病的可行的疗法。已经在由啮齿类动物MSC治疗的大脑中动脉闭塞(MCAO)的大鼠模型中证明了显著的功能恢复。
材料和方法hMSC的制备和体外生长动力学。为研究hMSC在体外的细胞生长动力学和扩增，通过在局部麻醉时穿刺3个健康人类供体的后骼嵴获得骨髓抽出物。骨髓样本(每人15到16mL)的单核细胞于Ficoll密度梯度(Ficoll-Paque[密度，1.073]，Pharmacia，CA)分离。HMSC培养物的分离和建立如Digirolamo等所述进行。简要地，单核细胞以1×106细胞/75cm2组织培养瓶的密度置于20mL低葡萄糖Dulbecco改良Eagle培养基中(Gibco-BRL，Grand Island，NY)，并补充有20％胎牛血清(Gibco-BRL)、100单位/mL青霉素、100μg/mL链霉素和2mmol/L L-谷氨酰胺。温育72小时后，从培养物中除去未粘附细胞，并向培养瓶中添加新鲜培养基。在第14天(铺满90％)将塑性粘附的hMSC分开(split)，之后每7天评价细胞生长和细胞产率。利用血细胞计数器计数有核髓细胞，以确保足够的用于移植的细胞数目。对每只大鼠注射3×106hMSC的剂量。由5次传代收集并进一步在具有20％剔除血清替代培养基(Gibco-BRL)的剔除Dulbecco改良Eagle培养基(无血清；Gibco-BRL)中培养的hMSC被用来进行ELISA检测(n＝6)。在1、4和7天的无血清Dulbecco改良Eagle培养基中检测HMSC分泌的脑源神经营养因子(BDNF)和神经生长因子(NGF)。
体外大鼠脾细胞和hMSC之间的混合淋巴细胞反应。为研究抗原诱导的淋巴细胞增殖，将来自健康大鼠或者早在2周前注射了3×106hMSC的大鼠的2×105脾细胞以10∶1的应答细胞(脾细胞)∶刺激细胞(hMSC)比和或不和照射的(20Gy)hMSC一式三份培养96小时。混合细胞由3H-脱氧胸苷(0.25μCi/孔)脉冲16小时。hMSC对脾淋巴细胞增殖的诱导通过掺入到复制的脾细胞中的3H-脱氧胸苷检测。由自动细胞收集器收集细胞，并通过液闪测量3H-脱氧胸苷的掺入。
插入等式大鼠对hMSC的体外细胞毒性T淋巴细胞应答T淋巴细胞为移植物抗宿主致命医原性疾病的引发剂。因此，利用51Cr测定法检测人类移植物抗大鼠宿主T细胞应答，以确定溶胞效果。健康大鼠脾细胞或者早在2周前注射了3×106hMSC的大鼠的脾细胞以10∶1的应答细胞(脾细胞)∶刺激细胞(hMSC)比和照射的hMSC培养5天。在温育结束时，从培养物中回收存活细胞，并在8-小时51Cr-释放测定中测试其对51Cr-标记的hMSC的细胞毒性。
动物MCAO模型成年雄性Wistar大鼠(体重270到300g)购于Charles RiverBreeding Company(Wilmington，MA)。大鼠最初用3.5％氟烷麻醉，并利用面罩以在70％N2O和30％O2中的1.0％到2.0％氟烷维持。在整个手术操作中利用反馈调节的水热系统使直肠温度维持在37℃。瞬时MCAO利用实验室改良的管腔内血管闭塞诱发。暴露右侧颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉。一段由动物体重决定的4-0单丝尼龙缝线(18.5到19.5mm)，其顶端通过靠近火焰加热弄圆，从颈外动脉送入颈内动脉的内腔，直到它阻断MCA的来源。MCAO后2小时，动物由氟烷再麻醉，通过撤回缝线直到顶端穿过(cleared)颈外动脉的内腔对动物重新灌注。
实验组组1为检测营养蛋白，大鼠经受MCAO而不治疗(n＝3)或者在中风后1天注射1-mL总液体体积的3×106MSC(n＝3)或3×106肝成纤维细胞(n＝3)到尾部静脉中。肝成纤维细胞研究是严格的“对照”，其中成纤维细胞收集自相同的Wistar大鼠株，以避免对照细胞对宿主大鼠的不期望的免疫应答。MCAO后7天杀死大鼠检测营养蛋白。也使用3只健康大鼠作为对照受试者。
组2大鼠经受MCAO，第1天注射3×106hMSC(n＝9)或3×106大鼠肝成纤维细胞(n＝9；对照)或者仅经受MCAO而无细胞供体(n＝10；对照)。MCAO后14天杀死大鼠检测细胞形态。由于MCAO诱导室管膜和室管膜下区域(也被称之为心室区/心室下区域[VZ/SVZ])的内源神经干细胞和祖细胞增殖，组2中的17只大鼠在MCAO后连续14天每日接受溴脱氧尿苷(BrdU，标记新合成的DNA的脱氧胸苷类似物[50mg/kg]；Sigma，St.Louis，MO)腹膜内注射，伴有或不伴有供体细胞的静脉内注射，用以鉴定细胞增殖。作为对照，另外两只健康动物在死前给予14天50mg/kg BrdU的每日常腹膜内注射。
行为测验由对实验组不知情的调查者对所有动物在MCAO前以及MCAO后1、7和14天进行行为测验。为检测前肢体感对称性，利用粘性支撑的小纸点(113.1mm2)作为双侧触觉刺激，并在笼中每天的5次试验中施于每个前肢的桡骨面。记录大鼠接触以及取走刺激物的时间。每次试验间隔至少5分钟。动物在手术前3天接受所述粘性取点测验(adhesive-removal dot test)的训练。一旦大鼠能够在10秒内取走点，它们就进行MCAO。利用改良的神经病学严重度评分(mNSS)就神经功能的各方面打分。mNSS是运动性(肌肉状态和异常运动)、知觉(视觉、触觉和本体感受)以及反射测验的集成。
表1 改良的神经病学严重度评分测验
改良的神经病学严重度评分测验来自局部缺血脑的提取物的制备MCAO后7天，组1中的大鼠用氟烷麻醉，取出脑，并在冰上切割局部缺血半球。然后将样品贮存于-80℃。随后，每个组织样品在1g/mL匀浆缓冲液中均质化。匀浆于4℃离心(10,000g)10分钟，并收集上清用于分泌检测。
