通过诱导新血管形成使内生性心肌组织再生的制作方法

专利名称：通过诱导新血管形成使内生性心肌组织再生的制作方法
本申请要求于2002年4月23日提出的美国序列号10/128,738的优先权，其内容由此通过参考结合于此。
贯穿本申请，将众多出版物用阿拉伯数字引用于括号中。这些参考文献的完整引文列于本说明书结尾紧靠权利要求书之前。因此这些公开出版物中公开内容全部结合于本申请作为参考，以更完全地描述与本发明相关的现有技术。
背景作为对梗死组织损失的响应，梗死周边区域有活力的肌细胞需要经历代偿性肥大以增加泵功能，这使心肌梗死的治疗变得复杂(1，2)。这引发了一个称为心肌重塑的过程，其特征在于肥大肌细胞的凋亡损失，初始梗死区域的扩大，进行性胶原置换和心力衰竭(3-6)。我们最近提出一个假设，肥大的心肌细胞会经历细胞凋亡，因为内生性毛细血管网不能够提供细胞存活所需灌流的代偿性增加(7)。
血管网的形成是起始于出生前的一个复杂过程的最终结果，在此过程中，由人腹部主动脉成血管细胞诱导的血管发生作用引起内皮组织和造血成分的同时增加(8-11)。可分化成内皮成分的细胞同样存在于成人的骨髓中(12-14)并能够诱导局部缺血组织的血管发生(15-17)。在成人体内，新血管形成可通过已存在的成熟内皮组织引起的血管发生作用或由骨髓衍生性内皮前体所介导的血管发生作用而实现。最近，我们鉴定了一个成人骨髓衍生性内皮祖细胞(progenitor cell)(成血管细胞)特殊种群，该种群具有胚胎成血管细胞的表型和功能特征(7)。我们表明静脉施用这些细胞导致其选择性寻靶缺血心肌层，诱导梗死层血管发生，防止梗死区周边心肌细胞凋亡，并显著促进心肌功能。
我们最近发现含ELR基序的CXC趋化因子可调节人骨髓衍生性内皮祖细胞向组织局部缺血位点的迁移。此外，由于选择性骨髓寻靶和造血祖细胞的移入都依赖于CXCR4与骨髓中组成型表达的SDF-1的结合(28-30)，我们证明了阻断CXCR4/SDF-1相互作用能够使人骨髓衍生性内皮祖细胞更改方向而向组织局部缺血位点运输，从而促进了治疗性血管发生。我们的结果显示CXC趋化因子，包括IL-8，Gro-α和SDF-1在调节成人骨髓依赖性血管发生中起重要作用。
最近的观察显示了活性心肌细胞的另一种代偿性反应，即损伤后增殖和再生(18，19)。前面我们曾指出内皮祖细胞等血管生成素原因子可在最小浓度诱导血管发生。此处我们揭示令人惊奇的结果，小心剂量给药内皮祖细胞/其它血管生成素原(pro-angiogenic)试剂还能诱导心肌细胞增殖，并且通过控制CXCR4/基质衍生因子-1之间的相互作用可使这种增殖作用增强。此外，我们的结果显示这种增强的增殖其机理是通过调节许多与心肌细胞凋亡和细胞周期有关的应激诱导基因的mRNA来实现的。
概述本发明提供了一种治疗受试者涉及心肌细胞损失的心脏疾病的方法，该方法包括向受试者施用适量可有效使心肌细胞在受试者心脏内增殖的试剂，以便由此治疗疾病。
本发明另外提供了其中所述试剂为人内皮祖细胞的该方法。
本发明另外提供了该方法，其包括施用有效量的第二种试剂，该试剂增加由人内皮祖细胞导致的心肌细胞增殖。
本发明还提供了一种测定受试者心肌细胞对细胞凋亡的敏感性的方法，包括(a)定量心肌细胞中peroxiredoxin的表达；(b)定量心肌细胞中维生素D3正调节蛋白-1的表达；(c)定量peroxiredoxin的表达与维生素D3正调节蛋白-1的表达的比率，其中低比率显示心肌细胞对细胞凋亡的高敏感性而高比率显示心肌细胞对患者体内的细胞凋亡的低敏感性。
附图简述

图1A-1DIL-8/Gro-αCXC趋化因子调节人内皮祖细胞(成血管细胞)向体内心肌组织的迁移以及随后血管形成作用的发展。
(A)静脉注射入裸大鼠的DiI-标记人内皮祖细胞(血管生成细胞)(＞98％ CD34+纯)在冠状动脉结扎及梗死后而不是在假手术后的48小时，浸润到大鼠的心肌中。
(B)人内皮祖细胞(成血管细胞)向大鼠缺血心肌组织的迁移受抗大鼠IL-8或IL-8/Gro-α趋化因子家族受体CXCR1和CXCR2的单克隆抗体抑制(均为p＜0.01)，而不受抗VEGF单克隆抗体或其受体Flk-1的单克隆抗体抑制(结果表示为三个独立实验的均值+sem)。
(C)大鼠LAD结扎两周后心肌梗死层的Masson’s三色染色，显示注射了盐水的代表动物体内基质沉积中扩散增加而毛细血管极少(x400)，注射了人骨髓衍生性内皮祖细胞的代表动物体内毛细血管扩散增加(箭头所示)且基质沉积减少(x400)，同时注射人内皮祖细胞(成血管细胞)和抗CXCR1/2单克隆抗体的代表动物体内毛细血管数量减少(x400)。
(D)与注射盐水或干细胞因子(SCF)相比，心内注射1μg/ml的IL-8或SDF-1显著增强了DiI-标记的人内皮祖细胞(成血管细胞)(98％CD34+纯)向非局部缺血大鼠心脏的体内趋化作用，p＜0.01(结果表示为三个独立实验的均值+sem)。以下显示在用盐水、IL-8或SDF-1心脏内注射后，静脉注射的浸润非局部缺血大鼠心脏的DiI-标记的人内皮祖细胞的代表性荧光显微镜检查。
图2A-2C阻断CXCR4/SDF-1的相互作用使静脉注射的人内皮祖细胞从骨髓重定向到缺血心肌。
(A)静脉注射2-14天后大鼠骨髓中的人CD34+CD117亮内皮祖细胞(成血管细胞)的比例在由LAD结扎导致的局部缺血后显著升高(结果表示为三个动物在每个时间点上骨髓研究的均值+sem)(B)和(C)描绘了抗CXCR4，SDF-1或CD34单克隆抗体对人CD34+内皮祖细胞(成血管细胞)在LAD结扎后向大鼠骨髓和心肌层运输的影响。共同施用抗CXCR4抗体或抗SDF-1抗体48小时后显著降低了静脉注射的人CD34+细胞向大鼠骨髓的运输，并增强了其向缺血心肌的运输，然而抗CD34单克隆抗体没有任何作用(结果表示为对三个LAD结扎动物注射48小时后进行的骨髓和心脏研究的均值+sem)图3A-3F对人内皮祖细胞(成血管细胞)向梗死部位的重定向运输诱导了血管生成并保护心肌细胞免于凋亡。
(A)每组中代表动物在LAD结扎2周后的心肌梗死层，经Masson’s三色染色(上图)或结合抗CD31后的免疫过氧化物酶染色(下图)。接受了103或105内皮祖细胞(成血管细胞)的大鼠梗死区显示了三色染色染为蓝色的由少孔的高度纤维化的组织组成的心肌瘢痕(x400)。相反，注射了105内皮祖细胞和抗CXCR4单克隆抗体的大鼠梗死区则显示肉芽组织胞质成分显著增加，最低限度的基质沉积和纤维化，以及大量中等大小的人源毛细血管。注射了2×105内皮祖细胞的大鼠梗死区除同样显示纤维化组织减少以及中等大小毛细血管增加外，同时还显示大尺寸人源血管也有所增加。
(B)和(C)显示静脉注射(103，105，105+抗CXCR4单克隆抗体，和2×105)的人CD117亮内皮祖细胞的数量与两周时大鼠梗死层血管发生进展之间的关系，血管发生的程度定义为中等尺寸或大尺寸内腔直径(分别为平均直径0.02mm具3-6个内皮衬细胞和平均直径0.05mm具大于6个内皮衬细胞)毛细血管的平均数量/高倍视野(hpf)。结果表示为至少三个实验中的15个hpf的均值+sem。
(B)接受了2×105内皮祖细胞(成血管细胞)或105内皮祖细胞加抗CXCR4单克隆抗体的两组其中等尺寸毛细血管的数量是其它两组的1.7倍(p＜0.01)。
(C)接受了2×105内皮祖细胞(成血管细胞)的组大内腔毛细血管的数量是接受了103或105内皮祖细胞的两组的3.3倍(p＜0.01)，是接受了105内皮祖细胞加抗CXCR4单克隆抗体的组的2倍(p＜0.01)。
(D)显示同时施用抗CXCR4单克隆抗体与最高浓度的内皮祖细胞(成血管细胞)，2×105，导致大内腔毛细血管23％的另外增加。尤其引人注意的是，当向梗死的心脏内直接输入1.0μg/ml SDF-1后再静脉注射2×105内皮祖细胞，可引起毛细血管数量另外增加2倍(p＜0.01)(结果表示为三个独立实验的均值+sem)。
(E)显示两周时接受了2×105内皮祖细胞(成血管细胞)或105内皮祖细胞加抗CXCR4单克隆抗体的大鼠梗死周边区域心肌细胞凋亡的数量比接受了103内皮祖细胞或105内皮祖细胞的大鼠显著降低，该数量由抗结蛋白单克隆抗体和TUNEL技术DNA末端标记共同染色确定(结果表示为三个独立实验的均值+sem)。
(F)显示与抗CXCR4单克隆抗体共同给药或同时心内注射SDF-1可导致两周后心肌细胞凋亡另外分别减少65％和76％(二者均有p＜0.01)(结果表示为三个独立实验的均值+sem)。
图4A-4H梗死层的血管再生通过包括心肌细胞保护及增殖/再生在内的机制改善了心肌的长期功能。
(A)和(B)显示静脉注射(103，105，105+抗CXCR4单克隆抗体，和2×105)的人CD117亮内皮祖细胞数量与15周时心肌功能改善的关系，定义为左心室射血分数(LVEF)提高的平均值(A)和收缩末期左心室面积(LVA)减少的均值(B)。接受了103或105内皮祖细胞的两组与盐水注射的大鼠相比这些参数未观察到显著改善。相反，接受了105内皮祖细胞加抗CXCR4单克隆抗体的大鼠LVEF有显著恢复且LVA有显著降低(二者p＜0.01)。接受了2×105内皮祖细胞的组LVEF的恢复和LVA的降低更增加了50％(二者p＜0.01)。
(C)接受了2×105内皮祖细胞(成血管细胞)的代表动物的梗死切片显示心脏特异的肌钙蛋白I及大鼠特异Ki-67(箭头)的心肌细胞染色呈高频阳性。注意Ki-67阳性的心肌细胞与毛细血管的相似性(箭头)。
(D)接受了2×105内皮祖细胞的代表动物的梗死切片显示鼠源心肌细胞“指(finger)”，通过大鼠I类MHC分子的表达而测定，从梗死周边区域向梗死区延伸。这些细胞岛的心脏特异性肌钙蛋白I及大鼠特异Ki-67(箭头)性肌细胞染色呈高频阳性。而接受盐水的代表动物梗死切片没有相同频率的双染阳性肌细胞。条形图显示接受了2×105人内皮祖细胞的动物组具有比盐水对照或假手术动物显著提高的梗死周边区循环心肌细胞的指数。
(E)显示与LAD结扎的接受盐水的对照相比，当同时采取静脉注射2×105人内皮祖细胞和SDF-1直接注射入缺血心肌两项措施时梗死周边区域循环心肌细胞的指数另外增加了1.9倍(p＜0.01)，在两周时循环心肌细胞的指数累积增加了8倍(结果表示为三个独立实验的均值+sem)。
(F)显示与只静脉注射2×105人内皮祖细胞相比，同时静脉注射抗CXCR4单克隆抗体或心肌注射SDF-1而无IL-8可导致LVEF增加2.8到4倍(p＜0.01)，LVEF由超声心动图显象测定(结果表示为三个独立实验的均值+sem)。
(G)显示在15周时，与只接受103或105人内皮祖细胞(成血管细胞)的大鼠以及盐水对照组相比，同时接受或105内皮祖细胞和抗CXCR4单克隆抗体的大鼠其瘢痕/正常左心室心肌的平均比例显著下降(p＜0.01)，而接受2.0×105内皮祖细胞组的瘢痕/正常左心室心肌的平均比例还要低38％(结果表示为三个独立实验的均值+sem)。
(H)LAD结扎并注射了2.0×106G-CSF激活了的人细胞15周后的大鼠心脏Masson三色切片，所注射的人细胞中含103(左)或2.0×105(右)CD117亮内皮祖细胞。与接受了2.0×105内皮祖细胞的大鼠心脏相比，接受了103内皮祖细胞的大鼠心脏具有更多的前壁质损失、胶原沉积(亮灰色)以及隔膜肥大。
图5本图显示了缺血大鼠心脏中三个基因的mRNA在不同时间点的表达。你将发现LAD结扎并局部缺血后48小时和2周时HBP23(人PAG/NKEF-A，B，C基因的大鼠内同源基因，均为peroxiredoxin(Prx)家族的一部分)的表达降低了，而维生素D3正调节蛋白VDUP-1的表达升高了。早期(48小时)的PRX降低及VDUP-1升高导致巯基还原酶硫氧还蛋白(TRX)的代偿性升高。注意内皮祖细胞治疗逆转了这种mRNA表达的模式。
图6编码VDUP-1的mRNA的对应DNA序列(SEQ ID NO1)图7本图显示了VDUP-1 mRNA编码区对应的VDUP-1 DNA(SEQID NO3)上的催化性DNA 5’-AT-3’切点。切点对用大写字母表示。
图8本图显示了VDUP-1 mRNA对应的VDUP-1 DNA(SEQ ID NO3)上的催化性DNA 5’-GC-3’切点。切点对用大写字母表示。
图9本图显示了VDUP-1 mRNA对应的VDUP-1 DNA(SEQ ID NO3)上的催化性DNA 5’-GT-3’切点。切点对用大写字母表示。
图10本图显示了VDUP-1 mRNA对应的VDUP-1 DNA(SEQ ID NO3)上的催化性DNA 5’-AC-3’切点。切点对用大写字母表示。
图11本图显示了VDUP-1 mRNA编码区对应的VDUP-1 DNA(SEQID NO3)上锤头状核酶的切点。大写的”T”代表切点。
图12本图显示当VDUP-1酶浓度从0.05μM到5μM时，序列特异性VDUP1 DNA酶以浓度和时间依赖型方式切割合成的大鼠VDUP-1寡核苷酸。
图13(a)显示与注射杂混DNA酶对照相比，在LAD结扎后48小时心肌内注射大鼠序列特异性VDUP1 DNA酶，可导致两周后梗死区心肌成纤维细胞平均75％的增殖抑制(p＜0.01)。(b)显示与注射杂混DNA酶对照相比，注射VDUP1 DNA酶导致心肌细胞细胞凋亡平均减少了20％(p＜0.05)。
图14(a)显示对成纤维细胞增殖和心肌细胞凋亡的抑制导致梗死区成熟瘢痕沉积的显著降低，从接受杂混DNA酶对照动物的平均35％降到接受VDUP1 DNA酶的动物的20％(p＜0.01)。(b)显示接受VDUP1 DNA酶的动物心脏机能平均有50％恢复，而接受杂混对照DNA酶的动物则没有改善(p＜0.01)，心脏机能的恢复通过射血分数测定。
图15(a)显示在心肌梗死后系统使用同样剂量下，G-CSF是比GM-CSF更有效的心脏新血管形成诱导剂。(B)显示G-CSF是比GM-CSF更有有效的心肌细胞凋亡抑制剂。
图16(a)显示G-CSF是比GM-CSF更有效的心肌细胞再生诱导剂。
(b)显示G-CSF在急性心肌梗死后可比GM-CSF显著增强心脏机能的恢复。
图17(a)显示急性心肌梗死后静脉注射抗CXCR4单克隆抗体在梗死周边区域诱导出的血管显著增多。(b)显示与对照抗体相比更好的心脏/心肌机能恢复。
图18显示SDF-1 mRNA的心肌表达升高出现于心肌梗死的两周而不是48小时后，这种升高被皮下注射GM-CSF所抑制。
图19(a)显示心肌内注射SDF-1诱导了梗死周边区域的新血管形成和(b)保护梗死周边区域心肌细胞不发生细胞凋亡。
图20(a)显示心肌内单独施用SDF-1或与GM-CSF协同使用可诱导梗死周边区域心肌细胞再生以及(b)改善心脏机能。
图21(a)显示人成血管细胞或内皮祖细胞早在梗死后5天内就可诱导新血管形成。(b)显示人成血管细胞或内皮祖细胞早在梗死后5天内就可保护心肌细胞避免发生细胞凋亡。
图22(a)显示接受了人骨髓衍生性CD34+细胞的动物在梗死周边区域产生了大量大鼠源的小的有正常周期的细胞簇，这可通过大鼠Ki67特异性的单克隆抗体来检测。(b)显示CD34+给药两周后被处死的动物组织中不再是小的有循环着的心肌细胞簇，而是在可检测到DNA活性的梗死周边区域出现很多大的、成熟的大鼠心肌细胞，这通过心肌特异肌钙蛋白I单克隆抗体和大鼠Ki67单克隆抗体的双染色来测定。(c)显示了同样染色展示的细胞循环。
图23显示与正常大鼠心脏相比，RT-PCR的结果显示LAD结扎后两周大鼠心脏内的HBP23 mRNA水平平均降低了34％。
图24(a)显示一种HBP23 DNA酶对从大鼠HBP23 mRNA序列合成的23碱基寡核苷酸以剂量和时间依赖型的方式切割。(b)显示了细胞mRNA反转录后RT-PCR产物密度分析的结果，表明相比于无序DNA，HBP23 DNA酶抑制了所培养大鼠细胞80％以上的稳态mRNA水平。
图25(a)显示HBP23 DNA酶对由人骨髓成血管细胞引起的新血管形成无诱导作用，未观察到比盐水对照组更高的心肌毛细血管密度。(b)显示注射HBP23 DNA酶消除了新血管形成的抗凋亡作用，但无序对照无此作用。(c)显示注射HBP23 DNA酶消除了心脏机能的改善，但无序对照无此作用。
