用于抗血管发生疗法的四硫代钼酸四丙铵及相关化合物的制作方法

专利名称：用于抗血管发生疗法的四硫代钼酸四丙铵及相关化合物的制作方法
背景技术：
本申请要求2002年7月23日提交的待审美国临时申请流水号60/397,804的优先权，这篇临时申请的全部内容都列入本文作为参考。
I.发明领域本发明一般涉及血管发生性疾病领域。本发明更具体的提供了具有改良特性的与铜结合的化合物以及将这些化合物用于预防和治疗诸如癌症等具有生血管成分的疾病的方法。本发明还提供了药物组合物、治疗试剂盒和联合的治疗方法。
II.相关技术的描述为了能够向最外层细胞以内的其它细胞供应足够营养，实体瘤需要进行血管增生(血管发生)以维持生长(Hayes，1994；Horak等人，1993；Parangi等人，1996)。另一方面，除了创伤愈合、外伤或外科手术后的再生、和月经周期中子宫内膜的增生外，正常成人组织只需要极少量的新血管生长。因此，对血管发生的依赖性是肿瘤和正常组织之间的根本差别。这种差别在数量上比许多细胞还原化学疗法所依赖的细胞复制和细胞死亡速率的差别更显著。根据肿瘤对血管发生的依赖性，发展了针对恶性肿瘤的抗血管发生疗法的概念(Folkman，1995a；Folkman，1995b；Hanahan和Folkman，1996)。
存在特征为血管发生异常的大量其它病例。由血管发生介导的这种疾病的一个实例是眼睛新血管疾病。该病的特征是新血管侵入眼结构，诸如视网膜或角膜。这是失明最常见的原因，并涉及大约20种眼科疾病。在年龄相关的黄斑变性中，有关视觉问题就是由脉络膜毛细血管穿过透明层缺损向内生长和视网膜色素上皮下的血管组织增生引起的。
据信其中涉及血管发生的另一种疾病是类风湿性关节炎。关节滑膜内层中的血管进行血管发生。除了形成新的血管网，内皮细胞还释放导致血管翳生长和软骨破坏的因子和活性氧。涉及血管发生的因子可能积极引起并有助于维持类风湿性关节炎的慢性炎症状态。
兔角膜新血管形成的研究显示，铜既是血管发生的必要条件，也是血管发生的有效刺激物(Parke等人，1988)。在前列腺素E1(PGE1)在兔角膜中诱导血管发生的过程中，铜在血管发生位点积累(Parke等人，1988)。相反的，在缺铜的兔子中，兔角膜中应答PGE1的血管发生显著降低。在兔角膜中，血管发生所需的铜可以由血浆铜蓝蛋白(一种铜结合蛋白)以及溶解的硫酸铜供给；而脱铜血浆铜蓝蛋白(不含铜的血浆铜蓝蛋白)不支持血管发生(Gullino，1986)。其它研究也显示，铜是重要的血管发生试剂(Raju等人，1982；Ziche等人，1982)。这些研究都支持未结合铜是血管发生的必要条件的观念。
几年前，使用抗铜方法进行了一些动物肿瘤模型的研究(Brem等人，1990a；1990b；Yoshida等人，1995)。使用螯合剂青霉胺和低铜食谱，能够降低脑内植入了肿瘤的大鼠和兔子中的铜水平。然而，用低铜方案处理的动物，在显示肿瘤缩小的同时，存活情况并不显得比未处理的对照有所改进。
也有报导说，青霉胺治疗有显著的副作用，包括恶心和腹部不适，以及更严重的副作用，诸如可能导致再生障碍性贫血的白血球减少症和血小板减少症。在某些病例中还有肾病综合症的报导。