利用夹心ELISA检测生长因子的分泌BDNF ELISA试剂盒由R & D Systems(Minneapolis，MN)获得，且ELISA如厂商的指导制备。制备NGF ELISA溶液。抗-β(2.5S，7S)NGF单克隆抗体、抗-β(2.5S，7S)NGF-β-gal、NGF-β标准购于RocheMolecular Biochemicals(Indianapolis，IN)。简要地，将从局部缺血组织或者hMSC的无血清培养基中收集的上清分成100到200μL的三份样品。根据厂商的指导使用针对BDNF和NGF的单克隆抗体。随后，添加每个一抗的第二特异性多克隆抗体。在与显色底物温育一段时间后，颜色与生长因子的量成比例形成，并利用微板读数仪(450到620nm)测量。
组织学、免疫组织化学和细胞凋亡评价切片制备利用组2中MCAO后存活14天的大鼠进行形态学分析。此时，大鼠用氯胺酮(Ketamine)(44到80mg/kg，腹膜内)和赛拉嗪(xylazine)(13mg/kg，腹膜内)麻醉，然后血管系统经心脏灌注肝素化的磷酸缓冲盐溶液(PBS)，接着是处于PBS中的4％低聚甲醛。将脑浸泡在处于PBS中的4％低聚甲醛中2天，然后将脑组织切成7份同等间隔的(2mm)冠状块。处理组织，并从每块上切下100μm厚度的自由漂浮的vibratome冠状切片(每孔5个vibratome切片)。所有剩余的脑块包埋于石蜡中，并切下连串毗邻的6μm厚切片。
梗塞体积的测量来自7块的每个冠状石蜡切片之一(6μm厚)用苏木精-曙红(H-E)染色。利用Global Lab成像分析系统(Data Translation，Malboro，MA)探测7个脑切片。计算间接损伤区域，其中同侧半球的完整区域从对侧半球区域中扣除。损伤体积表示为损伤占对侧半球的体积百分比。
免疫组织化学染色在正常血清中封闭后，用在PBS中以1∶100稀释的人类细胞核特异性的单克隆抗体(mAb1281；Chemicon，Temecula，CA)于4℃处理所有的vibratome切片3天。在随后与荧光素-异硫氰酸盐缀合的小鼠IgG兔抗体(稀释度1∶100；Dakopatts，CA)温育后，二抗结合于mAb1281的一抗。来源于hMSC的细胞通过使用形态学标准和存在于供体细胞但不存在实质细胞中的mAb1281的免疫组织化学染色鉴定。为显现mAb1281的细胞定位(colocalication)和相同细胞中的细胞类型特异性标志，对集中于局部缺血核心区(前囟点-1.0 1.0mm)的系列参照Vibratome切片(100μm)使用双染色。每个冠状切片用第一个一抗mAb1281如前所述处理，然后用缀合于花色素甙-5.18(Calbiochem，CA)的细胞类型特异性第二一抗于4℃处理3天神经核抗原(神经细胞核的NeuN[稀释度1∶200]；Chemicon)、微管相关蛋白2(神经树突的MAP-2[稀释度1∶200]；Sigma)、胶质细胞原纤维酸性蛋白(星型胶质细胞的GFAP[稀释度1∶1,000]；DAKO，Carpinteria，CA)以及vWF(内皮细胞，[稀释度1∶400]；DAKO)。每个动物的阴性对照切片接受相同的制剂用于免疫组织化学染色，除了省去一抗之外。
激光扫描共焦显微镜术冠状Vibratome切片用安置在Zeiss显微镜上的Bio-Rad MRC1024(氩和氪)激光扫描共焦成像系统(Bio-Rad，Cambridge，MA)分析。对于免疫荧光标记的切片，切片上的绿色(荧光素-异硫氰酸盐)和红色(花色素甙-5.18)荧光色素由488nm和647nm的激光束激发，并且随后用光电倍增管通过522nm和670nm的发射滤波器获取发射波。通过用于细胞计数的XYZ阶段编码器(stage encoder)检测来自所有7个脑块中每块的5个连续切片(100μm厚)中mAb1281阳性细胞的总数目。26然后通过加和来自所有7个脑块的mAb1281阳性细胞数目计算完整前脑的mAb1281阳性细胞总数目。合计每只动物总共500个mAb1281阳性细胞达到了通过双染色与细胞类型特异性标志(NeuN、MAP-2、vWF和GFAP)共定位的mAb1281阳性细胞的百分比。
凋亡细胞染色利用来自上述在前囟点-1.0 1.0mm汇合的参照块的5个冠状石蜡切片(6μm厚；25-μm间隔)进行细胞凋亡分析。这些切片通过末端脱氧核苷酰转移酶介导的dUTP-生物素缺刻端-标记(TUNEL)法染色进行原位细胞凋亡检测(ApopTag试剂盒；Oncor，Gaithersburg，MD)。在用PBS中的H2O2淬灭内源过氧化物酶活性后，将切片置于末端脱氧核苷酰转移酶中。向切片施加抗-地高辛配基-过氧化物酶，并用3，3′-二氨基联苯胺检测过氧化物酶。在TUNEL染色后，切片用Mayer苏木精反染色。对每一脑块进行阴性对照切片。在TUNEL制备物中，只有含深棕色凋亡体(＞2)的细胞被称之为凋亡细胞。
图2描绘了在大鼠脑前连合水平的标准冠状切片，其将右半球分成3个亚区(缺血核心区、缺血边界区和VZ/SVZ)。检测同侧和对侧半球这些区域的外源hMSC(mAb1281)、细胞类型阳性细胞(NeuN、MAP-2、GFAP和vWF)以及凋亡细胞(TUNEL阳性细胞)。利用常规H-E染色的组织学特点鉴定三个区域缺血核心区(散布的苍白色嗜酸性粒细胞背景)以及缺血性损伤的内侧(神经毡空泡或海绵体(sponsiness))和外侧边界区(从海绵体到整个完整组织[多数细胞是完整的；不过，可能观察到散布的受损和死亡细胞])以及细胞形状和染色能力的改变。图2显示了在大鼠脑前连合水平鉴定的标准冠状切片，其将右半球分成3个亚区(缺血核心区[IC]；缺血边界区[IBZ]以及心室区/心室下区域[VZ/SVZ])和8个视野(1，IC中的皮质；2，IC中的纹状体；3-4，IBZ中的皮质；5-6，IBZ中的纹状体以及7-8，VZ/SVZ中的纹状体)用以分析对治疗的应答。
