专利名称：包含促滤泡素抑制素结构域的蛋白质的制作方法
技术领域：
本发明涉及利用包含至少一个促滤泡素抑制素(follistain)结构域的蛋白质来调节生长和分化因子-8(GDF-8)的水平或活性的用途。更特别的，本发明涉及包含至少一个促滤泡素抑制素结构域的蛋白质(不包括促滤泡素抑制素本身)在治疗与GDF-8水平或活性的调节相关的病症中的用途。本发明用于治疗肌肉疾病和病症，特别是随肌肉组织的增加而治疗有效的肌肉疾病和病症。本发明也用于治疗与新陈代谢、脂肪组织和骨退化相关的疾病和病症。
背景技术：
生长和分化因子-8(GDF-8)，亦称为肌肉生长抑制素(myostatin)，是结构上相关的生长因子的转化生长因子-β(TGF-β)超家族的成员，所有的生长因子具有重要的生理学生长调节和形态发生的特性(Kingsley等人，(1994)Genes Dev.，8133-46；Hoodless等人(1998)Curr.Topics Microbiol.Immunol.，228235-72)。GDF-8是骨骼肌质量的负调节物，并且对鉴定调节其生物活性的因子相当有兴趣。例如GDF-8在发育和成体骨骼肌中高表达。转基因小鼠中GDF-8的无效突变特征为骨骼肌的明显肥大和增生(McPherron等人，(1997)Nature，38783-90)。类似的骨骼肌质量增加在牛GDF-8的天然存在的突变中是明显的(Ashmore等人(1974)Growth，38501-507；Swatland和Kieffer(1994)J.Anim.Sci.，38752-757；McPherron和Lee(1997)Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.，9412457-12461；和Kambadur等人(1997)Genome Res.，7910-915)。最近的研究已经显示人类中与HIV感染有关的肌肉损耗伴随GDF-8蛋白质表达的增加(Gonzalez-Cadavid等人(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，9514938-43)。此外，GDF-8可以调节肌肉特异性酶的产生(例如，肌酸激酶)以及调节成肌细胞的增殖(WO 00/43781)。
许多人和动物的病症与肌肉组织的损失或功能性损伤相关。迄今为止，很少存在对这些病症可靠或有效的治疗。然而，与这些病症有关的可怕症状可基本上在患有这些病症的患者中通过使肌肉组织量增加的治疗而减轻。虽然并不治愈该病症，但这种治疗可显著改善这些患者的生活质量并且可以改进这些疾病的一些效果。因此，在本领域中有必要鉴定可在患这些病症的患者中促进肌肉组织整体增加的新疗法。
除骨骼肌中GDF-8的生长调节和形态发生的特性外，GDF-8也可参与许多其他的生理学过程(例如，葡萄糖体内稳态)，以及例如在类型2糖尿病和例如肥胖的脂肪组织病症发展过程中的异常状况。例如，GDF-8调节前脂肪细胞分化为脂肪细胞(Kim等人(2001)B.B.R.C.281902-906)。因此，GDF-8的调节也可用于治疗这些疾病。
GDF-8蛋白质是作为由氨基末端的前肽和羧基末端的成熟结构域组成的前体蛋白质而合成的(McPherron和Lee，(1997)Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.，9412457-12461)。切割前，该前体GDF-8蛋白质形成同型二聚体。随后氨基末端的前肽从成熟的结构域上切割下来。切割下来的前肽可保持与成熟的结构域二聚体非共价结合，使其生物活性失活(Miyazono等人，(1988)J.Biol.Chem.，2636407-6415；Wakefield等人(1988)J.Biol.Chem.，2637646-7654；和Brown等人(1990)Growth Factors，335-43)。相信2种GDF-8前肽与GDF-8成熟二聚体结合(Thies等人(2001)Growth Factors，18251-259)。由于这种失活的特性，前肽被称为″潜在相关的肽″(LAP)，并且成熟结构域和前肽的复合物通常称为″小的潜在的复合物″(Gentry和Nash(1990)Biochemistry，296851-6857；Derynck等人(1995)Nature，316701-705；和Massague(1990)Ann.Rev.CellBiol.，12597-641)。已知其他蛋白质是与GDF-8或结构上相关的蛋白质结合，并抑制其生物活性。具有这种抑制作用蛋白质包括促滤泡素抑制素(Gamer等人(1999)Dev.Biol.，208222-232)。相信当前肽被除去时，GDF-8的成熟结构域作为同型二聚体是有活的。
显而易见，GDF-8参与许多决定性的生物进程的调控。由于它在这些过程中的关键功能，GDF-8可能是用于治疗介入所需的目标。特别地，可使用抑制GDF-8活性的治疗剂治疗人或动物的病症，其中肌肉组织的增加是治疗有效的。
包含至少一个促滤泡素抑制素结构域的已知蛋白质在许多生物进程中，特别是在TGF-β超家族信号传导的调节和细胞外基质介导过程例如细胞粘附的调节中发挥作用。促滤泡素抑制素、与促滤泡素抑制素相关的基因(FLRG，FSRP)和与促滤泡素抑制素相关的蛋白质(FRP)，通过经TGF-β的转录调节(Bartholin等人(2001)Oncogene，205409-5419；Shibanuma等人(1993)Eur.J.Biochem.21713-19)或通过它们拮抗TGF-β信号传导途径的能力(Phillips和de Kretser(1998)Front.Neuroendocrin.，19287-322；Tsuchida等人(2000)J.Biol.Chem.，27540788-40796；Patel等人(1996)Dev.Biol.，178327-342；Amthor等人(1996)Dev.Biol.，178343-362)而都与TGF-β信号传导相联系。括号中蛋白质的名称是备选名称。
胰岛素生长因子结合蛋白7(IGFBP7，mac25)，包含至少一个促滤泡素抑制素结构域，结合胰岛素并随后阻断与胰岛素受体的相互作用。此外，IGFBP7已经显示结合一种TGF-β家族成员的活化素(Kato(2000)Mol.Med.，6126-135)。
集聚蛋白和与集聚蛋白相关的蛋白质包含9个以上的促滤泡素抑制素结构域并且从神经细胞分泌以促进乙酰胆碱受体和参与形成突触的其他分子的聚集。已经表明促滤泡素抑制素结构域可能帮助生长因子定位于突触(Patthy等人(1993)Trends Neurosci.，1676-81)。
骨粘连蛋白(SPARC，BM40)和hevin(SC1，mast9，QR1)是与细胞外基质的蛋白质相互作用并且调节细胞生长和粘附的紧密相关的蛋白质(Motamed(1999)Int.J.Biochem.Cell.Biol.，311363-1366；Girard和Springer(1996)J.Biol.Chem.，2714511-4517)。这些蛋白质包含至少一个促滤泡素抑制素结构域。
其他的促滤泡素抑制素结构域蛋白质已经被NCBI数据库(国家生物技术信息中心，Bethesda，马里兰州，美国)描述或公开，然而它们的功能目前是未知的。这些蛋白质包括U19878(G01639，与fomoregulin-1很相似)、T46914、人GASP1(与GDF-相关的血清蛋白1；在此所描述的；图7)、人GASP2(WFIKKN；Trexler等人(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，983705-3709；图9)，和testican(SPOCK)蛋白质的蛋白多糖家族(Alliel等人(1993)Eur.J.Biochem.，214347-350)。也根据Celera数据库确定了小鼠GASP1(图6)和小鼠GASP2(图8)的氨基酸和核苷酸序列(Rockville，MD)。如在此所描述的，克隆的小鼠GASP1的核苷酸序列除在不改变预测的氨基酸序列的摇摆密码子中的一些碱基置换外，与预测的Celera序列匹配(参见
图13)。
发明概述因此，本发明涉及除促滤泡素抑制素外的蛋白质，它包含独特的结构特征，即存在至少一个促滤泡素抑制素结构域。促滤泡素抑制素本身不包括于本发明中。包含至少一个促滤泡素抑制素结构域的蛋白质特异性地与成熟的GDF-8蛋白质或其片段反应，无论该GDF-8蛋白质是单体形式、二聚体的活性形式，或是GDF-8潜在复合物的复合形式。包含至少一个促滤泡素抑制素结构域的蛋白质可能结合成熟GDF-8蛋白质上的表位，导致与GDF-8相关的一种或多种生物活性的减少，相对于不与相同蛋白质结合的成熟GDF-8蛋白质。
本发明提供用于调节GDF-8对细胞的作用的方法。这种方法包括施用有效量的包含至少一个促滤泡素抑制素结构域的蛋白质。本发明也包括通过施用编码包含至少一个促滤泡素抑制素结构域的蛋白质的DNA分子，在细胞中表达蛋白质的方法。
根据本发明，包含至少一个促滤泡素抑制素结构域的蛋白质可以以治疗有效剂量对患者给药，以治疗或预防其中肌肉组织的增加对治疗有效的医学状况。实施方案包括与GDF-8的产生、新陈代谢或活性相关的疾病、病症和细胞和组织创伤的治疗。
包含至少一个促滤泡素抑制素结构域的蛋白质可以药物制剂的形式制备。该药物制剂可以包含帮助结合成熟GDF-8蛋白质或其片段的其他成分，无论该GDF-8是单体形式、二聚体的活性形式或是GDF-8潜在复合物的复合形式。
此外，包含至少一个促滤泡素抑制素结构域的蛋白质可用作定量或定性检测成熟GDF-8蛋白质或其片段的诊断工具，无论其是单体形式、二聚体的活性形式，或是GDF-8潜在复合物的复合形式。例如，包含至少一个促滤泡素抑制素结构域的蛋白质可用于检测细胞、体液、组织或生物体中GDF-8蛋白质的存在、缺乏或数量。检测的成熟GDF-8蛋白质的存在或数量可能与在此所列出的一种或多种医学状况相关。
包含至少一个促滤泡素抑制素结构域的蛋白质可在诊断试剂盒中提供以检测成熟GDF-8蛋白质或其片段，无论其是单体形式、二聚体的活性形式，或是GDF-8潜在复合物的复合形式，并且有助于使所得的结果与在此所描述的一种或多种医学状况相互关联。这种试剂盒可能包括包含至少一个促滤泡素抑制素结构域的至少一种蛋白质，无论它是标记的或未标记的，并且包括至少一个结合该蛋白质的试剂，例如标记的抗体。该试剂盒可能同时包括适当的生物标准物和对照样品，它们可用于比较实验检测的结果。它可能还包括缓冲液或洗涤液以及使用该试剂盒的用法说明。结构成分可被包括在内以用于进行实验，例如棍、珠、纸、柱、小瓶或凝胶。
附图简述图1显示了从野生型的小鼠血清中抗体纯化GDF-8复合物。银染还原性凝胶显示使用共价偶联琼脂糖珠的JA16单克隆抗体从野生型小鼠血清中纯化的蛋白质。平行进行使用模拟偶联珠的对照纯化(0)。随后使用缓冲液(模拟洗提)、竞争性肽和SDS样品缓冲液的洗提显示用来自JA16-结合珠的肽的特异洗提有2个可见的蛋白质条带(用箭头指示)。
图2显示在来自正常小鼠血清的亲和纯化的样品中鉴定成熟和未加工的GDF-8。图2A显示从亲和纯化的样品中的可见的12 kDa条带中鉴定出的GDF-8衍生肽(SEQ ID NO19)的代表性的MS/MS谱。N-末端碎片离子(b离子)和C-末端碎片离子(y离子)都是可见的。值得注意的是，最强的y碎片离子由脯氨酸残基前的裂解作用引起，这是包含脯氨酸的肽的通常的特征。图2B显示用识别GDF-8成熟区域的多克隆抗体作为探针的western印迹，证实亲和纯化样品中存在GDF-8。GDF-8的成熟和未加工的形式都是可见的。
图3显示GDF-8前肽和促滤泡素抑制素样相关基因(FLRG)与从正常小鼠血清分离的循环的GDF-8的结合。显示鉴定自36 kDa条带中的GDF-8前肽(SEQ ID NO23)(图3A)和FLRG(SEQ ID NO30)(图3C)的衍生肽的代表性MS/MS谱。图3B显示用特异性地识别GDF-8前肽区域的多克隆抗体作为探针对亲和纯化的GDF-8复合物进行的western印迹，证实GDF-8复合物中该蛋白质的质谱鉴定。剪切的前肽和未加工的GDF-8是可见的--在较长的曝光时间下，未加工的GDF-8也可在SDS洗提样品中见到。图3D显示用FLRG的单克隆抗体作为探针对亲和纯化的GDF-8复合物进行的western印迹。
图4显示鉴定的GDF-8前肽、FLRG和作为血清中的主要GDF-8结合蛋白的新蛋白质的大规模GDF-8纯化的完全分析的结果。将阴性对照和JA16免疫沉淀的肽洗提样品的银染凝胶切割成为13个部分。每个部分中的蛋白质用胰蛋白酶消化并且使用纳流(nanoflow)-LC-MS/MS和数据库搜索进行鉴定。JA16样品的独特蛋白质只包括未加工的和成熟的GDF-8、GDF-8前肽、FLRG和新的多结构域的蛋白酶抑制剂(与GDF-相关的血清蛋白1，GASP1)。这些蛋白质鉴定自凝胶的标记区域。
图5显示新的多结构域的蛋白酶抑制剂，GASP1，它与血清中的GDF-8结合。图5A(指定为SEQ ID NO31的肽)和5B(指定为SEQ ID NO33的肽)显示鉴定自图4银染凝胶的条带3的2个GASP1肽的代表性的MS/MS谱。
图6A显示预测的小鼠GASP1的核苷酸序列。图6B显示预测的小鼠GASP1的备选的核苷酸序列。图6C显示由图6A和6B中显示的核苷酸序列编码的预测的氨基酸序列。由这2种核苷酸序列编码的蛋白质序列是相同的，因为核苷酸的差异都在摇摆密码子的位置。促滤泡素抑制素结构域以粗体和加下划线显示。
图7A显示预测的人GASP1的核苷酸序列。图7B显示相应的预测的氨基酸序列。促滤泡素抑制素结构域以粗体和加下划线显示。图7C显示使用备选的起始位点预测的人GASP1的核苷酸序列。图7D显示相应的预测的氨基酸序列。促滤泡素抑制素的结构域以粗体和加下划线显示。序列的结尾加注星号表示。
图8A显示预测的小鼠GASP2的核苷酸序列，同时图8B显示相应预测的氨基酸序列。促滤泡素抑制素的结构域以粗体和加下划线显示。
图9A显示预测的人GASP2的核苷酸序列，同时图9B显示相应的预测的氨基酸序列。促滤泡素抑制素的结构域以粗体和加下划线显示。
图10显示小鼠GASP1在许多成体组织中和发育期间的表达。该图显示小鼠GASP1的组织表达分布图。GASP1的551bp片段扩增自Clontech(Palo Alto，CA)标准化的第一链cDNA组。扩增甘油醛-3-磷酸脱氢酶(G3PDH)的一部分作为对照。已知G3PDH的表达在骨骼肌中很高而在睾丸中很低。模板除了G3PDH之外相对于，还相对于β-肌动蛋白、磷脂酶A2和核糖体蛋白S29将cDNA组标准化。
图11显示分离自人血清的蛋白质。来自JA16免疫沉淀或对照样品(0)的蛋白质在模拟的PBS洗提、竞争性肽洗提或SDS洗提中洗提。凝胶指示区域的蛋白质用胰蛋白酶消化并且经LS-MS/MS和数据库搜索进行分析。存在于JA16样品而不存在于对照样品中的蛋白质是成熟的GDF-8(条带16)、GDF-8前肽和FLRG(条带11)以及人GASP1(条带4)。图11B显示用识别成熟GDF-8的抗体作为探针对相同JA16免疫沉淀进行的western印迹。相应于分离自人血清的成熟的和未加工的GDF-8的条带是可见的。
图12显示来源于分离自条带4，11和16(图11)的GDF-8的肽和相关的蛋白质的典型质谱。显示肽序列和N-末端(b离子)和C-末端(y离子)。鉴定的肽的一览表在表1中提供。显示的谱来自GASP1肽(SEQ ID NO44)(图12A)、FLRG肽(SEQ ID NO41)(图12B)、GDF-8前肽的肽(SEQ ID NO24)(图12C)和成熟的GDF-8肽(SEQ ID NO13)(图12D)。
图13显示克隆的小鼠GASP1的核苷酸(SEQ ID NO48)和氨基酸(SEQ ID NO49)序列。由质谱法在JA16亲和纯化的样品中鉴定的肽是加下划线的。序列的结尾加注星号表示。
图14A显示GASP1的结构域结构。GASP1具有在氨基酸29后的信号序列/切割位点。此外，GASP1包含可能抑制金属蛋白酶的2个Kunitz/BPTI丝氨酸蛋白酶抑制剂结构域，促滤泡素抑制素结构域(包括Kazal丝氨酸蛋白酶抑制剂基序)和netrin结构域。图14B显示从小鼠和人基因组序列预计的GASP1和GASP2的进行系统树。小鼠和人的GASP1是90％相同的。GASP1和GASP2是54％相同的。
图15显示重组生产的GASP1分别结合GDF-8和GDF-8前肽。(A)使用JA16从补充有重组纯化的GDF-8和/或前肽的模拟的或GASP1-V5-His转染的COS细胞条件培养基中免疫沉淀GDF-8。使用抗V5(上端组)、抗GDF-8(中间组)，或抗前肽的多克隆抗体的Western印迹检测这些蛋白质是否存在于免疫沉淀中。(B)重组生产的GASP1蛋白质从补充有重组纯化的GDF-8和/或前肽的模拟的或GASP1-V5-His条件培养基中经抗V5标记的抗体免疫沉淀。如(A)中所述通过western印迹分析免疫沉淀物。
图16显示GASP1抑制GDF-8和高度相关的BMP-11的生物活性，但不抑制活化素或TGF-β。将来自模拟(空心圆形)或GASP1-V5-His(实心正方形)转染子的条件培养基的多种稀释物与(A)10ng/ml GDF-8，(B)10ng/ml BMP-11，(C)10ng/ml活化素，或(D)0.5ng/ml TGF-β温育。然后将这些样品在A204(A-C)或RD(D)细胞中进行荧光素酶报道分子活性分析以确定加入的生长因子的活性。荧光素酶活性以相对的荧光素酶单位显示。由每一生长因子单独产生的活性通过实心菱形和短虚线显示。不加入任何生长因子，则分析中的背景活性很低，如不带有符号的长虚线表示。