文献中的负面报道，包括Brem等人(1990b)的研究在内，其中经处理动物的死亡率与未经处理的对照动物一样，这在很大程度上阻碍了此领域内进一步的工作。不过，在克服了这样的成见后，最终开发出了以对整体铜状态进行有效调控为基础的成功的抗血管发生疗法(PCT申请WO 00/13712)。这项工作的基础涉及对一定范围内的铜缺乏的测定，在该范围内，血管发生可以被抑制，但足以维持必要的铜依赖性细胞活动从而避免产生细胞毒性。利用诸如四硫代钼酸盐(TM)等结合铜并形成试剂-铜-蛋白质复合物的一系列试剂达到在此“范围”内进行有效治疗的目的，据报道在临床试验中获得了惊人的成功(PCT申请WO 00/13712)。
不过，除了这些进展外，在本领域内还需要有改进的试剂以用于通过铜的减少和维持而进行的抗血管发生疗法中。尤其希望开发具有改进的稳定性和贮藏寿命的化合物。在尝试开发更稳定的铜结合化合物的过程中，重要的是要克服所述研究中通常遇到的问题，诸如较低的溶解性和/或治疗活性的降低。因此，制备具有改进的稳定性和贮藏寿命的治疗上有效的可溶性铜结合化合物的药物制剂的能力代表了特别有意义的进步。
发明概述本发明通过提供与铜结合并形成化合物-铜-蛋白质三组分复合物的一系列化合物解决了本领域内的这些需要，其中的化合物展示出稳定性增强，而溶解性或治疗效力没有显著的丧失。本发明的化合物、药用制剂和试剂盒因此在临床抗血管发生和抗肿瘤治疗中具有多种优势，包括易于制备和操作，贮藏寿命增长，而且，在获得这些优势的同时却并未局限化合物的治疗特性。本发明提供了用于安全有效的干预诸如癌症等血管发生性疾病的潜在化合物、药品、药剂和试剂盒以及预防和治疗方法。
具体而言，本发明提供了包含生物学或治疗有效量的至少第一种硫代钼酸烷基铵化合物在内的化合物、组合物、药用制剂和试剂盒，以及相关的治疗方法及其医学用途。所述组合物优选是药物组合物或制剂，它们包含药用可接受赋形剂以及至少第一种硫代钼酸烷基铵化合物。
如整篇申请书中使用的，除了其后特别注明了上限或本领域普通技术人员将清楚理解的情况以外，术语“一种(个)”指“至少一种(个)”、“至少第一种(个)”、“一种(个)或多种(个)”或“多种(个)”提及的组分或步骤。因此，“一种硫代钼酸烷基铵化合物”指“至少第一种硫代钼酸烷基铵化合物”。本领域普通技术人员根据本公开书将能理解各组合的有效范围和参数，以及任何单一试剂的量。
除非特别提及，术语“一种(个)”也用于指所述方法中的“至少一种(个)”、“至少第一种(个)”、“一种(个)或多种(个)”或“多种(个)”步骤。这与治疗方法中的施用步骤尤其有关。因此，本发明不仅可以应用不同的剂量，还可以利用不同数量的剂量，可以多达并包括多种施用法。
在整篇说明书和权利要求中，除了其后特别注明了上限或本领域普通技术人员将清楚理解的情况之外，术语“或者”指“和/或”有关的公布和要求的组分和步骤。因此，术语“单烷基铵、二烷基铵、三烷基铵或四烷基铵”用于本文时指“单烷基铵、二烷基铵、三烷基铵或四烷基铵”及其组合，诸如“单烷基铵和二烷基铵；单烷基铵和四烷基铵；二烷基铵和三烷基铵”；等等。因此，除非另外特别提及或本领域普通技术人员将清楚理解的情况，术语“或者”仅仅用作涵盖了各个所述组分或步骤及其所有组合的简明参考术语。