详细说明这里使用的术语“VEGF”被定义为血管内皮生长因子。“VEGF-R”被定义为血管内皮生长因子受体。“FGF”被定义为成纤维细胞生长因子。“IGF”被定义为类胰岛素生长因子。“SCF”被定义为干细胞因子。“G-CSF”被定义为粒细胞集落刺激因子。“M-CSF”被定义为巨噬细胞集落刺激因子。“GM-CSF”被定义为粒细胞巨噬细胞集落刺激因子。“MCP”被定义为单核细胞趋化蛋白。
这里使用的术语“成血管细胞”与”内皮祖细胞”同义。
这里使用的术语“CXC”趋化因子指趋化因子的结构。每个“C”代表一个半胱氨酸，“X”代表任意氨基酸。“CXCR4”指CXC受体4。
这里使用的术语”CC”趋化因子指趋化因子的结构。每个“C”代表一个半胱氨酸。
一个”心脏祖细胞”指一个心脏驻留的细胞，或急性炎症后从别处进入心脏的细胞，比成熟心肌细胞小，表达α肌节肌纤蛋白但呈肌钙蛋白阴性，通常处于休眠期但能被诱导进入细胞周期并呈Ki67染色阳性。“心脏祖细胞”可作为”心肌祖细胞”的同意词。
“催化性的”应指某试剂的功能是催化剂，即一种试剂可增加某化学反应的速率而其本身并不发生永久性的结构变化。
“核酸”应不限于任意一种核酸，不限于DNA，RNA，寡核苷酸，或多核苷酸，及它们的类似物及衍生物。形成核酸的核苷酸可为核酸类似物或其衍生物。核酸中可能包含非核苷酸成分。
“核苷酸”应不限于核苷酸及其类似物或衍生物。例如，核苷酸可包括碱基A，C，G，T和U，以及它们的衍生物。这些碱基的衍生物在本领域内广为人知，并被列举于PCR系统，试剂及耗材中(Perkin Elmer目录1996-1997，Roche Molecular Systems，Inc.，Branchburg，New Jersey，USA)。
“增殖”和”再生”在本申请中当指的是心肌细胞时为同义词。
“增殖”当指的是心肌细胞时，应意味着进入细胞周期的心肌细胞相对于未治疗的大鼠心脏增加的比率倍数。
“运输”指源于血液的细胞迁移，尤指成血管细胞/内皮祖细胞的迁移。
本发明提供了一种治疗受试者涉及心肌细胞损失的心脏疾病的方法，该方法包括向受试者施用适量可有效使心肌细胞在受试者心脏内增殖的试剂，以便由此治疗疾病。
在一个实施方案中所用的试剂为人内皮祖细胞。在一个实施方案中所用人内皮祖细胞是骨髓衍生性的，在另一个实施方案中则来源于脐带血，或胚胎或胎儿等。足以导致心肌细胞增殖的内皮祖细胞的有效剂量可根据动物实验的数据用常规计算方法得出。在一个实施方案中该有效剂量为大约1.5×105到3×105内皮祖细胞每公斤体重。在另一个实施方案中该有效剂量为大约3×105到4.5×105内皮祖细胞每公斤体重。在另一个实施方案中该有效剂量为大约4.5×105到5.5×105内皮祖细胞每公斤体重。在另一个实施方案中该有效剂量为大约5.5×105到7×105内皮祖细胞每公斤体重。在另一个实施方案中该有效剂量为大约7×105到1×106内皮祖细胞每公斤体重。在另一个实施方案中该有效剂量为大约1×106到1.5×106内皮祖细胞每公斤体重。在一个实施方案中该有效剂量为大约1.5×106到4.5×106内皮祖细胞每公斤患者体重。在一个优选实施方案中该有效剂量为大约5×105内皮祖细胞每公斤患者体重。
在一个实施方案中所用的内皮祖细胞是与受试者异源的。在不同的实施方案中受试者是成人或胚胎或胎儿。在另一个实施方案中所用的内皮祖细胞来源于自体胚胎干细胞克隆。
在一个实施方案中所用试剂诱导了编码peroxiredoxin的mRNA的表达。peroxiredoxin的mRNA的表达可因例如施用2(3)-叔丁基-4-羟基苯甲醚而增加(见106)，现已显示当2(3)-叔丁基-4-羟基苯甲醚施用于食物中时可增加过peroxiredoxin的表达。备选地，局部控制O2也有同样的效果(见107)。巯基还原酶等peroxiredoxin的mRNA表达还可能被血红素，镉或钴所诱导(见108)。过氧化物还原酶包括，但不限于，PAG，HBP23，MSP23，NKEF。
在另一个实施方案中所用试剂诱导了编码NF-E2相关因子2(Nrf2)的mRNA的表达。细胞质内NF-E2相关因子(Nrf2)的表达可因增加游离Nrf2水平而间接升高。由于Nrf2在细胞质中是与keap1紧密结合的，因此通过keap1反义寡核苷酸或催化性核酸(关于keap1见109)等方法降低keap1 mRNA的表达成为合适的靶点。通过利用nrf2的完整Neh2域，1-73位氨基酸，或只是亲水区，33-73位氨基酸(见109)等方法抑制Nrf2的Neh2域与keap1的DGR域结合以阻断Nrf2和Keap1的相互作用也能增加细胞质游离Nrf-2。在另一个实施方案中所用试剂诱导了Nrf2蛋白从Keap-1上解离。在另一个实施方案中所用试剂抑制了Nrf2蛋白与Keap-1的结合。在另一个实施方案中所用试剂抑制了巯基还原酶硫氧还蛋白与VDUP-1蛋白的结合。在另一个实施方案中所用试剂抑制了c-Abl酪氨酸激酶的活化。在另外的实施方案中所用试剂为STI-571。
在一个实施方案中所用试剂为CXC趋化因子。在另外的实施方案中所用试剂是基质细胞衍生因子-1，白介素-8或Gro-α。在一个实施方案中所用CXC趋化因子的量为，在一个70公斤重人类受试者身上最多用10ml浓度在0.2至5μg/ml的试剂。在一个优选方案中该剂量为约1μg/ml。在一个实施方案中所用试剂是纤溶酶原活化因子抑制剂-1。在另一个实施方案吕所用试剂是针对CXCR4表位的抗体。在一个实施方案中所用针对CXCR4表位的抗体的量为，在一个70公斤重人类受试者身上最多用10ml浓度在25至75μg/ml的试剂。对不同体重的受试者进行了简单计算。在一个优选方案中该剂量是50μg/ml。
对于不同的实施方案所用试剂是基质细胞衍生因子-1α或基质细胞衍生因子-1α。在不同的实施方案中趋化因子可以是通过心肌内注射，冠状动脉注射，和/或经过植入物(stent)，支架，或缓释制剂使用。
在不同的实施方案中所用试剂是G-CSF，GM-CSF，或Gro家族趋化因子。在另外的实施方案中所用试剂试剂是Gro-α。
在另外的实施方案中该方法另外包括施用有效量的第二种试剂，该试剂促进了由人内皮祖细胞导致的心肌细胞增殖。第二种试剂的有效量为在施用内皮细胞后足以增强或加速心肌细胞的增殖。在另外的实施方案中内皮祖细胞表达CD117，CD34，AC133或高水平的胞内GATA-2活性。在一个实施方案中给药方式包括直接注射入患者周围循环，心肌，左心室，右心室，冠状动脉，脑脊液，神经组织，缺血组织或缺血后组织。
在一个实施方案中所用第二种试剂是特异性抑制维生素D3正调节蛋白-1(VDUP-1)mRNA翻译的反义寡聚核苷酸。
在治疗上有益的VDUP-1蛋白(SEQ ID NO2)表达的定向抑制可通过反义核苷酸的应用来实现。反义核苷酸是与某特定mRNA上确定序列互补的小片断DNA及其衍生物。VDUP-1反义核苷酸与VDUP-1mRNA(SEQ ID NO1)分子上的靶点特异性结合并因此抑制了其翻译成VDUP-1蛋白(SEQ ID NO2)。
现已证实，相比于标准脱氧核糖核酸，以硫代磷酸为主链合成的反义寡核苷酸分子能显著抵抗核酸外切酶的损伤，因此得到优先使用。硫代磷酸VDUP-1 mRNA反义寡核苷酸可在380B型Applied Biosystems(FosterCity，CA)DNA合成仪上用标准方法合成。例如硫化可用二硫化四乙基秋兰姆/乙腈来实现。在可控多孔玻璃载体的裂解后，寡聚脱氧核糖核酸在60℃氢氧化铵中处理8小时可被封闭碱基，然后用反相HPLC纯化
。寡聚体在3％乙酸中被去三苯甲基化然后用2％高氯酸锂/丙酮沉淀，在无菌水中溶解并用1M NaCl/乙醇重新沉淀为钠盐。全长成分的浓度可用UV光谱法测定。
本领域内目前所知的任何其它此类合成方法都可作为另外的或替代的方法。用相似技术制备硫代磷酸化和烷基化衍生物等寡核苷酸是众所周知的。
反义寡核苷酸与VDUP-1 mRNA的杂交干扰了VDUP-1 mRNA的一个或多个正常功能。被干扰的mRNA功能包括所有的生活功能，如RNA至蛋白翻译位点的易位，从RNA到蛋白的翻译，RNA剪接产生一个或多个mRNA，及RNA可能有的催化活性。
优选的修饰过的寡核苷酸主链包括，例如，硫代磷酸，手性硫代磷酸，二硫代磷酸酯，磷酸三酯，氨基烷基磷酸三酯，3’-亚烷基膦酸酯、5’-亚烷基膦酸酯和手性膦酸酯等甲基及其它烷基膦酸酯，亚膦酸盐，3’-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯等氨基磷酸酯，硫逐氨基磷酸酯，硫逐烷基膦酸酯，硫逐烷基磷酸三酯，磷酸硒盐和含有正常3’-5’键的硼烷磷酸酯以及它们的2’-5’键合的类似物，还有那些具有反极性的寡核苷酸，其中一个或多个核酸间键合是3’到3’，5’到5’或2’到2’键合。还包括具有反极性的寡核苷酸，包括单独的3’末端3’到3’的键合，即包括脱碱基的(核酸碱基缺失或在其替代位有一个羟基)单独反向核苷酸残基。还包括各种盐类，混合盐类及游离酸形式。
教导了上述含磷键合物制备的代表性美国专利包括，但不限于，美国专利Nos.3,687,808；4,469,863；4,476,301；5,023,243；5,177,196；5,188,897；5,264,423；5,276,019；5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,399,676；5,405,939；5,453,496；5,455,233；5,466,677；5,476,925；5,519,126；5,536,821；5,541,306；5,550,111；5,563,253；5,571,799；5,587,361；5,194,599；5,565,555；5,527,899；5,721,218；5,672,697和5,625,050，其中的某些和本申请所属相同，上述每一个专利都引于此处作为参考。
按照本发明，本领域普通技术人员都理解信使RNA不仅包括三字母遗传码蛋白编码信息，还涉及到形成这些人所知一些区域的核酸，包括5’-不翻译区，3’-不翻译区，5’帽子区和内含子/外显子连接处核糖核酸。因此，可根据本发明合成全部或部分定向于这些相关核糖核苷酸或信息核糖核苷酸的下述反义寡核苷酸或催化性核酸。因此这些反义寡核苷酸与翻译起始位点，翻译起始密码子区，5’帽子区，内含子/外显子连接区，编码序列，翻译终止密码子区或5’-及3’-不翻译区序列有杂交特异性。相似地，催化性核酸能特异性切割转录起始位点区，翻译起始密码子区，5’帽子区，内含子/外显子连接区，编码序列，翻译终止密码子区或5’-及3’-不翻译区序列。正如在本领域内所共知的，代表性的翻译起始子为5’-AUG(在转录了的mRNA上；在相应的DNA分子上是5’-ATG)。目前已揭示在体内有功能的少数基因的翻译起始密码子RNA序列为5’-GUG，5’-UUG或5’-CUG，及5’-AUA，5’-ACG和5’-CUG。因此，术语“翻译起始密码子”可包括许多密码子序列，尽管在真核细胞中每个序列对应的起始氨基酸都以甲硫氨酸为代表。本领域还知道真核基因可有两个或更多可替代的翻译起始密码子，其中的任何一个在特定的细胞或组织中，或在特定的情况下，都可被优先用于翻译起始。在本发明文中，“翻译起始密码子”指在体内被用于起始翻译由VDUP-1编码基因转录的mRNA分子那个或那些密码子，无论这些密码子的序列是什么。本领域还知道一个基因的翻译终止密码子可能是三个序列中的一个，即5’-UAA，5’-UAG和5’-UGA(相应的DNA序列分别是5’-TAA，5’-TAG，5’-TGA)。术语“翻译起始密码子区”指这样一段mRNA，它包含了从翻译起始密码子向任一方(即5’或3’)约25至30个连续的核苷酸。这个区域是一个优选的目标区域。类似地，术语“翻译终止密码子区”指这样一段mRNA，它包含了从翻译终止密码子向任一方(即5’或3’)约25至30个连续的核苷酸。这个区域也是一个优选的目标区域。可读框或“编码区”，在本领域共知指的是翻译起始密码子到翻译终止密码子之间的区域，也是一个有效的靶点区域。其它优选的靶点区域包括5’-不翻译区(5’UTR)，在本领域共知指mRNA上从翻译起始密码子向5’方向的一段区域，因此也包括了mRNA上5’帽子和翻译起始密码子之间的序列或相应的基因上的核苷酸，还包括3’-不翻译区(3’UTR)，在本领域共知指mRNA上从翻译终止密码子向3’方向的一段区域，因此也包括了mRNA上翻译终止密码子和3’末端之间的序列或相应的基因上的核苷酸。mRNA剪接位点也是优选的靶点区域，并且在与疾病相关的异常剪接或特定mRNA剪接产物过量表达等情况下有特殊作用。因基因重排或缺失导致的异常融合连接区也是优选的靶点。
一旦靶点确定了，就可选出与靶点有足够特异互补性的反义寡核苷酸，即既能很好杂交又有足够的特异性，然后如期望的那样破坏分子的功能。“杂交”在本发明中意指互补碱基间氢键，也称为Watson-Crick碱基配对，通常发生于相对的核酸链上或一条核酸链的两个区域。鸟嘌呤和胞嘧啶是所知的相互之间形成三个氢键的互补碱基的例子。腺嘌呤和胸腺嘧啶是所知的相互之间形成两个氢键的互补碱基的例子。“特异性杂交”和”互补性”是用来表明有足够互补程度的术语，指足以在DNA或RNA靶点和催化性核酸间形成稳定的和特异的结合。类似地，催化性核酸在VDUP-1 mRNA分子靶点切割后被立即合成。
对于患有心血管疾病的哺乳动物优先施用反义寡核苷酸或催化性核酸及其类似物或其它试剂，可使用这些试剂的天然形式或在载体介质中的悬液，采用能降低心血管疾病有害作用的有效治疗量和治疗方案。根据治疗需要，靶向VDUP-1 mRNA核酸序列不同区域的一种或几种不同的催化性核酸或反义寡核苷酸或其类似物可以单一剂量或在不同时间不同量的不同的药剂共同施用。将催化性核酸或反义寡核苷酸施用于哺乳动物的方式可先使催化性核酸或反义寡核苷酸进入血流然后再进入细胞，或者也可以通过电穿孔或心脏直接注射这样的方法直接将其导入心肌细胞等细胞或细胞组。存在于细胞中可抑制转录或蛋白合成的反义寡核苷酸其给药方式可以是静脉注射，静脉滴注，皮下、腹膜内或肌内注射，口服或直肠给药。某些反义寡核苷酸的人体药代动力学已有所研究。参见引用的参考文献的全文(105)。本领域技术人员的技术已足以确定本治疗给药方法的最佳剂量和治疗方案。
本发明用到的所有试剂都可以，例如通过注射，在冠状动脉内或心肌内施用。正如在其它方面所讨论的，试剂可通过众多不同的方式给药，包括给药物洗脱支架等支架系统，以及缓释等按时间释放的制剂。当试剂是蛋白时，包括但不限于SDF-1，G-CSF，GM-CSF和VEGF，可直接或间接施用，或可通过诱导基因表达、基因治疗、腺病毒传递及其它本领域技术人员熟悉的这些方法给药。
本发明中寡核苷酸或其类似物的以药学剂量单位表示的剂量应是对一名需要心肌细胞再生(或VDUP-1表达抑制)的人类患者每1至2天给药1-6次或更多次的非毒性有效剂量。剂量依赖于病情的严重程度及待治疗的异常心血管疾病的应答效应，治疗时间可从几天到几个月，直到治愈或药效开始降低为止。通常以低剂量作为对人给药的口服剂量单位。给药的实际剂量应考虑患者的体重和体积，给药性质是预防性还是治疗性，患者年龄、体重、健康状况和性别，给药途径，及其它因素。
在另一个实施方案中第二种试剂是促血管生成剂(pro-angiogenicagent)。在另外的实施方案中该促血管生成剂是血管内皮生长因子，成纤维细胞生长因子或血管生成素(angiopoietin)。在另一个实施方案中第二种试剂诱导促血管生成因子的表达。在另外的实施方案中第二种试剂是缺氧诱导因子-1。
在另一个实施方案中第二种试剂是催化性核酸，可特异性抑制维生素D3正调节蛋白-1 mRNA的翻译。在另外的实施方案中该催化性核酸包括脱氧核糖核酸。在另一个实施方案中催化性核酸包括核糖核酸。