图17显示GASP1抑制GDF-8的效价。测试了纯化的GASP1在RD细胞的(CAGA)12(SEQ ID NO53)荧光素酶报道分子分析中抑制20ng/ml肌肉生长抑制素的能力(实心正方形)。由GDF-8单独产生的活性通过实心菱形和短虚线显示。没有加入生长因子时存在的活性以长虚线显示。
定义术语″促滤泡素抑制素结构域″是指以富含半胱氨酸的重复单元为特征的氨基酸结构域或编码该氨基酸结构域的核苷酸结构域。促滤泡素抑制素结构域一般包括65-90个氨基酸的跨度并且包含10个保守的半胱氨酸残基和与Kazal丝氨酸蛋白酶抑制剂结构域相似的区域。一般，半胱氨酸残基之间的环区域在促滤泡素抑制素结构域显示出序列的可变性，但是一些保守仍是明显的。第4和第5个半胱氨酸之间的环通常是小的，只包含1或2个氨基酸。第7和第8个半胱氨酸之间的环中的氨基酸一般是最高度保守的，包含(G，A)-(S，N)-(S，N，T)-(D，N)-(G，N)的共有序列，然后为(T，S)-Y基序。第9和第10个半胱氨酸之间的区域一般包括被另一个氨基酸分隔开的包含2个疏水残基(具体地为V，I或L)的基序。
术语″包含至少一个促滤泡素抑制素结构域的蛋白质″是指包含至少一个，但可能超过一个促滤泡素抑制素结构域的蛋白质。该术语也指这种蛋白质的任何变体(包括片段；具有置换、添加或缺失突变的蛋白质；以及融合蛋白质)，这些变体保持与天然蛋白质相关的已知生物活性，特别是与GDF-8结合活性相关的已知生物活性，包括已经用保守的或非保守的氨基酸序列变化修饰的序列。这些蛋白质可来源于天然或合成的任何来源。该蛋白质可以来源于人或动物来源，包括牛、鸡、鼠、大鼠、猪、羊、火鸡、狒狒和鱼。促滤泡素抑制素本身不包括于本发明中。
术语″GDF-8″或″GDF-8蛋白质″是指特异的生长和分化因子。该术语包括该蛋白质的全长未加工的前体形式，以及由翻译后切割产生的成熟的和前肽的形式。该术语也指保持与蛋白质相关的已知生物活性的GDF-8的任何片段，包括已经用保守的或非保守的氨基酸序列变化修饰的序列。这些GDF-8分子可来源于天然或合成的任何来源。该蛋白质可能来源于人或动物来源，包括牛、鸡、鼠、大鼠、猪、羊、火鸡、狒狒和鱼。多种GDF-8分子已经在McPherron等人(1997)Proc.Natl.Acad.Sci. USA，9412457-12461中有描述。
″成熟的GDF-8″是指从GDF-8前体蛋白质的羧基末端结构域切割下来的蛋白质。成熟的GDF-8可作为单体、同型二聚体或GDF-8潜在的复合物存在。根据体内或体外的状况，成熟的GDF-8可在这些不同的任何或所有形式之间建立平衡。同型二聚体被认为是有生物学活性的。在它的生物活性形式中，该成熟的GDF-8也被称为″活化的GDF-8″。
″GDF-8前肽″是指从GDF-8前体蛋白质的氨基末端结构域切割下来的多肽。GDF-8前肽能够结合成熟的GDF-8上的前肽结合结构域。
″GDF-8潜在的复合物″是指在成熟GDF-8的同型二聚体和GDF-8前肽之间形成的蛋白质复合物。认为2个GDF-8前肽结合2个分子的同型二聚体形式的成熟GDF-8以形成无活性的四聚合复合物。该潜在复合物可包括替代一个或多个GDF-8前肽的其它GDF抑制剂或除一个或多个GDF-8前肽之外还包括其他的GDF抑制剂。
短语″GDF-8活性″是指与活化的GDF-8蛋白质相关的一种或多种生理学上的生长调节或形态发生的活性。例如，活化的GDF-8是骨骼肌的负调节剂。活化的GDF-8还可以调节肌肉-特异性酶(例如，肌酸激酶)的生产，刺激成肌细胞的细胞增殖并且调节前脂肪细胞分化成脂肪细胞。GDF-8也被认为增加对胰岛素的敏感性和在外周组织中，特别是在骨骼肌或脂肪细胞中对葡萄糖的摄取。因此，GDF-8生物活性包括但不限于，抑制肌肉形成、抑制肌细胞生长、抑制肌肉发育、减少肌肉质量、调节肌肉特异性酶、抑制成肌细胞的细胞增殖、调节前脂肪细胞分化成脂肪细胞、增加对胰岛素的敏感性、调节葡萄糖摄取、葡萄糖止血和调节神经元细胞的发育和维持。
术语″分离的″或″纯化的″是指基本上不含其自然环境的分子。例如，分离的蛋白是指来源于细胞或组织源而基本上不含源于该细胞或组织的细胞物质或其他污染蛋白质的蛋白质。短语″基本上不含细胞物质″是指其中分离的蛋白至少为70％-80％(w/w)纯、至少为80％-89％(w/w)纯、至少为90-95％纯，或至少为96％、97％、98％、99％或100％(w/w)纯的制剂。
术语″LC-MS/MS″指液相层析与质谱仪串联安排以分离特定质量/电荷比的分子离子、破碎该离子并且记录该碎片离子的质量/电荷比。当分析肽样品时，这种技术使得能够通过液相层析上游分离复杂样品，然后记录碎片离子的质量并且随后确定肽的序列。
术语″MS/MS″指使用质谱仪分离特定质量/电荷比的分子离子、破碎该离子并且记录所得到的碎片离子的质量/电荷比的方法。该碎片离子提供有关肽序列的信息。
术语″治疗″或″疗法″指治疗法和预防法或预防措施。需要治疗者可能包括已经患有特定的医学病症以及可能最终患上病症的个体(即，需要预防措施的个体)。术语治疗包括确定病症的潜在原因的措施和减少医学病症的症状而不必影响其成因的措施。因此，改进生活质量和改善症状，正如抵消病因的措施被认为是治疗。
术语″医学病症″指肌肉、骨或葡萄糖体内稳态的紊乱，并且包括与GDF-8和/或TGF-β超家族其他成员(例如，BMP-11)相关的病症。这种病症的实例包括但不限于，代谢疾病和紊乱，例如胰岛素依赖性(1型)糖尿病、非胰岛素依赖型(2型)糖尿病、高血糖、减损的葡萄糖耐量、新陈代谢综合征(例如，综合征X)，和由外伤(如烧伤或氮失衡)诱导的胰岛素抗性，以及脂肪组织紊乱(例如，肥胖症)；肌肉和神经肌肉病症，例如肌营养不良(包括但不限于，严重的或良性的X-连锁的肌营养不良、肢带肌营养不良、面肩胛肱骨营养不良、强直性肌营养不良、远端肌营养不良、进行性营养不良的眼肌麻痹、眼咽肌营养不良，杜兴肌营养不良和Fakuyama型先天性肌营养不良)；肌萎缩性侧索硬化(ALS)；肌内萎缩；器官萎缩；脆性；腕管综合征；充血梗阻性肺病；先天性肌病；先天性肌强直；家族性周期性麻痹；突发性肌红蛋白尿；重症肌无力；伊-朗综合征；继发性肌无力；去神经支配萎缩；突发性肌肉萎缩；以及肌肉贫乏症(Sarcopenia)、恶病质和其他肌肉消耗综合征。其他实例包括，特别是在老年人和/或绝经后的妇女中的骨质疏松症；糖皮质激素诱导的骨质疏松症；骨量减少；骨关节炎；与骨质疏松症相关的骨折；以及肌肉组织的外伤或慢性损伤。更进一步的实例包括由慢性糖皮质激素治疗、早熟性生殖腺障碍、雄激素抑制、维生素D缺乏、继发性甲状旁腺功能亢进、营养缺乏和神经性厌食造成的低骨质量。
术语″质量增加″是指在用包含至少一个促滤泡素抑制素结构域的蛋白质治疗后，相对于治疗前存在的肌肉量，出现更多数量的肌肉。
术语″治疗效益″指病症症状的改善，病症发展的减慢，或病症发展的停止。治疗效益通过比较病症的各个方面而确定，例如在包含至少一个促滤泡素抑制素结构域的至少一种蛋白质的施用前后肌内的数量。
术语″调节″指通过增加、减少或抑制蛋白质的活性、性能或数量改变蛋白质的特性。例如，包含至少一个促滤泡素抑制素结构域的蛋白质可通过抑制其活性而调节GDF-8。
术语″稳定化修饰″是本领域已知的或在此提出的，能够稳定蛋白质、增加蛋白质的体外半衰期、增加蛋白质的循环半衰期和/或减少蛋白质的蛋白水解降解的任何修饰。这种稳定化修饰包括但不限于，融合蛋白质(包括，例如，包含至少一个促滤泡素抑制素结构域的蛋白质和第二蛋白质的融合蛋白质)、糖基化位点的修饰(包括，例如，给包含至少一个促滤泡素抑制素结构域的蛋白质增加糖基化位点)，以及碳水化合物部分的修饰(包括，例如，从包含至少一个促滤泡素抑制素结构域的蛋白质除去碳水化合物部分)。在包括融合蛋白质的稳定化修饰的情况下(例如，第二蛋白质与包括至少一个促滤泡素抑制素结构域的蛋白质融合)，该第二蛋白质可被称为″稳定剂部分″或″稳定剂蛋白质″。例如，包括至少一个促滤泡素抑制素结构域的蛋白质人蛋白质可以与IgG分子融合，其中IgG作为稳定剂蛋白质或稳定剂部分起作用。如在此所使用的，除了指融合蛋白质的第二蛋白质外，″稳定剂部分″也包括非蛋白质类的修饰，例如碳水化合物部分或非蛋白质类的聚合物。
术语″IgG分子的Fc区域″是指如本领域技术人员所公知的同种型IgG免疫球蛋白的Fc结构域。IgG分子的Fc区域是负责增加IgG分子的体内血清半衰期的IgG分子(IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)的部分。
″体外半衰期″指在活生物体外测量的蛋白质的稳定性。测量体外半衰期的测定方法是本领域公知的，包括但不限于，SDS-PAGE、ELISA、基于细胞的分析、脉冲追踪、western印迹、northern印迹等。这些和其他有用的测定是本领域公知的。
″体内半衰期″是指生物体中蛋白质的稳定性。体内半衰期可通过许多本领域已知的方法测量，包括但不限于，体内血清半衰期、循环半衰期和在此的实施例中所阐明的测定方法。
″体内血清半衰期″指在生物体的血液中循环的蛋白质的半衰期。本领域已知的方法可用于测量体内血清半衰期。例如，可对动物施用放射性的蛋白质并且可随时间监测血清中标记蛋白质的数量。
为了帮助鉴定本说明书和附图中所列出的序列，提供下列表格，列出SEQ ID NO、图的位置和序列的说明。
发明详述包含至少一个促滤泡素抑制素结构域的蛋白质本发明涉及除促滤泡素抑制素外的蛋白质，它具有独特的结构特征，即包括至少一个促滤泡素抑制素结构域。促滤泡素抑制素本身不包括于本发明中。相信包含至少一个促滤泡素抑制素结构域的蛋白质将结合和抑制GDF-8。具有至少一个促滤泡素抑制素结构域的蛋白质的实例包括但不限于，与促滤泡素抑制素类相关的基因(FLRG)、FRP(flik，tsc36)、集聚素、骨粘连蛋白(SPARC，BM40)、hevin(SC1，mast9，QR1)、IGFBP7(mac25)和U19878。包括图6和7中提供的核苷酸和氨基酸序列的GASP1，和包括图8和9中提供的核苷酸和氨基酸序列的GASP2是包括至少一个促滤泡素抑制素结构域的蛋白质的其他实例。
如上所述，促滤泡素抑制素结构域被定义为，其特征为富含半胱氨酸重复单元的氨基酸结构域或编码该氨基酸结构域的核苷酸结构域。促滤泡素抑制素结构域一般包括65-90个氨基酸的跨度并且包含10个保守的半胱氨酸残基和与Kazal丝氨酸蛋白酶抑制剂结构域相似的区域。一般，半胱氨酸残基之间的环区域在促滤泡素抑制素结构域显示出序列的变化性，但是一些保守仍是明显的。第4和第5个半胱氨酸之间的环通常是小的，只包含1或2个氨基酸。第7和第8个半胱氨酸之间的环中的氨基酸一般是最高度保守的，包含(G，A)-(S，N)-(S，N，T)-(D，N)-(G，N)的共有序列，然后为(T，S)-Y基序。第9和第10个半胱氨酸之间的区域一般包括被另一个氨基酸分隔开的包含2个疏水残基(特定地为V，I或L)的基序。
可结合GDF-8的包括至少一个促滤泡素抑制素结构域的蛋白质，可使用多种方法分离。例如，可如本发明所举例说明的利用GDF-8的亲和纯化。此外，可使用cDNA文库的低严谨筛选，或使用利用靶向促滤泡素抑制素结构域的探针的简并PCR技术。当可利用更多基因组数据时，使用大量的序列分布图和分析程序进行相似性搜索，例如MotifSearch(Genetics Computer Group，Madison，WI)、ProfileSearch(GCG)和BLAST(NCBI)可用于发现包含与已知的促滤泡素抑制素结构域有显著同源性的新蛋白质。
本领域的技术人员将认识到GDF-8或包含至少一个促滤泡素抑制素结构域的蛋白质可包含其各自氨基酸序列的任何数量的保守变化而不改变它们的生物特性。这种保守的氨基酸改变是基于氨基酸侧链取代基的相对相似性的，例如，其疏水性、亲水性、电荷、大小等。对于本领域的技术人员来说，考虑上述多种特征的代表性的保守置换是公知的并且包括精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。此外，可使用包括至少一个促滤泡素抑制素结构域的蛋白质来产生包括至少一个促滤泡素抑制素结构域的功能性片段。预计这种片段可结合并抑制GDF-8。在本发明的实施方案中，包括至少一个促滤泡素抑制素结构域的蛋白质特异性地结合成熟的GDF-8或其片段，无论它是单体形式、活性的二聚体形式或GDF-8潜在复合物的复合形式，其亲和力在0.001-100nM或0.01-10nM或0.1-1nM之间。
核苷酸和蛋白质序列虽然不一定总是必需的，但如果需要，本领域的普通技术人员可以确定包括至少一个促滤泡素抑制素结构域的新蛋白质的氨基酸或核酸序列。例如，本发明提供如图6-9所示的GASP1和GASP2的氨基酸和核苷酸序列。
本发明也包括该核酸和氨基酸序列的变体、同系物和片段。例如，该核酸或氨基酸序列可包括与天然蛋白质的核酸或氨基酸序列至少70％-79％相同，或至少80％-89％相同，或至少90％-95％相同，或至少96％-100％相同的序列。本领域的技术人员将认识到结合GDF-8的区域可以容许比不参与结合的蛋白质的另外部分更少的序列变异。因此，该蛋白质的这些非结合区域可包含不显著改变该蛋白质结合特性的实质性变异。然而，本领域的技术人员也将认识到可产生许多变化以特异性地增加该蛋白质对于其目标物的亲和力。这种增加亲和力的改变一般通过在结合区域改变蛋白质并测试结合GDF-8的能力或该结合的强度而以经验方式确定。所有这类变化，无论其在结合区域的内部或外部都包括在本发明的范围内。
相对的序列相似性或同一性可使用序列分析软件包(SequenceAnalysis Software PackageTM)(版本10；Genetics Computer Group，Inc.，威斯康辛大学生物技术中心，Madison，WI)的″Best Fit″或″Gap″程序确定。″Gap″运用Needleman和Wunsch(Needleman和Wunsch，1970)的算法以发现最大化相配数目并最小化缺口数目的2个序列的序列对比。″BestFit″进行2个序列间相似性最好部分的最适序列对比。最适的序列对比是通过使用Smith和Waterman(Smith和Waterman，1981；Smith等人，1983)的局部同源性算法插入缺口以最大化相配数目而发现的。
如上所述的序列分析软件包包含许多用于鉴定本发明所公开的核苷酸和氨基酸序列的同系物的其他有用的序列分析工具。例如，″BLAST″程序(Altschul等人，1990)在特定的数据库(例如，NCBI维持的序列数据库)中搜索与查询序列(肽或核酸)相似的序列；″FastA″(Lipman和Pearson，1985；也参见Pearson和Lipman，1988；Pearson等人，1990)进行Pearson和Lipman搜索，用于在查询序列和一组相同类型(核酸或蛋白质)的序列之间搜索相似性；″TfastA″进行Pearson和Lipman搜索，用于在蛋白质查询序列和任何核苷酸序列组(它在进行比较前按总共6个阅读框翻译该核苷酸序列)之间搜索相似性；″FastX″进行考虑到移码的Pearson和Lipman搜索，用于在核苷酸查询序列和一组蛋白质序列之间搜索相似性。″TfastX″进行考虑到移码的Pearson和Lipman搜索，用于在蛋白质查询序列和任何核苷酸序列组之间搜索相似性(它在进行比较前翻译该核酸序列的两个链)。
修饰的蛋白质本发明包括包含至少一个促滤泡素抑制素结构域的蛋白质的片段。这种片段可能包括促滤泡素抑制素结构域的全部或部分。片段可包括在促滤泡素抑制素结构域和N-末端之间和/或在促滤泡素抑制素结构域和C-末端之间全部、部分序列或不包括该序列。
本领域的普通技术人员可以理解，蛋白质结构中的某些氨基酸可被其他氨基酸置换，而并不有害地影响该蛋白质活性，例如包含至少一个促滤泡素抑制素结构域的蛋白质的结合特性。因此发明者预期可在包含至少一个促滤泡素抑制素结构域的蛋白质的氨基酸序列、或编码该蛋白质的DNA序列中产生多种变化，而不明显地损失它们的生物用途或活性。这种改变可包括缺失、插入、截短、置换、融合、基序序列的改组(shuffing)等。
在产生这种改变中，可考虑氨基酸的亲水指数。亲水氨基酸指数在赋予蛋白质相互作用的生物功能中的重要性一般在本领域中是可理解的(Kyte和Doolittle(1982)J.Mol.Biol.，157105-132)。公认氨基酸相对的亲水特性对生成的蛋白质的二级结构有贡献，该二级结构又转过来限定该蛋白质与其他分子，例如酶、底物、受体、DNA、抗体、抗原等的相互作用。
每种氨基酸已经根据其疏水性和电荷特性被指定了亲水指数(Kyte和Doolittle，1982)；这些是异亮氨酸(+4.5)、缬氨酸(+4.2)、亮氨酸(+3.8)、苯丙氨酸(+2.8)、半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)、甲硫氨酸(+1.9)、丙氨酸(+1.8)、甘氨酸(-0.4)、苏氨酸(-0.7)、丝氨酸(-0.8)、色氨酸(-0.9)、酪氨酸(-1.3)、脯氨酸(-1.6)、组氨酸(-3.2)、谷氨酸(-3.5)、谷氨酰胺(-3.5)、天冬氨酸(-3.5)、天冬酰胺(-3.5)、赖氨酸(-3.9)和精氨酸(-4.5)。在产生这种改变中，置换的氨基酸的亲水指数可在±2内、±1内和±0.5内。
本领域中也可理解类似氨基酸的置换可根据亲水性有效产生。美国专利4,554,101说明蛋白质最大的局部平均亲水性取决于其邻近氨基酸的亲水性，与蛋白质的生物学性质有关。
如美国专利4,554,101中所详述的，下列亲水性的值已经被指定给氨基酸残基精氨酸(+3.0)、赖氨酸(+3.0)、天冬氨酸(+3.0±1)、谷氨酸(+3.0±1)、丝氨酸(+0.3)、天冬酰胺(+0.2)、谷氨酰胺(+0.2)、甘氨酸(0)、苏氨酸(-0.4)、脯氨酸(-0.5±1)、丙氨酸(-0.5)、组氨酸(-0.5)、半胱氨酸(-1.0)、甲硫氨酸(-1.3)、缬氨酸(-1.5)、亮氨酸(-1.8)、异亮氨酸(-1.8)、酪氨酸(-2.3)、苯丙氨酸(-2.5)和色氨酸(-3.4)。在产生这种改变中，置换的氨基酸的亲水值可在±2内、±1内和±0.5内。