本发明的组合物、药物组合物、药剂和试剂盒包含通过形成“试剂-铜-蛋白质三组分复合物”并随后从体内清除而仍然维持较低铜水平的更稳定的试剂。在这些“试剂-铜-蛋白质三组分复合物”中结合的铜不会可逆性的从这些复合物中释放出来，这使本发明与可逆性的二组分铜鳌合作用有所区别。
在某些实施方案中，本发明的组合物、药物组合物、药剂和试剂盒包含药用可接受赋形剂和至少第一种硫代二钼酸烷基铵化合物，所述化合物在暴露于空气和湿气中时基本稳定、保持溶解性且在溶液中释放生物学或治疗有效量的硫代钼酸盐化合物。
硫代钼酸烷基铵化合物中烷基的数目在本发明的实践中可有所变化。本发明的例证性实施方案因此包括硫代二钼酸单烷基铵、二烷基铵、三烷基铵和四烷基铵化合物及其药物组合物。在某些实施方案中优选硫代二钼酸四烷基铵化合物。
正如在硫代钼酸盐化学中所已知的，硫基的数目也可以有所变化。因此，本发明更多的实施例包括单硫代钼酸烷基铵、二硫代钼酸烷基铵、三硫代钼酸烷基铵、四硫代钼酸烷基铵、八硫代钼酸烷基铵和十二硫代二钼酸烷基铵化合物及其药物组合物。
本发明的硫代钼酸烷基铵化合物和药物组合物还包括其中的硫代钼酸盐化合物包含至少一个铁原子或至少一个氧原子的那些化合物。一个具体的例子是铁八硫代二钼酸烷基铵。可以理解，应当避免硫代钼酸盐化合物的完全氧化。
在某些优选的实施方案中，本发明提供了包含药用可接受赋形剂和至少第一种四硫代钼酸烷基铵化合物的组合物、药物组合物、药剂和试剂盒，所述化合物包含在暴露于空气和湿气中时足以保护四硫代钼酸盐免于氧化的许多烷基，从而提高了四硫代钼酸盐化合物的稳定性，其中的硫代钼酸烷基铵化合物在溶液中释放生物学或治疗有效量的四硫代钼酸盐。
在其它优选的实施方案中，本发明提供了四硫代钼酸四烷基铵化合物及其药物组合物。烷基的种类在本发明中是不受限制的，因此本发明包括四硫代钼酸四甲铵、四硫代钼酸四乙铵和四硫代钼酸四丁铵及其药物组合物。在本发明的某些方面中优选四硫代钼酸四丙铵及其药物组合物。
所述组合物、药物组合物、药剂和试剂盒因此包含了药用可接受赋形剂和至少第一种四硫代钼酸四烷基铵化合物，其中的烷基可以保护四硫代钼酸盐在接触空气和湿气时免于被氧化，从而提高了四硫代钼酸盐化合物的稳定性，其中四硫代钼酸四烷基铵化合物保持了溶解性，并且在水溶液中释放在生物学或治疗上基本上有活性的四硫代钼酸盐和在生物学上基本上是惰性的烷基铵基团。
本发明还提供了含有与药用可接受赋形剂混合的生物学或治疗有效量的四硫代钼酸四烷基铵化合物的组合物、药物组合物、药剂和试剂盒；其中四硫代钼酸四烷基铵化合物可以在潮湿的热空气中实质性稳定存在至少约7天；在室温空气中的半寿期至少是四硫代钼酸铵的两倍；在水中的溶解度至少约为1mg/ml；在水溶液中释放基本上具有完整铜结合特性的四硫代钼酸盐。
具有这些优点的某些优选组合物和药物组合物是其中至少第一种四硫代钼酸四烷基铵为四硫代钼酸四丙铵的组合物。因此，含生物学有效量四硫代钼酸四丙铵和药用可接受赋形剂的组合物、药剂和试剂盒是本发明优选的实施方案。
药物组合物和药用可接受赋形剂的性质对于本发明的实践而言不是关键的。一般而言，选择这样的组合物和赋形剂，使它们适合待治疗的血管发生类疾病，诸如将其制备成可供静脉内给药、口服、从眼部施用等等。本发明的一个优点在于全身性施用所述组合物和化合物对于治疗多种疾病都是有效的。尤其优选配制成口服的组合物。不过，对特殊位点的局部施药也包括在内，由此包括眼部、局部和其它配方。