催化性核酸分子可切割维生素D3正调节蛋白(VDUP-1)mRNA(对应的DNA见SEQ ID NO1，图5)中的任何一个保守序列。由于催化性核糖核酸及脱氧核糖核酸的保守序列已知，并且VDUP-1蛋白mRNA序列已知，一种普通技术可基于本说明书容易地构建出针对任何VDUP-1蛋白mRNA保守序列的催化性核糖核酸或脱氧核糖核酸。在本发明优选的实施方案中催化性脱氧核糖核酸包括10-23的结构。催化性核糖核酸的例子包括发夹结构和锤头状核酶。在本发明的优选方案中催化性核糖核酸分子形成于锤头状(50)或发夹结构基序(51，52，53)中，但也可形成于丁型肝炎病毒基序(55，56)，I类内含子(60)，RNA酶P RNA(与RNA引导序列相关)(55，56)或红色链孢霉(Neurospora)VS RNA(57，58，59)中。
为了靶向VDUP-1 mRNA(SEQ ID NO1)，催化性核酸可根据VDUP-1mRNA序列上的保守切点5’-嘌呤嘧啶-3’(104)(见图6-10)为编码VDUP-1(SEQ ID NO2)mRNA相应的DNA切点而设计。位于该mRNA开放环上的那些潜在的切点是特别优选的靶目标，这些潜在切点是根据RNADRaw 2.1等RNA折叠软件找到的(61)。基于DNA的催化性核酸可利用这样一种结构，其中两个序列特异性的臂附着到一个基于VDUP-1mRNA序列的催化核心上。关于催化性DNA结构的另外的例子详见于(62)和(63)。市售小鼠大脑polyA-RNA(Ambion)可作为体外切割反应的模板以检测催化性脱氧核糖核酸的功效。催化性RNA可如上所述进行类似设计。锤头状核酶可切割一个mRNA上的任意5’-NUH-3’三联密码子，其中U是保守的，N是任意核苷酸，H可以是C，U，A但不能是G。例如，图10显示了人VDUP-1 mRNA编码区可被锤头状核酶切割的位点。
用催化性核酸对VDUP-1 mRNA进行切割干扰了VDUP-1 mRNA一个或几个正常功能。被干扰的mRNA功能包括所有的生命机能，如RNA至蛋白翻译位点的易位，从RNA到蛋白的翻译，RNA剪接产生一个或多个mRNA，及RNA可能有的催化活性。
该核苷酸也可使用包括肌苷，脱氧肌苷，次黄嘌呤等的其它碱基。另外，电子等排的嘌呤2’脱氧呋喃糖苷类似物，2’-脱氧水粉蕈素或2’-脱氧黄苷，或其它嘌呤或嘧啶类似物也可使用。通过仔细选择碱基和碱基类似物，可对寡核苷酸的杂交性进行精细调整。例如，肌苷可用来减少杂交特异性，而二氨基嘌呤可用于增加杂交特异性。
腺嘌呤和鸟嘌呤可在N3，N7，N9，C2，C4，C5，C6或C8位被修饰而仍然保持其氢键结合的能力。胞嘧啶，胸腺嘧啶和尿嘧啶可在N1，C2，C4，C5或C6位被修饰而仍然保持其氢键结合的能力。某些碱基类似物与天然存在的碱基相比有不同的氢键结合属性。例如，2-氨基-2’-dA与胸腺嘧啶(T)形成三个氢键(3)而不是通常的两个氢键。已证实能增强双链体稳定性的碱基类似物包括但不限于，5-氟-2’-dU，5-溴-2’-dU，5-甲基-2’-dC，5-丙炔基-2’-dC，5-丙炔基-2’-dU，2-氨基-2’-dA，7-去氮杂鸟嘌呤，7-去氮杂腺嘌呤和N2-咪唑基丙基-2′-dG。
核酸类似物可通过修饰和/或置换糖基来构建。核酸上的糖基也可通过另加一个或多个取代基进行修饰。例如，一个或多个糖基可能含一个或多个如下取代基氨基，烷基氨基，芳烷基，杂烷基，杂环烷基，氨基烷基氨基，O，H，烷基，聚烷基氨基，取代了的甲硅烷基，F，Cl，Br，CN，CF3，OCF3，OCN，O-烷基，S-烷基，SOMe，SO2Me，ONO2，NH-烷基，OCH2CH＝CH2，OCH2CCH，OCCHO，烯丙基，O-烯丙基，NO2，N3和NH2。例如，糖的2’位可被修饰成含有下列基团之一H，OH，OCN，O-烷基，F，CN，CF3，烯丙基，O-烯丙基，OCF3，S-烷基，SOMe，SO2Me，ONO2，NO2，N3，NH2，NH-烷基，或OCH＝CH2，OCCH，其中的烷基可以是直链的，支链的，饱和的或不饱和的。另外，核苷酸中的糖也可能被修饰和/或置换从而成为核糖或己糖(即葡萄糖，半乳糖)或含有一个或多个异头糖。核苷酸也含有一个或多个L-糖。
教导如何制备上述被修饰碱基/核苷/核苷酸的代表性美国专利包括但不限于美国专利Nos.6,248,878和6,251,666，它们在此处被列为参考文献。
糖可能被修饰成含有一个或多个接头，通过这些接头能附着到荧光标记等其它化学试剂上。在一个实施方案中，糖与一个或多个氨基烷氧基接头连接。在另一个实施方案中，糖含有一个或多个烷基氨基接头。氨基烷氧基和烷基氨基接头可通过其氨基连接到生物素，胆酸，荧光素或其它化学基团上。
核苷酸类似物或衍生物可含有附着的侧基。侧基有多种功能，包括但不限于，增加细胞对寡核苷酸的摄入，增强靶核酸的降解，以及增强杂交亲和力。侧基可连接至寡核苷酸的任何部分，但经常被连接到寡核苷酸链的末端。侧基的例子包括但不限于吖啶衍生物(即2-甲氧基-6-氯-9-氨基吖啶)；交联接头如补骨脂素衍生物，重氮苯酰，原黄素，和重氮原黄素；人工核酸内切酶；金属络合物如EDTA-Fe(II)，O-二氮杂菲-铜(I)，和卟啉铁(II)；烷化基团；氨基-1-己醇葡萄球菌核酸酶等核酸酶以及碱性磷酸酶；末端转移酶；抗体酶；胆固醇基团；亲脂载体；多肽偶联物；长链醇类；磷酸脂；氨基；巯基基团；放射性标记物；染料等非放射性标记物；以及多聚赖氨酸和其它多胺。在一个实施例中，核酸包含一个与糖，硫化糖，或gylcan偶联的寡核苷酸。偶联物可被视为通过将非特异性DNA结合分子共价连接到选择性杂交寡核苷酸上从而引入特异性的一个方法。
催化性核酸结合域(即非催化域)或反义寡核苷酸可以包含修饰过的基团。例如寡核苷酸的核苷酸间键可包含硫代磷酸键。核酸中核苷酸的基团中的一个或两个桥连氧原子可以被-NH，-CH2或-S等类似物所替代修饰。也可利用本领域内所知的其它氧类似物。硫代磷酸酯键可以是立体有序的也可是立体无序的。
寡核苷酸基团中的一个或多个糖可被修饰或替代从而成为核糖，葡萄糖，庶糖，或半乳糖，或任何其它糖。备选地，硫代磷酸寡核苷酸中的一个或多个糖可在其2’位即2’烯丙基或2’-O-烯丙基被置换或修饰。2’-O-烯丙基糖的一个例子是2’-O-甲基核糖核苷酸。硫代磷酸寡核苷酸中的一个或多个糖可被另外置换或修饰形成α-异头糖。
催化性核酸可包含非核苷酸取代。非核苷酸取代包括脱碱基(abasic)核苷酸，聚醚，多胺，聚酰胺，肽，糖，脂或聚烃化合物。此处所用术语“脱碱基”或“脱碱基核苷酸”指缺少碱基的或在1’位用其它化学基团代替碱基的糖基。
基于动物的数据利用常规的计算方法可确定该核酸分子的有效量。在一个实施方案中，有效量包括每公斤体重大约10ng到100μg的该核酸分子。在另一个实施例中，有效量包括每公斤体重大约100ng到大约10μg核酸分子。在另外的实施方案中，有效数量包括每公斤体重从大约1μg到大约5μg核酸分子，在另外的实施方案中，有效数量包括每公斤体重大约2μg核酸分子。
在另一个实施方案中第二种试剂是心肌祖细胞。在另一个实施方案中第二种试剂是骨胳肌祖细胞。这些细胞都可从胚胎、胎儿或成人受试者分离。
在一个实施方案中第二种试剂促进了内皮祖细胞向受试者心脏的输送。
在另外的实施方案中促进了输送的第二种试剂是针对CXCR4表位的抗体。
在另一个另外的实施方案中促进了输送的第二种试剂是一种CC趋化因子。在另外的实施方案中该CC趋化因子是RANTES，EOTAXIN，单核细胞化学引诱蛋白-1(monocyte chemoattractant protein(MCP)，MCP-1)，MCP-2，MCP-3，或MCP。
在另一个实施方案中促进了输送的第二种试剂是一种CXC趋化因子。在另外的实施方案中该CXC趋化因子是白介素-8，Gro-α，或基质细胞衍生因子-1。
在一个实施方案中第二种试剂促进了成血管细胞向患者血流中的迁移。在不同的实施方案中该试剂是G-CSF，GM-CSF，SDF-1，或VEGF。
本发明还提供了一种测定受试者心肌细胞对细胞凋亡的敏感性的方法，包括(a)定量测定心肌细胞中编码peroxiredoxin的mRNA的量；(b)定量测定心肌细胞中编码维生素D3正调节蛋白-1的mRNA的量；(c)定量测定编码peroxiredoxin的mRNA的量与编码维生素D3正调节蛋白-1的mRNA的量的比率，其中低比率意味着心肌细胞对细胞凋亡的高敏感性而高比例意味着心肌细胞对患者体内的细胞凋亡的低敏感性。
本发明还提供了一种测定患者心肌细胞对细胞凋亡敏感性的方法，包括(a)定量测定心肌细胞中peroxiredoxin蛋白的表达；(b)定量测定心肌细胞中维生素D3正调节蛋白-1的表达；和(c)定量测定peroxiredoxin的表达与维生素D3正调节蛋白-1的表达的比率，其中低比率意味着心肌细胞对细胞凋亡的高敏感性而高比率意味着心肌细胞对受试者中的细胞凋亡的低敏感性。
高于拥有正常心脏的对照患者至少两倍标准偏差的比值被认为是高比率。心肌细胞内蛋白表达的定量采用本领域技术人员所知的常规技术进行，例如RNA印迹和蛋白质印迹。
本发明另外提供一种心肌祖细胞。在一个实施方案中心肌祖细胞是驻留在心脏，或急性炎症后从任何地方进入心脏的，比成熟心肌细胞小，表达α肌节肌动蛋白但呈肌钙蛋白阴性，通常处于休眠期但能被激活进入细胞周期并呈Ki67染色阳性。
本发明另外提供一种诱导受试者心脏组织内心肌祖细胞细胞循环(cycling)的方法，包括给受试者施用适量能有效诱导受试者心脏组织新血管形成的试剂从而诱导受试者心脏组织的心脏细胞细胞循环。
本发明另外提供了一种改善受试者心脏功能的方法，包括向患者施用适量能有效诱导受试者心脏组织新血管形成的试剂从而改善受试者心脏功能。
本发明另外提供了一种改善受试者心脏功能的方法，包括向患者施用适量能有效诱导受试者心脏组织心肌细胞增殖的试剂从而改善受试者心脏功能。
心脏功能，或心肌功能，可由下列各项的任意组合所确定射血分数改善，心脏灌流，心绞痛症状减轻，生活质量提高，行走能力增强，寿命延长，心脏给药减少，和/或心衰预防，因为这些术语是本领域内普遍理解的。受试者心脏功能的改善通过检测受试者在接受任何现有方法治疗前后上述因素的改变来测定。
在本方法的一个的实施方案中，受试者患有心肌缺血或心肌梗死。在不同的实施方案中所用的试剂是G-CSF，GM-CSF，IL-8，一种Gro家族趋化因子，CXCR4抑制剂，或SDF-1抑制剂。在另外的实施方案中CXCR4抑制剂是小分子或一个单克隆抗体，CXCR4抑制剂是一种小分子并且是AMD 3100，SDF-1抑制剂是一种小分子或单克隆抗体，并且Gro家族趋化因子是Groα。在另一个实施方案中该抑制剂是AMD 070。在不同的实施方案中CXCR4抑制剂是一种催化性核酸，寡核苷酸，RNAi，(RNA干扰(interference))或一种小分子。
本发明另外提供了一种在细胞中诱导细胞凋亡的方法，包括抑制细胞内peroxiredoxin的表达。在一个实施方案中上述细胞是肿瘤细胞。在不同的实施方案中该peroxiredoxin是peroxiredoxin I，II，III，IV或V。在一个实施方案中，通过使细胞与一种能与编码peroxiredoxin的mRNA结合的催化性核酸接触并因此抑制其表达，抑制了peroxiredoxin的表达。在不同的实施方案中抑制peroxiredoxin表达通过使细胞与反义寡核苷酸，单克隆抗体，RNA干扰或一种小分子接触而实现。
本发明另外提供了一种治疗受试者因涉及组织胞损失而导致的组织细胞疾病的方法，该方法包括给受试者使用适量可有效使组织细胞在受试者组织内增殖的试剂，从而得以治疗疾病。在不同的实施例中，该组织是心脏组织，脑组织，周围血管组织，肝组织，肾组织，胃肠组织，肺组织，平滑肌组织，或横纹肌组织。在不同的实施方案中所用的试剂是G-CSF，SDF-1，GM-CSF，IL-8，VEGF。在一个实施方案中该试剂是CXCR4/SDF-1相互作用的抑制剂。在另外的实施方案中该抑制剂是催化性核酸，单克隆抗体，反义寡核苷酸，小分子，或RNAi。在一个实施方案中该试剂是peroxiredoxin表达的诱导剂。在另外的实施方案中上述peroxiredoxin是peroxiredoxin I，II，III，IV或V。
在其中试剂是G-CSF的任何当前方法中，G-CSF可以是重组蛋氨酰人G-CSF(非格司停(Filgrastim))和一甲氧基聚乙二醇的共价偶联物，如Neulasta。非格司停是一种水溶性175个氨基酸的蛋白，分子量约19kd。非格司停由细菌发酵获得，发酵菌株为转化了含人G-CSF基因的基因工程质粒的大肠杆菌。为了合成pegfilgrastim，一个20kd的一甲氧基聚乙二醇分子被共价地结合到非格司停的N-端蛋氨酰残基上。Pegfilgrastim的平均分子量是大约39kd。Neulasta通过用0.6ml载药注射器皮下注射而供给。每个注射器含有6mg Pegfilgrastim(基于蛋白质量)，溶于无菌，清澈，无色，无防腐剂的溶液中(pH4.0)，该溶液含有乙酸(0.35mg)，山梨糖醇(30.0mg)，聚三梨醇酯20(0.02mg)，以及注射用水中的钠(0.02mg)，USP。
本发明还提供了一种治疗受试者因涉及组织内细胞凋亡而导致的组织疾病的方法，包括给受试者使用适量能有效抑制受试者体内组织细胞凋亡抑制剂从而治疗该疾病。在一个实施方案中该试剂是VDUP-1表达抑制剂。在另外的实施方案中所述VDUP-1表达抑制剂是催化性核酸，单克隆抗体，反义寡核苷酸，小分子，或RNAi。在不同的实施方案中该组织是心肌组织，脑血管组织，或脑组织。
本发明还提供了一种抑制组织中成纤维细胞或炎症细胞的增殖从而抑制胶原形成的方法，包括使组织与VDUP-1表达抑制剂相接触。在一个实施方案中VDUP-1表达抑制剂是催化性核酸，单克隆抗体，反义寡核苷酸，小分子，或RNAi。
在一个实施方案中上述任何一种方法的受试者是哺乳动物，在一个优选的实施方案中该哺乳动物是人类。在一个实施方案中受试者患有心血管疾病。在另外的实施方案中受试者患有充血性心力衰竭，患有心肌梗死，患有心肌缺血，患有心绞痛，或患有心肌病。
参考下述实验细节可更好地理解本发明，但本领域技术人员容易理解这个具体的实验细节只不过是在后附的权利要求中更完整地描述的本发明的一个例证。
实验结果CXC趋化因子调节内皮祖细胞向心脏迁移。
利用裸鼠LAD结扎模型中的心肌梗死，我们研究了CXC受体-配体相互作用在介导人内皮祖细胞向缺血组织的趋化作用及随后的血管发生诱导中的作用。如图1a所示，通过G-CSF动员(mobilization)获得的DiI标记人CD34+细胞(＞98％CD34纯度，含1-12％CD117亮内皮祖细胞)静脉注射后在梗死的心肌内被选择性检出，但在假手术后的大鼠心肌中未检出。抗大鼠Cinc(人IL-8和Gro-α的大鼠同源物)封闭单克隆抗体或抗人CXCR1或CXCR2这两个促血管生成趋化因子表面受体的封闭单克隆抗体的共同施用后48小时，与对照抗体相比使人骨髓衍生性CD34+细胞的心肌迁移降低了40-60％(p＜0.01)，图1b。两周后，接受了人CD34+细胞的大鼠与接受盐水的大鼠比显示出显著增加的梗死层微血管供应，图1c，并且当与抗CXCR1/2抗体共同施用时这种效果降低了50％。由于我们前面已说明CD34+细胞的血管生成性能在小CD117亮成血管细胞部分缺失后就消失了，这些结果表明CXC趋化因子通过调节成血管细胞向缺血组织迁移而影响了这些位点血管生成的发展。相反，尽管直接心内注射1.0μg/mlIL-8或SDF-1入未梗死心脏后48小时导致心肌内CD34+细胞浸润增加了2.3和2.5倍(两者都有p＜0.01)，图1d，此条件下后两周内未观察到血管生成。这些结果共同表明趋化因子诱导下的向缺血区的迁移，内皮祖细胞向成熟内皮细胞的分化及血管生成的诱导需要另外的因子，此因子在缺血情况下生成，但目前尚未被鉴定。
抑制CXCR4/SDF-1相互作用使内皮祖细胞重新向心脏输送。
尽管LAD冠状动脉结扎导致静脉注射的人内皮祖细胞向缺血心肌部位输送，但这也伴随着人类细胞向大鼠骨髓的扩散增加。如图2a所示，静脉注射2×106人CD34+细胞2-14天后，LAD结扎的大鼠骨髓内人CD117亮内皮祖细胞的含量比正常大鼠骨髓高5-8倍，p＜0.001。这可能是由缺血血清中因子的增殖效果所导致，正如我们前面所示，在缺血血清中培养2天可使CD34+CD117亮内皮祖细胞的含量增加4-5倍(7)。因为活跃的处于细胞周期中的CD34+细胞向骨髓的迁移可被由骨髓组成型合成的SDF-1所促进(31)，所以我们研究了人CD34+CD117亮内皮祖细胞向缺血大鼠骨髓的分布是否涉及SDF-1/CXCR4的相互作用。如图2b所示，与抗CD34对照抗体相比，共同施用人CXCR4或大鼠SDF-1的单克隆抗体可显著抑制静脉给药的人内皮祖细胞向缺血大鼠骨髓的迁移(两者均p＜0.001)。而且，共同施用人CXCR4或大鼠SDF-1的单克隆抗体使CD34+人内皮祖细胞向缺血大鼠心肌的输送平均分别增加了24％和17％(两者均p＜0.001)，图2c。