修饰可能是保守的以使得蛋白质的结构或生物功能不受该变化的影响。这种保守的氨基酸修饰是基于氨基酸侧链取代基的相对相似性的，例如，它们的疏水性、亲水性、电荷、大小等。对于本领域的技术人员来说，考虑上述多种特征的代表性的保守置换是公知的并且包括精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。包含至少一个促滤泡素抑制素结构域的蛋白质的氨基酸序列可改变为具有任何数目的保守变化，只要该蛋白质对其靶抗原的结合不受有害影响。这种变化可导入包含至少一个促滤泡素抑制素结构域的蛋白质结合部分的内部或外部。例如，可以对导入蛋白质抗原结合部分内部的变化进行设计来增加蛋白质对其目标物的亲合性。
稳定化修饰稳定化修饰能够稳定蛋白质，增加蛋白质体外和/或体内的半衰期，增加蛋白质循环的半衰期和/或减少蛋白质的蛋白水解的降解作用。这种稳定化修饰包括但不限于融合蛋白质，糖基化位点的修饰和碳水化合物部分的修饰。稳定剂蛋白质可以是能增加修饰的GDF前肽的总稳定性的任何蛋白质。如本领域的普通技术人员所能认识到的，这种融合蛋白质可任选地在前肽部分和稳定化部分之间包括接头肽。本领域众所周知，制备融合蛋白质使得第二蛋白质与第一蛋白质在框内融合，因此所得到的翻译的蛋白质包含第一和第二蛋白质。例如，在本发明中，可制备融合蛋白质以使得包含至少一个促滤泡素抑制素结构域的蛋白质与第二蛋白质(例如，稳定剂蛋白质部分)融合。制备这种融合蛋白质以使得所得到的翻译蛋白质包含前肽部分和稳定剂部分。
包含至少一个促滤泡素抑制素结构域的蛋白质可以是糖基化的或与清蛋白或是非蛋白质类的聚合物相连的。例如，包含至少一个促滤泡素抑制素结构域的蛋白质可与一种或多种非蛋白质类的聚合物，例如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯，以在美国专利号4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192或4,179,337中阐明的方式相连。例如，将蛋白质通过共价连接到聚合物上来进行化学修饰以提高它们的循环半衰期。聚合物和使它们附着于肽的方法也在美国专利号4,766,106；4,179,337；4,495,285；和4,609,546中显示。
包含至少一个促滤泡素抑制素结构域的蛋白质可被聚乙二醇化。聚乙二醇化是通过将聚乙二醇(PEG)附着于蛋白质的方法以延长蛋白质在体内的半衰期。包含至少一个促滤泡素抑制素结构域的蛋白质的聚乙二醇化可减少最适抑制GDF-8所需的蛋白质给药的剂量或频率。该技术的评述在Bhadra等人(2002)Pharmazie，575-29和Harris等人(2001)Clin.Pharmacokinet.，40539-551中有提供。
包含至少一个促滤泡素抑制素结构域的蛋白质可与IgG分子的Fc区域连接。包含至少一个促滤泡素抑制素结构域的蛋白质可与IgG分子的Fc区域邻接融合，或通过接头肽附着于IgG分子的Fc区域。这种接头肽的使用在蛋白质生物化学领域中是公知的。该Fc区域可来源于例如IgG1或IgG4。
包含至少一个促滤泡素抑制素结构域的蛋白质可被修饰为具有改变的糖基化模式(即，与原始的或天然的糖基化模式不同)。如在此所使用的，″改变的″指缺失一种或多种碳水化合物部分，和/或将一种或多种糖基化位点添加到原始蛋白质中。
蛋白质的糖基化一般是N-连接的或O-连接的。N-连接是指碳水化合物部分附着到天冬酰胺残基的侧链上。其中X是除脯氨酸之外的任何氨基酸的三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸是碳水化合物部分酶促地附着于天冬酰胺侧链的识别序列。因此，在多肽中这些三肽序列中任何一个的存在产生潜在的糖基化位点。O-连接的糖基化是指N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖中的一种糖附着于羟基氨基酸，最通常为丝氨酸或苏氨酸，不过也可使用5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸。
向包含至少一个促滤泡素抑制素结构域的蛋白质加入糖基化位点是通过改变氨基酸序列以使得其包含一种或多种上述的三肽序列(用于N-连接的糖基化位点)而方便地实现的。该变化也可通过向原始蛋白质的序列加入或置换一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基(用于O-连接的糖基化位点)而产生。为了方便，蛋白质氨基酸序列可通过在DNA水平上的变化而改变。
另一种在蛋白质上增加碳水化合物部分的数量的方式是通过将糖苷化学偶联或酶促偶联于蛋白质的氨基酸残基。这些方法由于它们不需要在具有用于N-或O-连接糖基化的糖基化能力的宿主细胞中产生GDF肽的抑制剂因而是有利的。根据所使用的偶联方式，糖可附着于(a)精氨酸和组氨酸，(b)自由羧基，(c)例如半胱氨酸的自由巯基，(d)例如丝氨酸、苏氨酸或羟脯氨酸的自由羟基，(e)例如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的芳族残基，或(f)谷氨酰胺的酰胺基。这些方法在WO 87/05330和Aplin和Wriston(1981)CRC Crit.Rev.Biochem.，22259-306中有描述。
除去包含至少一个促滤泡素抑制素结构域的蛋白质上存在的任何碳水化合物部分可通过化学或酶促方式完成。化学的去糖基化需要将蛋白质暴露于三氟甲磺酸或等同的化合物。这种处理导致除连接糖(N-乙酰葡糖胺或N-乙酰半乳糖胺)之外的大部分或全部的糖被切除，同时剩下完整的氨基酸序列。
化学的去糖基化由Hakimuddin等人(1987)Arch.Biochem.Biophys.，25952；和Edge等人(1981)Anal.Biochem.，118131描述。GDF肽的抑制剂上碳水化合物部分的酶促切割可通过利用如Thotakura等人(1987)Meth.Enzymol.，138350描述的多种内切和外切糖苷酶获得。
包含至少一个促滤泡素抑制素结构域的蛋白质可与蛋白质清蛋白或清蛋白的衍生物相连。将蛋白质和多肽连接到清蛋白或清蛋白衍生物的方法是本领域公知的。参见，例如，美国专利号5,116,944。
药物组合物本发明提供包含包括至少一个促滤泡素抑制素结构域的蛋白质的组合物。这种组合物可适合于药物用途和对患者给药。该组合物一般包含包括至少一个促滤泡素抑制素结构域的一种或多种蛋白质和药物学上可接受的赋形剂。如在此所使用的，短语¨药物学上可接受的赋形剂¨包括与药物给药相适应的任何和所有的溶剂、分散介质、涂层、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。用于药物学上活性物质的这种介质和试剂的用途在本领域中是公知的。该组合物也可包含提供补充、附加或增加治疗功能的其他活性化合物。该药物组合物还可与给药说明书一起被包括在容器、包装或分液器中。
配制本发明的药物组合物以与其预定的给药途径相适应。完成给药的方法是本领域的普通技术人员公知的。给药可以是例如，静脉内的、肌内的或皮下的给药。
用于皮下应用的溶液或悬液一般包括一种或多种下列成分无菌的稀释剂，例如注射用水、盐水溶液、固定油类、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗菌剂，例如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，例如乙二胺四乙酸；缓冲液，例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及用于调节渗度的试剂，例如氯化钠或葡萄糖。pH可用酸或碱，例如盐酸或氢氧化钠调节。这种制剂可装入安瓿瓶、一次性的注射器或由玻璃或塑料制成的多次剂量小瓶中。
适合注射的药物组合物包括无菌的水溶液或分散液和用于临时配制无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉剂。对于静脉内给药，合适的载体包括生理盐水、抑菌的水、Cremophor ELTM(BASF，Parsippany，NJ)或磷酸盐缓冲的盐水(PBS)。在所有情况中，该组合物必须是无菌的并且应该是达到能够轻易注射程度的液体。它必须在制造和贮存的条件下是稳定的，并且必须在抗微生物，例如抗细菌和真菌的污染作用下保存。载体可以是溶剂或分散介质，包含例如，水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物。例如，适当的流动性可通过利用例如卵磷脂的包被，在分散液的情况下通过保持所需颗粒的大小并且通过使用表面活性剂而保持。防止微生物的作用可通过多种抗细菌和抗真菌剂获得，例如对羟基苯甲酸、氯代丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等。多数情况下，可在该组合物中包括等渗剂，例如糖、多元醇，例如甘露糖醇、山梨糖醇、氯化钠。可注射组合物的延长吸收可通过在该组合物中包括延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶而实现。
在一个实施方案中，将包含至少一个促滤泡素抑制素结构域的蛋白质用可保护该化合物不被机体快速消除的载体制备，这样的载体例如为控释制剂，包括植入物和微胶囊密封的递送系统。可使用生物可降解的、生物相容的聚合物，例如乙烯-乙酸乙烯基酯共聚物、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。制备这种制剂的方法对于本领域的技术人员是显而易见的。该物质还可从Alza有限公司和Nova药物公司从商业上获得。包含包括至少一个促滤泡素抑制素结构域的蛋白质的脂质体悬液也可以用作药物学上可接受的载体。这些可根据本领域技术人员公知的例如，如美国专利号4,522,811所描述的方法制备。
治疗有用的试剂，例如生长因子(例如，BMPs、TGF-β、FGF、IGF)、细胞因子(例如，白细胞介素和CDFs)、抗生素，和对所治疗的状况有效的任何其他治疗剂可任选地被包括在内，或与包含至少一个促滤泡素抑制素结构域的蛋白质同时或相继给药。
特别有利的是以便于给药和剂量一致性的剂量单位的形式配制组合物。如在此所使用的剂量单位形式是指对于治疗的受试者适合作为单一剂量的物理上非连续的单位；每种单位包含经计算的预先确定量的活性化合物以与所要求的药物载体产生相应的所需的治疗效果。本发明剂量单位形式的规格直接取决于活性化合物的独特特性和所获得的特定治疗效果，以及在化合物领域中这种活性化合物对于个体治疗所固有的局限性并受其支配。
治疗适应症包含至少一个促滤泡素抑制素结构域的蛋白质对预防、诊断、或治疗多种人或动物的医学病症有用。因此，本发明提供用于通过对受试者施用足够改善疾病症状的数量的，包括至少一个包含至少一个促滤泡素抑制素结构域的蛋白质的组合物治疗与肌细胞及组织相关的疾病以及病症的方法。这类病症包括肌营养不良，包括但不限于严重的或良性的X-连锁的肌营养不良、肢带肌营养不良、面肩胛肱骨营养不良、强直性肌营养不良、远端肌营养不良、进行性营养不良的眼肌麻痹、眼咽肌营养不良，杜兴肌营养不良和Fakuyama型先天性肌营养不良)；肌萎缩性侧索硬化(ALS)；肌内萎缩；器官萎缩；脆性；腕管综合征；充血梗阻性肺病；先天性肌病；先天性肌强直；家族性周期性麻痹；突发性肌红蛋白尿；重症肌无力；伊-朗综合征；继发性肌无力；去神经支配萎缩；突发性肌肉萎缩；以及肌肉贫乏症、恶病质和其他肌肉消耗综合征。
本发明还涉及肌肉组织的外伤性或慢性损伤。
除了提供用于肌肉疾病和病症的治疗外，本发明也提供用于预防或治疗代谢疾病或由异常的葡萄糖体内稳态产生的病症的方法。这种疾病或病症包括代谢疾病和病症(例如胰岛素依赖性(1型)糖尿病、非胰岛素依赖型(2型)糖尿病)、高血糖、减损的葡萄糖耐量、新陈代谢综合征(例如，综合征X)，和由外伤(如烧伤或氮失衡)诱导的胰岛素抗性，脂肪组织紊乱(例如，肥胖症)；或骨退化疾病(例如骨质疏松症，特别是老年人和/或绝经后妇女中的骨质疏松症；糖皮质激素-诱导的骨质疏松症；骨量减少；骨关节炎；和骨质疏松症相关的骨折)。更进一步的实例包括由于慢性糖皮质激素治疗、早发性生殖腺障碍、雄激素抑制、维生素D缺乏、继发性甲状旁腺功能亢进、营养缺乏和神经性厌食造成的低骨质量。
正常的葡萄糖体内稳态需要胰腺的β-细胞应答血液中葡萄糖水平的微小变化从而精细调节胰岛素分泌的协调结合。胰岛素的一个基本作用是刺激从血液中摄取葡萄糖到组织，特别是到肌肉和脂肪组织中。
因此，本发明提供通过对受试者施用足够改善症状的数量的，包括至少一种包含至少一个促滤泡素抑制素结构域的蛋白质的组合物来治疗糖尿病和相关病症，例如肥胖症或高血糖的方法。2型或非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)，特别地，其特征为三个(1)在外周组织，特别是骨骼肌和脂肪细胞中阻抗胰岛素作用于葡萄糖摄取，(2)减弱胰岛素抑制肝产生葡萄糖的作用，和(3)异常调节胰岛素分泌(DeFronzo(1997)Diabetes Rev.5177-269)。因此，患有2型糖尿病的受试者可根据本发明通过施用包括至少一个促滤泡素抑制素结构域的蛋白质而治疗，该蛋白质增加对胰岛素的灵敏度和细胞对葡萄糖的摄取。
类似地，以胰岛素机能障碍(例如，阻抗、失活或缺乏)和/或转运到细胞中的葡萄糖不足为特征的其他疾病和代谢病症也可根据本发明通过施用包含至少一个促滤泡素抑制素结构域的蛋白质而治疗，该蛋白质增加对胰岛素的灵敏度和细胞对葡萄糖的摄取。
使用蛋白质治疗的方法相对于不被相同蛋白质结合的GDF-8蛋白质，可使用包含至少一个促滤泡素抑制素结构域的蛋白质来抑制或减少与GDF-8蛋白质(无论是单体形式、二聚体的活性形式，或GDF-8潜在复合物的复合形式)相关的一种或多种活性。在实施方案中，当与包含至少一个促滤泡素抑制素结构域的蛋白质结合时，成熟的GDF-8蛋白质相对于不与具有促滤泡素抑制素结构域的蛋白质结合的成熟GDF-8蛋白质，其活性被抑制至少50％，或至少60，62，64，66，68，70，72，72，76，78，80，82，84，86，或88％，或至少90，91，92，93，或94％，或至少95％至100％。
包括包含至少一个促滤泡素抑制素结构域的蛋白质的药物制剂以治疗的有效量给药。如在此所使用的，″有效量″的蛋白质是足够减少GDF-8的活性以获得所需的生物学结果的剂量。所需的生物学结果可以是任何的治疗效益，包括增加肌肉质量、增加肌力、改善代谢、减少肥胖或改善葡萄糖的体内稳态。这种改善可通过多种方法测量，包括测量瘦体重和胖体重(例如双X-射线扫描分析)、肌力、血清脂类、血清瘦素(1eptin)、血清葡萄糖、糖化的血红蛋白、葡萄糖耐量和改善糖尿病的继发性并发症的方法。
一般，治疗的有效量可随受试者的年龄、状况和性别以及受试者的医学病症的严重程度而变化。剂量可由医生确定并根据需要调整以适合治疗观察的效果。施用包括至少一个促滤泡素抑制素结构域的至少一种蛋白质的适当剂量可以是在5mg-100mg，15mg-85mg，30mg-70mg，或40mg-60mg的范围内。蛋白质可以一个剂量给药，或以例如每日一次、每周一次以及每月一次的间隔给药。剂量时间表可根据蛋白质对GDF-8的亲合力、蛋白质的半衰期或患者病症的严重度调整。一般，组合物以大丸剂的剂量给药，以使包括至少一个促滤泡素抑制素结构域的蛋白质在给药后在最长的时间内的循环水平最大化。持续的灌输也可在大丸剂剂量后使用。
这种化合物的毒性和治疗效果可以通过细胞培养物或实验动物中的标准制药规程确定，例如，确定LD50(50％群体的致死剂量)和ED50(50％群体的治疗有效剂量)。毒性和治疗效果之间的剂量比是疗效指数并且它可以表示为比率LD50/ED50。可使用显示大的疗效指数的包括至少一个促滤泡素抑制素结构域的蛋白质。
可使用通过对细胞培养物的分析和动物研究获得的数据来评估用于人类的剂量范围。这种化合物的剂量可在包括ED50而毒性较少或无毒性的循环浓度的范围内。剂量可依赖于所使用的剂型和所使用的给药途径而在该范围内变化。对于本发明中使用的任何包括至少一个促滤泡素抑制素结构域的蛋白质，治疗有效剂量可从细胞培养分析开始估计。剂量可在动物模型中制定以获得如在细胞培养物中所确定的，包括IC50(即，达到症状的最大抑制的一半时测试蛋白质的浓度)的循环血浆的浓度范围。血浆中的水平可通过例如高效液相层析测量。任何特定剂量的效果可通过合适的生物测定监测。合适的生物测定的实例包括GDF-8蛋白/受体结合分析、肌酸激酶分析、基于脂肪细胞中葡萄糖摄取的分析和免疫学分析。
DNA给药的方法本发明也提供在体内产生包括至少一个促滤泡素抑制素结构域的蛋白质的基因治疗。这种治疗可通过将多核苷酸序列导入患有在此所列出的病症的细胞或组织而取得其治疗效果。
递送包括至少一个促滤泡素抑制素结构域的蛋白质的多核苷酸序列可使用例如嵌合病毒的重组表达载体或胶态分散系统获得。可使用目标脂质体进行多核苷酸序列的治疗性递送。可用于基因治疗的多种病毒载体包括腺病毒(adenovirus)、疱疹病毒(herpes virus)、牛痘(vaccinia)或例如反转录病毒(retrovirus)的RNA病毒。反转录病毒载体可以是鼠或鸟类反转录病毒的衍生物。其中可插入单个外源基因的反转录病毒载体的实例包括，但不限于莫洛尼鼠类白血病毒(Moloney murine leukemiavirus)(MoMuLV)、Harvey鼠类肉瘤病毒(Harrey murine sarcoma virus)(HaMuSV)、鼠类乳癌病毒(murinemammary tumor virus)(MuMTV)和劳斯肉瘤病毒(Rous sarcomavirus)(RSV)。许多附加的反转录病毒载体可整合入多基因中。所有这些载体可传递或整合选择标记的基因以使得转导细胞可被鉴定并产生。例如通过将令人感兴趣的GDF前肽多核苷酸序列与另一个编码特异的靶细胞上受体的配体的基因一起插入到病毒载体中，则该载体现在就是靶特异性的。