任何给定的本发明组合物或药物组合物可以包含一种或多种硫代钼酸烷基铵化合物，如含有至少两种、三种、四种或更多种这样的化合物。含有多种硫代钼酸烷基铵化合物的组合物和药物组合物也包括在本发明的范围内。
本发明的组合物和药物组合物还可以包含生物学或治疗学有效量的另外的生物学试剂和/或治疗剂，诸如包含生物学或治疗学有效量的至少第二种、第三种或第四种或更多种生物学试剂和/或治疗剂。当然，“至少第二种生物学试剂和/或治疗剂”这一表述是参考“至少第一种硫代钼酸烷基铵化合物”作为组合物中的第一种生物学和治疗学试剂而选择使用的。
“至少第二种生物学和/或治疗学试剂”经常是治疗剂，但并非必须如此。例如，所述的至少第二种生物学试剂可以是药用可接受赋形剂、稀释剂或载体；抗真菌或抗细菌试剂；或者与药物制备和/或储存相关的其它生物学试剂。所述的第二种生物学试剂还可以是诊断试剂，它与硫代钼酸烷基铵治疗剂分开保存。
在所述至少第二种生物学试剂是治疗剂时，通常基于待治疗疾病来选择这样的治疗剂。例如，抗关节炎化合物可以应用于关节炎的治疗，等等。本发明中这样的“联合型”组合物和药物组合物包括混合物或“调和物”(cocktail)，以及为销售和/或用于本发明中而包装的独特制剂。
在本发明的联合组合物、药物、调和物、试剂盒以及相关方法、药剂和第一种和第二种医学用途中，联合是“治疗学上有效的组合”。因此，本发明的预定实践中涉及第二种治疗剂的在先、同时或随后的施用，从而在体内产生联合的治疗有效量试剂，而不管施用的时间以及联合治疗有效量是否是增加的、加成的或协同的量。
某些优选的第二种治疗剂是第二种抗血管发生试剂或“第二种独特的抗血管发生试剂”，而所述的至少第一种硫代钼酸烷基铵化合物是组合物中的第一种抗血管发生试剂。代表性的第二种抗血管发生试剂包括与烷基铵基团无关的其它硫代钼酸盐化合物，诸如四硫代钼酸铵本身。与诸如单糖、二糖、三糖、寡糖或多糖等至少第一种碳水化合物分子相关的其它硫代钼酸盐化合物是可与本发明硫代钼酸烷基铵化合物联合使用的试剂的更进一步的实施例。
在本发明的组合物和药物组合物中联合使用的例证性抗血管发生试剂可选自表2。抗VEGF抗体是另一类适当的抗血管发生试剂。举例说来，所述的至少第二种抗血管发生试剂可以是选自制管张素、endostatin、trientine和青霉胺的抗血管发生试剂。联合用于本发明中的其它有效的第二种抗血管发生试剂是锌化合物。
在与异常血管发生相关的待治疗疾病是癌症的情况下，所述至少第二种治疗剂可以是至少第二种抗癌剂，即“至少第二种独特的抗癌剂”。在这样的实施方案中，该至少第一种硫代钼酸烷基铵化合物还是所述的“至少第一种抗癌剂”。
代表性的第二种抗癌试剂包括化疗试剂、放疗试剂、免疫毒素、凋亡诱导试剂、不同的抗血管发生试剂和不同的铜结合试剂。第二种抗癌剂还包括锌化合物。
如此处使用的，术语“化疗试剂”指用于恶性肿瘤治疗的传统化疗试剂或药物。该术语是为了简便而使用的，事实上其它化合物(包括免疫毒素)只要它们发挥抗癌作用也可以技术性的描述为化疗试剂。然而，“化疗”已经在技术上具有特殊含义，并根据该标准含义进行使用。因此“化疗剂”在本申请书的内容中一般不指免疫毒素、放疗试剂等等，尽管它们在操作上有重叠。