毛细血管腔的尺寸依赖于成血管细胞的绝对数量。
接下来我们研究了成血管细胞数量，心肌新血管形成和保护心肌细胞免于凋亡之间的关系。LAD结扎两天后动物被静脉注射以G-CSF活化的与不同比例CD117亮内皮祖细胞重建的CD34+人细胞(103，105，105加抗CXCR4单克隆抗体，2×105，和2×105加抗CXCR4单克隆抗体)。每种细胞群注入后的48小时，相似数量的DiI标记的人细胞在梗死区被检出，数据未显示。两周后的新血管形成诱导情况通过定量分析中等尺寸及大尺寸毛细血管来测量，两个尺寸的毛细血管分别定义为有3-6个或＞6个相邻的内皮衬细胞。中等尺寸毛细血管的平均直径为0.020mm+0.002，而大尺寸毛细血管的平均直径为0.053mm+0.004(p＜0.001)。值得注意的是，大内腔毛细血管在尺寸上与小动脉有所重叠，这些小动脉可通过含2-3个鼠源平滑肌细胞薄层而辨别出来，由结蛋白和大鼠I类MHC单克隆抗体正染色确定。如图3a-c所示，与另外两组相比，接受了2×105内皮祖细胞和105内皮祖细胞加抗CXCR4单克隆抗体中等尺寸毛细血管的数量多了1.7倍。另外，接受2×105内皮祖细胞的组大尺寸血管的数量还比接受103或105内皮祖细胞的组高3.3倍(p＜0.01)，比接受了105内皮祖细胞加抗CXCR4单克隆抗体的组高2倍(p＜0.01)。如图3d所示，最高浓度的内皮祖细胞，2×105，与抗CXCR4单克隆抗体共同施用，导致大内腔毛细血生长23％的进一步增长。最引人注目的是，当在梗死心脏直接心内注射1.0μg/ml SDF-1后静脉注射2×105内皮祖细胞时，毛细血管的数量有2倍的进一步提高(p＜0.01)。由于心内注射IL-8后未发现相似的梗死周围毛细血管数量的增长，我们认为这些结果表明缺血大鼠心脏中的内生性IL-8足以饱和体内的成血管细胞CXCR1/2受体，反之心内注射SDF-1导致了骨髓与心脏间SDF-1表达平衡的偏移，并因而导致成血管细胞重新定向输送至缺血心脏。
如图3e所示，接受105内皮祖细胞加抗CXCR4单克隆抗体及接受2×105内皮祖细胞的大鼠梗死区凋亡的心肌细胞数量比接受103内皮祖细胞或只有105内皮祖细胞的大鼠都显著减少(两者均有p＜0.001)。而且，与抗CXCR4单克隆抗体共同施用或心内注射SDF-1分别导致心肌细胞凋亡减少了65％和76％，图3f(两者均有p＜0.001)。这些结果共同表明抵抗心肌细胞凋亡的梗死后心脏保护依赖于静脉注射内皮祖细胞的临界数量诱导的心肌新血管形成。这个临界值显然可通过阻止内皮祖细胞重新向骨髓分布的策略而降低，如阻断CXCR4/SDF-1相互作用或增强SDF-1在缺血心肌中的表达。
毛细血管尺寸作为心脏功能改善的决定性因素接下来我们检查了增加向缺血心肌输送的人内皮祖细胞的数量对心脏长期功能的影响，由静脉注射后15周左心室射血分数(LVEF)的改善程度及左心室收缩末期面积(LVA)的减少来确定，图4a和b。与接受盐水的大鼠相比，接受103或105内皮祖细胞的组未观察到这些参数有所改善。相反，接受105内皮祖细胞加抗CXCR4单克隆抗体的组这些参数表现出显著改善，LVEF平均恢复22+2％并且LVA平均减少24+4％(两者均有p＜0.001)。更令人惊奇的是，接受2×105内皮祖细胞的组显示出34+4％的LVEF平均恢复和37+6％的LVA平均减少(两者均有p＜0.001)，或两参数均有50％的进一步改善。这些结果令我们十分惊奇，因为这两组动物两周后都表现出相似程度的包含了中等尺寸毛细血管的新血管形成及相似水平的对早期心肌细胞凋亡的保护。这暗示接受了2×105人内皮祖细胞的大鼠额外的长期功能改善与早期大尺寸毛细血管发育有关，并且由与保护心肌细胞凋亡不同的机理所介导。
大毛细血管诱导内生性性心肌细胞的持久性再生。
尽管心肌肥大和核酸倍增通常被认为是哺乳动物心脏对缺血、损伤和过载的主要应答(1，2)，最近的观察暗示人心肌细胞具有增殖和再生的能力以应答损伤(18，19)。因此，我们研究了注射了2×105人内皮祖细胞后观察到的心脏功能的额外的改善是否与心肌细胞增殖和/或再生的诱导有关。接受2×105人内皮祖细胞的LAD结扎大鼠在两周后表现出大量鼠源心肌细胞”手指”，这由鼠I类MHC的表达确定，从梗死周围区域延伸至梗死区。接受103和105内皮祖细胞的动物中类似的延伸发生的频率有所下降，而接受盐水的动物中凡乎没有这种现象。如图4c所示，接受2×105人内皮祖细胞的动物中周围梗死区的心肌细胞岛包含了高频率的有DNA活性的心肌细胞，这通过抗心肌细胞特异性肌钙蛋白I和大鼠Ki-67的单克隆抗体反应的双染色来确定。相反，在接受盐水的动物中有高频的成纤维细胞形态的细胞，这些细胞与鼠Ki-67反应，但不和梗死区内肌钙蛋白反应。接受了2×105人内皮祖细胞的大鼠梗死区周围进行着细胞周期的心肌细胞比梗死区远端高40倍，而梗死区远端的心肌细胞DNA活性与假手术的大鼠没有区别。如图4d所示，接受2×105人内皮祖细胞的动物梗死周围区中处于细胞周期中的心肌细胞比未梗死心脏中的高20倍(1.19+0.2％vs 0.06+0.03％，p＜0.01)，比接受盐水的LAD结扎对照动物同一区域高3.5倍(1.19+0.2％vs 0.344+0.1％，p＜0.01)。当直接心内传递1.0μg/mlSDF-1于梗死心脏后静脉注射2×105人内皮祖细胞时，梗死周围区域的处于细胞周期中的心肌细胞数量比只静脉注射2×105人内皮祖细胞另外增加了1.9倍(图4e，p＜0.01)。这样，与LAD结扎的盐水对照相比，心内注射SDF-1与静脉注射2×105人内皮祖细胞相结合在两周时导致了大约8倍的周期内细胞累计增长，同时与只静脉注射2×105人内皮祖细胞相比，有超过4倍的LVEF改善，这由超声心动图显像确定(图4f，p＜0.01)。共同施用抗CXCR4单克隆抗体使LVEF的改善增强了2.8倍(p＜0.01)，但是心内注射IL-8却没带来任何另外的益处。
15周后成纤维组织与心肌比值的定量测定显示接受2×105内皮祖细胞和105内皮祖细胞加抗CXCR4单克隆抗体的组瘢痕/正常左心室心肌比例有显著下降，分别是13％和21％，而另外两组每组都是37-46％(p＜0.01)，图4g。由于这两组具有几乎相同的抵抗早期心肌细胞凋亡的保护水平，我们推断注射了2×105内皮祖细胞组中观察到的另外38％的瘢痕/心肌比率的降低反映了大容量新血管形成引起的营养供给所诱导的内生性性大鼠心肌细胞增殖/再生。这个假设解释了该组中所见到的功能改善。我们的结论是瘢痕尺寸与左心室肌肉组织的比率部分地反映了残余心肌细胞增殖和再生能力带来的正效应，除初始的梗死尺寸的负效应外还有抗细胞凋亡，心脏保护机制等正效应。中等尺寸和大尺寸新血管系统的总效应是保护细胞不发生细胞凋亡和诱导心肌细胞增殖/再生的结合，如图4h所示，其中与盐水对照相比，注射2×105内皮祖细胞使冠状动脉几乎完全补救，形成正常的中隔尺寸及最少的胶原沉积。
影响再生PAI-1抑制性催化性核酸促进人成血管细胞依赖性心肌细胞再生。
我们研究了由可抑制PAI-1表达的催化性核酸(命名为E2)所诱导的可能的新血管形成是否与心肌细胞的再生有关。单独注射E2没有诱导心肌细胞再生，尽管引起了新血管形成的增加。将E2注射与静脉注射人内皮祖细胞相结合显著地增加了心肌细胞的再生程度，比盐水对照增加了7.5倍(p＜0.01)。杂混DNA对照酶(E0)无此效果。而且，通过左心室射血分数确定，虽然单独使用E2两周后不能促进心肌功能，但E2与人内皮祖细胞结合使用引起的心肌功能恢复是单独使用人内皮祖细胞的2倍。这些结果强调了心肌细胞再生作为梗死后心脏功能改善的基本机制的重要性。由于结合使用E2和人内皮祖细胞使梗死周围区域的大毛细血管数量比单独使用其中的任何一种方法都高出62％，这些结果表明成血管细胞诱导的心肌细胞再生和心脏功能改善可通过使用心肌病治疗方法而得到优化，如抑制PAI-1表达的策略，这些治疗方法直接地，或者通过成血管细胞依赖的过程间接地促进了新血管形成。
利用肌钙蛋白和Ki67双染色，我们另外发现静脉注射人CD34+CD117亮成血管细胞使大鼠梗死周围区心肌细胞的增殖/再生比盐水对照增加了4倍(p＜0.01)。将E2注射与静脉传递人内皮祖细胞相结合显著地增加了心肌细胞的再生程度，比盐水对照增加了7.5倍(p＜0.01)。杂混DNA对照酶(E0)无此效果。
基因对心肌细胞增殖的效果我们假设心肌的新血管形成诱导了引起心肌细胞增殖所需的信号，那么对此进行模仿的治疗性介入就可能和缺血发作或其它损伤发作引起的心脏损伤的修复和再生具有显著的关系。
为了开始解决这个复杂的问题，我们采用了cDNA减除杂交技术。此技术使能够比较不同情况之间基因表达模式。我们最初的方法是比较正常大鼠心脏和左前降支(descending)(LAD)冠状动脉结扎48小时前的大鼠之间哪些基因的表达发生了变化。我们假设在缺血后48小时无论基因是被过表达还是低表达的改变的模式，新血管形成会使这种模式逆转向非缺血大鼠心脏的状态转变。
利用cDNA减除杂交法我们观察到一组基因显著的相互表达变化，这组基因的功能通过它们对在氧化应激或其它DNA损伤诱导因素后的细胞凋亡和细胞周期进程的调节而联系起来。虽然某些抗氧化基因如超氧化物岐化酶在缺血组织中的表达被正调节，但是由氯化高铁血红素，特别是亚铁血红素结合蛋白23(HBP23)和谷胱甘肽-S-转移酶所诱导的抗氧化应激应答基因却被负调节。而且，一个最近被鉴别的蛋白，维生素D3正调节蛋白(VDUP-1)在缺血心脏中被正调节，其mRNA表达被氧化应激后的过氧化氢(H2O2)所诱导，其功能与HBP23相平衡。前面我们看到抗氧化剂缺乏和氧化应激增加伴随的心肌梗死看起来直接牵涉到梗死后心脏衰竭的发病，而上述发现当与此现象一同考虑时显得格外引人注目(74，75)。
如图5所示，利用RT-PCR，HBP23和VDUP1在缺血心肌和正常大鼠心脏内的mRNA表达的交互变化得到证实。而且，静脉注射人成熟骨髓衍生性祖细胞和梗死区新血管发生两周后，此时大鼠组织中这两个基因的mRNA表达回复到正常水平。相反，在接受盐水的LAD结扎大鼠心脏中，与48小时的表达水平相比较，两周后未见这两个基因mRNA的表达有所变化。为了理解新血管形成对HBP23和VDUP1在缺血后这种表达的变化模式的影响和所观察到的保护心肌细胞抵抗凋亡并诱导心肌细胞增殖/再生现象这两者之间的关系，详细了解这两个基因所编码的产物对细胞凋亡和细胞周期进程的分子作用就显得重要起来。
当细胞增殖时，有丝分裂周期进程紧密地被一个正向和负向信号网络所调节。细胞周期从一阶段到下一阶段的进程被丝裂信号向周期表达的称为细胞周期蛋白(cyclin)的转导以及其后一个称为细胞周期蛋白依赖性激酶(cdks)的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族的激活和失活所控制(67)。见于DNA损伤，末端分化及复制性衰老这些不同过程中的生长停滞是由细胞周期进程的负调节引起的，两个功能不同的Cdk抑制子家族，Ink4和Cip/Kip家族，引发了这种负调节(64)。p21Cip1/WAF1的细胞周期抑制活性与其核定位及参与形成细胞周期调节剂四聚复合物密切相关，它通过N端域与G1细胞周期蛋白-CDK结合，并且通过C端域与增殖细胞核抗原(PCNA)结合，从而形成细胞周期调节子四聚复合物(68-71)。后者相互作用阻断了PCNA激活DNA聚合酶的能力，DNA聚合酶是主要的复制性DNA聚合酶(72)。生长停滞的细胞随后进入凋亡途径需要特异性凋亡刺激所提供的信号和细胞周期调节剂的共同作用。例如，半胱天冬酶介导的p21位点切割，与细胞调节蛋白A相关cdk2活性的正调节一起，被表明是诱导细胞凋亡的关键步骤，这是因为丧失了生长因子(73)或心肌细胞缺血而造成的(74)。
凋亡信号调节激酶1(ASK1)是细胞因子和应激诱导的细胞凋亡机制中的中枢成分(75，76)。在基础条件下，对ASK1介导的细胞凋亡的抵抗似乎是ASK1，细胞质p21Cip1/WAF1(77)，和巯基还原酶硫氧还蛋白(TRX)(78)之间形成复合物的结果。p21Cip1/WAF1在细胞质内的完整表达似乎对预防ASK1应答引起的细胞凋亡(75)和保持末端分化的状态都很重要(77)。而且，TRX的还原形式，而不是氧化形式，与ASK1的N端部份结合，并且是ASK1介导的细胞凋亡的生理抑制剂(78)。最近鉴定的VDUP1已表明与ASK1竞争结合于TRX的还原形式(78，79)，促进了ASK1介导的凋亡(80)。这表明ASK1介导的细胞凋亡可因导致TRX与ASK1的净解离的过程而增强，如TRX-VDUP1复合物的生成，或由细胞内伴随氧化应激而发生的还原状态的改变而生成氧化的TRX。
TRX和谷胱苷肽构成了胞内主要的还原系统，这个系统保持了胞质溶胶中巯基二氧化硫的状态(81)。TRX的氧化还原活性/二巯基活性部位是在所有物种中高度保守的，Trp-Cys-Gly-Pro-Cys-Lys。其中活性位点的两个半胱氨酸残基，Cys-32和Cys-35，进行着可逆的由一种NADPH-依赖性酶TRX还原酶催化的氧化还原反应。这些反应包括了通过二硫键进行的电子传递，其中的二硫键形成于一类称为peroxiredoxin(Prx)的抗氧化酶家族成员之间，这类酶显示过氧化物酶活性(82，83)。Prxs与其它过氧化物酶不同，它们没有辅助因子，如金属或辅基。Prxs通常在N和C端区域有两个保守的半胱氨酸(84)，并且它们的抗氧化活性与TRX系统的电子供体活性相偶联(82，85，86)。目前已鉴别出在大鼠(亚铁血红素结合蛋白23，HBP23)(87)，小鼠(鼠巨噬应激蛋白23，MSP23)(88)和人(增殖相关基因产物，PAG(89)和人自然杀伤细胞增强因子A(90))中有95％序列同源性的Prxs。
Prxs是一组氧化应激响应基因集合(repertoire)的成员，这组基因的表达受NF-E2相关因子2(Nrf2)调节，Nrf2与一种存在于每个的启动子的抗氧化效应元件(ARE)相结合(91)。这些包括了谷胱苷肽-S-转移酶，亚铁血红素加氧酶-1，和TRX。在基础条件下，Nrf2与胞质溶胶中特定的蛋白，Keap1，相结合(92)。然而，在氧化应激条件下，Nrf2与Keap1解离并易位至胞核，在那里它诱导了含ARE基序的抗氧化基因的转录表达。尽管确切的细胞外传导途径还未被阐明，Nrf2核易位及后续的ARE激活似乎依赖于磷酯酰肌醇3-激酶(PI3激酶)激活的途径(93)。另外，氯化高铁血红素是Nrf2从Keap1解离的有效诱导剂，导致TRX基因通过ARE转录(94)。
在细胞氧化还原快速变化期间，Prxs可能通过接受来自氧化形式TRX的电子用于维持还原TRX的胞质溶胶水平。这种稳态机制可能使保持足够的还原态TRX以保证与ASK1的充分结合及预防细胞凋亡成为可能。如果内生性Prx系统过载，这可能发生于有过量氧化态TRX生成的细胞氧化还原变化期间，细胞凋亡就可能因不受抑制的ASK1效应而发生。为了抵制这种情况，在氧化应激后必须有通过Nrf2核易位而引起的Prxs转录激活。这可通过氯化高铁血红素和PI3激酶依赖的机制下Nrf2与Keap1的解离而获得(93，94)，也可通过增加Nrf2 mRNA和蛋白的表达来实现，正如在氧张力增强时发生的那样(95，96)。