反转录病毒载体可通过附着例如糖、糖脂、或蛋白质而产生靶特异性。靶向可通过使用抗体而实现。本领域的技术人员将认识到可将特异性的多核苷酸序列插入反转录病毒基因组或附着于病毒包膜以使得包含包括至少一个促滤泡素抑制素结构域的蛋白质的多核苷酸的反转录病毒载体靶能够特异地递送。在一个实施方案中，载体靶向肌细胞或肌肉组织。
由于重组反转录病毒是有缺陷的，它们需要包含编码所有在LTR中调节序列的调控下的反向病毒结构基因的质粒的辅助细胞系。这些质粒丢失了启动识别用于衣壳化作用的RNA转录物的包装机制的核苷酸序列。缺失包装信号的辅助细胞系包括但不限于，例如PSI.2、PA317和PA12。这些细胞系因为没有包装基因组而产生空的病毒体。如果将反转录病毒载体引入这种其中包装信号是完整的，但是结构基因被其他令人感兴趣的基因替代的细胞，该载体可被包装并且产生载体病毒体。
备选地，其他组织培养细胞可通过常规的磷酸钙转染用编码反向病毒结构基因gag、pol ar env的质粒直接转染。随后用包含令人感兴趣的基因的载体质粒转染这些细胞。所得到的细胞释放反转录病毒载体到培养基中。
另一个包括至少一个促滤泡素抑制素结构域的蛋白质的多核苷酸的定向递送系统是胶态分散系统。胶态分散系统包括高分子复合物、纳胶囊、微球体、珠和基于脂类的系统，包括水包油乳剂、胶束、混合的胶束和脂质体。脂质体是体外和体内作为有用的递送载体的人工膜小泡。可将RNA、DNA和完整的病毒体包封在水分散体的内部并且以生物活性形式递送到细胞(参见，例如，Fraley等人(1981)TrendsBiochem.Sci.，677)。使用脂质体载体的有效基因转移的方法是本领域公知的(参见，例如，Mannino等人(1988)Biotechniques，6682)。脂质体的组合物通常是磷脂的组合，一般与类固醇，特别是胆固醇组合。也可使用其他磷脂或其他脂类。脂质体的物理性质取决于pH、离子强度和二价阳离子的存在。
在脂质体生产中有用的脂类的实例包括磷脂酰基化合物，例如磷脂酰甘油、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、鞘脂类、脑苷脂类和神经节苷脂。示例性的磷脂包括卵磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱和二硬脂酰磷脂酰胆碱。脂质体的定向也可基于例如，器官特异性、细胞特异性和细胞器特异性并且是本领域已知的。
有多种方法可用于递送表达包括至少一个促滤泡素抑制素结构域的蛋白质的细胞至一个位点以用于调节GDF-8应答。在本发明的一个实施方案中，表达促滤泡素抑制素蛋白质的细胞可通过直接的应用例如，将这种细胞的样品直接注射到组织损伤的位点而递送。这些细胞可被纯化。这种细胞可在部分阻碍其流动性的介质或基质中递送以使得其将细胞定位至创伤的位点。这种介质或基质可以是半固体的，例如糊剂或凝胶，包括胶状的聚合物。备选地，该介质或基质可以是固体的形式，使得细胞能够迁移入固体基质，并且将它们保持在其中同时使得细胞能够增殖的多孔质固体。
检测和分离GDF-8的方法可使用包括至少一个促滤泡素抑制素结构域的蛋白质在体内或体外检测GDF-8的存在或水平。通过使这些蛋白质的存在或水平与医学状况相关联，本领域的技术人员可诊断相关的医学状况。在此阐明了可通过包括至少一个促滤泡素抑制素结构域的蛋白质诊断的医学状况。
这种检测方法是本领域公知的并且包括ELISA、放射免疫测定、免疫印迹、western印迹、免疫荧光、免疫沉淀和其他可比较的技术。包括至少一个促滤泡素抑制素结构域的蛋白质可进一步存在于结合了一种或多种检测GDF-8的技术的诊断试剂盒中。这种试剂盒可包含其他成分、包装、用法说明或帮助检测蛋白质和使用该试剂盒的其他物质。
当试图将包括至少一个促滤泡素抑制素结构域的蛋白质用于诊断目的时，可按照需要，例如用配体基团(例如生物素)或可检测的标记基团(例如荧光基团、放射性同位素或酶)修饰它们。如果需要，可使用常规技术标记蛋白质。合适的标记包括荧光团、生色团、放射性原子、电子密集试剂、酶和具有特异性结合伴侣的配体。酶一般通过它们的活性检测。例如，辣根过氧化物酶一般通过其将3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)转化为蓝色色素的能力来检测，可用分光光度计计量而检测。其他合适的结合伴侣包括生物素和抗生物素蛋白或链霉抗生物素、IgG和A蛋白，以及本领域已知的许多受体-配体对。其他的变换和可能性对本领域的普通技术人员来说是显而易见的，并且在本发明的范围内被认为是等同的。
包括至少一个促滤泡素抑制素结构域的蛋白质或其片段也可用于在纯化过程中分离GDF-8。在一类方法中，蛋白质可以例如通过掺入柱或树脂而固定。使用该蛋白质结合GDF-8，并随后施用于导致该结合的GDF-8释放的状况。可使用这种方法商业性生产GDF-8。
下列实施例提供本发明的实施方案。本领域的普通技术人员将认识到可进行许多修饰和变异而不改变本发明的精神或范围。这种修饰和变异被认为包括在本发明的范围内。实施例不以任何方式限制本发明。可以理解，说明书和权利要求中所有经术语大约修饰的数量，例如作为剂量中的微小变化，被认为是在本发明的范围内的。
实施例实施例1JA16-结合珠的纯化N-羟基琥珀酰亚胺基活化的珠(4％琼脂糖珠，Sigma H-8635，St Louis MO)在MilliQ-H2O中洗涤，并且于4℃与抗GDF-8的JA16单克隆抗体(100mM的MOPS中3-4μg/μl，pH 7.5)以10mg JA16/ml的树脂终浓度的比率温育4小时。将珠用100mM pH 7.5的MOPS和磷酸缓冲盐水(PBS)充分洗涤(Ausubel等人，(1999)Current Protocolsin Molecular Biology，John Wiley和Sons)并且于4℃储存在PBS中直到使用。以相同的方式制备对照珠只是不含JA16抗体。
实施例2亲和纯化总共40μl包装的与JA16-结合的珠或对照的珠与15ml正常的Balb/C小鼠血清(Golden West Biologicals，Temecula CA)或30ml收集的正常人血清(ICN Biomedical，Aurora OH)于4℃温育3小时。将珠在～10ml冷的1％Triton X-100/PBS中洗涤两次，在～10ml冷的0.1％Triton X-100/PBS中洗涤两次，以及在～1ml冷的PBS中洗涤两次。将蛋白质分3个后续步骤从珠中洗提出来。首先，珠受到‘模拟洗提’处理，其中将100μl PBS加入珠中并且在4℃温育30分钟。收集上清液并且与30μl 4×LDS样品缓冲液(Invitrogen，Carlsbad CA)相结合。第二，珠受到‘肽洗提’，将100μl PBS中的1μg/μl竞争肽(序列DFGLDSDEHSTESRSSRYPLTVDFEAFGWD-COOH(SEQ IDNO12)加入珠中并且再于4℃温育30分钟。如上所述收集上清液。第三，将珠用‘SDS洗提’技术处理，其中将30μl的4×LDS缓冲液(Invitrogen)和100μl的PBS加入珠中并在转移上清液到新的试管前于80℃加热10分钟。
将每个洗提步骤中释放的蛋白质的银染凝胶显示在图1中。图1中显示的银染凝胶中大约为12和36kDa的2个蛋白质条带是从与JA16-结合的珠中特异性地洗提出来的，而不是从非结合的对照珠中洗提出来的。
实施例3质谱法将样品用NuPage 10×还原剂(Invitrogen)于80℃还原10分钟并且用110μM的碘乙酰胺于22℃在黑暗中烷基化30分钟。立即在10％的NuPage Bis-Tris凝胶上根据制造商的推荐(Invitrogen)将样品于MES缓冲系统中电泳并且使用无戊二醛的系统银染(Shevchenko等人，(1996)Anal.Chem.，68850-858)。切下条带并且在Abimed DigestPro(Langenfeld，德国)或ProGest Investigator(Genomics Solutions，Ann Arbor MI)中用测序级改良的胰蛋白酶(Promega，Madison WI)消化。通过蒸发减小消化样品的体积并且用1％的乙酸补充到～20μl的终体积。将样品(5-10μl)加载到包装在Picofrit针(New Objectives，Woburn MA)中的10cm×75μm内径的C18反相柱上。使用LCQ Deca或LCQ Deca XP(Finnigan，San Jose CA)质谱仪收集MS/MS数据并且使用Sequest程序(Finnigan)对NCBI的非冗余数据库进行搜索。除非另有说明，在本文中列出的所有肽序列相应于通过手工检验被认为是高质量的MS/MS谱，并且在Sequest记分系统中产生Xcorr记分＞2.5。
实施例4Western印迹将蛋白质转移到0.45μm的硝化纤维素膜(Invitrogen)上并且用封闭缓冲液(Tris-缓冲盐水(TBS10mM Tris-Cl，pH 7.5，150mMNaCl)中的5％脱脂奶粉)于4℃封闭过夜。然后在封闭缓冲液中用1∶1000稀释的第一抗体在室温下探测印迹1-3小时，用5×TBS洗涤，在封闭缓冲液中用辣根过氧化物酶结合的第二抗体在室温下探测1-3小时，并且如上述洗涤。通过使用West Pico Substrate(Pierce)放射自显影检测信号。
实施例5GDF-8的分离使用上述实施例所描述方法的实验导致GDF-8的分离。因为还原形式的GDF-8是12kDa，我们推测图1中显示的银染凝胶上的较低条带的蛋白质是成熟的GDF-8。为了证实该假设，我们切下该条带，用胰蛋白酶消化，并且通过LC-MS/MS获得所得到肽的MS/MS谱。对应于6个胰蛋白酶肽的MS/MS谱证实成熟的GDF-8从凝胶的这个区域中分离，正如图2A和表1所显示的。
表1列出了在来源于小鼠和人血清的JA16免疫沉淀中发现的GDF-8(SEQ ID NO13-20)、GDF-8前肽(SEQ ID NO21-27)、FLRG(SEQ ID NO28-30)，和GASP1(SEQ ID NO31-35)的肽。在蛋白质序列中恰好在每种肽前面的氨基酸显示在括号中，并且列出了肽的电荷状态(z)和Sequest程序的相关系数(Xcorr，置信度量度)。表中的序列表号码只是指分离的肽和它们的序列。在括号中的所述的前面的氨基酸不包括在肽内，只是提供参考。所有的谱都经过手工检验确认。
有趣地是，western印迹也包含相当于未加工的全长GDF-8(43kDa)的条带，这意味着该分子的一些部分未受到蛋白水解加工而分泌到血清中(图2B)。通过质谱法证实了未加工的GDF-8的存在(数据未显示)。因此，亲和纯化方法能有效地从正常小鼠血清中分离GDF-8。
尽管JA16抗体识别GDF-8和高度相关的蛋白质BMP/GDF-11，但我们通过质谱法注意到在我们的亲和纯化样品中不存在BMP-11肽。
表1在JA16免疫沉淀中鉴定的肽
M*＝氧化的甲硫氨酸
实施例6与GDF-8结合的蛋白质的分离一旦证实亲和纯化技术可从正常小鼠血清成功分离GDF-8，我们在自然条件下对结合GDF-8的蛋白质进行了鉴定。图1中显示的银染凝胶上的36kDa条带如上所述进行分析。质谱法鉴定在特异于JA16免疫纯化样品的凝胶的该区域中的2种蛋白质。这些确定是GDF-8前肽和促滤泡素抑制素样相关基因(FLRG)。从这些蛋白质的每一个鉴定的肽显示在表1中(SEQ ID NO13-27)。从GDF-8前肽中发现的6个独特肽的高质量的MS/MS谱、从FLRG中发现的3个独特的肽、代表性的肽显示在图3A和3C中。此外，这两种蛋白质的存在通过利用分别特异于GDF-8前肽和FLRG的多克隆抗体的western印迹得到证实(图3B和3D)。因此，循环的GDF-8看来似乎在体内结合GDF-8前肽和FLRG。
实施例7与GDF-8结合的新蛋白质的分离为了表征体内循环的GDF-8复合物的主要成分，从野生型小鼠血清中通过用与琼脂糖结合的抗GDF-8单克隆抗体JA16亲和纯化分离天然的GDF-8及其缔合蛋白质。结合JA16的蛋白质随后受到单独的PBS缓冲液(模拟洗提)、与GDF-8竞争结合JA16的肽以及SDS去污剂的洗提步骤。浓缩这些样品，在一维的SDS-PAGE凝胶上电泳，并且通过银染显象(图4)。JA16纯化的样品独有的2个条带是可见的--12kDa的条带被鉴定为GDF-8，而36kDa的条带包含GDF-8前肽和FLRG。
为了确定是否可以在体内鉴定结合GDF-8的其他蛋白质，我们将纯化扩大了大约5倍并且使用质谱法搜索存在于JA16免疫复合物中，但不存在于阴性对照中的蛋白质。为了达到这个目的，我们切下银染凝胶上相应于分子量为10-200kDa的区域成为13个凝胶切片，如图4所示。这些切片的每一个都经受凝胶中胰蛋白酶的消化并进行LC-MS/MS。将所得的MS/MS谱与已知蛋白质的非冗余NCBI数据库比较，未显示任何特异于JA16免疫沉淀的另外的蛋白质，尽管以前所描述的蛋白质(成熟的GDF-8、GDF-8前肽、未加工的GDF-8和FLRG)都在这些样品中鉴定出来(图4)。在JA16免疫复合物和阴性对照样品中都出现的背景蛋白质包括大量的血清蛋白，例如清蛋白、免疫球蛋白和补体蛋白质。没有证据显示在JA16样品中存在其他TGF-β超家族的成员，包括高度相关的蛋白质BMP--11/GDF-11。因此，在这些实验中JA16抗体特异地纯化GDF-8。
有趣地是，我们发现在我们的GDF-8免疫复合物中不存在促滤泡素抑制素，尽管JA16能够在体外免疫沉淀GDF-8/促滤泡素抑制素复合物(数据未显示)。已经显示促滤泡素抑制素通过拮抗GDF-8与ActRIIB受体的缔合而抑制GDF-8活性(Lee和McPherron(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，989306-9311)。我们的结果表明促滤泡素抑制素在正常情况下的循环GDF-8复合物的活性调节中不发挥主要作用。
既然通过MS/MS方法鉴定蛋白质依赖于所搜索的数据库的内容量，我们进一步通过将收集自13个样品的MS/MS谱与来自Celera小鼠基因组序列的预测的蛋白质数据库比较来分析来自图4的数据。这些分析鉴定特异于JA16-纯化样品的附加蛋白质，并因此被称为GDF-缔合的血清蛋白1(GASP1)。由于这些蛋白质的初始鉴定，这些序列已经通过公共基因组测序工作以登录号gi|20914039加到NCBI的nr数据库中。
根据高质量MS/MS谱(表1(SEQ ID NO31-35)；图5A和B)将相应于GASP1序列的5个肽鉴定出来。在条带3中发现相应于GASP1肽的谱，其中包含70-80kDa的蛋白质。然而，相应于该蛋白质的特异条带是不可见的，大概由于在该区域有大量的背景免疫球蛋白和清蛋白(参见图4)。高于2.3的Sequest Xcorr记分一般认为对于2+离子是显著的。偶然地，我们实验中鉴定的一个肽(序列＝ECETDQECETYEK(SEQ ID NO31))跨越了编码该蛋白质的2个外显子之间的接合处，在这种情况下证实了Celera基因预测算法的准确度。
在GASP1的实际克隆前对GASP1转录本和蛋白质的序列进行预测(图6)。预测GASP1是571个氨基酸的蛋白质，预计的分子量为63kDa。它在其N-末端具有推定的信号序列/切割位点并且在氨基酸314和514处有2个可能的N-糖基化位点。通过Pfam和BLAST(根据Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.，215403-410；Bateman等人(2002)Nucleic Acids Res.，30276-280)对GASP1蛋白质序列的分析显示，GASP1包含许多保守的结构域，包括WAP结构域、促滤泡素抑制素/Kazal结构域、免疫球蛋白结构域、2个串联的Kunitz结构域和netrin结构域(图14A)。最初在乳清酸性蛋白中鉴定的WAP结构域包含形成4个二硫键核心的8个半胱氨酸，并且经常出现在具有抗蛋白酶活性的蛋白质中(Hennighausen和Sippel(1982)NucleicAcids Res.，102677-2684；Seemuller等人(1986)FEBS Lett.，19943-48)。相信促滤泡素抑制素结构域介导GDF-8和GASP1之间的相互作用。促滤泡素抑制素结构域的C-末端包含与Kazal丝氨酸蛋白酶抑制剂结构域的相似性。就GASP1来说，该区域是比在促滤泡素抑制素或FLRG中与Kazal结构域更加紧密相关的，提示该区域可能具有附加的蛋白酶抑制剂的功能。最初在牛胰腺胰蛋白酶抑制剂中鉴定的Kunitz结构域，也抑制丝氨酸蛋白酶，因此确定GASP1可能在这类蛋白质的调节中发挥作用。此外，netrin结构域已涉及金属蛋白酶的抑制(Banyai和Patthy，1999；Mott等人，2000)。因此，根据这些保守区域的存在，GASP1可能抑制蛋白酶的活性，或许调节GDF-8的加工或潜在的GDF-8复合物的活化。