统计学分析所有测量双盲进行。行为评分(来自粘性取点测验和mNSS)用于评估常态。进行重复测量分析以测试对行为评分的治疗影响。分析以在0.1的显著性水平测试治疗-时间相互作用起始；如果在0.05的显著性水平未检测到相互作用，则进行整体治疗效果的测试。在每个时间对每种行为得分的治疗影响的亚组分析在0.05的显著性水平进行，如果在0.1的显著性水平存在治疗-时间相互作用、或者在0.05的显著性水平存在整体治疗效果的话。否则，亚组分析被认为是探测性的。利用Student′s t-检验评价对照组和治疗组之间的损伤体积和细胞数目差异。通过将BDNF和NGF浓度的对数对光密度的对数绘图使ELISA数据线性化，并通过回归分析法确定最佳拟合线。对每个标准、对照和样品进行平均双份读数，并减去平均零标准光密度。显示了测试治疗和对照组间差异的均值(SD)和p值。
结果hMSC的体外生长动力学通过培养扩增测试了来自3个健康人类供体的骨髓来源的hMSC。在原代培养中，hMSC生长为形态学上均一的成纤维细胞样<p>表4
从表4可明显看出，麦角甾醇衍生物与抗坏血酸2-葡糖苷或抗坏血酸磷酸酯镁盐掺合并用，可进一步提高麦角甾醇衍生物的美白效果，即黑色素生成抑制效果。
以下所述为按照常规方法调制各种配方的组合物的本发明的实施例。任一实施例都显现出良好的黑色素生成抑制效果和美白效果。
乳霜成分 配比量(重量％)硬酯酸6.0甘油一硬酯酸酯2.0聚氧乙烯(20摩尔) 2.0山梨糖醇酐一硬脂酸酯1，3-丁二醇 10.0麦角甾醇衍生物5.0肉豆蔻酸异丙酯12.0三十碳烷 5.0液体石蜡 3.0维生素E 0.05亚硫酸氢钠适量防腐剂适量香料 适量离子交换水余分神经功能测验在中风后14天，与仅经历MCAO的对照大鼠以及注射3×106大鼠肝成纤维细胞的大鼠相比，在MCAO后1天注射3×106hMSC的大鼠中发现了通过粘性取点测验(p＜0.05；图3A)和mNSS测验(p＜0.05；见图3B)所显示的功能恢复。
图3显示了大脑中动脉闭塞(MCAO)前后的行为功能测验结果(A粘性取点测验；B改良的神经病学严重度评分[mNSS]测验)。大鼠只经受2小时MCAO(n＝10)或者在MCAO后1天用培养的人类骨髓基质细胞(hMSC)(n＝9)或用大鼠肝成纤维细胞(LC；n＝9)注射。与对照受试者相比，用hMSC治疗的大鼠中检测到显著的功能恢复。空心圆＝MCAO；实心圆＝+LC；三角形＝+hMSC。
夹心ELISA定量利用夹心ELISA法，与没有细胞治疗而仅接受MCAO7天后的大鼠以及用肝成纤维细胞细胞治疗的大鼠相比，hMSC治疗大鼠的缺血半球中BDNF(969±198pg/mL相对于434±59pg/mL及498±76pg/mL)和NGF(1,227±111pg/mL相对于834±123pg/mL和980±55pg/mL)的分泌水平提高(p＜0.05)。体外数据表明hMSC以时间依赖性的方式分泌BDNF和NGF。与1天的相比，在4和7天的无血清培养基中检测到BDNF和NGF的显著增加(表3)。
表3 培养中hMSC的神经营养蛋白分泌
形态学分析经受2小时MCAO的大鼠在缺血后1天输注3×106hMSC，并于MCAO后14天杀死进行形态学分析。在由H-E染色的冠状切片内，在有或无hMSC注射的所有经受MCAO的大鼠缺血核心区观察到黑色和红色的神经元。于仅经受MCAO的对照大鼠(36.3％±10.5％)或者MCAO后14天注射大鼠肝成纤维细胞的大鼠(34.6％±9.1％)相比，发现hMSC治疗大鼠中的缺血损伤体积无显著下降(受损体积，33.3％±7.6％)。
在脑组织中，来自hMSC的细胞以由人类特异性抗体mAb1281鉴定到的圆形到椭圆形的细胞核为特征。hMSC(124×103±46×103；3×106hMSC的4％)存活并散布在受体大鼠的整个缺血损伤大脑中。虽然在同侧半球的多处区域(包括皮质和纹状体)观察到mAb1281反应性细胞，但多数mAb1281标记的hMSC(总计124×103±46×103的60％)分布在缺血边界区。也在对侧半球观察到少数细胞(9×103±2×103；3×106hMSC的0.3％)。
双染色免疫组织化学揭示少数mAb1281阳性细胞对所用的神经标志具反应性。表达NeuN、MAP-2、GFAP和vWF的mAb1281标记的hMSC的百分比为1％、1％、5％和2％。激光扫描共焦显微成像显示了人核mAb1281(鉴定hMSC的绿色)特异性单克隆抗体与NeuN、MAP-2、GFAP或vWF(细胞类型特异性标志的红色)在受体大鼠脑中的共定位(图4，a-h)。多数mAb1281阳性细胞环绕血管，少数细胞分布在实质。
图9显示了表现大鼠脑中外源人类骨髓基质细胞(hMSC)和内源脑细胞的形态特征的显微照片。利用双免疫荧光染色，mAb1281(人核特异性单克隆抗体)反应性细胞存在于脑损伤区域。激光扫描共焦显微成像显示了受体大鼠脑中的mAb1281(hMSC的绿色[a，c，d，f-h])、神经元细胞核抗原(NeuN)(b，c)、微管相关蛋白2(MAP-2)(e，f)、胶质细胞原纤维酸性蛋白(GFAP)(g)以及vWF(h)(细胞类型特异性标志的红色)。比例尺＝50μm。
利用TUNEL(图7，a，c和d)以及H-E染色(见图7b)，对缺血边界区具有典型深棕色圆形或椭圆形凋亡体的凋亡细胞进行计数。在参照的冠状6μm厚切片中，与仅经受MCAO后14天的动物或者用肝成纤维细胞治疗的缺血大鼠相比，hMSC处理大鼠的缺血边界区中测到的凋亡细胞数目减少(38.5±3.4相对于82.6±3.8或76.4±6.8；p＜0.05)。