除直接与TRX反应以外，Prx基因产物(PAG，HBP23，MSP23，NKEF等)特异地结合于非受体酪氨酸激酶c-Abl的SH3域，抑制了能损伤DNA的试剂等许多刺激对其的激活(97)。c-Abl通过SH3的激活诱导了细胞周其停滞于G1阶段或诱导了细胞凋亡(98)。细胞周期停滞依赖于c-Ab1的激酶活性(96)并被c-Abl对细胞周期蛋白依赖性激酶Cdk2的活性进行负调节并诱导p21表达的能力所介导(99)。c-Abl的细胞凋亡效应依赖于核c-Abl磷酸化p73的能力，p73是可诱导细胞凋亡的肿瘤抑制蛋白p53家族的一员(100，101)。最近，有研究表明细胞质形式而不是核内的c-Abl被H2O2激活而且这导致了c-Abl定位于线粒体，c-Abl依赖性细胞色素c释放，以及氧化应激后的细胞凋亡(102，103)。通过与c-Abl在体内结合，PAG基因产物(有可能是另外一个Prxs)能够抑制由c-Abl过表达而诱导的酪氨酸磷酸化，并且能将细胞从c-Abl基因产物激活的细胞生长抑制和促凋亡效应中解救出来(97)。
我们发现Nrf2依赖性氧化应激效应基因在心肌缺血后被负调节，这可能反映了氯化高铁血红素和不供氧的直接效果。缺血心脏中Prx负调节的最终结果将会促进ASK1依赖性细胞凋亡和Abl依赖性细胞凋亡以及细胞周期停滞。同时观察到的VDUP1表达的增加将进一步促进ASK1依赖性细胞凋亡。这样，PAG或其它Prx mRNA或蛋白表达与VDUP1 mRNA或蛋白表达的比例可形成诊断检测的基础，该检测可用来预测缺血后心肌细胞凋亡及细胞周期停滞的风险程度，还可用来监测心肌缺血后对特定治疗的应答，这种应答保护心肌细胞免于凋亡性死亡并增强心肌的增殖和再生。
逆转心肌缺血后Prxs被减少了的表达将增加心脏内Prxs的水平，通过抑制c-Abl和还原氧化型的TRX以保护缺血心肌免于细胞凋亡，并通过抑制c-Abl对细胞周期进程从G1到S阶段的抑制效应而启动心肌细胞增殖/再生。
为了增加一组氧化应激响应基因的转录和活性，在缺血心肌中增加Nrf2 mRNA或使Nrf2蛋白从Keap1解离，或最好让两者同时发生，可保护心肌细胞免于凋亡并诱导氧化应激后心肌细胞细胞周期进程发生，这组氧化应激效应基因的表达被Nrf2和抗氧化应答元件(ARE)，包括Prxs，TRX和谷胱苷肽-S-转移酶，在启动子处的结合所抑制。
心肌缺血后降低VDUP1的表达将因减少了TRX与VDUP1的结合而保护缺血心肌免于细胞凋亡，并随之增强了TRX-ASK1的相互作用。
骨髓衍生性内皮祖细胞或者任何其它过程引起的心肌层新血管形成，是一个方法的例子，这个方法导致了心肌缺血后Prx表达的诱导和VDUP1表达的减少，也保护了细胞免于氧化还原介导的细胞凋亡以及诱导了心肌增殖/再生。
可预见特异性抑制Nrf2与Keap1结合的小分子对抵抗细胞凋亡具有相似的保护效果并在缺血后诱导心肌增殖与再生。相似地，可预见特异性抑制TRX与VDUP1结合的小分子将对缺血后抵抗心肌细胞凋亡有相似的保护作用。
可预见心肌缺血后用小分子特异性地抑制c-Abl酪氨酸激酶的活性将对缺血后抵抗心肌细胞凋亡有相似的保护作用并在缺血后诱导心肌增殖与再生。一个用来抑制c-Abl酪氨酸激酶的小分子的例子是STI-571。在心肌梗死后使用这个或相关的分子可抵抗心肌细胞凋亡并诱导心肌增殖/再生。
VDUP-1特异性DNA酶切割合成的大鼠VDUP-1寡核苷酸通过减除杂交技术，我们发现VDUP1蛋白的mRNA表达在急性缺血心脏中显著升高。已有研究表明VDUP1与胞质蛋白硫氧还蛋白TRX结合，TRX的功能是维持胞质内巯基二硫化物的状态。通过结合于还原型的TRX，VDUP1阻止了还原型TRX进行由NADPH依赖性酶TRX还原酶催化的可逆氧化还原反应的能力。这产生了因胞质和线粒体中过量氧化基团的生成而导致的细胞凋亡。
VDUP1与另一个通常结合于还原型TRX的胞质蛋白，凋亡信号调节激酶1(ASK1)，竞争和TRX的结合。ASK-1是细胞因子和应激诱导的细胞凋亡机制中的中枢成分。它的激活导致过量的p38 MAP激酶磷酸化和激活，p38 MAP激酶是细胞凋亡的主要介导者。还原型TRX，而不是氧化型TRX，结合于ASK1的N端部分，是ASK1介导的细胞凋亡的生理抑制剂。VDUP1和TRX的结合导致ASK1和TRX的净解离效果，潜在地促进了ASK1介导的p38 MAP激酶依赖性途径的细胞凋亡。
至于心脏内VDUP1的过表达，其预期的效果将是由过量的p38 MAP激酶活性和氧化性氧化还原反应损伤引起的后果，包括心肌细胞凋亡，成纤维细胞增殖，胶原分泌和瘢痕形成。类似的效果将是可预见随之而来的VDUP在其它发生急性或慢性缺血性损伤组织中的过表达，如脑血管缺血/中风后的大脑。
我们已经开发了一种靶向于VDUP1 mRNA的DNA酶。这种DNA酶，一旦输送至缺血心肌(或大脑等其它缺血组织)能抑制局部的VDUP1mRNA和蛋白表达，从而降低了p38 MAP激酶的激活和氧化损伤。
如图12所示，酶浓度在0.05uM到5uM之间时，序列特异性VDUP1DNA酶以一种浓度-时间依赖的方式切割人工合成的大鼠VDUP1寡核苷酸。
VDUP1 DNA酶减少了成纤维细胞增殖并抵抗心肌细胞凋亡。如图13(a)所示LAD结扎48小时后心内注射大鼠序列特异性VDUP1 DNA酶，两周后心脏成纤维细胞增殖比注射杂混DNA酶的对照平均抑制了75％(p＜0.01)。另外，如图13(b)所示，VDUP1 DNA酶注射使梗死周围区心肌细胞凋亡相对于注射杂混DNA酶的对照降低了20％。
VDUP-1 DNA酶在急性梗死后减小了心肌瘢痕并促进了心脏功能。对成纤维细胞增殖和心肌细胞凋亡的抑制导致了沉积于梗死区的成熟瘢痕显著降低，从接受对照杂混DNA酶动物的平均35％降低到接受VDUP1DNA酶动物的20％，图14(a)(p＜0.01)。最引人注意的是其在心脏功能上的作用。如图14(b)所示，通过射血分数测定，接受VDUP1 DNA酶的动物显示心脏功能平均50％的恢复，而接受无序对照DNA酶的动物则无可见的改善(p＜0.01)。
VDUP1 DNA酶明显防止了心肌细胞凋亡、心脏成纤维细胞增殖和瘢痕形成，使急性缺血后心脏功能显著增强。这些作用可能是阻止p38 MAP激酶活化和抵抗氧化还原损伤的结果。类似的结果可通过在脑血管缺血后的大脑等其它血流减少的组织中使用VDUP1 DNA酶而得到。
G-CSFG-CSF是心肌梗死后比GM-CSF更有效的新血管形成诱导剂。如图15(a)所示，左前降支(LAD)冠状动脉结扎诱发心肌梗死后两天进行皮下注射10ug/kg人G-CSF四天的大鼠在两周后梗死周围区大内径血管的数量比盐水处理的对照高约7.5倍(p＜0.01)。依同样给药方案使用大鼠GM-CSF就不如此有效，尽管与对照动物相比仍然诱导了多出4倍数量的大内腔血管。
另外，G-CSF是在心肌梗死后比GM-CSF更有效的心肌细胞凋亡抑制剂。G-CSF注射液是比同样给药方案下的GM-CSF更有效的抵抗心肌细胞凋亡的试剂，图15(b)。给药G-CSF两周后使梗死周围区凋亡的心肌细胞比盐水下理的对照降低了36+16％(p＜0.01)，而GM-CSF只使凋亡的心肌细胞降低了12+9％。
G-CSF是在心肌梗死后比GM-CSF更有效的心肌再生诱导剂。下面我们检测了骨髓活化对心肌细胞循环/再生及心脏功能恢复的作用。如图16(a所示，左前降支(LAD)冠状动脉结扎诱发心肌梗死后两天进行皮下注射10ug/kg人G-CSF四天的大鼠在两周后梗死周围区循环期内心胸细胞的数量比盐水处理的对照高约3.2倍(p＜0.05)。依同样给药方案使用大鼠GM-CSF就不如此有效，使循环期内心肌细胞的数量增加了2.6倍。如图16(b)所示，这与心脏功能的恢复有关。然而通过射血分数测量的盐水处理动物在梗死后2到14天内心脏功能有平均17％的损失，GM-CSF治疗的动物只有10％的心脏功能损失，而G-CSF治疗的动物实际上心脏功能平均提高了10％(P＜0.01)。我们认为这些功能数据反映了G-CSF骨髓活化在心肌新血管形成，抵抗心肌细胞凋亡和诱导心肌细胞循环中的出色作用。
抗CXCR4抗体静脉注射抗CXCR4抗体在急性梗死后增加了心肌新血管形成并改善了心肌功能。G-CSF导致骨髓元素活化的机理是阻断了驻骨髓干细胞上趋化因子受体CXCR4和其配体SDF-1之间的相互作用。G-CSF诱导了CXCR4 N-端的切割和直接切割并使SDF-1失活的丝氨酸蛋白酶的积累。为了检测G-CSF对心肌新血管形成和心脏功能改善的作用是否是相似的机理，我们在LAD结扎后48小时静脉注射单克隆抗CXCR4抗体，研究了阻断CXCR4-SDF1相互作用的效果。如图17(a)所示，使用抗体2周后接受抗CXCR4单克隆抗体的动物在梗死周围区的新血管形成比接受盐水的对照或抗CXCR2单克隆抗体的对照增加了两倍。而且，如图17(b)所示抗CXCR4治疗的动物射血分数平均恢复了10％，而接受抗CXCR2单克隆抗体的动物心肌功能平均损失了8％(p＜0.05)。这些数据支持了这样一个概念，所观察到的G-CSF给药的作用是来自于阻断CXCR4在骨髓中的相互作用，使内皮祖细胞向周围循环系统运动并靶向缺血心肌，在这里新血管形成的结果使心肌功能得到改善。
SDF-1SDF-1 mRNA的表达不在急性缺血心肌的早期被诱导，并且其较迟的诱导被GM-CSF所抑制。下面，我们试图找到一种策略，在此策略下GM-CSF的作用可被促进到接近用G-CSF单独治疗的程度，如增加急性缺血心肌中趋化信号。由于CD34+骨髓干细胞的趋化作用被CD34+细胞上的CXCR4受体和CXC趋化因子SDF-1之间的相互作用所调节，我们研究了SDF-1 mRNA的表达是否在急性缺血心肌中被诱导。如图18所示，LAD结扎后48小时的实验动物心肌SDF-1 mRNA的表达与非缺血对照相比未观察到任何区别。梗死后2周，心肌SDF-1 mRNA表达比盐水处理对照增加了3.3倍(p＜0.01)。我们认为这种延迟的SDF-1合成最可能的是反映了巨噬细胞等浸润细胞的加工作用。相反，使用合成的GM-CSF两周后引起SDF-1 mRNA表达大约4.5倍的抑制，降到实际比非缺血对照还低的水平。由于SDF-1是内皮祖细胞有效的趋化因子，这些数据暗示使用合成的GM-CSF可能会因降低了SDF-1等趋化因子配体的心肌表达而导致内皮祖细胞的次最佳的心肌寻靶。
急性心肌梗死后心内注射SDF-1导致了新血管形成和抵抗心肌细胞凋亡。为了确定急性缺血心脏中改变了的SDF-1表达是否影响内皮祖细胞的趋化作用和心肌功能，我们检测了LAD结扎后48直接心内注射SDF-1蛋白的效果。如图19(a)和(b)所示，LAD结扎后2天在5个梗死周围位点心内注射总体积0.2ml的4ug/kg人重组SDF-1，两周后与接受心内注射盐水的对照动物相比，新血管形成增加了5倍，梗死周围区凋亡的心肌细胞减少了44+9％(两者均有p＜0.05)。心内注射SDF-1对新血管形成及抵抗心肌细胞凋亡程度的作用与G-CSF全身给药得到的结果十分相近。尽管外加GM-CSF皮下给药导致了心肌新血管形成的协同增加，未见有另外的抵抗心肌细胞凋亡的益处。这些结果暗示新血管形成诱导的抵抗心肌细胞凋亡作用是有限的，不能通过诱导另外的新血管而进一步改善。
心内注射SDF-1诱导了心肌细胞再生。如图20(a)所示，LAD结扎后2天在5个梗死周围位点心内注射总体积0.2ml的4ug/kg人重组SDF-1，两周后与接受心内注射盐水的对照动物相比，处于细胞周期中的细胞数量增加了4.5倍(p＜0.01)。附加GM-CSF的全身给药则导致心肌细胞再生的协同效应。值得注意的是，经SDF-1和GM-CSF结合治疗的动物梗死周围区的处于细胞周期内的心肌细胞数量超过了只接受G-CSF治疗的动物(分别比盐水处理的对照高7倍和3.2倍，p＜0.01)。由于SDF-1和GM-CSF结合治疗的动物梗死周围区大内腔血管的平均数量与只接受G-CSF治疗的动物相似(分别为8.0和7.5/高倍视野)，因此这些数据暗示SDF-1增强心肌细胞循环/再生是通过与诱导新血管形成所不同的另外的机制实现的。
心内注射SDF-1改善了心脏功能并与骨髓活化有协同作用。心内注射SDF-1导致了与G-CSF系统给药相似程度的功能性心肌恢复(LAD结扎后2-14天之间射血分数平均增加了10％，接受G-CSF治疗的动物平均增加了10％，而盐水处理的对照平均减少了17％，两种治疗均有p＜0.01)。最引人注意的是，SDF-1注射与用GM-CSF使骨髓活化相结合导致了功能恢复的显著提高(射血分数平均提高了21％，p＜0.01)，图20(b)。这些数据表明心内注射SDF-1通过两种独立的机制使急性缺血后心脏功能得到改善，一种直接的机制包括诱导心肌细胞循环和再生，另一种间接的机制通过增强活化的骨髓衍生性内皮祖细胞的趋化作用和增强心脏新血管形成来发挥作用。最佳结果可能出现于心内联合使用SDF-1和最有效的骨髓内皮祖细胞活化剂，包括G-CSF和其它抑制骨髓内CXCR4与SDF-1相互作用的试剂。
方法与材料趋化因子活化了的人CD34+细胞的纯化和鉴定从连续四天每天接受10mg/kg G-CSF(Amgen，CA)的人体内获得单个供体的白细胞去除后的产物。供体是为异源干细胞移植而经历骨髓活化、收获和分离等标准通用程序的健康个体。单核细胞通过菲柯尔-泛影钠分离，通过利用包被了抗CD34单克隆抗体的磁珠(Miltenyi Biotech，CA)得到高纯CD34+细胞(＞98％阳性)。纯化了的CD34细胞经荧光素染色，这些荧光素偶联抗CD34和CD117(Becton Dickinson，CA)，AC133(Miltenyi Biotech，CA)，CD54(Immunotech，CA)，CD62E(BioSource，MA)，VEGFR-2，Tie-2，vWF，eNOS，CXCR1，CXCR2，和CXCR4(所有Santa Cruz Biotech，CA)的单克隆抗体，染色后用FACScan(Becton Dickinson，CA)四参数荧光法进行分析。选出的CD34表达阳性细胞再经偶联抗CD117单克隆抗体的藻红蛋白(PE)(BectonDickinson，CA)染色，然后用Facstar Plus(Becton Dickinson)和PE过滤器分成亮荧光和暗荧光。GATA-2的细胞内染色，用PharmingenCytofix/CytopermTM试剂盒从每个发亮荧光和暗荧光的细胞群中透化处理一百万个细胞，和1μl偶联CD117和CD34表面抗原的双抗单克隆抗体的荧光染料(Becton Dickinson，CA)冰上共育30分钟。4℃下重悬于250μlCytofix/CytopermTM溶液后20分钟，再将细胞与抗GATA-2单克隆抗体或抗IgG对照标记的荧光染料4℃下温育30分钟，然后用三参数流式细胞计量术进行分析。
人骨髓衍生性内皮祖细胞的趋化作用高纯CD34+和CD117亮(＞98％纯度)t细胞置于有膜48孔趋化作用板上(8mm孔)(Neuro Probe，MD)。37℃温育2小时后，将板倒置，细胞在含有浓度分别为0.2，1.0和5.0μg/ml的IL-8，SDF-1α/β，和SCF的培养基中培养3小时。膜用甲醇固定并经LeukostatTM(Fischer Scientific，Ill)染色。通过10个高倍视野内的迁移细胞计数来计算趋化作用。
实验动物，外科手术过程，人细胞注射，和细胞迁移入组织的定量Rowett(rnu/rnu)无胸腺裸大鼠(Harlan Sprague Dawley，Indianapolis，Indiana)经“哥伦比亚大学动物保护和使用委员会”认可后用于实验研究。麻醉后，实施左胸廓开胸术，打开心包膜，然后结扎左前降支(LAD)冠状动脉。假手术的大鼠经历相似的手术过程，但没有冠状动脉的缝合。对于细胞迁移研究，LAD结扎后48小时把从G-CSF活化的单一供体得到的2.0×106CD34+细胞单独或与50μg/ml已知抑制功能活性的抗人CXCR1，人CXCR2，人CXCR4，大鼠SDF-1(均来自R&D Systems，MN)，人CD34(Pharmingen，CA)，或大鼠IL-8(ImmunoLaboratories，日本)单克隆抗体共同注射入尾静脉。对照动物LAD结扎后接受同一浓度的同类对照抗体或盐水。注射前，将2.0×106人细胞和2.5μg/mL荧光羰花青(carbocyanine)DiI染料在37℃下共同孵育5分钟，然后在4℃下孵育15分钟。用PBS洗涤后，DiI标记的人细胞重悬于盐水并静脉注射。2.0×106CD34+人细胞也注射入假手术大鼠或接受了三次人IL-8，SDF-1，SCF或盐水注射的大鼠的尾静脉中。每组由6-10只大鼠构成。通过测定注射两天后被处死的大鼠心脏内的DiI荧光强度定量测定人细胞注射后的心肌细胞浸润(表示为每个高倍视野DiI阳性细胞的数量，每个样品至少检测5个高倍视野)。对12只大鼠在基线，2、7、14天时人细胞对大鼠骨髓渗入度的定量测定通过用流式细胞和RT-PCR技术分析I类HLA阳性细胞与大鼠骨髓细胞总量的比值来进行。对于新血管形成和其对心肌存活性及功能的影响的研究，从G-CSF活化的单一供体得到的2.0×106DiI标记人CD34+细胞用103，105，或2.0×105免疫纯的CD34+CD117亮细胞重建，在LAD结扎后48小时注入到大鼠尾静脉中，同时使用或不使用已知抑制活性的抗CXCR4单克隆抗体。每组包括6-10只大鼠。在第2周和第15周进行组织和功能研究。