针对小鼠Celera转录本数据库的BLAST搜索显示与GASP1具有＞50％同一性的蛋白质，在此称为GASP2。GASP2包含与GASP1相同的结构域结构，表明这些蛋白质定义多价蛋白酶抑制剂的2个成员的家族(图14B)。有趣地是，在我们的JA16纯化样品中只发现相应于GASP1而不是GASP2的肽。该结果表明GASP1和GASP2可能具有不同的生物学特异性。GASP1和GASP2在人类中都是保守的(与小鼠有＞90％的同一性)。人类GASP1的序列现在在NCBI的nr数据库的登录号gi|18652308下是可得到的。虽然GDF-8在人类血清中的浓度与在小鼠血清中所发现的相比是相当低的(Hill等人(2002)J.Biol.Chem.，27740735-40741)，但蛋白质质谱分析的灵敏度使得我们能够鉴定相应于来自人类血清JA16免疫沉淀的人GASP1的同系物的3种肽(表1)。在相应的阴性对照中未发现这些肽。此外，在这些实验中也没有存在人类GASP2的证明。因此，GASP1和GDF-8之间的相互作用在小鼠和人之间是保守的。
GDF-8几乎专门在骨骼肌中产生。为了确定GASP1 mRNA的组织分布，从由多种小鼠组织和分阶段的胚胎中产生的第一链cDNA扩增GASP1的551bp片段(图10)。从标准化的小鼠第一链cDNA组(Clontech，Palo Alto CA)利用Advantage cDNA PCR试剂盒(Clontech)根据制造商的推荐对小鼠GASP1片段扩增(正向引物5′TTGGCCACTGCCACCACAATCTCAACCACTT 3′(SEQ IDNO46)；反向引物5′TCTCAGCATGGCCATGCCGCCGTCGA 3′(SEQ ID NO47))。GASP1看来得到了相当广泛地表达，在骨骼肌和心脏中得到了特别高的表达。也在脑、肺和睾丸中见到显著的表达。相反，肝和肾相对低水平地表达GASP1 mRNA。在发育中，GASP1mRNA的水平保持相当恒定，或许在小鼠胚胎发育的第7天和第11天之间有轻微的增加。
实施例8人类和小鼠血清中的GDF-8在人类血清中GDF-8的浓度比起在小鼠血清中发现的浓度是相当低的。既然GDF-8具有作为治疗目标的潜能，所以目标是确定人类中循环的GDF-8复合物的组成。这种知识将决定小鼠模型的有效性和有可能鉴定备选的治疗目标。因此，基于JA16的GDF-8的亲和纯化利用人类血清重复进行。由于与小鼠相比，人类血清中的GDF-8水平较低，没有见到相应于成熟GDF-8和GDF-8前肽/FLRG的条带(图11A)。然而，使用识别GDF-8成熟区域的多克隆抗体的western印迹显示，在JA16-纯化的样品中存在成熟的和未加工的GDF-8(图11B)。
我们利用质谱法的高灵敏度鉴定与成熟的GDF8共同纯化的蛋白质。将相应于从阴性对照和JA16结合珠的样品洗提的肽的泳道切割成16个片段。这些凝胶切片受到凝胶中胰蛋白酶的消化，进行纳流LC-MS/MS以及如前所述用Sequest分析。
有趣地是，只在JA16样品而非阴性对照中特异性地鉴定的唯一蛋白质是成熟的GDF-8、GDF-前肽、人FLRG和人的GASP1同系物。从这些蛋白质的每一个中发现的肽列在表1中(SEQ ID NO36-45)并且其代表性的MS/MS谱显示在图12中。因此看来活体内的GDF-8复合物在小鼠和人之间是保守的。
实施例9小鼠GASP1的克隆和表征在鉴定预测的GASP1序列后，目标是确定小鼠GASP1的实际序列。根据Celera预测的序列，从小鼠心脏的QUICKCLONE cDNA(Clontech)通过使用PfuTurbo聚合酶(Stratagene)PCR对GASP1编码序列进行扩增，其中使用下列引物(fp5′CACCATGTGTGCCCCAGGGTATCATCGGTTCTGG3，(SEQ IDNO50)；rp5′TTGCAAGCCCAGGAAGTCCTTGAGGAC3′(SEQID NO51))。该反应的PCR产物在1％的琼脂糖凝胶上电泳，走成由大约1700个碱基对组成的单个主要条带。随后根据制造商的推荐将扩增的DNA克隆到pcDNA3.1D/V5-His-TOPO载体(Invitrogen)的TOPO位点使其包含框内的C-末端V5-His标记。在两个链上都进行全长的cDNA插入物的测序。小鼠GASP1克隆的核苷酸序列显示在图13中。该克隆除在摇摆密码子的一些不改变预测的氨基酸序列上发生碱基置换外(即，288CG；294GA；615GA；738AG；768CT；1407AG；1419AG；以及1584CG，其中在标明位置的第一个碱基是由Celera报道的，而第二个碱基是对克隆进行测序获得的；参见图6A和B)，与预测的Celera序列相匹配。
为了确定GASP1蛋白质的N-末端加工，我们用编码小鼠GASP1的哺乳动物表达载体转染COS1细胞，该GASP1与C-末端V5-His(GASP1-VS-His)标记一起克隆。48小时后收获无血清的条件培养基并且通过使用抗V5多克隆抗体(Sigma)的western印迹分析进行检测。更具体地说，用GASP1-V5-His/pcDNA3.1D-V5-His-TOPO或空载体，利用FuGENE6试剂(Roche)在无血清的Dulbecco′s改良的Eagle′s培养基中转染COS1细胞48小时后收集条件培养基。
看到在大约80kDa处电泳的单一条带，证实GASP1被分泌到条件培养基中(数据未显示)。让大约10ml的该条件培养基通过His-亲和柱并进一步通过反相层析纯化。这个纯化方案在考马斯染色的SDS-PAGE凝胶上产生了预期大小的全长GASP1的条带。该条带的Edman测序确定N-末端序列为L-P-P-I-R-Y-S-H-A-G-I(SEQ ID NO52)。因此，GASP1的氨基酸1-29构成了在加工和分泌期间被除去的信号序列。
实施例10重组生产的GASP1与GDF-8前肽和成熟的GDF-8的结合下一步，确定重组生产的GASP1具有与分离自小鼠血清的GASP1相同的结合GDF-8的模式。为了免疫沉淀重组的蛋白质，将来自载体或GASP1转染细胞的400μl条件培养基与1.2μg重组纯化的GDF-8和/或GDF-8前肽蛋白质混合(Thies等人，2001)。将JA16(10μl包装体积)或抗V5(30μl)结合的琼脂糖珠与补充的条件培养基在4℃温育2小时，并且在含1％Triton的冷的磷酸缓冲盐水(PBS)中洗涤两次，以及在PBS中洗涤两次。将珠重悬在含DTT的50μl 1×LDS缓冲液中。如前所述进行western印迹(Hill等人，2002)。
为了证实并进一步表征GDF-8和GASP1之间的相互作用，我们将纯化的重组GDF-8和纯化的重组GDF-8前肽与来自用对照载体或GASP1-V5-His转染的COS1细胞的条件培养基温育。随后我们用JA16-结合的琼脂糖珠免疫沉淀GDF-8并且利用western印迹寻找GASP1和GDF-8前肽的共纯化物(图15A)。GASP1(泳道3)和GDF-8前肽(泳道1)与GDF-8的共免疫沉淀，证明GDF-8可与这两种蛋白质相互作用。在JA16免疫沉淀中，当缺少GDF-8时既未检测到GASP1也未检测到前肽(泳道4)，消除了这些实验中非特异结合的可能性。当存在所有3种蛋白质时，GASP1和GDF-8前肽都随GDF-8被一起洗脱下来，提示有可能这些蛋白质可以形成三元复合物(泳道5)。然而，这个实验没有消除GASP1和前肽与分离的GDF-8分子上的相同表位结合的可能性。
为了进一步证实GASP1和GDF-8之间的相互作用，我们通过从补充有GDF-8和/或GDF-8前肽的重组蛋白质的条件培养基中洗脱GASP1而进行反向免疫沉淀。为了达到这个目的，我们用与琼脂糖缀合的靶向GASP1上C-末端V5-His标记的V5表位的单克隆抗体。不出所料，GDF-8与GASP1共免疫沉淀(图15B，泳道3和5)，进一步证实在这些蛋白质之间存在直接的相互作用。令人惊讶的是，即使在不存在GDF-8(泳道4)的情况下，GDF-8前肽也与GASP1共同纯化，提示GDF-8前肽可直接与GASP1结合。因此，GASP1独立地结合GDF-8和GDF-8前肽二者。这与FLRG-另一个专门结合成熟的GDF-8的促滤泡素抑制素-结构域蛋白质相反(Hill等人(2002)J.Biol.Chem.，27740735-40741)。与当单独加入前肽时相比，同时加入GDF-8和前肽一致显示较少的前肽与GASP1结合。这个观察提示GASP1也许不与GDF-8的小的潜在复合物结合。
实施例11GASP1-介导的对GDF-8和BMP-11活性的抑制，但不对活化素或TGF-β1的活性产生抑制将荧光素酶报道构建体，pGL3-(CAGA)12(SEQ ID NO53)(Dennler等人(1998)EMBO J.，173091-3100)瞬时转染到A204或RD横纹肌肉瘤细胞中。将来自载体或GASP1转染的细胞的条件培养基的稀释物与10ng/ml GDF-8、10ng/ml BMP-11、10ng/ml rh活化素A(R&D Systems)或0.5ng/ml rh TGF-β1(R&D Systems)在37℃温育30分钟。荧光素酶活性根据Thies等人(2001)Growth Factors，18251-259和Zimmers等人(2002)Science，2961486-1488进行测量。在这个分析中，A204细胞应答GDF-8、BMP-11和活化素，但并不很好地应答TGF-β1。RD细胞应答GDF-8和TGF-β1。因此，我们使用A204细胞检测GASP1抑制GDF-8、BMP-11和活化素的能力，并使用RD细胞监测TGF-β和GDF-8的活性。GDF-8的结果在A204细胞中显示，但与RD细胞中的相似。对于每个实验，分别产生了测量经这些生长因子的每一种诱导的荧光素酶活性的浓度依赖性标准曲线(数据未显示)。所使用的生长因子的浓度落在该曲线的线性区域内，使得浓度的微小变化导致荧光素酶活性的可测量变化。
2种促滤泡素抑制素-结构域蛋白质，促滤泡素抑制素和FLRG在(CAGA)12(SEQ ID NO53)荧光素酶转录报道分析中抑制GDF-8活性，但也抑制相关蛋白质活化素和BMP-11的生物活性。也在(CAGA)12(SEQ ID NO53)报道分析中测试了GASP1抑制GDF-8、BMP-11、活化素和TGF-β1活性的能力。
将来自用V5-His标记的GASP1或对照载体转染的COS细胞的条件培养基的多种稀释物与纯化的重组GDF-8(10ng/ml)、BMP-11(10ng/ml)、活化素(10ng/ml)或TGF-β1(0.5ng/ml)温育，并且分析在表达(CAGA)12(SEQ ID NO53)报道构建体的横纹肌肉瘤细胞中的生长因子活性。GASP1以浓度依赖的方式有效地抑制GDF-8的活性(图16A)。正如所料，在这个分析中，GASP1同样抑制BMP-11的活性(图16B)，因为成熟的GDF-8和BMP-11是高度保守的并且只相差11个氨基酸。令人惊讶的是，GASP1不抑制活化素或TGF-β1的活性(图16C和D)，表明有极高水平的特异性，这是不能经促滤泡素抑制素本身证明的。因此，GASP1在其对GDF-8和BMP-11的抑制中显示特异性。
GASP1对GDF-8的亲和性通过在报道基因分析中确定抑制GDF-8的IC50而被评估。如上所述，GASP1-V5-His蛋白质是在钴亲和柱上的条件培养基纯化并进行洗提。进一步通过在PBS中利用BioSepS3000柱(Phenomenex)大小排阻层析纯化包含GASP1的级分。如图17所示，GASP1以约3nM的IC50抑制GDF-8。
实施例12肌肉病症的治疗可根据表2给患有与GDF-8功能相关的疾病或病症的患者施用GASP1。患者以一定时间或间隔摄取该组合物，例如每日一次，并且他们的疾病或病症的症状得到改善。例如，与肌肉的病症相关的症状得到改善，如通过测量肌肉质量、肌肉活性和/或肌张力所示。由此可见，本发明的组合物可用于治疗与GDF-8功能相关的疾病或病症，例如肌肉病症。
表2GASP1的给药
本申请中自始至终引用的所有参考文献、专利和公开的专利申请的全部内容在此引入作为参考。给出上述的发明详述只为了例证说明的目的。可对如上所述的实施方案进行各种各样的变化和修饰。因此应该理解下列权利要求书，包括所有的等同物是用来限定本发明的范围的。
序列表<110>HILL，JENNIFER J.
WOLFMAN，NEIL M.
<120>包含促滤泡素抑制素结构域的蛋白质<130>08702.0014-00<140>
<141>
<150>60/357,846<151>2002-02-21<150>60/434,645<151>2002-12-20<160>53<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1716<212>DNA<213>小鼠<400>1atgtgtgccc cagggtatca tcggttctgg tttcactggg ggctgctgtt gctgctgctc 60ctcgaggctc cccttcgagg cctagcactg ccacccatcc gatactccca tgcgggcatc 120tgccccaacg acatgaaccc caacctctgg gtggatgccc agagcacctg caagcgagag 180tgtgaaacag accaggaatg tgagacctat gagaaatgct gccccaatgt gtgtgggacc 240aagagctgtg tggcagcccg ctacatggat gtgaaaggga agaagggccc tgtgggcatg 300cccaaggagg ccacatgtga ccatttcatg tgcctgcagc agggctctga gtgtgacatc 360tgggacggcc agcccgtgtg taagtgcaaa gatcgctgtg agaaggagcc cagcttcacc 420tgtgcctctg atggccttac ctactacaac cgttgcttca tggacgccga agcctgctcc 480aagggcatca cactgtctgt ggtcacctgt cgttatcact tcacctggcc taacaccagc 540cctccaccgc ctgagaccac ggtgcatccc accaccgcct ctccggagac tctcgggctg 600gacatggcag ccccggccct gctcaaccac cctgtccatc agtcagtcac cgtgggtgag 660actgtgagtt tcctctgtga cgtggtaggc cggcctcggc cagagctcac ttgggagaaa 720cagctggagg accgagaaaa tgttgtcatg aggcccaacc acgtgcgcgg taatgtggtg 780gtcactaaca ttgcccagct ggtcatctac aacgtccagc cccaggatgc tggcatatac 840acctgtacag ctcgaaatgt cgctggtgtc ctgagggctg acttcccgtt gtcggtggtc 900aggggtggtc aggccagggc cacttcagag agcagtctca atggcacagc ttttccagca 960
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<221>经过修饰的碱基<222>(732)<223>a，t，c or g
<400>4atgaatccca acctctgggt ggacgcacag agcacctgca ggcgggagtg tgagacggac 60caggagtgtg agatggacca ggtgagtggg atccagaagc cacagtgtga ggcagaccag 120gtgaatgggg tccagaagcc gcaatgtgag atggaccaga agtgggagtg tgaggttgac 180caggtgagtg gggtccagaa gccggtgtgt gaggcggacc aggtgagtgg ggtccagaag 240ccacagtgtg agatggacca ggtgagtggg atccagaagc tggagtgtga ggcggaccag 300aagtgggagt atgaggtgga ccaggtgagt ggggtccaga agccacagtg tgagatggac 360caggtgagtg ggatccagaa gctggagtgt gaggcggacc aggagtgtga gacctatgag 420aagtgctgcc ccaacgtatg tgggaccaag agctgcgtgg cggcccgcta catggacgtg 480aaagggaaga agggcccagt gggcatgccc aaggaggcca catgtgacca cttcatgtgt 540ctgcagcagg gctctgagtg tgacatctgg gatggccagc ccgtgtgtaa gtgcaaagac 600cgctgtgaga aggagcccag ctttacctgc gcctcggacg gcctcaccta ctataaccgc 660tgctacatgg atgccgaggc ctgctccaaa ggcatcacac tggccgttgt aacctgccgc 720tatcacttca cntggcccaa caccagcccc ccaccacctg agaccaccat gcaccccacc 780acagcctccc cagagacccc tgagctggac atggcggccc ctgcgctgct caacaaccct 840gtgcaccagt cggtcaccat gggtgagaca gtgagcttcc tctgtgatgt ggtgggccgg 900ccccggcctg agatcacctg ggagaagcag ttggaggatc gggagaatgt ggtcatgcgg 960cccaaccatg tgcgtggcaa cgtggtggtc accaacattg