大量化疗试剂的范例是本领域所已知的且在本文中有进一步的描述。本领域的普通技术人员将容易的理解化疗试剂的使用和适当剂量，但是与本发明组合时可以适当的降低剂量。也可以称为“化疗试剂”的一类新药是可诱导凋亡的试剂。这些药物中的任何一种或多种，包括基因、载体、和反义构建物，也可以适当的与本发明进行组合。
本发明还提供了一系列的治疗试剂盒。在实施例中，某些治疗试剂盒包含至少第一种药物组合物，这种组合物中包含药用可接受赋形剂和生物学或治疗有效量的至少第一种硫代钼酸烷基铵化合物。在另一实施例中，另外的试剂盒包含生物学或治疗有效量的至少第一种硫代钼酸烷基铵化合物以及将该化合物用于治疗或预防与异常血管形成相关的疾病的说明书，诸如将该化合物用于治疗或预防癌症的说明书。优选的，这些试剂盒中的任一种都包含用于装载药物组合物或组合物的至少第一种容器。
所述试剂盒还可包含生物学或治疗学有效量的至少一种诊断组分或至少第二种生物试剂或治疗试剂，诸如抗血管发生试剂或抗癌试剂。上述任一种或多种第二生物试剂或治疗试剂都可用于所述试剂盒中。
在这样的试剂盒中，任何组合的治疗剂都可包含在单一的容器或容器装置中，或者包含于不同的容器或容器装置中。调和物(cocktail)通常被混合在一起以便联合使用。诊断和检测组分包含在不同的容器或容器装置中。
在具体的实施方案中，本发明的试剂盒包含用于测定血清铜蓝蛋白水平的检测体系中至少一种组分。优选的，试剂盒中包含测定血清铜蓝蛋白水平所必需的检测体系中的各组分。这些组分或整个检测体系将包含于与试剂盒中所述的至少第一种四硫代钼酸四烷基铵化合物分开的容器中。在优选的实施方案中，这样的试剂盒还包含另外的说明书，诸如基于对特定患者测定的血清铜蓝蛋白水平调节硫代钼酸烷基铵疗法的有关说明书。
本发明另外的试剂盒包括含有检测或诊断癌症所用的检测体系中生物学或诊断有效量的至少一种组分(即，“癌症诊断组分”)在内的试剂盒。优选整个癌症诊断体系或检测法。这样的组分或体系包含在不同于所述的至少第一种四硫代钼酸四烷基铵化合物的组合物中。
本发明的化合物、组合物、药用制剂、试剂盒及其联合物特别适用于结合铜并形成试剂-铜-蛋白质复合物，并且由此能够有效用于治疗或预防与异常血管形成或血管发生相关或以此为特征的一系列疾病和紊乱。
因此，本发明还提供了一种或多种硫代钼酸烷基铵化合物在制备治疗或预防以异常血管形成或血管发生为特征的药物中的用途。本发明的具体方面是利用至少第一种硫代钼酸烷基铵化合物制备用于治疗或预防人受试者中以异常血管形成或血管发生为特征的疾病的药物。本发明的另一具体方面是利用与铜结合并形成硫代钼酸化合物-铜-蛋白质复合物的硫代钼酸烷基铵化合物制备用于治疗或预防以异常血管形成或血管发生为特征的疾病、任选人受试者中的疾病的药物。
从本发明的这些方面产生出更多的独创性的试剂盒。例如，治疗试剂盒，优选用于人，所述试剂盒中包含A.按照本发明制备的药物，即，含至少第一种硫代钼酸烷基铵化合物的药物；和B.测定血清铜蓝蛋白(Cp)水平的试剂，优选用于测定人体内血清铜蓝蛋白水平的试剂。