大鼠CXC趋化因子mRNA和蛋白表达的测定用标准方法从3只正常和12只LAD结扎的大鼠心脏中提取Poly(A)+mRNA。用RT-PCR定量测定大鼠IL-8和Gro-αmRNA在基线以及LAD结扎后6、12、24和48小时的心肌表达，用GAPDH表达测定的大鼠mRNA总量进行归一化。用寡(dT)15-链节(mer)和随机六聚物启动，被莫洛尼氏白血病毒反转录酶(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)反转录后，用Taq聚合酶(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，放射性标记的双脱氧核苷酸([a32P]-ddATP3,000Ci/mmol，Amersham，Arlington Heights，IL)，和大鼠Cinc(人IL-8/Gro-α的大鼠同源物和GAPDH，Fisher Genosys，CA)进行聚合酶链式反应(PCR)扩增。大鼠Cinc和GAPDH的引物对(正链/反义链)分别是gaagatagattgcaccgatg(SEQ ID NO4)/catagcctctcacatttc SEQ ID NO5)，gcgcccgtccgccaatgagctgcgc SEQ ID NO6)/cttggggacacccttcagcatcttttgg SEQID NO7)，和ctctacccacggcaagttcaa SEQ ID NO8)/gggatgaccttgcccacagcSEQ ID NO9)。标记了的样品加样于2％琼脂糖凝胶，用电泳分离，并于-70℃下放射自显影6小时。用市售抗IL-8/Gro大鼠同源Cinc多克隆抗体ELISA试剂盒(ImmunoLaboratories，日本)检测LAD结扎6、12、24、48小时及基线的大鼠IL-8/Gro-α在血清中的水平。每个血清样品中的蛋白量根据用通过已知大鼠IL-8/Gro-α蛋白浓度建立的吸光度标准曲线进行计算。抗Cinc抗体还根据制造商的说明书稀释1∶200倍用于免疫组化研究以鉴别LAD结扎后的大鼠心肌Cinc合成的细胞来源。染色阳性的细胞在下述抗生物素蛋白/生物素系统中显棕色。
组织学及梗死尺寸测量在第2周和第15周切除后，每个实验动物的左心室从上至下被切成10-15个横剖面。有代表性的切片用福尔马林固定并作常规组织学染色(H&E)以检测心肌的细胞构成，表示为每个高倍视野(HPF)的细胞数量(600x)。马森三染色，将胶原染成蓝色而心肌染成红色，被用来半定量(0-3+)评估胶原含量，1+为浅蓝，2+为浅蓝和深蓝斑点，3+为深蓝染色。这使心肌瘢痕的尺寸能通过数码相机分析仪进行检测。梗死表面的长度，包括心表和心内区，通过一种数码成像面积分析仪进行测量并表示为心室总周长的百分数。最终的梗死尺寸取每个心脏样品的所有切片的均值进行计算。所有研究对操作实验的病理学家保密。梗死尺寸表示为左心室面积的百分数。最终的梗死尺寸取每个心脏样品的所有切片的均值进行计算。
毛细血管密度定量为了定量测定毛细血管密度及其种群来源，另外的切片用定向抗大鼠或人CD31(分别是Serotec，UK，和ResearchDiagnostics，NJ)，VIII因子(Dako，CA)和大鼠或人I类MHC(AccurateChemicals，CT)的单克隆抗体(Accurate Chemicals，CT)进行新鲜染色。在平滑肌层存在下从大毛细血管中分离出小动脉，并用抗肌肉特异性结蛋白单克隆抗体(Dako，Ca)对切片染色以进行鉴别。使用抗生物素蛋白/生物素封闭试剂盒，大鼠可吸收的生物素酰抗鼠IgG，和过氧化物酶结合剂(均自Vector Laboratories Burlingame，CA)进行过氧化物免疫酶标记法染色。梗死两周后用抗CD31单克隆抗体标记的切片确定毛细血管密度，并用抗VIII因子的单克隆抗体验证，与未受损心肌中毛细血管密度相对比。结果表示为每HPF(400x)CD31阳性毛细血管数。
心肌细胞增殖的定量测定心肌细胞DNA合成及细胞循环通过对注射了盐水或人CD34+细胞两周后的LAD结扎心肌组织切片进行心肌细胞特异性肌钙蛋白I和人或鼠特异性Ki67双染色而测定，用健康大鼠作为阴性对照。简单地说，石腊包埋的切片在0.1M EDTA缓冲液中用微波炉加热，然后用1∶3000稀释的抗大鼠Ki-67初级单克隆抗体(赠自GiorgioCatoretti，Columbia University)或1∶300稀释的人Ki-67初级单克隆抗体(Dako，CA)进行染色并于4℃培育过夜。洗涤后，切片与和碱性磷酸酶以1∶200稀释比例相连的种特异性第二抗体(Vector Laboratories Burlingame，CA)共同温育30分钟，正染色的细胞核用BCIP/NBT底物试剂盒(Dako，CA)显为蓝色。然后切片在4℃与抗心肌特异性肌钙蛋白I单克隆抗体(AccurateChemicals，CT)共同温育过夜，正染色的细胞用上述抗生物素蛋白/生物素系统显为棕色。心肌细胞在梗死区，梗死周围区和远离梗死区域的细胞循环进程以每个高倍视野表达Ki-67的肌钙蛋白阳性细胞的比例计算。
用石腊组织切片DNA末端标记技术测定心肌细胞凋亡对于单细胞水平的凋亡原位检测我们采用了脱氧核苷酸转移酶(TdT)(BoehringerMannheim，Mannheim，德国)介导的DNA末端标记TUNEL法。大鼠心肌组织切片来自注射了盐水或人CD34+细胞两周后的LAD结扎的大鼠，以来自健康大鼠的相应切片作为阴性对照。简单地说，组织用二甲苯去石腊，用分级乙醇和两次磷酸缓冲液(PBS)洗涤脱水。然后组织切片用蛋白酶K(10μg/ml溶于Tris/HCL)在37℃下消化30分钟。然后将切片在PBS中洗涤3次，与50μl TUNEL反应混合液(TdT和荧光标记的dUTP)在37℃湿润空气中共同温育60分钟。阴性对照的TdT根据反应混合液估算。在PBS中洗涤3次后，切片与荧光偶联碱性磷酸酶(AP)特异性抗体(Boehringer Mannheim，Mannheim，Germany)共同孵育30分钟。TUNEL染色在一种使细胞核中DNA片断染为蓝色的底物系统中显色(BCIP/NBTsubstrate system，Dako，Carpinteria，CA)。置于于PBS中3分钟使该反应终止。为了确定心肌中染成蓝色的凋亡细胞核的比例，用结蛋白特异性单克隆抗体对组织复染。用3％过氧化氢酶的PBS溶液作用15分钟以封闭内生性过氧化物酶，然后用20％山羊血清溶液洗涤。抗肌钙蛋白I抗体(Accurate Chemicals，CT)在40℃下孵育过夜(1∶200)。3次洗涤后，用抗兔IgG抗体作用切片，然后用生物素偶联的二抗(Sigma，Saint Louis，Missouri)作用30分钟。加入抗生物素蛋白-生物素复合物(Vector Laboratories，Burlingame，CA)再作用30分钟，置于DAB溶液混合物(Sigma，Saint Louis，Missouri)中5分钟后肌细胞显棕色。组织切处用显微镜在200倍放大下观察。在每个200x镜区检察4个区域，每区域包含至少250个细胞和计约1mm2组织，包括梗死周围区和远离梗死区。组织边缘的被染色的细胞不被计数。结果表示为每个检测位置上每平方毫米凋亡心肌细胞的平均数量。
心脏功能分析用一种高频线性传感器阵列(SONOS 5500，HewlettPackard，Andover，MA)进行超声心动图研究。二维图象通过中间乳突(mid-papillary)和顶端水平得到。舒张末期(EDV)和收缩末期(ESV)左心室体积通过双-平面区域长度法得到，左心室射血分数的百分数依[(EDV-ESV)/EDV]×100计算。
CDNA减除杂交法简单地说，从每个心脏中分离信使RNA，1μg用于用随机引物合成cDNA的第一链。减除杂交法使用了PCR选择cDAN减除试剂盒(CLONTECH)，依制造商的建议操作。当第二链合成后，这两个cDNA文库用RsaI进行消化。“试验者(tester)”文库的消化产物连接到一个特殊受体上(T7启动子)，然后与30倍过量的减除“驱动(driver)”文库杂交。杂交后得到的产物用PCR进行扩增。正向减除确定了缺血样品中被过表达的基因，其中缺血组织是那个“试验者”，而正常组织是那个“驱动者”。在反向减除中，“试验者”和“驱动者”变成用来确定缺血样品中被负调控了的蛋白。
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实验结果II静脉施用人骨髓衍生性内皮祖细胞诱导梗死后五天内新血管形成并防止心肌细胞凋亡。
我们试图确定在大鼠永久性LAD结扎的48小时内静脉注射人骨髓衍生性内皮祖细胞会使心脏在多久时间内发生新血管形成。当动物在静脉注射通过G-CSF活化得到的DiI标记的人CD34+细胞(＞98％ CD34纯，含6-12％CD117亮成血管细胞)两天后被处死时，梗死周围区可见大量DiI阳性的间质细胞，但无法鉴别出表达DiI的确定的血管结构，数据未显示。相反，注入人CD34+细胞五天后被处死的动物在梗死周围区域表现出大量的DiI阳性血管结构，并且毛细血管的数量比接受盐水的大鼠高3.5倍，图21(a)(p＜0.01)。第五天心肌毛细血管的增长伴随着梗死周围区心肌细胞凋亡数量相对于接受盐水的对照动物3.3倍的降低，这通过肌钙蛋白I和TUNEL双染阳性来确定，图21(b)(p＜0.01)。这些数据共同表明从骨髓衍生性成血管细胞分化和组织成成熟的、有功能的缺血心肌毛细血管网络的血管生成过程需要2到5天的时间。
人骨髓衍生性内皮祖细胞的静脉内给药诱导了心肌细胞祖细胞的细胞循环和心肌细胞分化。
我们用免疫组织化学方法和聚焦显微术对五天时处死的实验动物和对照动物的心脏组织检查以寻找心肌细胞循环的证据，据认为这在急性局部缺血后的成人心脏内可能很少发生。尽管实验动物和对照动物在梗死后5天都未检测到肌钙蛋白阳性的心肌细胞循环，但接受人骨髓衍生性CD34+细胞的动物在梗死周围区域表现出大量小的，循环着的大鼠源的细胞簇，这些通过大鼠Ki67特异性单克隆抗体确定。这些细胞对心肌细胞分化的标志物心肌特异性肌钙蛋白I呈阴性，但呈α-肌节肌动蛋白染色阳性，表明它们是成熟的心肌谱系细胞。在注射盐水的对照动物中未见有类似的循环着的心肌细胞簇。
使用人CD34+细胞两周后处死的动物组织不再呈现小的，循环着的心肌祖细胞簇，取而代之的是在梗死周围区域高频率的大的、具有可检测的DNA活性的成熟大鼠心肌细胞，这通过抗心肌细胞特异性肌钙蛋白I和大鼠Ki67单克隆抗体双染色而确定，图22(b)和(c)。接受人内皮祖细胞的动物体内梗死周围区域的成熟心肌细胞数量比LAD结扎的接受盐水的对高4倍(p＜0.01)，后者中有高频率的呈成纤维细胞形态的细胞，它们与大鼠Ki67反应，但不与肌钙蛋白I反应。我们推测梗死后接受人内皮祖细胞14天后的动物身上看到的循环着的成熟的心肌细胞是5天时在相同解剖学部位看到的小的循环着的不成熟心肌祖细胞随着新血管形成而分化的结果。究竟这些循环着的心肌祖细胞是通常驻留于心脏中处于休眠期的原位心脏干细胞，还是从体内别处迁移到心脏来的，还有待研究。
HBP23，一种大鼠保护细胞抵抗氧自由基损伤的peroxiredoxin，在心肌的表达因缺血而降低，因新血管形成而升高。下面我们试图鉴别一种分子机制以解释梗死周围区新血管形成和邻近区域心肌祖细胞增殖/再生的关系。首先我们进行cDNA减除杂交以鉴别正常大鼠心脏和LAD结扎后48小时大鼠心脏在基因表达上的变化模式。由于随着心肌梗死发生的抗氧化剂的不足及氧化应激的增加已经直接关系到梗死后心脏衰竭的发病机理(13-15)，因此我们选择检测特定抗氧化剂基因表达的变化。有一组称为peroxiredoxin的抗氧化剂家族，表现过氧化物酶活性(16)并被氧气所诱导(17)，对调节细胞在缺血等氧化应激期间得以存活起到关键作用。它们通过进行可逆氧化还原反应帮助保持半胱氨酸的巯基二氧化物状态，其中的氧化还原反应包括电子经与硫氧还蛋白(TRX)间形成的二硫键传递，TRX构成了哺乳动物细胞间的主要还原系统之一(18)。另外，peroxiredoxin能抑制被氧化应激诱导的c-Abl酪氨酸激酶活性(19，20)，还能把细胞从活化的c-Abl基因产物所诱导的前凋亡状态或细胞周期停滞状态中解救出来(21)。通过cDNA减除杂交，我们发现LAD结扎48小时后的大鼠心脏中大鼠peroxiredoxin HBP23 mRNA的表达比正常大鼠心脏减少了。RT-PCR表明，LAD结扎后两周后大鼠心脏内的HBP23 mRNA水平比正常大鼠平均下降了34％，图23(p＜0.01)。相反，LAD结扎后接受了人成血管细胞两周后大鼠心脏内的HBP23 mRNA水平回复到比未缺血对照只差14％。由于peroxiredoxin mRNA的表达被氧气所诱导，这些数据说明HBP23mRNA的表达可能为急性缺血事件所抑制，也可能被随后的血管生成细胞依赖性新血管形成所诱导。
生成一种DNA酶以切割HBP23 mRNA。为了研究诱导的HBP23表达是否与新血管形成影响心肌细胞凋亡、再生/增殖及功能有关，我们合成了一种催化性DNA酶，其靶序列为大鼠HBP23基因上的特殊序列(22，23)。我们选择特异性靶向大鼠HBP23上翻译起始位点AUG附近的嘧啶-嘌呤连结处，该区域在不同物种之间保守并具有低的相对自由能(24)。在这个区域，大鼠HBP23序列与人的同源基因，增殖相关基因(PAG)，只相差一个碱基。为了合成对照DNA酶，HBP23 DNA酶两条侧臂上的核苷酸序列被打乱而未改变催化域。每个分子的3’端加了反向3’-3’相连的胸腺嘧啶帽以抵抗3’-到-5’核酸外切酶的消化。
该HBP23特异性DNA酶以一种剂量和时间依赖性方式对根据HBP23mRNA序列合成的23-碱基寡核苷酸进行切割，图24(a)。相反，该DNA酶不能切割由与大鼠HBP23寡核苷酸只相差一个碱基的人同源基因PAG合成的23-碱基寡核苷酸，表明了其精密的目标特异性。一种对人PAG基因同样翻译起始位点有特异性的酶能有效切割PAG寡核苷酸，但不能切割由HBP23合成的寡核苷酸(数据未显示)。杂环的对照DNA酶不能切割二者中的任何一个。为了确定该DNA酶对内生性HBP23合成的作用，取自大鼠胎儿心脏的心肌单分子层被培养至会合并用种性特异性DNA酶或杂混(scrambled)对照进行转染。细胞mRNA反转录后RT-PCR产物的光密度分析显示HBP23 DNA酶抑制所培养大鼠细胞稳态的mRNA水平比杂混DNA对照低了80％，图24(b)。
DNA酶的体内给药防止了大鼠心肌内HBP23 mRNA的诱导新血管形成不受影响，但其对心肌细胞凋亡、再生和功能的影响被消除了。为了研究实验中心肌梗死体内诱导表达的HBP23的作用，向LAD结扎后48小时的大鼠静脉注射人骨髓衍生性内皮祖细胞和心肌注射HBP23 DNA酶或杂混对照。如图25(a)所示，HBP23 DNA酶对人骨髓衍生性成血管细胞诱导新血管形成并无影响。给药5天后被处死时，接受人内皮祖细胞的大鼠，无论共同注射的是HBP23 DNA还是杂混对照，与盐水对照相比都显示出毛细胞血管密度增加。然而，注射HBP23 DNA消除了新血管形成的抗细胞凋亡作用，图25(b)，和心脏功能和促进，图25(c)，而注射杂混对照则无此现象。在接受了人内皮祖细胞并表现出心肌新血管形成的动物中，HBP23 DNA酶处理导致心肌细胞凋亡水平增加了1.7倍(p＜0.01)，并且超声心动图显像表明心脏功能平均下降了38％(p＜0.01)。另外，HBP23DNA酶对心肌祖细胞增殖/再生也有显著的影响。然而在接受成血管细胞和杂混DNA的动物中可轻易检测到梗死周围区表达Ki67和α-肌节肌动蛋白的大鼠小细胞簇，在接受HBP23 DNA酶的动物中则检测不到。这些结果清楚地表明成血管细胞依赖性新血管形成保护了心肌细胞免于凋亡并通过peroxiredoxin基因产物所调节的途径诱导驻留的心肌细胞谱系祖细胞增殖/再生。