cccagctggt catctataac 1020gcccagctgc aggatgctgg gatctacacc tgcacggccc ggaacgtggc tggggtcctg 1080agggctgatt tcccgctgtc ggtggtcagg ggtcatcagg ctgcagccac ctcagagagc 1140agccccaatg gcacggcttt cccggcggcc gagtgcctga agcccccaga cagtgaggac 1200tgtggcgaag agcagacccg ctggcacttc gatgcccagg ccaacaactg cctgaccttc 1260accttcggcc actgccaccg taacctcaac cactttgaga cctatgaggc ctgcatgctg 1320gcctgcatga gcgggccgct ggccgcgtgc agcctgcccg ccctgcaggg gccctgcaaa 1380gcctacgcgc ctcgctgggc ttacaacagc cagacgggcc agtgccagtc ctttgtctat 1440ggtggctgcg agggcaatgg caacaacttt gagagccgtg aggcctgtga ggagtcgtgc 1500cccttcccca gggggaacca gcgctgtcgg gcctgcaagc ctcggcagaa gctcgttacc 1560agcttctgtc gcagcgactt tgtcatcctg ggccgagtct ctgagctgac cgaggagcct 1620gactcgggcc gcgccctggt gactgtggat gaggtcctaa aggatgagaa aatgggcctc 1680aagttcctgg gccaggagcc attggaggtc actctgcttc acgtggactg ggcatgcccc 1740tgccccaacg tgaccgtgag cgagatgccg ctcatcatca tgggggaggt ggacggcggc 1800atggccatgc tgcgccccga tagctttgtg ggcgcatcga gtgcccgccg ggtcaggaag 1860cttcgtgagg tcatgcacaa gaagacctgt gacgtcctca aggagtttct tggcttgcac 1920tga 1923<210>5<211>640<212>PRT<213>人<400>5Met Asn Pro Asn Leu Trp Val Asp Ala Gln Ser Thr Cys Arg Arg Glu
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65 70 75 80Asn Val Cys Gly Thr Lys Ser Cys Val Ala Ala Arg Tyr Met Asp Val85 90 95Lys Gly Lys Lys Gly Pro Val Gly Met Pro Lys Glu Ala Thr Cys Asp100 105 110His Phe Met Cys Leu Gln Gln Gly Ser Glu Cys Asp Ile Trp Asp Gly115 120 125Gln Pro Val Cys Lys Cys Lys Asp Arg Cys Glu Lys Glu Pro Ser Phe130 135 140Thr Cys Ala Ser Asp Gly Leu Thr Tyr Tyr Asn Arg Cys Tyr Met Asp145 150 155 160Ala Glu Ala Cys Ser Lys Gly Ile Thr Leu Ala Val Val Thr Cys Arg165 170 175Tyr His Phe Thr Trp Pro Asn Thr Ser Pro Pro Pro Pro Glu Thr Thr180 185 190Met His Pro Thr Thr Ala Ser Pro Glu Thr Pro Glu Leu Asp Met Ala195 200 205Ala Pro Ala Leu Leu Asn Asn Pro Val His Gln Ser Val Thr Met Gly210 215 220Glu Thr Val Ser Phe Leu Cys Asp Val Val Gly Arg Pro Arg Pro Glu225 230 235 240Ile Thr Trp Glu Lys Gln Leu Glu Asp Arg Glu Asn Val Val Met Arg245 250 255Pro Asn His Val Arg Gly Asn Val Val Val Thr Asn Ile Ala Gln Leu260 265 270Val Ile Tyr Asn Ala Gln Leu Gln Asp Ala Gly Ile Tyr Thr Cys Thr275 280 285Ala Arg Asn Val Ala Gly Val Leu Arg Ala Asp Phe Pro Leu Ser Val290 295 300
Val Arg Gly His Gln Ala Ala Ala Thr Ser Glu Ser Ser Pro Asn Gly305 310 315 320Thr Ala Phe Pro Ala Ala Glu Cys Leu Lys Pro Pro Asp Ser Glu Asp325 330 335Cys Gly Glu Glu Gln Thr Arg Trp His Phe Asp Ala Gln Ala Asn Asn340 345 350Cys Leu Thr Phe Thr Phe Gly His Cys His Arg Asn Leu Asn His Phe355 360 365Glu Thr Tyr Glu Ala Cys Met Leu Ala Cys Met Ser Gly Pro Leu Ala370 375 380Ala Cys Ser Leu Pro Ala Leu Gln Gly Pro Cys Lys Ala Tyr Ala Pro385 390 395 400Arg Trp Ala Tyr Asn Ser Gln Thr Gly Gln Cys Gln Ser Phe Val Tyr405 410 415Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gly Asn Asn Phe Glu Ser Arg Glu Ala Cys420 425 430Glu Glu Ser Cys Pro Phe Pro Arg Gly Asn Gln Arg Cys Arg Ala Cys435 440 445Lys Pro Arg Gln Lys Leu Val Thr Ser Phe Cys Arg Ser Asp Phe Val450 455 460Ile Leu Gly Arg Val Ser Glu Leu Thr Glu Glu Pro Asp Ser Gly Arg465 470 475 480Ala Leu Val Thr Val Asp Glu Val Leu Lys Asp Glu Lys Met Gly Leu485 490 495Lys Phe Leu Gly Gln Glu Pro Leu Glu Val Thr Leu Leu His Val Asp500 505 510Trp Ala Cys Pro Cys Pro Asn Val Thr Val Ser Glu Met Pro Leu Ile515 520 525Ile Met Gly Glu Val Asp Gly Gly Met Ala Met Leu Arg Pro Asp Ser530 535 540
Phe Val Gly Ala Ser Ser Ala Arg Arg Val Arg Lys Leu Arg Glu Val545 550 555 560Met His Lys Lys Thr Cys Asp Val Leu Lys Glu Phe Leu Gly Leu His565 570 575<210>8<211>1659<212>DNA<213>小鼠<400>8atgcctgccc cacagccatt cctgcctctg ctctttgtct tcgtgctcat ccatctgacc 60tcggagacca acctgctgcc agatcccgga agccatcctg gcatgtgccc caacgagctc 120agcccccacc tgtgggtcga cgcccagagc acctgtgagc gtgagtgtac cggggaccag 180gactgtgcgg catccgagaa gtgctgcacc aatgtgtgtg ggctgcagag ctgcgtggct 240gcccgctttc ccagtggtgg cccagctgta cctgagacag cagcctcctg tgaaggcttc 300caatgcccac aacagggttc tgactgtgac atctgggatg ggcagccagt ttgtcgctgc 360cgtgaccgct gtgaaaaaga acccagcttc acatgtgctt ctgatggcct tacctattac 420aaccgctgct acatggacgc agaagcctgc ctgcggggtc tccacctgca cgttgtaccc 480tgtaagcaca ttctcagttg gccgcccagc agcccgggac cacccgagac cactgctcgc 540ccaacccctg gggctgctcc catgccacct gccctgtaca acagcccctc accacaggca 600gtgcatgttg gggggacagc cagcctccac tgtgatgtta gtggccgtcc accacctgct 660gtgacctggg agaagcagag ccatcagcgg gagaacctga tcatgcgccc tgaccaaatg 720tatggcaacg tggttgtcac cagtatcgga cagctagtcc tctacaatgc tcagttggag 780gatgcgggcc tgtatacctg cactgcacga aacgctgccg gcctgctgcg ggccgacttt 840cccctttccg ttttacagcg ggcaactact caggacaggg acccaggtat cccagccttg 900gctgagtgcc aggccgacac acaagcctgt gttgggccac ctactcccca tcatgtcctt 960tggcgctttg acccacagag aggcagctgc atgacattcc cagccctcag atgtgatggg 1020gctgcccggg gctttgagac ctatgaggca tgccagcagg cctgtgttcg tggccccggg 1080gatgtctgtg cactgcctgc agttcagggg ccctgccagg gctgggagcc acgctgggcc 1140tacagcccac tgctacagca gtgccacccc tttgtataca gtggctgtga aggaaacagc 1200aataactttg agacccggga gagctgtgag gatgcttgcc ctgtaccacg cacaccaccc 1260tgtcgtgcct gccgcctcaa gagcaagctg gctctgagct tgtgccgcag tgactttgcc 1320atcgtgggga gactcacaga ggtcctggag gagcccgagg ctgcaggcgg catagctcgt 1380gtggccttgg atgatgtgct aaaggacgac aagatgggcc tcaagttctt gggcaccaaa 1440tacctggagg tgacattgag tggcatggac tgggcctgcc catgccccaa cgtgacagct 1500gtcgatgggc cactggtcat catgggtgag gttcgtgaag gtgtggctgt gttggacgcc 1560aacagctatg tccgtgctgc cagcgagaag cgagtcaaga agattgtgga actgctcgag 1620aagaaggctt gtgaactgct caaccgcttc caagactag1659
<210>9<211>552<212>PRT<213>小鼠<400>9Met Pro Ala Pro Gln Pro Phe Leu Pro Leu Leu Phe Val Phe Val Leu1 5 10 15Ile His Leu Thr Ser Glu Thr Asn Leu Leu Pro Asp Pro Gly Ser His20 25 30Pro Gly Met Cys Pro Asn Glu Leu Ser Pro His Leu Trp Val Asp Ala35 40 45Gln Ser Thr Cys Glu Arg Glu Cys Thr Gly Asp Gln Asp Cys Ala Ala50 55 60Ser Glu Lys Cys Cys Thr Asn Val Cys Gly Leu Gln Ser Cys Val Ala65 70 75 80Ala Arg Phe Pro Ser Gly Gly Pro Ala Val Pro Glu Thr Ala Ala Ser85 90 95Cys Glu Gly Phe Gln Cys Pro Gln Gln Gly Ser Asp Cys Asp Ile Trp100 105 110Asp Gly Gln Pro Val Cys Arg Cys Arg Asp Arg Cys Glu Lys Glu Pro115 120 125Ser Phe Thr Cys Ala Ser Asp Gly Leu Thr Tyr Tyr Asn Arg Cys Tyr130 135 140Met Asp Ala Glu Ala Cys Leu Arg Gly Leu His Leu His Val Val Pro145 150 155 160Cys Lys His Ile Leu Ser Trp Pro Pro Ser Ser Pro Gly Pro Pro Glu165 170 175Thr Thr Ala Arg Pro Thr Pro Gly Ala Ala Pro Met Pro Pro Ala Leu180 185 190Tyr Asn Ser Pro Ser Pro Gln Ala Val His Val Gly Gly Thr Ala Ser195 200 205
Leu His Cys Asp Val Ser Gly Arg Pro Pro Pro Ala Val Thr Trp Glu210 215 220Lys Gln Ser His Gln Arg Glu Asn Leu Ile Met Arg Pro Asp Gln Met225 230 235 240Tyr Gly Asn Val Val Val Thr Ser Ile Gly Gln Leu Val Leu Tyr Asn245 250 255Ala Gln Leu Glu Asp Ala Gly Leu Tyr Thr Cys Thr Ala Arg Asn Ala260 265 270Ala Gly Leu Leu Arg Ala Asp Phe Pro Leu Ser Val Leu Gln Arg Ala275 280 285Thr Thr Gln Asp Arg Asp Pro Gly Ile Pro Ala Leu Ala Glu Cys Gln290 295 300Ala Asp Thr Gln Ala Cys Val Gly Pro Pro Thr Pro His His Val Leu305 310 315 320Trp Arg Phe Asp Pro Gln Arg Gly Ser Cys Met Thr Phe Pro Ala Leu325 330 335Arg Cys Asp Gly Ala Ala Arg Gly Phe Glu Thr Tyr Glu Ala Cys Gln340 345 350Gln Ala Cys Val Arg Gly Pro Gly Asp Val Cys Ala Leu Pro Ala Val355 360 365Gln Gly Pro Cys Gln Gly Trp Glu Pro Arg Trp Ala Tyr Ser Pro Leu370 375 380Leu Gln Gln Cys His Pro Phe Val Tyr Ser Gly Cys Glu Gly Asn Ser385 390 395 400Asn Asn Phe Glu Thr Arg Glu Ser Cys Glu Asp Ala Cys Pro Val Pro405 410 415Arg Thr Pro Pro Cys Arg Ala Cys Arg Leu Lys Ser Lys Leu Ala Leu420 425 430Ser Leu Cys Arg Ser Asp Phe Ala Ile Val Gly Arg Leu Thr Glu Val