图7显示了凋亡细胞(a末端脱氧核苷酰转移酶介导的dUTP-生物素缺刻标记的[TUNEL]阳性细胞[箭头]；b苏木精-曙红[H & E]染色)在单独大脑中动脉闭塞(MCAO)后存在于缺血边界区。与注射肝成纤维细胞的大鼠(c)相比，在注射人类骨髓基质细胞(hMSC)的大鼠中检测到减少的凋亡细胞(d更多存活的蓝色苏木精反染色的细胞；箭头)。少数溴脱氧尿苷(BrdU；新合成DNA的标记)阳性细胞(箭头)存在于健康脑的心室区/心室下区域(VZ/SVZ)(e)。在只经受MCAO的大鼠(f)和注射肝成纤维细胞的大鼠(g)同侧半球的VZ/SVZ中检测到增加的BrdU阳性细胞。与经受MCAO用或不用肝细胞处理的大鼠相比，用hMSC处理大鼠的VZ/SVZ中检测到显著增加的BrdU阳性细胞(h)。比例尺＝15μm。
少数BrdU阳性细胞存在于VZ/SVZ(见图7，e到h)。与只经受MCAO的大鼠(见图7f)或用肝成纤维细胞处理的大鼠(见图7g)相比，在经历MCAO和hMSC处理的大鼠同侧半球的VZ/SVZ中检测到显著更多的BrdU反应性细胞(见图7h)。利用来自在前囟点-1.0 1.0mm的标准参照切片的5个冠状石蜡切片(6μm厚；25-μm间隔)进行BrdU反应性细胞分析。与只经受MCAO的大鼠(27.5±18.5)或用肝成纤维细胞治疗的缺血大鼠(37.8±11.2)VZ/SVZ中的相比，在经历MCAO和hMSC治疗的大鼠(95.3±24.1)每个切片上VZ/SVZ中的BrdU阳性细胞数目明显更高。与只经受MCAO的大鼠或者在中风后14天用肝成纤维细胞治疗的大鼠相比，经历MCAO和hMSC治疗的大鼠中每个切片上更高数目的BrdU阳性细胞表达NeuN(2.5±0.4相对于0.5±0.6或0.6±0.4；p＜0.05)和GFAP(4.4±2.3相对于1.4±1.1或1.7±0.5；p＜0.05)。
讨论根据体感评分和mNSS，与只经受MCAO或者注射大鼠肝成纤维细胞的大鼠相比，中风后1天静脉内注射hMSC显著改善功能结果。这种益处可归咎于产生生长因子(包括能够促进受损的实质细胞修复的神经营养蛋白)，降低缺血边界区的细胞凋亡，以及促进内源神经干细胞和祖细胞在大鼠中风后在VZ/SVZ中的增殖和分化。
神经移植物具有与脑损伤相关的反向功能缺陷。本发明的人类移植物抗大鼠宿主数据与其它研究的发现相符，所述研究证明在辐射动物的永久性MCAO以及非辐射动物的瞬时2小时MCAO发作后，静脉内移植的异源骨髓细胞优先返回到损伤部位。形态学分析显示hMSC具有选择性迁往缺血损伤的大鼠脑中的能力。hMSC存活，并且散布着表达实质脑细胞蛋白质标志的少数hMSC。
虽然hMSC能够具有取代丧失的神经元的潜力，很可能提供治疗益处的机制是多分枝的(multipronged)。数据显示，根据体感评分和mNSS，与未治疗的大鼠相比，中风后1天注射3×106hMSC在给药后7和14天改善功能结果(p＜0.01)。不过，只有1％、5％和2％的hMSC表达神经元、星形细胞和内皮细胞蛋白，太快以至于无法进行完全细胞分化并整合到组织中。因此，短期益处更可能的介质是由hMSC为受损组织补充系列促进残余神经元功能恢复且减少缺血边界区细胞凋亡的生长因子。MSC能够直接地参与促进缺血损伤神经元的可塑性或者刺激神经胶质细胞分泌营养蛋白(例如BDNF和NGF)。hMSC与宿主大脑之间的相互作用可导致hMSC和实质细胞产生丰富的营养因子，它们能够促成损伤引起的丧失的功能的恢复。30，31利用本研究的夹心ELISA法，证明了与仅经历MCAO 7天而没有细胞治疗以及有大鼠肝细胞治疗的动物相比，hMSC治疗大鼠的缺血半球中BDNF和NGF的分泌水平显著增加。虽然只检测了缺血脑中BDNF和NGF的存在，不排除其它生长因子(例如血管生成因子VEGF32和HGF33)能够至少部分地通过增加血管生成而促进功能恢复的可能性。血管生成与改善的中风神经恢复有关。
MSC发挥小分子“工厂”的作用。这些细胞产生系列细胞因子和营养因子。它们也可以在延长的期限内且并非以单次大剂量分泌这些因子。MSC表达许多已知在造血作用中起作用的细胞因子，并且也提供影响髓微环境本身细胞的自分泌、旁分泌和juxtacrine因子。很可能脑组织中的MSC表达这些因子，并且正是这些细胞因子和营养因子对脑组织的作用，迅速和有效地促进了功能的恢复。当在不同的离子微环境(例如钙)中培养时，这些细胞通过调整生长因子的表达响应所述离子微环境的暗示。这表明受损组织中的细胞根据(titruted to)组织的需要而表达营养和生长因子。在脑中，用MSC治疗中风以解剖学分布的、组织敏感性和暂时行进性的方式产生许多营养因子和细胞因子，这与单次局部注射特定因子形成强烈对比。
神经干细胞定居于VZ/SVZ中，并且这些细胞迁往发育的脑中。在健康成年脑中，前脑神经元产生的缺乏不能归咎于合适的神经元前体细胞的缺乏，而是强直性(tonic)抑制和/或有丝分裂期后营养和迁移支持的缺乏。在本研究中，与仅MACO相比，MCAO后用hMSC治疗的VZ/SVZ中BrdU反应性细胞增加，提示静脉内hMSC注射可刺激内源脑细胞增殖并参与缺血损伤脑的修复。这些发现与利用静脉内给药来自大鼠的MSC获得的数据一致。
在大鼠中静脉内移植hMSC不使大鼠对hMSC致敏，就如体外混合淋巴细胞反应所确定的那样。类似地，健康大鼠或者注射hMSC的大鼠脾细胞不能产生针对hMSC的细胞毒性T细胞应答，外源器官/细胞移植排斥所牵涉的一种功能性免疫应答。这些数据表明对测试hMSC作为中风的治疗而言不用考虑大鼠对hMSC的免疫排斥。潜在地，并且更重要的是，大鼠脾细胞显示出很小或者对注射的hMSC无敏感性。hMSC无力诱发强免疫应答可归结为这些细胞由于主要组织相容性复合体(I类和II类)以及共刺激(CD40、CD80和CD86)分子的缺乏或低表达而致的弱免疫原性。另外，hMSC也能够分泌下调异种移植物排斥所涉及的免疫应答的可溶性介质。这些数据要求进行另外的研究调查MSC异源细胞粘附群的免疫原性。