讨论在本研究中我们显示由人骨髓衍生性内皮祖细胞引起的缺血心肌新血管形成不但保护了梗死周围区域成熟心肌细胞免于凋亡，而且还刺激了该位置心肌祖细胞进入细胞循环、增殖和再生。而且，我们显示看起来成血管细胞依赖性新血管形成调节心肌存活和自我更新的机制中至少包括了一个基因家族涉及氧化应激伴随的抗凋亡和前增殖途径，peroxiredoxin家族。虽然氧张力正向调节peroxiredoxin基因的表达(17)，但这是否是成血管细胞介导的新血管形成对HBP mRNA表达有正向影响的唯一解释还不清楚。由于peroxiredoxin mRNA表达被蛋白激酶Cδ所诱导(25)，因此骨髓衍生性成血管细胞有可能是调节蛋白激酶Cδ活性并进而调节细胞存活的细胞外信号来源，如FGF-1(26)。
伴随着心肌梗死而产生的抗氧化剂缺乏和氧化应激增加与梗死后心脏衰竭有直接关系(13-15)。我们的研究表明梗死后降低了的peroxiredoxin水平可能是随后左心室改变及衰竭的直接原因。peroxiredoxin的抗氧化作用与TRX系统生理电子供体的活性相偶联(27-29)。另外为了直接与TRX相作用，peroxiredoxin基因产物特异性结合于一种非受体酪氨酸激酶c-Abl的SH3域以抑制其活性(21)。由DNA损伤试剂等刺激通过SH3域引起的c-Abl活化诱导了细胞生长停滞于G1期或细胞凋亡(30)。细胞循环停滞依赖于c-Abl的激酶活性，该活性对细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶Cdk2进行负调节并诱导p21的表达(31)。通过在体内与c-Abl相结合，peroxiredoxin能够抑制由c-Abl过表达引起的酪氨酸磷酸化并将细胞从活化了的c-Abl基因产物的细胞生长抑制作用和促凋亡效应中解救出来(32)。我们的体内实验表明与定向抗大鼠peroxiredoxin HBP23的DNA酶同时使用消除了缺血大鼠心脏中人成血管细胞依赖性新血管形成的抗凋亡和前增殖作用，这强烈证明这个基因家族是与新血管形成促进心脏功能并防止心脏衰竭这一行为的机制直接相关的。
年轻和年老细胞混合存在于正常心肌的整个生命周期中。尽管大多数肌细胞似乎是终端分化了的，仍然有一部分年轻的肌细胞保留了复制的能力(33)。在本实验中，人成血管细胞依赖性新血管形成在五天内导致梗死周围区小的内生性大鼠心肌细胞前体的增殖。分裂着的肌细胞前体可通过免疫组织化学标准进行鉴别，其基础是细胞表面有α-肌节肌动纤维但无肌钙蛋白I的表达，以及通过大鼠Ki67特异性抗体确定的增殖核结构。由于在14天内这个过程之后紧接着相同部位成熟、循环着的心肌细胞的增加，这通过形态学、肌钙蛋白I在细胞表面的表达和Ki67的核内表达确定，我们得出结论，循环着的心肌细胞前体在原位分化成为新的、成熟的、有功能的心肌细胞。究竟这些前体是从驻留的心肌干细胞库中衍生而来还是来源于可再生的定向于损伤心肌的循环骨髓衍生性干细胞还有待确定。而且，虽然心肌细胞前体原位表达所需的信号似乎包含了，至少是部分地包含了peroxiredoxin基因家族成员所调节的途径，心肌细胞分化所需的信号目前仍是未知。对这些问题的了解可打开操作内生性心肌细胞生物学的可能性以改善心肌缺血后的治疗过程。
方法与材料趋化因子活化了的人CD34+细胞的纯化和鉴定从连续四天每天接受10mg/kg G-CSF(Amgen，CA)的人体内获得单个供体的白细胞去除后的产物。供体是为异源干细胞移植而经历骨髓活化、收获和分离等标准通用程序的健康个体。单核细胞通过菲柯尔-泛影钠分离，通过利用包被了抗CD34单克隆抗体的磁珠(Miltenyi Biotech，CA)得到高纯CD34+细胞(＞98％阳性)。纯化了的CD34细胞经荧光素染色，这些荧光素偶联抗CD34和CD117(Becton Dickinson，CA)，AC133(Miltenyi Biotech，CA)，CD54(Immunotech，CA)，CD62E(BioSource，MA)，VEGFR-2，Tie-2，vWF，eNOS，CXCR1，CXCR2，和CXCR4(所有Santa Cruz Biotech，CA)的单克隆抗体，染色后用FACScan(Becton Dickinson，CA)四参数荧光法进行分析。选出的CD34表达阳性细胞再经偶联抗CD117单克隆抗体的藻红蛋白(PE)(BectonDickinson，CA)染色，然后用Facstar Plus(Becton Dickinson)和PE过滤器分成亮荧光和暗荧光。GATA-2的细胞内染色，用PharmingenCytofix/CytopermTM试剂盒从每个发亮荧光和暗荧光的细胞群中透化处理一百万个细胞，和1μl偶联CD117和CD34表面抗原的双抗单克隆抗体的荧光染料(Becton Dickinson，CA)冰上共育30分钟。4℃下重悬于250μlCytofix/CytopermTM溶液后20分钟，再将细胞与抗GATA-2单克隆抗体或抗IgG对照标记的荧光染料4℃下温育30分钟，然后用三参数流式细胞计量术进行分析。
实验动物，外科手术过程，人细胞注射。Rowett(rnu/rnu)无胸腺裸大鼠(Harlan Sprague Dawley，Indianapolis，Indiana)经“哥伦比亚大学动物保护和使用委员会”认可后用于实验研究。麻醉后，实施左胸廓开胸术，打开心包膜，然后结扎左前降支(LAD)冠状动脉。假手术的大鼠经历相似的手术过程，但没有冠状动脉的缝合。
组织学及梗死尺寸测量在第2周和第15周切除后，每个实验动物的左心室从上至下被切成10-15个横剖面。有代表性的切片用福尔马林固定并作常规组织学染色(H&E)以检测心肌的细胞构成，表示为每个高倍视野(HPF)的细胞数量(600x)。马森三染色(Masson trichrome stain)，将胶原染成蓝色而心肌染成红色，被用来半定量(0-3+)评估胶原含量，1+为浅蓝，2+为浅蓝和深蓝斑点，3+为深蓝染色。这使心肌瘢痕的尺寸能通过数码相机分析仪进行检测。梗死表面的长度，包括心表和心内区，通过一种数码成像面积分析仪进行测量并表示为心室总周长的百分数。最终的梗死尺寸取每个心脏样品的所有切片的均值进行计算。所有研究对操作实验的病理学家保密。梗死尺寸表示为左心室面积的百分数。最终的梗死尺寸取每个心脏样品的所有切片的均值进行计算。
毛细血管密度定量为了定量测定毛细血管密度及其种群来源，另外的切片用针对大鼠或人CD31(Serotec，UK，and Research Diagnostics，NJ，respectively)，factor VIII(Dako，CA)和大鼠或人I类MHC(AccurateChemicals，CT)的单克隆抗体(Accurate Chemicals，CT)进行新鲜染色。在平滑肌层存在下从大毛细血管中分离出小动脉，并用抗肌肉特异性结蛋白单克隆抗体(Dako，Ca)对切片染色以进行鉴别。使用抗生物素蛋白/生物素封闭试剂盒，大鼠可吸收的生物素酰抗鼠IgG，和过氧化物酶偶联物(均来自Vector Laboratories Burlingame，CA)进行过氧化物免疫酶标记法染色。梗死两周后用抗CD31单克隆抗体标记的切片确定毛细血管密度，并用抗VIII因子单克隆抗体验证，与未受损心肌中毛细血管密度相对比。结果表示为每HPF(400x)CD31阳性毛细血管数。
心肌细胞增殖的定量测定心肌细胞DNA合成及细胞循环通过对注射了盐水或人CD34+细胞两周后的LAD结扎心肌组织切片进行心肌细胞特异性肌钙蛋白I和人或鼠特异性Ki67双染色而测定，用健康大鼠作为阴性对照。简单地说，石腊包埋的切片在0.1M EDTA缓冲液中用微波炉加热，然后用1∶3000稀释的抗大鼠Ki-67初级单克隆抗体(赠自GiorgioCatoretti，Columbia University)或1∶300稀释的人Ki-67初级单克隆抗体(Dako，CA)进行染色并于4℃培育过夜。洗涤后，切片与和碱性磷酸酶以1∶200稀释比例偶联的种性特异性第二抗体(Vector Laboratories Burlingame，CA)共同培育30分钟，正染色的细胞核用BCIP/NBT底物试剂盒(Dako，CA)显为蓝色。然后切片在4℃与抗心肌特异性肌钙蛋白I单克隆抗体(AccurateChemicals，CT)共同培育过夜，正染色的细胞用上述素抗生物素蛋白/生物素系统显为棕色。心肌细胞在梗死区，梗死周围区和远离梗死区域的细胞循环进程以每个高倍视野表达Ki-67的肌钙蛋白阳性细胞的比例计算。对于共聚焦显微镜，异硫氰酸荧光素(FITC)偶联的兔抗鼠IgG用作检测细胞核内Ki67的第二抗体。一种Cy5偶联的抗肌节肌动纤维的鼠单克隆抗体(clone 5C5；Sigma)用于检测心肌细胞，碘化丙锭用于鉴别所有细胞核。
用石腊组织切片DNA末端标记技术测定心肌细胞凋亡对于单细胞水平的凋亡原位检测我们采用了脱氧核苷酸转移酶(TdT)(BoehringerMannheim，Mannheim，德国)介导的DNA末端标记TUNEL法。大鼠心肌组织切片来自注射了盐水或人CD34+细胞两周后的LAD结扎的大鼠，以来自健康大鼠的相应切片作为阴性对照。简单地说，组织用二甲苯去石腊，用分级乙醇和两次磷酸缓冲液(PBS)洗涤脱水。然后组织切片用蛋白酶K(10μg/ml溶于Tris/HCL)在37℃下消化30分钟。然后将切片在PBS中洗涤3次，与50μl TUNEL反应混合液(TdT和荧光标记的dUTP)在37℃湿润空气中共同温育60分钟。阴性对照的TdT根据反应混合液估算。在PBS中洗涤3次后，切片与荧光偶联碱性磷酸酶(AP)特异性抗体(Boehringer Mannheim，Mannheim，Germany)共同孵育30分钟。TUNEL染色在一种使细胞核中DNA片断染为蓝色的底物系统中显色(BCIP/NBTsubstrate system，Dako，Carpinteria，CA)。置于于PBS中3分钟使该反应终止。为了确定心肌中染成蓝色的凋亡细胞核的比例，用结蛋白特异性单克隆抗体对组织复染。用3％过氧化氢酶的PBS溶液作用15分钟以封闭内生性过氧化物酶，然后用20％山羊血清溶液洗涤。抗肌钙蛋白I抗体(Accurate Chemicals，CT)在40℃下孵育过夜(1∶200)。3次洗涤后，用抗兔IgG抗体作用切片，然后用生物素偶联的二抗(Sigma，Saint Louis，Missouri)作用30分钟。加入抗生物素蛋白-生物素复合物(Vector Laboratories，Burlingame，CA)再作用30分钟，置于DAB溶液混合物(Sigma，Saint Louis，Missouri)中5分钟后肌细胞显棕色。组织切处用显微镜在200倍放大下观察。在每个200x镜区检察4个区域，每区域包含至少250个细胞和计约1mm2组织，包括梗死周围区和远离梗死区。组织边缘的被染色的细胞不被计数。结果表示为每个检测位置上每平方毫米凋亡心肌细胞的平均数量。
心脏功能分析用一种高频线性传感器阵列(SONOS 5500，HewlettPackard，Andover，MA)进行超声心动图研究。二维图象通过中间乳突(mid-papillary)和顶端水平得到。舒张末期(EDV)和收缩末期(ESV)左心室体积通过双-平面区域长度法得到，左心室射血分数的百分数依[(EDV-ESV)/EDV]×100计算。
CDNA减除杂交法这项技术使我们能够对来自正常大鼠和经历了左前降支(LAD)冠状动脉结扎48小时内的大鼠心脏中基因表达结构进行比较。简单地说，从每个心脏中分离信使RNA，1μg用于用随机引物合成cDNA的第一链。减除杂交法使用了PCR选择cDAN减除试剂盒(CLONTECH)，依制造商的建议操作。当第二链合成后，这两个cDNA文库用RsaI进行消化。“试验者(tester)”文库的消化产物连接到一个特殊受体上(T7启动子)，然后与30倍过量的减除“驱动(driver)”文库杂交。杂交后得到的产物用PCR进行扩增。正向减除确定了缺血样品中被过表达的基因，其中缺血组织是那个“试验者”，而正常组织是那个“驱动者”。在反向减除中，“试验者”和“驱动者”变成用来确定缺血样品中被负调控了的蛋白。
HBP23 mRNA表达的反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)分析用购自Qiagen的RNeasy试剂盒(Valencia，CA)从正常大鼠心脏或经历LAD结扎后两周接受盐水或人成血管细胞的大鼠心脏中提取总RNA。RNA用SMART cDNA Synthesis Kit(Clontech，Palo Alto，CA)进行反转录。在25ul体系里进行扩增，初始94℃ 5分钟，然后94℃ 30秒和94℃ 1分钟进行26-32个循环，用TITANIUM Taq PCR试剂盒(Clontech，Palo Alto，CA)。HBP23的引物为5′-GCTGATGAAGGTATCTCTTTCAGGGGCCTC(SEQID NO10)和5′-GATGGTCTGCCCCTTACCAATAGTGGAAG(SEQ IDNO11)。大鼠GAPDH用作内部对照(正向引物5′TGAAGGTCGGAGTCAACGGATTTG 3′(SEQ ID NO12)，反向引物5′CATGTGGGCCA TGAGG TCCA CCAC 3′(SEQ ID NO13))。扩增后的溴化乙锭染色扩增片段条带，用密度计进行定量。
DNA酶和RNA底物3’-3’倒置胸腺嘧啶DNA酶通过整合DNA技术(Coralville，IA)合成，通过不含RNA酶的IE-HPLC或RP-HPLC纯化。与靶DNA酶序列相对应的短链RNA底物通过化学方法合成后用不含RNA酶的PAGE进行纯化，也可通过DNA模板的体外转录而制备。通过对分别从培养的大鼠胎儿心肌细胞和HUVEC中提取的总RNA进行RT-PCR来扩增大鼠HBP23 cDNA和人PAG cDNA，采用下列引物5′TTTACCCTCTTGACTTTACTTTTGTGTGTCCCAC 3′(正向引物)和5′CCAGCTGGGCACACTTCACCATG 3′(反向引物)。把HBP23和PAGcDNA克隆到pGEM-T载体(Promega)中得到质粒构建体pGEM-ratHBP23和pGEM-humanPAG。cDNA序列用自动测序仪进行验证。32P-标记的核苷酸大鼠HBP23和人PAG RNA转录物通过20ml体系在32℃下体外转录(SP6聚合酶，Promega)1小时而制备。未结合的标记物和短核苷酸(＜350碱基)通过在Chromaspin-200柱(Clontech，Palo Alto，CA)上离心而从放射性标记的样品中分离。合成的RNA底物用T4多核苷酸激酶进行32P末端标记，并与0.05％ 5uM HBP23或杂混DNA酶共同孵育。反应可在37℃下进行，并通过分装入含90％甲酰胺、20mM EDTA和加样染料的试管中而“淬灭(quenched)”。样品用15％的TBE-尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，用-80℃下的放射自显影进行检测。原代大鼠胚胎心肌细胞来自于Clonetic(USA)，在含2％FCS、100ug/ml链霉素和100IU/ml青霉素的培养基中37℃下含5％ CO2的潮湿空气中培养。细胞在第6代和第8代间用于所述实验。分会合(70-80％)的大鼠胚胎心肌细胞用0.5ml含0.05％ 5uM HBP23或杂混DNA酶和20ug/ml阳离子脂质(DOTAP)的无血清培养基转染。温育8小时后细胞用Trizol试剂(LifeSciences，CA)裂解以分离用于HBP23表达的RT-PCR的RNA，如上所述。