435 440 445Leu Glu Glu Pro Glu Ala Ala Gly Gly Ile Ala Arg Val Ala Leu Asp450 455 460Asp Val Leu Lys Asp Asp Lys Met Gly Leu Lys Phe Leu Gly Thr Lys465 470 475 480Tyr Leu Glu Val Thr Leu Ser Gly Met Asp Trp Ala Cys Pro Cys Pro485 490 495Asn Val Thr Ala Val Asp Gly Pro Leu Val Ile Met Gly Glu Val Arg500 505 510Glu Gly Val Ala Val Leu Asp Ala Asn Ser Tyr Val Arg Ala Ala Ser515 520 525Glu Lys Arg Val Lys Lys Ile Val Glu Leu Leu Glu Lys Lys Ala Cys530 535 540Glu Leu Leu Asn Arg Phe Gln Asp545 550<210>10<211>1695<212>DNA<213>人<400>10atgcccgccc tacgtccact cctgccgctc ctgctcctcc tccggctgac ctcgggggct 60ggcttgctgc cagggctggg gagccacccg ggcgtgtgcc ccaaccagct cagccccaac 120ctgtgggtgg acgcccagag cacctgtgag cgcgagtgta gcagggacca ggactgtgcg 180gctgctgaga agtgctgcat caacgtgtgt ggactgcaca gctgcgtggc agcacgcttc 240cccggcagcc cagctgcgcc gacgacagcg gcctcctgcg agggctttgt gtgcccacag 300cagggctcgg actgcgacat ctgggacggg cagcccgtgt gccgctgccg cgaccgctgt 360gagaaggagc ccagcttcac ctgcgcctcg gacggcctca cctactacaa ccgctgctat 420atggacgccg aggcctgcct gcggggcctg cacctccaca tcgtgccctg caagcacgtg 480ctcagctggc cgcccagcag cccggggccg ccggagacca ctgcccgccc cacacctggg 540gccgcgcccg tgcctcctgc cctgtacagc agcccctccc cacaggcggt gcaggttggg 600ggtacggcca gcctccactg cgacgtcagc ggccgcccgc cgcctgctgt gacctgggag 660aagcagagtc accagcgaga gaacctgatc atgcgccctg atcagatgta tggcaacgtg 720gtggtcacca gcatcgggca gctggtgctc tacaacgcgc ggcccgaaga cgccggcctg 780tacacctgca ccgcgcgcaa cgctgctggg ctgctgcggg ctgacttccc actctctgtg 840
gtccagcgag agccggccag ggacgcagcc cccagcatcc cagccccggc cgagtgcctg 900ccggatgtgc aggcctgcac gggccccact tccccacacc ttgtcctctg gcactacgac 960ccgcagcggg gcggctgcat gaccttcccg gcccgtggct gtgatggggc ggcccgcggc 1020tttgagacct acgaggcatg ccagcaggcc tgtgcccgcg gccccggcga cgcctgcgtg 1080ctgcctgccg tgcagggccc ctgccggggc tgggagccgc gctgggccta cagcccgctg 1140ctgcagcagt gccatccctt cgtgtacggt ggctgcgagg gcaacggcaa caacttccac 1200agccgcgaga gctgcgagga tgcctgcccc gtgccgcgca caccgccctg ccgcgcctgc 1260cgcctccgga gcaagctggc gctgagcctg tgccgcagcg acttcgccat cgtggggcgg 1320ctcacggagg tgctggagga gcccgaggcc gccggcggca tcgcccgcgt ggcgctcgag 1380gacgtgctca aggatgacaa gatgggcctc aagttcttgg gcaccaagta cctggaggtg 1440acgctgagtg gcatggactg ggcctgcccc tgccccaaca tgacggcggg cgacgggccg 1500ctggtcatca tgggtgaggt gcgcgatggc gtggccgtgc tggacgccgg cagctacgtc 1560cgcgccgcca gcgagaagcg cgtcaagaag atcttggagc tgctggagaa gcaggcctgc 1620gagctgctca accgcttcca ggactagccc ccgcaggggc ctgcgccacc ccgtcctggt 1680gaataaacgc actcc 1695<210>11<211>548<212>PRT<213>人<400>11Met Pro Ala Leu Arg Pro Leu Leu Pro Leu Leu Leu Leu Leu Arg Leu1 5 10 15Thr Ser Gly Ala Gly Leu Leu Pro Gly Leu Gly Ser His Pro Gly Val20 25 30Cys Pro Asn Gln Leu Ser Pro Asn Leu Trp Val Asp Ala Gln Ser Thr35 40 45Cys Glu Arg Glu Cys Ser Arg Asp Gln Asp Cys Ala Ala Ala Glu Lys50 55 60Cys Cys Ile Asn Val Cys Gly Leu His Ser Cys Val Ala Ala Arg Phe65 70 75 80Pro Gly Ser Pro Ala Ala Pro Thr Thr Ala Ala Ser Cys Glu Gly Phe85 90 95Val Cys Pro Gln Gln Gly Ser Asp Cys Asp Ile Trp Asp Gly Gln Pro100 105 110
Va1 Cys Arg Cys Arg Asp Arg Cys Glu Lys Glu Pro Ser Phe Thr Cys115 120 125Ala Ser Asp Gly Leu Thr Tyr Tyr Asn Arg Cys Tyr Met Asp Ala Glu130 135 140Ala Cys Leu Arg Gly Leu His Leu His Ile Val Pro Cys Lys His Val145 150 155 160Leu Ser Trp Pro Pro Ser Ser Pro Gly Pro Pro Glu Thr Thr Ala Arg165 170 175Pro Thr Pro Gly Ala Ala Pro Val Pro Pro Ala Leu Tyr Ser Ser Pro180 185 190Ser Pro Gln Ala Val Gln Val Gly Gly Thr Ala Ser Leu His Cys Asp195 200 205Val Ser Gly Arg Pro Pro Pro Ala Val Thr Trp Glu Lys Gln Ser His210 215 220Gln Arg Glu Asn Leu Ile Met Arg Pro Asp Gln Met Tyr Gly Asn Val225 230 235 240Val Val Thr Ser Ile Gly Gln Leu Val Leu Tyr Asn Ala Arg Pro Glu245 250 255Asp Ala Gly Leu Tyr Thr Cys Thr Ala Arg Asn Ala Ala Gly Leu Leu260 265 270Arg Ala Asp Phe Pro Leu Ser Val Val Gln Arg Glu Pro Ala Arg Asp275 280 285Ala Ala Pro Ser Ile Pro Ala Pro Ala Glu Cys Leu Pro Asp Val Gln290 295 300Ala Cys Thr Gly Pro Thr Ser Pro His Leu Val Leu Trp His Tyr Asp305 310 315 320Pro Gln Arg Gly Gly Cys Met Thr Phe Pro Ala Arg Gly Cys Asp Gly325 330 335Ala Ala Arg Gly Phe Glu Thr Tyr Glu Ala Cys Gln Gln Ala Cys Ala340 345 350
Arg Gly Pro Gly Asp Ala Cys Val Leu Pro Ala Val Gln Gly Pro Cys355 360 365Arg Gly Trp Glu Pro Arg Trp Ala Tyr Ser Pro Leu Leu Gln Gln Cys370 375 380His Pro Phe Val Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gly Asn Asn Phe His385 390 395 400Ser Arg Glu Ser Cys Glu Asp Ala Cys Pro Val Pro Arg Thr Pro Pro405 410 415Cys Arg Ala Cys Arg Leu Arg Ser Lys Leu Ala Leu Ser Leu Cys Arg420 425 430Ser Asp Phe Ala Ile Val Gly Arg Leu Thr Glu Val Leu Glu Glu Pro435 440 445Glu Ala Ala Gly Gly Ile Ala Arg Val Ala Leu Glu Asp Val Leu Lys450 455 460Asp Asp Lys Met Gly Leu Lys Phe Leu Gly Thr Lys Tyr Leu Glu Val465 470 475 480Thr Leu Ser Gly Met Asp Trp Ala Cys Pro Cys Pro Asn Met Thr Ala485 490 495Gly Asp Gly Pro Leu Val Ile Met Gly Glu Val Arg Asp Gly Val Ala500 505 510Val Leu Asp Ala Gly Ser Tyr Val Arg Ala Ala Ser Glu Lys Arg Val515 520 525Lys Lys Ile Leu Glu Leu Leu Glu Lys Gln Ala Cys Glu Leu Leu Asn530 535 540Arg Phe Gln Asp545<210>12<211>30<212>PRT
<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述示例性的竞争肽<400>12Asp Phe Gly Leu Asp Ser Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Ser Ser1 5 10 15Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp20 25 30<210>13<211>15<212>PRT<213>小鼠<400>13Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu Phe Val Phe Leu Gln Lys1 5 10 15<210>14<211>12<212>PRT<213>小鼠<400>14Met Ser Pro Ile Asn Met Leu Tyr Phe Asn Gly Lys1 5 10<210>15<211>14<212>PRT<213>小鼠<400>15Asp Phe Gly Leu Asp Cys Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg1 5 10
<210>16<211>15<212>PRT<213>小鼠<400>16Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu Phe Val Phe Leu Gln Lys1 5 10 15<210>17<211>12<212>PRT<213>小鼠<400>17Met Ser Pro Ile Asn Met Leu Tyr Phe Asn Gly Lys1 5 10<210>18<211>19<212>PRT<213>小鼠<400>18Tyr Pro Leu Thr Val Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile Ile1 5 10 15Ala Pro Lys<210>19<211>12<212>PRT<213>小鼠<400>19Met Ser Pro Ile Asn Met Leu Tyr Phe Asn Gly Lys1 5 10<210>20
<211>11<212>PRT<213>小鼠<400>20Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys1 5 10<210>21<211>16<212>PRT<213>小鼠<400>21Leu Asp Met Ser Pro Gly Thr Gly Ile Trp Gln Ser Ile Asp Val Lys1 5 10 15<210>22<211>28<212>PRT<213>小鼠<400>22Ala Leu Asp Glu Asn Gly His Asp Leu Ala Val Thr Phe Pro Gly Pro1 5 10 15Gly Glu Asp Gly Leu Asn Pro Phe Leu Glu Val Lys20 25<210>23<211>16<212>PRT<213>小鼠<400>23Leu Asp Met Ser Pro Gly Thr Gly Ile Trp Gln Ser Ile Asp Val Lys1 5 10 15<210>24<211>10
<212>PRT<213>小鼠<400>24Glu Leu Ile Asp Gln Tyr Asp Val Gln Arg1 5 10<210>25<211>11<212>PRT<213>小鼠<400>25Thr Pro Thr Thr Val Phe Val Gln Ile Leu Arg1 5 10<210>26<211>11<212>PRT<213>小鼠<400>26Ala Gln Leu Trp Ile Tyr Leu Arg Pro Val Lys1 5 10<210>27<211>10<212>PRT<213>小鼠<400>27Glu Gly Leu Cys Asn Ala Cys Ala Trp Arg1 5 10<210>28<211>18<212>PRT<213>小鼠<400>28
Pro Gln Ser Cys Leu Val Asp Gln Thr Gly Ser Ala His Cys Val Val1 5 10 15Cys Arg<210>29<211>12<212>PRT<213>小鼠<400>29Asp Ser Cys Asp Gly Val Glu Cys Gly Pro Gly Lys1 5 10<210>30<211>9<212>PRT<213>小鼠<400>30Ser Cys Ala Gln Val Val Cys Pro Arg1 5<210>31<211>13<212>PRT<213>小鼠<400>31Glu Cys Glu Thr Asp Gln Glu Cys Glu Thr Tyr Glu Lys1 5 10<210>32<211>9<212>PRT<213>小鼠<400>32Ala Asp Phe Pro Leu Ser Val Val Arg
1 5<210>33<211>11<212>PRT<213>小鼠<400>33Glu Ala Cys Glu Glu Ser Cys Pro Phe Pro Arg1 5 10<210>34<211>8<212>PRT<213>小鼠<400>34Ser Asp Phe Val Ile Leu Gly Arg1 5<210>35<211>12<212>PRT<213>小鼠<400>35Val Ser Glu Leu Thr Glu Glu Gln Asp Ser Gly Arg1 5 10<210>36<211>15<212>PRT<213>人<400>36Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu Phe Val Phe Leu Gln Lys1 5 10 15<210>37