数据显示静脉内给药hMSC在中风后2周促进神经功能恢复。hMSC选择性地进入脑缺血区。hMSC与缺血脑之间的相互作用增强了营养蛋白的分泌，它能够减少缺血边界区神经元的凋亡，并促进细胞自从缺血脑中相对完整的SVZ增殖。不过，是否起源于SVZ的细胞迁移并整合到缺血脑中尚未确定。在CNS中，神经损伤的有效治疗可需要内源补偿机制的激活，包括重塑脑循环，但确切机制尚不确定。随着MSC引发的神经缺陷降低潜在机制的阐明，以及长期治疗益处的证明，hMSC能够为中风乃至可能广范围的人类神经学疾病提供强有力的分子和细胞疗法。
实施例3神经损伤治疗临床前方案在研究MSC促进中风后功能恢复的假说中，申请人面临多种选择实施临床前细胞疗法方案。其中需要致力解决的是何时何处植入细胞。由于目的在于恢复性疗法，在缺血损伤的大小不能被有效的恢复疗法改变的假设下，申请人最初选择在中风后1天或更长时间治疗动物。31，32这种取时在临床上是合理的。如果缺陷在中风后持续1天，则该事件被定义为中风而不是瞬时性缺血攻击。在第1天，患者倾向于稳定，因而神经缺陷的严重度可容易地评估。
将细胞置于脑中最直接的途径是通过手术移植。那么细胞应当放置在病变处、在健康非缺血组织中，还是边界区呢？考虑到脑，尤其是有关处于发育状态中的病变边界区中的观察结果，在初始研究中申请人选择将原初 全骨髓细胞放置在边界区。32因而，细胞从供体大鼠中提取，并经手术和立体地植入皮质下和皮质组织内缺血病变的边界区。31-33待测验的主要假说为这些细胞促进功能恢复，因此对动物进行神经学和功能测验。进行了彻底的神经学检查(表1)。这种检查，即改良的神经病学严重度评分(mNSS)，提供了运动性、知觉反射以及肌肉状态的指数。34-38另外，申请人利用了体感测验，其包括从爪上除去粘性卡片，39以及rotarod测验，40其测量大鼠在加速踏旋器(treadmill)上坚持的时间。在中风前和之后7天及14天进行测量。31动物在第14天杀死，并通过组织学在脑组织中寻找移植的细胞。用这种组织学分析致力解决的一个问题是是否MSC分化为脑实质细胞。对经受大脑中动脉栓塞的小鼠进行类似的实验，并用来自供体小鼠的原初 全骨髓细胞的脑内移植治疗。移植后28天进行功能检测。在缺血性病变边界置入这些细胞后，出现显著和迅速的功能恢复。将MSC实质内移植到由1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢嘧啶诱导的帕金森样病变小鼠纹状体中的类似研究表现出处运动性功能的显著恢复。42同样地，将MSC植入到邻近脊髓挫伤处，显著的功能效益很明显。
这些实验变化证明共给药MSC和营养因子如脑源神经生长因子促进功能恢复，且在生长因子中预培养这些细胞有助于功能效益，而且还增加表达脑细胞表型蛋白的细胞的数目。使培养中的细胞对脑环境的适应似乎易化从体外到体内的过渡。许多移植的骨髓细胞在缺血脑中经历凋亡。因此，申请人与骨髓细胞共给药Z-Val-Ala-DL-Asp-氟甲基酮(Z-VAD)，一种caspase抑制剂。假说得到证实；凋亡细胞数目显著下降，并且rotarod测验检测的功能显示了增大的效益。因而，即使对于细胞疗法，附加疗法可提高预期结果。
相似的治疗干预在外伤性脑损伤、脊髓损伤和帕金森氏病动物模型中也是有效的；在所有3种动物模型中，随着MSC的手术植入，出现神经缺陷的显著下降。在移植后数天内治疗效益变得明显。不过，只有1-3％的细胞表达实质细胞的蛋白表型。虽然表达此类蛋白的细胞比例能够由预培养提高，但移植的细胞数目与大脑中动脉闭塞后梗塞的半球脑组织量相比很少(大概40％)。闭塞后14天，大约50000细胞(SE 18000)或400000移植细胞的12.5％存后，小百分比的细胞表达神经蛋白-太少不足以取代梗塞组织。
直接将这些细胞移植到脑中的成功促进了测试更少侵入性的血管给药途径的实验。大鼠被施以大脑中动脉闭塞，并在与缺血病变半球同侧的颈动脉中插入导管以注射细胞。中风后1天注射约2百万MSC。在治疗前后进行一系列神经学测验。组织学分析表明少量细胞表达实质细胞的蛋白表型。不过，显著的功能效益很明显。申请人也测验了动脉途径MSC给药治疗外伤性脑损伤的潜力。虽然经颈动脉途径给药时细胞进入脑中，但没有功能效益，很可能是因为该给药途径需要结扎内部颈动脉，造成强加的血流灌注不足，加剧了外伤性脑损伤。
申请人接着研究了临床上更为相关的静脉内给药途径的可行性。该途径显然更少侵入性并且比颈动脉或直接组织注射具有更小的副作用。静脉途径也允许多种和长期的细胞治疗。
其它人已证明静脉内注射的细胞能够进入大脑。然而，尚没有研究证明在损伤如中风或外伤中，静脉内注射的细胞会选择性地迁往缺血性损伤部位并提高功能效益。申请人因此在经受大脑中动脉闭塞的大鼠中测试这个假说。中风后1天或更多天，向尾静脉中注射1-3百万MSC。申请人进行了一系列神经学结果测量(表1)。在中风后1天给药细胞的动物于中风后14天杀死(图1)而中风后7天治疗的那些动物于第35天杀死。如先前的实验中一样，细胞用溴脱氧尿苷(新合成的DNA的标记)标记，以指示新细胞的产生。同样，将雄性大鼠的MSC注射到雌性动物中，并且细胞通过与Y染色体的原位杂交鉴定。治疗动物随着治疗表现出显著的功能改善(图2)。也利用对照细胞群测试细胞类型在促进改善功能中的特异性。死亡的MSC以及肝和肺成纤维细胞(作为非间充质细胞对照)不表现出治疗效益，并且不比磷酸缓冲盐溶液对照好。因而，中风和外伤后的静脉内途径提供了显著的功能改善。这对于中风后7天起始的治疗也是正确的，并且功能效益在雄性和雌性大鼠中是相似的。
为了更接近地类似于人类测试条件，利用人类骨髓基质细胞作为供体细胞群，而不是大鼠MSC。人类细胞通过在局部麻醉时穿刺健康供体的后髂嵴提取。分离骨髓提取物(15-16mL)中的单核细胞。在闭塞后或者外伤性脑损伤后1天，向每只大鼠静脉内注射3百万剂量的人类MSC。在中风和外伤后都发现强烈的功能改善。人类细胞很容易由供体获得。它们可以容易地扩增至很高的数目，而且可获得抗体，以通过流式细胞仪或磁性细胞分选分离。人类MSC已经用于治疗癌症或多发性硬化症患者。因而，可获得人类中安全性数据。