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<400>1aaactaaccc ctctttttct ccaaaggagt gcttgtggag atcggatctt ttctccagca 60attgggggaa agaaggcttt ttctctgact tcgcttagtg taaccagcgg cgtatatttt 120ttaggcgcct tttcgaaaac ctagtagtta atattcattt gtttaaatct tattttattt 180ttaagctcaa actgcttaag aataccttaa ttccttaaag tgaaataatt ttttgcaaag 240gggtttcctc gatttggagc tttttttttc ttccaccgtc atttctaact cttaaaacca 300actcagttcc atc atg gtg atg ttc aag aag atc aag tct ttt gag gtg349Met Val Met Phe Lys Lys Ile Lys Ser Phe Glu Val1 5 10gtc ttt aac gac cct gaa aag gtg tac ggc agt ggc gag aag gtg gct 397Val Phe Asn Asp Pro Glu Lys Val Tyr Gly Ser Gly Glu Lys Val Ala15 20 25ggc cgg gtg ata gtg gag gtg tgt gaa gtt act cgt gtc aaa gcc gtt 445Gly Arg Val Ile Val Glu Val Cys Glu Val Thr Arg Val Lys Ala Val30 35 40agg atc ctg gct tgc gga gtg gct aaa gtg ctt tgg atg cag gga tcc 493Arg Ile Leu Ala Cys Gly Val Ala Lys Val Leu Trp Met Gln Gly Ser45 50 55 60cag cag tgc aaa cag act tcg gag tac ctg cgc tat gaa gac acg ctt 541Gln Gln Cys Lys Gln Thr Ser Glu Tyr Leu Arg Tyr Glu Asp Thr Leu65 70 75ctt ctg gaa gac cag cca aca ggt gag aat gag atg gtg atc atg aga 589Leu Leu Glu Asp Gln Pro Thr Gly Glu Asn Glu Met Val Ile Met Arg80 85 90
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<223>涉及RAT Cinc的引物<400>4gaagatagat tgcaccgatg 20<210>5<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>涉及RAT Cinc的引物<400>5catagcctct cacatttc 18
<210>6<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>涉及RAT Cinc的引物<400>6gcgcccgtcc gccaatgagc tgcgc 25<210>7<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>涉及RAT Cinc的引物<400>7cttggggaca cccttcagca tcttttgg 28<210>8<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>涉及RAT Cinc的引物<400>8ctctacccac ggcaagttca a 21<210>9<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>涉及RAT Cinc的引物<400>9gggatgacct tgcccacagc 20<210>10<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>涉及HBP23的引物<400>10gctgatgaag gtatctcttt caggggcctc30
<210>11<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>涉及HBP23的引物<400>11gatggtctgc cccttaccaa tagtggaag 29<210>12<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>涉及GADPH的引物<400>12tgaaggtcgg agtcaacgga tttg 24<210>13<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>涉及GADPH的反向引物<400>13catgtgggcc atgaggtcca ccac 2权利要求
1.一种治疗受试者涉及心肌细胞损失的心脏疾病的方法，该方法包含向所述受试者施用适量有效导致心肌细胞在受试者心脏内增殖的试剂，以便由此治疗所述疾病。
2.权利要求1的方法，其中所述试剂是人内皮祖细胞。
3.权利要求2的方法，其另外包括施用有效量的第二种试剂，该试剂增加由所述人内皮祖细胞导致的心肌细胞增殖。
4.权利要求3的方法，其中所述试剂是反义寡核苷酸，该反义寡核苷酸特异性地抑制维生素D3正调节蛋白-1(VDUP-1)mRNA的翻译。
5.权利要求3的方法，其中所述试剂是催化性核酸，该催化性核酸特异性地抑制维生素D3正调节蛋白-1mRNA的翻译。
6.权利要求5的方法，其中所述催化性核酸包含脱氧核糖核苷酸。
7.权利要求5的方法，其中所述催化性核酸包含核糖核酸。
8.权利要求3的方法，其中所述第二种试剂是促血管生成剂。
9.权利要求8的方法，其中所述促血管生成剂是血管内皮生长因子，成纤维细胞生长因子或血管生成素。
10.权利要求3的方法，其中所述第二种试剂诱导促血管生成因子的表达。
11.权利要求10的方法，其中所述第二种试剂是缺氧诱导因子-1。
12.权利要求3的方法，其中所述第二种试剂促进内皮祖细胞向受试者心脏的输送。
13.权利要求12的方法，其中促进输送的第二种试剂是针对CXCR4表位的抗体。
14.权利要求12的方法，其中促进输送的第二种试剂是CC趋化因子。
15.权利要求14的方法，其中所述CC趋化因子是RANTES，EOTAXIN，单核细胞化学引诱蛋白-1(MCP-1)，MCP-2，MCP-3，或MCP。
16.权利要求12的方法，其中所述第二种试剂是CXC趋化因子。
17.权利要求16的方法，其中所述CXC趋化因子是白细胞介素-8，Gro-α，或基质衍生因子-1。
18.权利要求17的方法，其中所述基质衍生因子-1是基质衍生因子-1α或基质衍生因子-1β。
19.权利要求3的方法，其中所述第二种试剂促进成血管细胞向受试者血流中转移。
20.权利要求19的方法，其中所述试剂是G-CSF，GM-CSF，SDF-1，或VEGF。
21.权利要求3的方法，其中所述第二种试剂是心肌细胞祖细胞。
22.权利要求3的方法，其中所述第二种试剂是骨骼肌祖细胞。
23.权利要求2的方法，其中所述人内皮祖细胞的有效量为每kg受试者体重2.5×105至7.5×105个内皮祖细胞。
24.权利要求23的方法，其中所述有效量为每kg受试者体重5×105个内皮祖细胞。
25.权利要求2的方法，其中所述内皮祖细胞相对于受试者是异源的。
26.权利要求25的方法，其中所述受试者是成年人。
27.权利要求25的方法，其中所述受试者是胚胎或胎儿。
28.权利要求2的方法，其中所述施用包含直接注射入所述受试者的外周循环，心肌，左心室，右心室，冠状动脉，脑脊液，神经组织，局部缺血组织或局部缺血后组织。
29.权利要求2的方法，其中所述人内皮祖细胞表达CD117，CD34或AC133。
30.权利要求2的方法，其中所述内皮祖细胞表达高水平的胞内GATA-2活性。
31.权利要求1的方法，其中所述试剂诱导编码peroxiredoxin的mRNA的表达。
32.权利要求31的方法，其中所述试剂是2(3)-叔丁基-4-羟基苯甲醚。
33.权利要求1的方法，其中所述试剂诱导编码NF-E2-相关因子2(Nrf2)的mRNA的表达。
34.权利要求1的方法，其中所述试剂诱导Nrf2蛋白从Keap-1上的解离。
35.权利要求1的方法，其中所述试剂抑制Nrf2蛋白与Keap-1的结合。
36.权利要求1的方法，其中所述试剂抑制巯基还原酶硫氧还蛋白与VDUP-1蛋白的结合。
37.权利要求1的方法，其中所述试剂抑制c-Abl酪氨酸激酶的激活。
38.权利要求37的方法，其中所述试剂是STI-571。
39.权利要求1的方法，其中所述试剂是CXC趋化因子。
40.权利要求39的方法，其中所述趋化因子是基质衍生因子-1，I1-8或Gro-α。
41.权利要求40的方法，其中所述试剂是基质衍生因子-1并且在心肌内给药。
42.权利要求40的方法，其中所述试剂是基质衍生因子-1并且在冠状动脉内给药。
43.权利要求40的方法，其中所述试剂是基质衍生因子-1并且通过植入物，支架或缓释制剂给药。
44.权利要求39的方法，其另外包含施用第二种试剂。
45.权利要求44的方法，其中所述第二种试剂是GM-CSF，G-CSF，IL-8或Gro家族趋化因子。
46.权利要求44的方法，其中所述第二种试剂是CXCR4的抑制剂或SDF-1的抑制剂。
47.权利要求1的方法，其中所述试剂是纤溶酶原激活物抑制剂-1的抑制剂。
48.权利要求1的方法，其中所述试剂是针对CXCR4表位的抗体。
49.权利要求1的方法，其中所述试剂是G-CSF，GM-CSF，VDUP-1表达的抑制剂，或Gro家族趋化因子。
50.权利要求1的方法，其中所述受试者患有心血管疾病。
51.权利要求50的方法，其中所述受试者患有充血性心力衰竭。
52.权利要求50的方法，其中所述受试者患有心肌梗死。
53.权利要求50的方法，其中所述受试者患有心肌缺血。
54.权利要求50的方法，其中所述受试者患有心绞痛。
55.权利要求50的方法，其中所述受试者患有心肌病。
56.权利要求1的方法，其中所述受试者是哺乳动物。
57.权利要求56的方法，其中所述哺乳动物是人类。
58.一种测定受试者心肌细胞对细胞凋亡的敏感性的方法，包含(a)定量测定心肌细胞中编码peroxiredoxin的mRNA的量；(b)定量测定心肌细胞中编码维生素D3正调节蛋白-1的mRNA的量；(c)测定编码peroxiredoxin的mRNA的量与编码维生素D3正调节蛋白-1的mRNA的量的比率，其中低比率表示心肌细胞对细胞凋亡的高敏感性而高比率表示心肌细胞对受试者体内的细胞凋亡的低敏感性。
59.一种测定受试者心肌细胞对细胞凋亡敏感性的方法，包含(a)定量测定心肌细胞内peroxiredoxin蛋白的表达；(b)定量测定心肌细胞内维生素D3正调节蛋白-1的表达；(c)测定peroxiredoxin蛋白表达与维生素D3正调节蛋白-1表达的比率，其中低比率表示心肌细胞对细胞凋亡的高敏感性而高比率表示心肌细胞对受试者体内的细胞凋亡的低敏感性。
60.一种心脏祖细胞。
61.一种诱导受试者心脏组织内心肌祖细胞的细胞循环的方法，其包括向受试者施用适量有效诱导受试者心脏组织新血管形成的试剂，从而由此诱导受试者心脏组织内心脏细胞的细胞循环。
62.一种改善受试者心脏功能的方法，其包括向受试者施用适量有效诱导受试者心脏组织新血管形成的试剂，从而由此改善受试者的心脏功能。
63.一种改善受试者心脏功能的方法，其包括向受试者施用适量有效诱导受试者心脏组织心肌细胞增殖的试剂，从而由此改善受试者的心脏功能。
64.权利要求62或63的方法，其中所述受试者患有心肌缺血或心肌梗死。
65.权利要求62或63的方法，其中所述试剂是G-CSF，GM-CSF，IL-8，Gro家族趋化因子，CXCR4的抑制剂，或SDF-1的抑制剂。
66.权利要求65的方法，其中所述CXCR4的抑制剂是小分子或单克隆抗体。
67.权利要求65的方法，其中所述CXCR4的抑制剂是小分子和是AMD 3100。
68.权利要求65的方法，其中所述CXCR4的抑制剂是AMD 070。
69.权利要求65的方法，其中所述CXCR4的抑制剂是催化性核酸，寡核苷酸，单克隆抗体，RNAi，或小分子。
70.权利要求65的方法，其中所述SDF-1的抑制剂是小分子或单克隆抗体。
71.权利要求65的方法，其中所述Gro家族趋化因子是Groα。
72.一种诱导细胞凋亡的方法，其包含抑制细胞内peroxiredoxin的表达。
73.权利要求72的方法，其中所述细胞表达peroxiredoxin。
74.权利要求73的方法，其中所述细胞由脉管系统供养，并且该脉管系统诱导peroxiredoxin的表达。
75.权利要求72的方法，其中所述peroxiredoxin是过氧化物还原酶I，过氧化物还原酶II，过氧化物还原酶III，过氧化物还原酶IV，或过氧化物还原酶V。
76.权利要求72的方法，其中对peroxiredoxin表达的抑制是通过使细胞接触与编码peroxiredoxin的mRNA结合的催化性核酸来实现的，从而抑制其表达。
77.权利要求72的方法，其中所述细胞是肿瘤细胞。
78.一种治疗受试者涉及组织细胞损失的组织细胞疾病的方法，其包含向受试者施用适量有效导致所述受试者组织内组织细胞增殖的试剂，从而由此治疗所述受试者的组织细胞疾病。
79.权利要求78的方法，其中所述试剂是G-CSF，SDF-1，GM-CSF，IL-8，或VEGF。
80.权利要求78的方法，其中所述试剂是CXCR4/SDF-1相互作用的抑制剂。
81.权利要求80的方法，其中所述抑制剂是催化性核酸，单克隆抗体，反义寡核苷酸，小分子，或RNAi。
82.权利要求78的方法，其中所述试剂是peroxiredoxin表达的诱导剂。
83.权利要求79或80的方法，其中所述组织是心脏组织，脑组织，周围血管组织，肝脏组织，肾脏组织，胃肠组织，肺组织，平滑肌组织，或横纹肌组织。
84.权利要求20，45，65或79的方法，其中所述试剂是G-CSF，并且该G-CSF是重组甲硫氨酰人G-CSF和一甲氧基聚乙二醇的共价偶联物。
85.一种治疗受试者涉及组织细胞凋亡的组织疾病的方法，其包含向受试者施用适量有效抑制所述受试者组织细胞凋亡的试剂，从而由此治疗所述疾病。
86.权利要求85的方法，其中所述试剂是VDUP-1表达的抑制剂。
87.权利要求86的方法，其中所述VDUP-1表达抑制剂是催化性核酸，单克隆抗体，反义寡核苷酸，小分子，或RNAi。
88.权利要求86的方法，其中所述组织是心脏组织，脑血管组织，或脑组织。
89.一种抑制组织内成纤维细胞或炎症细胞增殖而由此抑制胶原形成的方法，其包含使所述组织接触适量的有效抑制组织内成纤维细胞或炎症细胞增殖的VDUP-1表达的抑制剂。
90.权利要求89的方法，其中所述VDUP-1表达抑制剂是催化性核酸，单克隆抗体，反义寡核苷酸，小分子，或RNAi。
全文摘要
本发明提供了一种治疗受试者涉及心肌细胞损失的心脏疾病的方法，该方法包括给受试者施用适量可有效使心肌细胞在受试者心脏内增殖的试剂，从而得以治疗疾病。本发明另外提供了其中所述试剂为人内皮祖细胞，G－CSF，GM－CSF，SDF－1，和IL－8的该方法。本发明还提供了测定受试者心肌细胞对细胞凋亡的敏感性的方法。
文档编号A61K48/00GK1662548SQ03814715
公开日2005年8月31日 申请日期2003年4月23日 优先权日2002年4月23日
发明者S·伊泰斯库 申请人:纽约市哥伦比亚大学信托人