本发明别的试剂盒中包含以下组分按照本发明制备的药物的负荷剂量，即，含至少第一种硫代钼酸烷基铵化合物的药物，其中的负荷剂量药物使血清铜蓝蛋白水平降低至药物施用前水平的约20％以下，以及按照本发明制备的药物的维持剂量，即，含至少第一种硫代钼酸烷基铵化合物的药物，其中的维持剂量药物使血清铜蓝蛋白水平维持在药物施用前水平的约20％以下。
就方法而言，本发明还提供了治疗或预防与异常血管形成或血管发生相关的疾病的方法。如此处使用的，术语“异常血管形成”或“异常血管发生”将理解为包括异常新血管形成，包括形成新的血管、更大的血管、进一步分支的血管(套叠生长)、和任何以及所有导致患病组织或位点的血液运输能力不恰当或升高的机制。本发明的试剂将理解为，能够消除“异常血管形成”或“异常血管发生”而与作用的实际机制无关。
本发明所提供的“抗血管发生疗法”可应用于患有或有风险患上以不希望有的、不恰当的、异常的、过度的和/或病理性血管形成或血管发生为特征的任何疾病或紊乱的动物和患者中。本领域普通技术人员众所周知，因为无论周围组织如何，以血管发生为基础的过程基本上相同，并且，由于异常的血管发生存在于多种疾病和紊乱中，所以一旦某一给定的抗血管发生疗法在任何可接受模型体系中显示出有效，它就能用于治疗与血管发生相关的全部类型的疾病和紊乱。
本发明的方法、药物和医学用途特别意图用于患有或有风险患上以下疾病的动物和患者中任何形式的血管形成型肿瘤；黄斑变性，包括与年龄相关的黄斑变性；关节炎，包括类风湿性关节炎；动脉粥样硬化和动脉粥样硬化斑；糖尿病性视网膜病和其它视网膜病；甲状腺增生，包括突眼性甲状腺肿；血管瘤；新生血管性青光眼；和牛皮癣。
本发明的方法、药物和医学用途特别意图用于患有或有风险患上以下疾病的动物和患者中动静脉畸形(AVM)、脑脊膜瘤和血管再狭窄，包括血管成形术后的再狭窄。所述治疗方法和用途的其它预期目标是患有或有风险患上以下疾病的动物和患者血管纤维瘤、皮炎、子宫内膜异位症、血友病性关节、肥厚性瘢痕、发炎性疾病和紊乱、化脓性肉芽肿、硬皮病、滑膜炎、沙眼和血管粘附。
如特别收编于此作为参考的美国专利5,712,291中所述，各前述稍优选被治疗疾病决非彻底涵盖了本发明可治疗疾病的类型。由于以下目的，将美国专利5,712,291收编于此作为参考鉴别可用抗血管发生疗法有效治疗的许多其它疾病；证明在公开了确定类型的抗血管发生化合物(在此情况下，是硫代钼酸烷基铵化合物)时所有血管发生疾病的疗法即代表了统一的概念；以及证明只通过来自单一模型系统的资料即能对所有血管发生型疾病进行治疗。
在更多的方面，以及如收编于此作为参考的美国专利5,712,291中所述的，本发明的方法、药物和医学用途意图用于治疗患有或有风险患上以下疾病的动物和患者纤维血管组织的异常增殖、酒糟鼻、获得性免疫缺陷综合症、动脉栓塞、特应性角膜炎、细菌性溃疡、Bechets disease、有血肿瘤、颈动脉梗阻性疾病、化学烧伤、脉络膜新血管形成、慢性炎症、慢性视网膜脱落、慢性葡萄膜炎、慢性玻璃体炎、隐形眼镜过度磨损、角膜移植排异、角膜新血管形成、角膜移植新血管形成、Crohn’s disease、Eales disease、流行性角膜结膜炎、真菌性溃疡、单纯疱疹感染、带状疱疹感染、高粘滞综合征、卡波西肉瘤、白血病、脂质变性、莱姆病、边缘性角质层分离、Mooren溃疡、除麻疯病以外的分枝杆菌感染、近视、眼睛新血管疾病、眼凹陷、Osler-Weber综合症(Osler-Weber-Rendu)、骨关节炎、派杰病、pars