申请人未观察到免疫排斥的任何迹象(未发表的结果)。取出未治疗大鼠和用人类MSC治疗动物的脾脏并用人类MSC培养。注射了人类MSC的大鼠脾细胞的增殖在由这些细胞在体外再刺激后提高；不过，所述增殖应答与未治疗大鼠的脾细胞没有显著差别。因而，虽然人类MSC能够在大鼠脾淋巴细胞中诱导初级增殖应答，向大鼠给药这些细胞不在体内致敏淋巴细胞以引起体外的二次增殖应答。T淋巴细胞为移植物抗宿主疾病的引发剂。因此，用标准铬-51测定法检测大鼠宿主T细胞对人类移植物的应答以评价裂解效果。人类MSC在大鼠脾细胞中不诱导细胞毒性T淋巴细胞应答。申请人不能够排除啮齿类动物和人类可以对MSC治疗不同应答的可能性。不过，另一种可能性是通用细胞、异源细胞而非自体细胞能够用于治疗患者。显然，需要更多的人类数据以测试该假说。最初的临床应用将必须使用自体移植。
仍然有许多问题待解决，包括这些细胞是怎样靶向损伤部位的，以及它们是如何提供效益的。细胞如何知晓去哪里？什么机制将这些细胞特异性地靶向到损伤部位？不过，最令人感兴趣的问题是细胞对大脑的影响，以及这些影响是怎样转变为治疗效益的。
MSC到脑损伤部位的靶向静脉内注射的细胞去往何处？首先，必须标记注射细胞，这样可以在组织中鉴定它们。MSC可通过对多种标记的抗体反应性鉴定。MSC可以用溴脱氧尿苷标记；可将雄性来源的细胞注射到雌性动物中，并通过原位杂交鉴定Y染色体；或者可将人类细胞注射到大鼠中，并利用针对人类抗原的抗体。已在肝、肾、脾和骨髓中发现静脉内注射的细胞。不过，多数鉴定的MSC环绕这些器官的微血管，少数分布在实质中。在脑组织中检测到很少的细胞(在治疗后14-35天，为3百万注射MSC的1.5-3.0％)。在受损大脑中，无论是中风或外伤损伤后，绝大多数细胞靶向到受损区。例如，中风后，多于80％的细胞位于患病半球中，这些细胞中多数聚集在病变周围区。许多细胞也存在于血管附近或之中。细胞是如何靶向受损组织的，而且这些细胞的定位对于微脉管系统重要吗？MSC回归到受损部位是炎性细胞对受损组织应答的记忆。嗜中性粒细胞和单核细胞通过依次的血管和细胞分子信号传导而靶向受损和发炎的组织。表达在炎性细胞和维管系统中的粘附分子及其受体，指导细胞到受损组织中，并运输这些细胞穿越血管边界，通常是穿过血-脑屏障。这些靶向和粘附分子与趋化因子协调运作。申请人因此测试了是否粘附分子和化学引诱剂操作并将MSC靶向到脑中。申请人利用Boyden腔室，细胞在由渗透膜隔离的两个腔室间迁移的一种测定法。将迁移培养基(具有5％牛血清白蛋白的Iscove′s改良Dulbecco′s培养基)中的MSC调整至5×105细胞/mL。向上层每个孔中添加50·L细胞悬液。计数5个视野(面积0.12mm2)中迁移到底部表面的MSC数目。由于缺血大脑组织表达趋化蛋白，例如单核细胞趋化引诱蛋白1和巨噬细胞炎性蛋白1，申请人将这些物质放置在下层腔室中，以为迁移提供剂量依赖性的增加。当粘附分子例如胞间粘附分子1置于下层腔室中时，发现了相似的反应。这种增加的迁移通过向下层腔室中添加粘附分子或趋化因子的抗体被有效地阻断。当将来自经受外伤性损伤或中风的脑的组织放置在下层腔室中时，细胞迁移也显著上升。这些发现表明了有关细胞如何表现炎性细胞样特性以及它们如何“知晓”特异性地靶向受损组织的。因而，任何具有炎性应答的损伤，包括变性过程例如帕金森氏病和多发性硬化症，可以指导MSC进入患病部位。指导对于损伤程度的依赖性也提供了“有效”细胞剂量的一种确定方式。损伤以及伴随的炎性反应越严重，指向受损部位的细胞数目越高。
作用机制细胞是如何影响大脑并由此促进自损伤和病理进程的功能恢复呢？MSC通过变成脑细胞而帮助脑组织的可能性是非常不可能的。利用静脉内注射，且实质内细胞数目至多总计数十万，即使它们变成脑细胞，也存在太少的细胞可替代大于几立方毫米体积的组织。在治疗后数天的许多病例中检测到效益。至多仅有小比例的细胞表达实质细胞的蛋白表型。这些蛋白的表达并不意味着真正的分化和神经元或神经胶质细胞功能。在这样一个短期阶段之后，即使分化的细胞也不可能真正整合到组织中并形成改善功能的复杂连接。因而，组织替代作为MSC促进其有益效果的机制是非常不可能的。这种效益更加合理的解释是MSC诱导脑组织激活脑的内源恢复作用。MSC能够开启反应，并与大脑相互作用以激活恢复和可能的再生机制。
MSC作为小分子“工厂”，产生许多不同的细胞因子和营养因子。在脑组织或者在受损大脑微维管系统中的MSC很可能表达这些因子，并且所述营养因子对脑组织的作用就是迅速而有效地促进恢复功能的机制。申请人已经证明MSC产生肝细胞生长因子、VEGF、神经生长因子(NGF)和脑源营养因子(BDNF)以及许多其它营养和生长因子。这类因子而不是特定生长因子的单个集合促成了有益效果。非常重要的观察结果是当在不同的离子微环境中培养时，MSC通过调整生长因子的表达响应所述离子微环境的暗示。这种发现提示受损组织中的细胞适应组织的需要而表达营养和生长因子。不同的环境影响这些这些因子的分泌。因而，组织损伤以及相应离子环境破坏的程度将决定营养因子的分泌。申请人在不同的实验条件下测试了这种假说。在患中风或损伤脑的组织提取物中培养MSC显著增加营养因子的分泌。MSC对受损大脑的应答分泌根据组织从染病大脑中提取的时间而不同。然后进行了检测用MSC治疗的大脑中生长因子的分泌的实验。申请人利用定量夹心ELISA，其通过免疫标记法检测脑中生长因子的表达。与经受中风或外伤的未治疗动物相比，MSC治疗动物中营养因子的表达明显更高。