<211>14<212>PRT<213>人<400>37Asp Phe Gly Leu Asp Cys Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg1 5 10<210>38<211>28<212>PRT<213>人<400>38Ala Leu Asp Glu Asn Gly His Asp Leu Ala Val Thr Phe Pro Gly Pro1 5 10 15Gly Glu Asp Gly Le uAsn Pro Phe Leu Glu Val Lys20 25<210>39<211>10<212>PRT<213>人<400>39Glu Leu Ile Asp Gln Tyr Asp Val Gln Arg1 5 10<210>40<211>18<212>PRT<213>人<400>40Pro Gln Ser Cys Val Val Asp Gln Thr Gly Ser Ala His Cys Val Val1 5 10 15Cys Arg
<210>41<211>13<212>PRT<213>人<400>41Cys Glu Cys Ala Pro Asp Cys Ser Gly Leu Pro Ala Arg1 5 10<210>42<211>12<212>PRT<213>人<400>42Leu Gln Val Cys Gly Ser Asp Gly Ala Thr Tyr Arg1 5 10<210>43<211>12<212>PRT<213>人<400>43Val Ser Glu Leu Thr Glu Glu Pro Asp Ser Gly Arg1 5 10<210>44<211>10<212>PRT<213>人<400>44Cys Tyr Met Asp Ala Glu Ala Cys Ser Lys1 5 10<210>45<211>10<212>PRT
<213>人<400>45Gly Ile Thr Leu Ala Val Val Thr Cys Arg1 5 10<210>46<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>46ttggccactg ccaccacaat ctcaaccact t 31<210>47<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>47tctcagcatg gccatgccgc cgtcga 26<210>48<211>1716<212>DNA<213>小鼠<220>
<221>CDS<222>(1)..(1713)<400>48atg tgt gcc cca ggg tat cat cgg ttc tgg ttt cac tgg ggg ctg ctg 48Met Cys Ala Pro Gly Tyr His Arg Phe Trp Phe His Trp Gly Leu Leu1 5 10 15
ttg ctg ctg ctc ctc gag gct ccc ctt cga ggc cta gca ctg cca ccc96Leu Leu Leu Leu Leu Glu Ala Pro Leu Arg Gly Leu Ala Leu Pro Pro20 25 30atc cga tac tcc cat gcg ggc atc tgc ccc aac gac atg aac ccc aac144Ile Arg Tyr Ser His Ala Gly Ile Cys Pro Asn Asp Met Asn Pro Asn35 40 45ctc tgg gtg gat gcc cag agc acc tgc aag cga gag tgt gaa aca gac192Leu Trp Val Asp Ala Gln Ser Thr Cys Lys Arg Glu Cys Glu Thr Asp50 55 60cag gaa tgt gag acc tat gag aaa tgc tgc ccc aat gtg tgt ggg acc240Gln Glu Cys Glu Thr Tyr Glu Lys Cys Cys Pro Asn Val Cys Gly Thr65 70 75 80aag agc tgt gtg gca gcc cgc tac atg gat gtg aaa ggg aag aag ggg288Lys Ser Cys Val Ala Ala Arg Tyr Met Asp Val Lys Gly Lys Lys Gly85 90 95cct gta ggc atg ccc aag gag gec aca tgt gac cat ttc atg tgc ctg336Pro Val Gly Met Pro Lys Glu Ala Thr Cys Asp His Phe Met Cys Leu100 105 110cag cag ggc tct gag tgt gac atc tgg gac ggc cag ccc gtg tgt aag384Gln Gln Gly Ser Glu Cys Asp Ile Trp Asp Gly Gln Pro Val Cys Lys115 120 125tgc aaa gat cgc tgt gag aag gag ccc agc ttc acc tgt gcc tct gat432Cys Lys Asp Arg Cys Glu Lys Glu Pro Ser Phe Thr Cys Ala Ser Asp130 135 140ggc ctt acc tac tac aac cgt tgc ttc atg gac gcc gaa gcc tgc tcc480Gly Leu Thr Tyr Tyr Asn Arg Cys Phe Met Asp Ala Glu Ala Cys Ser145 150 155 160aag ggc atc aca ctg tct gtg gtc acc tgt cgt tat cac ttc acc tgg528Lys Gly Ile Thr Leu Ser Val Val Thr Cys Arg Tyr His Phe Thr Trp165 170 175cct aac acc agc cct cca ccg cct gag acc acg gtg cat ccc acc acc576Pro Asn Thr Ser Pro Pro Pro Pro Glu Thr Thr Val His Pro Thr Thr180 185 190
gcc tct ccg gag act ctc ggg ctg gac atg gca gcc cca gcc ctg ctc624Ala Ser Pro Glu Thr Leu Gly Leu Asp Met Ala Ala Pro Ala Leu Leu195 200 205aac cac cct gtc cat cag tca gtc acc gtg ggt gag act gtg agt ttc672Asn His Pro Val His Gln Ser Val Thr Val Gly Glu Thr Val Ser Phe210 215 220ctc tgt gac gtg gta ggc cgg cct cgg cca gag ctc act tgg gag aaa720Leu Cys Asp Val Val Gly Arg Pro Arg Pro Glu Leu Thr Trp Glu Lys225 230 235 240cag ctg gag gac cga gag aat gtt gtc atg agg ecc aac cac gtg cgt768Gln Leu Glu Asp Arg Glu Asn Val Val Met Arg Pro Asn His Val Arg245 250 255ggt aat gtg gtg gtc act aac att gcc cag ctg gtc atc tac aac gtc816Gly Asn Val Val Val Thr Asn Ile Ala Gln Leu Val Ile Tyr Asn Val260 265 270cag ccc cag gat gct ggc ata tac acc tgt aca gct cga aat gtc gct864Gln Pro Gln Asp Ala Gly Ile Tyr Thr Cys Thr Ala Arg Asn Val Ala275 280 285ggt gtc ctg agg gct gac ttc ccg ttg tcg gtg gtc agg ggt ggt cag912Gly Val Leu Arg Ala Asp Phe Pro Leu Ser Val Val Arg Gly Gly Gln290 295 300gcc agg gcc act tca gag agc agt ctc aat ggc aca gct ttt cca gca960Ala Arg Ala Thr Ser Glu Ser Ser Leu Asn Gly Thr Ala Phe Pro Ala305 310 315 320aca gag tgc ctg aag ccc cca gac agt gag gac tgt gga gag gag cag1008Thr Glu Cys Leu Lys Pro Pro Asp Ser Glu Asp Cys Gly Glu Glu Gln325 330 335aca cgc tgg cac ttc gac gcc cag gct aac aac tgc ctc act ttc acc1056Thr Arg Trp His Phe Asp Ala Gln Ala Asn Asn Cys Leu Thr Phe Thr340 345 350ttt ggc cac tgc cac cac aat ctc aac cac ttt gag acc tac gag gcc1104Phe Gly His Cys His His Asn Leu Asn His Phe Glu Thr Tyr Glu Ala355 360 365
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<223>人工序列的描述引物<400>50caccatgtgt gccccagggt atcatcggtt ctgg 34<210>51<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>51ttgcaagccc aggaagtcct tgaggac 27<210>52<211>11<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述示例性的N-末端肽序列<400>52Leu Pro Pro Ile Arg Tyr Ser His Ala Gly Ile1 5 10<210>53<211>48<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的寡核苷酸<400>53cagacagaca gacagacaga cagacagaca gacagacaga cagacaga 48
权利要求
1.一种药物组合物，包括i)包含至少一个促滤泡素抑制素结构域的至少一种蛋白质，其中该蛋白质不是促滤泡素抑制素，和ii)至少一种药物学上可接受的载体。
2.权利要求1的组合物，其中所述的蛋白质选自FLRG、FRP、集聚蛋白、骨粘连蛋白、hevin、IGFBP7、U19878和GASP2。
3.权利要求1的组合物，其中所述的蛋白质具有稳定化修饰。
4.权利要求3的组合物，其中所述的修饰是与IgG分子的Fc区域融合。
5.权利要求4的组合物，其中IgG分子是IgG1或IgG4，或其衍生物。
6.权利要求5的组合物，其中IgG分子是IgG1或其衍生物。
7.权利要求4的组合物，其中IgG分子通过接头肽与包含至少一个促滤泡素抑制素结构域的蛋白质融合。
8.权利要求3的组合物，其中所述的修饰包括改变的糖基化位点。
9.权利要求3的组合物，其中所述的修饰包括至少一个碳水化合物部分。
10.权利要求3的组合物，其中所述的修饰包括清蛋白或清蛋白的衍生物。
11.权利要求3的组合物，其中所述的修饰包括非蛋白质类的聚合物。
12.权利要求3的组合物，其中所述的修饰包括聚乙二醇化。
13.包括包含至少一个促滤泡素抑制素结构域的至少一种蛋白质的诊断试剂盒，其中该蛋白质不是促滤泡素抑制素并且至少一种另外的试剂盒成分选自i)至少一种结合蛋白质的试剂；ii)至少一种缓冲液和/或溶液；和iii)至少一种结构性成分。
14.权利要求13的试剂盒，其中所述的蛋白质选自FLRG、FRP、集聚蛋白、骨粘连蛋白、hevin、IGFBP7、U19878和GASP2。
15.包括编码包含至少一个促滤泡素抑制素结构域的蛋白质的核酸的重组细胞，其中该蛋白质不是促滤泡素抑制素。
16.权利要求15的重组细胞，其中所述的蛋白质具有稳定性修饰。
17.权利要求15或16的重组细胞，其中所述的蛋白质选自FLRG、FRP、集聚蛋白、骨粘连蛋白、hevin、IGFBP7、U19878和GASP2。
18.调节GDF-8的方法，包括施用包含至少一个促滤泡素抑制素结构域的至少一种蛋白质，其中该蛋白质不是促滤泡素抑制素，并且使该蛋白质能够与GDF-8相互作用。
19.治疗患有医学病症的患者的方法，包括施用有效剂量的包含至少一个促滤泡素抑制素结构域的至少一种蛋白质，其中该蛋白质不是促滤泡素抑制素，并且使该蛋白质能够与GDF-8相互作用。
20.治疗患有医学病症的患者的方法，包括施用编码包含至少一个促滤泡素抑制素结构域的蛋白质的核酸，其中该蛋白质不是促滤泡素抑制素，使该核酸能够被翻译成蛋白质，并使翻译的蛋白质能够与GDF-8相互作用。
21.表达核酸的方法，包括i)将编码包含至少一个促滤泡素抑制素结构域的蛋白质的核酸施用于细胞，其中该蛋白质不是促滤泡素抑制素，ii)使该核酸能够进入细胞，以及iii)使细胞能够表达该蛋白质。
22.权利要求18，19，20或21的方法，其中所述的蛋白质选自FLRG、FRP、集聚蛋白、骨粘连蛋白、hevin、IGFBP7、U19878和GASP2。
23.权利要求18，19，20或21的方法，其中所述的蛋白质具有稳定化修饰。
24.权利要求23的方法，其中所述的修饰是与IgG分子的Fc区域融合。
25.权利要求24的方法，其中IgG分子是IgG1或IgG4或其衍生物。
26.权利要求25的方法，其中IgG分子是IgG1或其衍生物。
27.权利要求24的方法，其中IgG分子通过接头肽与包含至少一个促滤泡素抑制素结构域的蛋白质融合。
28.权利要求23的方法，其中所述的修饰包含改变的糖基化位点。
29.权利要求23的方法，其中所述的修饰包含至少一个碳水化合物部分。
30.权利要求23的方法，其中所述的修饰包含清蛋白或清蛋白的衍生物。
31.权利要求23的方法，其中所述的修饰包含非蛋白质类的聚合物。
32.权利要求23的方法，其中所述的修饰包含聚乙二醇化。
33.权利要求19的方法，其中所述的患者从肌肉组织质量和数量的增加中获得治疗效果。
34.权利要求19的方法，其中所述的病症是肌肉性病症。
35.权利要求34的方法，其中所述的肌肉性病症是肌营养不良。
36.权利要求35的方法，其中所述的肌肉萎缩选自严重的或良性的X-连锁的肌营养不良、肢带肌营养不良、面肩胛肱骨营养不良、强直性肌营养不良、远端肌营养不良、进行性营养不良的眼肌麻痹、眼咽肌营养不良，和Fakuyama型先天性肌营养不良。
37.权利要求34的方法，其中所述的病症选自先天性肌病、先天性肌强直、家族性周期性麻痹、突发性肌红蛋白尿、重症肌无力、伊-朗综合征、继发性肌无力、去神经支配萎缩、突发性肌肉萎缩、肌肉消耗综合征、肌肉贫乏症和恶病质。
38.权利要求34的方法，其中所述的病症是肌肉病症，选自肌肉组织的外伤和肌肉组织的慢性损伤。
39.权利要求19的方法，其中所述的病症是新陈代谢疾病或病症。
40.权利要求39的方法，其中所述的病症是2型糖尿病、非胰岛素依赖型糖尿病、高血糖症或肥胖症。
41.权利要求19的方法，其中所述的病症是脂肪组织病症，例如肥胖症。
42.权利要求19的方法，其中所述的病症是骨退化疾病，例如骨质疏松症。
43.权利要求19的方法，其中所述的蛋白质是以一定的时间或每天、每周或每月的时间间隔给药的。
44.权利要求19的方法，其中所述的蛋白质是以5mg-100mg的剂量给药的。
45.权利要求19的方法，其中所述的蛋白质是以15mg-85mg的剂量给药的。
46.权利要求19的方法，其中所述的蛋白质是以3mg-70mg的剂量给药的。
47.权利要求19的方法，其中所述的蛋白质是以40mg-60mg的剂量给药的。
全文摘要
本发明涉及包含至少一个促滤泡素抑制素结构域的蛋白质调节生长和分化因子－8(GDF－8)的水平或活性的用途。更特别地，本发明涉及利用除了促滤泡素抑制素本身外的包含至少一个促滤泡素抑制素结构域的蛋白质，治疗与GDF－8的水平或活性的调节相关的病症。本发明可用于治疗肌肉疾病和病症，特别是随肌肉组织的增加而治疗有效的肌肉疾病和病症。本发明也用于治疗与新陈代谢、脂肪组织和骨退化相关的疾病和病症。
文档编号A61K38/16GK1993048SQ03808084
公开日2007年7月4日 申请日期2003年2月21日 优先权日2002年2月21日
发明者J·J·希尔, N·M·沃尔夫曼 申请人:惠氏公司