假设MSC选择性进入受损大脑并在组织反馈环路中分泌生长和营养因子，这些因子是如何改变大脑促进治疗效益的呢？起作用的前提是治疗效益是由与大脑可塑性相关的系列事件诱发的；该过程包括但不限于血管生成、神经发生、突触发生、树突树枝状分枝以及组织边界区战略上重要组织内细胞凋亡的减少。
VEGF和碱性成纤维细胞生长因子是重要的血管生成剂。申请人测试了MSC或MSC上清对血管生成诱发的作用。检测由系列人类大脑内皮细胞进行，其中证明MSC上清诱导细管的迅速形成，反应了结构性及血管生成形进程。在体内所用的测定法是典型的无血管角膜测定法。手术切除在角膜中形成凹处，并将包被有MSC上清或者MSC本身的胶原片插入到所述凹处。对照条件包括手术切口以及单独将胶原片置入或者将VEGF直接置入凹处。申请人在用荷载了MSC上清的胶原片处理的角膜中观察到迅速和健壮的血管生成。虽然直接放置到角膜切口的多数细胞扩散远离置入部位，但血管生成是明显的。在对照动物中没有血管生成(图2)。由MSC上清诱导的血管生成比直接利用VEGF更健壮，这提示上清是高度有效的血管生成因子的来源。MSC治疗脑组织对血管生成诱导的初步研究也暗示了新血管形成的增加(未发表的观察结果)。尽管血管生成的诱导并不直接转换为功能的促进，申请人先前已经证明在中风后1天或更多天内用VEGF治疗中风显著改善功能恢复并提高血管生成。
通过MSC诱导神经发生也能促成中风后的功能改善。重要的神经发生部位是邻近侧脑室的区域-侧脑室区。神经发生也见于啮齿类动物大脑的嗅球和齿状回。脑损伤如中风扩大了大脑某些区域中的神经元的产生。功能修复(尤其是中风后的长时期内)与新脑细胞的产生有关。促进产生这些细胞的机制能够改善恢复。申请人测试了用MSC治疗中风对诱导神经发生的作用。中风后在侧脑室区检测到显著增加的细胞数目。许多这些细胞具有新近形成的先祖样细胞标志，如通过特异性分子标志的表达所显示的，例如TUJ-1。同侧半球的脑组织也显示出干细胞标志巢蛋白(nestin)表达的大量增加，显示脑组织激活为先祖或发育状态。移植了MSC的脑组织的组织学分析也显示了缺血组织内神经球玫瑰花结的存在。这些神经元细胞的玫瑰花结类似于在正在发育的大脑中发现的那些。这些细胞系统到脑组织中的迁移可由自脑室区发射出的星形细胞样突起指导，再次与正在发育的大脑中的事件类似。因而，骨髓细胞的存在似乎促进新细胞的迅速诱导以及从脑室区和脉络丛内的初始源头迁往受损大脑。这些细胞能够有助于功能修复，虽然没有直接测试神经发生诱导以及这些细胞的迁移与功能恢复的关系。
MSC产生的生长和营养因子能够影响突触发生并提高受损和缺血大脑中的树突树枝状分枝。用MSC治疗中风对树突树枝状分枝的直接作用有待进一步的实验。在初步实验中，申请人已经证明突触泡蛋白(一种突触蛋白)在中风后缺血性病变边界区内的表达。
在神经损伤后神经胶质增生对于神经突生长和树枝状分枝是障碍。转化生长因子蛋白在创伤愈合中具有主导的重要性，并且与皮肤和心肌膜的结疤抑制以及胎儿中观察到的无疤痕伤口修复有关。由于MSC产生该生长因子，治疗效益也可以来自于减少结疤和随后突触发生及树突树枝状分枝的提高。
除了细胞因子以及生长和营养因子，MSC表达与骨形成相关的因子，例如成骨细胞特异性因子2和骨形态发生蛋白1。他们也表达神经细胞粘附分子neuropilin和神经营养因子包括NGF和BDNF。最近的研究证明骨形态发生蛋白、sonic hedgehog、甲状旁腺激素以及成纤维细胞生长因子8通过修饰中胚层和神经外胚层途径，在胚胎细胞分化期间具有调节作用。是否MSC在受损大脑中的这种细胞因子级联分泌有助于功能效益为仔细考虑和进一步实验提供了正当理由。
病变周围区域受凋亡细胞死亡的高度影响。细胞凋亡在中风或脑外伤后持续数月。对恢复的影响是未知的。申请人已经证明用MSC治疗中风和脑外伤显著减少该区域内的细胞凋亡。这种作用可以通过在受损大脑中产生生长因子如NGF介导。申请人推测该区域细胞凋亡的选择性减少能够支持脑再联线(rewiring)。
大脑重塑、神经发生的机制以及损伤后激发功能改善的神经保护机制尚不确定，因而是重要的研究课题。所有这些通过MSC治疗放大的事件，是否真正有助于改善中风和外伤后的结果正在研究中。
在这个时候，不能将促成神经功能恢复的具体事件分离开来。不过，申请人推测，促进功能恢复的过程不是组织的单独修饰(如神经发生)，而最可能是交织在一起的系列事件，即血管生成、神经发生、突触发生以及边界结疤和细胞凋亡的减少，它们以偶联的方式，如果不是协同方式的话，促成了功能的改善。虽然测试这种假说并鉴定促成神经系统功能改善的特定因子是值得做的；可是申请人在选择性地增加边界区内细胞凋亡、降低血管生成而不影响神经发生方面具有有限的能力。
许多方面的受损脑组织阻塞再现了个体发生的各阶段。中风或损伤后，脑组织退回到发育的早期阶段，因而对于来自侵入的MSC的细胞因子以及营养和生长因子的刺激变得高度敏感。MSC很可能在准发育脑组织内刺激结构和再生性变化，包括血管生成、血管发生、神经发生和树突树枝状分枝。是对各种刺激物和生长因子高度敏感的初生状态的组织，而不是初生状态的MSC，主要地促成了治疗应答。MSC能够简单地提供个体发生性脑组织所需的资源以刺激脑重塑。申请人不排除其它细胞或者细胞因子及生长因子依次输注能够刺激受损脑细胞应答并恢复功能的可能性。同样地，申请人不能够排除MSC亚群为干细胞样或祖细胞样细胞，并且能够与受损组织协同反应的可能性。不过，申请人相信脑内的MSC不替代组织，并且它们不分化成行使功能的神经元和支持性星形细胞，至少是在申请人看到功能性效益的时间范围上。初级效益通过激活受损组织重塑并补偿损伤获得。图3举例说明了目前对于能够获取MSC并用于治疗受损脑组织的过程的理解。
患者移植显然，在这种形式的细胞疗法用于中风患者之前必须解决安全问题。尽管骨髓移植是癌症治疗中常见的操作并且已经用于多发性硬化症的辅助疗法，中风安全性的I期研究得到了批准。迄今为止，在对将近2000只中风动物的研究中，申请人未检测到该疗法的任何副作用或者肿瘤形成的任何迹象。患者应当用他们自身的细胞、HLA匹配细胞或者万能供血者细胞群治疗吗？迄今为止的临床前数据提示用供体细胞治疗是可能的。不过，必须进行临床前和I期临床研究以解决这个问题。在此描述的临床前和基础研究表明用MSC治疗中风能够提供可行和高度有效的恢复治疗。因而，临床研究得到了批准。
在整个申请中，各种出版物，包括美国专利，是以作者和年代引用的，而专利以专利号引用。所述出版物的完全引用列于下文。特此将这些出版物和专利公开的内容全文并入本申请作为参考，以便更加充分地描述本发明所属技术领域的状态。
本发明以举例说明的方式进行了描述，并且应当理解所用的术语旨在指所述描述语言的性质而不是限制。
显然，本发明的任何修饰和变形在上述教导的启示下是可能的。因此应当理解，在所描述的发明范围之内，本发明能够以与具体描述不同的方式实施。
表.由TBI组织提取物诱导的hMSC的分化组别 TBI Ext.(％) 神经样细胞(％)Knockout DMEM 0正常脑提取物 20 3.16±1.9740 20.8±1.19TBI提取物10 2.07±0.4920 29.60±16.89*40 12.70±8.49*用TBI组织提取物处理的hMSC与具有剔除血清替代品的剔除DMEM以及正常脑提取物对照进行比较。*P＜0.01
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权利要求
1.用于诱导血管生成和血管发生的治疗剂，所述治疗剂包括与药学上可接受的细胞治疗剂相结合的分离自干细胞的血管生成和血管发生诱导因子，所述治疗剂用于诱导血管生成和血管发生。
2.根据权利要求1的治疗剂，其中所述血管生成和血管发生诱导因子选自基本上由血管生成因子、营养因子和生长因子组成的组。
3.根据权利要求1的治疗剂，其中所述细胞治疗剂是选自基本上由间充质干细胞、基质细胞及其前体细胞、成纤维细胞、网织红细胞、脂肪细胞和内皮细胞组成的组中选择的干细胞。
4.增强由基质细胞分泌的血管生成和血管发生诱导因子产生的方法，通过将基质细胞暴露于并与增加血管生成和血管发生诱导因子产生的分化诱导化合物共培养实施。
5.根据权利要求4的方法，其中所述方法包括将基质细胞暴露于并与增加血管生成和血管发生诱导因子产生的分化诱导化合物共培养，所述分化诱导化合物选自基本上由脑提取物和钙组成的组。
6.从干细胞分离和纯化的用作治疗的血管生成和血管发生诱导因子。
7.根据权利要求6的血管生成和血管发生诱导因子，其中血管生成和血管发生诱导因子在向需要此种治疗的患者给药后诱导血管生成和血管发生。
8.根据权利要求6的血管生成和血管发生诱导因子，其中所述血管生成和血管发生诱导因子是由暴露于并与增加目的因子产生的分化诱导化合物共培养的干细胞分泌的因子。
9.根据权利要求8的血管生成和血管发生诱导因子，所述分化诱导化合物选自基本上由脑提取物和钙组成的组。
10.根据权利要求9的血管生成和血管发生诱导因子，其中所述脑提取物选自基本上由脑细胞、由脑获得的细胞以及由培养基培养的基质细胞的上清组成的组。
11.获得如权利要求6中所示的血管生成和血管发生诱导因子的方法，所述方法包括步骤在分化前从组织中分离和纯化人类间充质干细胞；并培养扩增所述间充质干细胞以产生用于神经学和肌与骨胳治疗的工具。
12.分离的且在分化诱导化合物的影响下培养扩增的间充质干细胞，所述干细胞能够分化并产生组织修复所需的期望细胞表型。
13.根据权利要求12的干细胞，所述分化诱导化合物选自基本上由脑提取物和钙组成的组。
14.根据权利要求13的干细胞，其中所述脑提取物选自基本上由脑细胞、由脑获得的细胞以及由培养基培养的基质细胞的上清组成的组。
15.根据权利要求12的干细胞用于重定向细胞的修复能力。
16.在需要所述治疗的患者中诱导血管生成和血管发生的疗法，通过给药包含与药学上可接受的细胞治疗剂相结合的分离自干细胞的血管生成和血管发生诱导因子的治疗剂实施，所述治疗剂诱导患者血管生成和血管发生。
17.根据权利要求16的疗法，其中所述给药步骤包括以选自基本上由皮下、肠胃外、静脉内、动脉内、肌内、腹膜内、鼻内、鞘内以及通过输注的技术组成的组中的方式给药所述治疗剂。
18.诱导组织修复的方法，通过给药包括与药学上可接受的细胞治疗剂相结合的分离自干细胞的血管生成和血管发生诱导因子的治疗剂实施，所述治疗剂诱导组织修复。
19.根据权利要求18的方法，其中所述给药步骤包括以选自基本上由皮下、肠胃外、静脉内、动脉内、肌内、腹膜内、鼻内、鞘内以及通过输注的技术组成的组中的方式给药所述治疗剂。
20.用于增强细胞功能的治疗剂，所述治疗剂包含与药学上可接受的细胞治疗剂相结合的分离自干细胞的细胞功能增强因子，所述治疗剂用于增强细胞功能。
全文摘要
本发明公开了用于诱导血管生成和血管发生的治疗剂，所述治疗剂包括与药学上可接受的细胞治疗相结合的分离自干细胞的血管生成和血管发生诱导因子。公开了通过将干细胞暴露于并与增加血管生成和血管发生诱导因子产生的化合物共培养，增加分泌的血管生成和血管发生诱导因子产生的方法。公开了从干细胞分离和纯化的治疗用血管生成和血管发生诱导因子。公开了获得如上所示的血管生成和血管发生诱导因子的方法，该方法包括在分化前从组织中分离和纯化人类间充质干细胞，然后培养扩增所述间充质干细胞以产生用于神经学和肌与骨胳治疗的工具的步骤。公开了分离的且在必需化合物的影响下培养扩增的间充质干细胞，它能够分化并产生组织修复所需的期望细胞表型。
文档编号A61K35/00GK1615143SQ03802244
公开日2005年5月11日 申请日期2003年1月14日 优先权日2002年1月14日
发明者M·肖普, Y·李, X·陈 申请人:亨利·福特卫生系统