planitis、类天疱疮、phylectenulosis、多动脉炎、激光后并发症、原生动物感染、弹性假黄色瘤、翼状胬肉干燥性角膜炎、放射状角膜切开术、视网膜新血管形成、早产儿视网膜病变、晶状体后纤维增生、类肉瘤、巩膜炎、镰状细胞血症、Sogrens综合症、实体瘤、Stargarts disease、Steven’s Johnson disease、超边缘性角膜炎、梅毒、系统性狼疮、Terrien’s边缘性变性、弓形体病、外伤、尤因肉瘤、成神经细胞瘤、骨肉瘤、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、溃疡性结肠炎(ulceritive colitis)、静脉栓塞、维生素A缺乏症和魏格纳氏结节病。
本发明进一步提供了用于治疗患有或有风险患上关节炎的动物和患者的方法、药物和医学用途，和特别收编于此作为参考的美国专利5,753,230中所述的关节炎的疗法一致。美国专利5,972,922也特别收编于此作为参考来进一步举例说明抗血管发生方法在治疗与以下疾病相关的不希望有的血管发生中的应用糖尿病、寄生虫病、异常伤口愈合、手术后的肥大、烧伤、损伤或创伤、头发生长的抑制、排卵和黄体形成的抑制、植入着床的抑制和子宫中胚胎发育的抑制。美国专利5,639,757也特别收编于此作为参考，用于举例说明抗血管发生策略在移植排斥反应通用疗法中的应用。因此所有上述疾病都被考虑可通过本发明的方法和用途进行治疗。
尽管在本项统一的发明中能治疗每一种上述疾病，本发明方法、药物和医学用途中尤其优选的方面是将抗血管发生疗法应用于治疗患有或有风险患上血管化实体瘤、转移性肿瘤或来自原发性肿瘤的转移性病灶的动物和患者。
在本发明的内容中，术语“血管形成化肿瘤”最优选指血管形成化的恶性肿瘤、实体瘤、或“癌”。就癌症治疗而言，本发明的组合物和方法可以用于治疗具有血管成分的所有形式的实体瘤。实体瘤，诸如癌和肉瘤，是适合用本发明组合物和方法进行治疗的肿瘤类型的范例。使用本发明能够预防或治疗的肿瘤类型的具体范例包括(但不限于)肾肿瘤、肺肿瘤、乳腺肿瘤、结肠肿瘤、前列腺肿瘤、胃肿瘤、肝肿瘤、胰肿瘤、食道肿瘤、脑肿瘤、和喉肿瘤，以及血管肉瘤和软骨肉瘤。
各种大小的肿瘤都可以使用本发明进行治疗。因此，由直径大约1cm或更小的肿瘤例示的小肿瘤(包括转移性肿瘤)、由直径大约1cm至大约5cm之间的肿瘤例示的中等肿瘤、和由直径大约5cm或更大的肿瘤例示的大肿瘤也意欲使用本发明进行治疗。所述肿瘤可以是原发性或转移性肿瘤，或二者。
既然无论肿瘤细胞的表型如何，本发明的组合物和方法都可应用于治疗各种肿瘤，患有超过一种类型肿瘤的患者也可以使用本发明进行有效的治疗。因此，患有至少第一种和至少第二种、第三种或更多不同类型肿瘤(由乳腺肿瘤和软骨肉瘤或者肾肿瘤和肺肿瘤例示)的患者也意欲使用本发明进行治疗。
本发明的例证性方法包括对患有或有风险患上异常血管发生相关性疾病(包括黄斑变性、类风湿性关节炎和癌症)的动物或患者施用含有生物学或治疗有效量的至少第一种硫代钼酸烷基铵化合物的药物组合物。任一种或多种前述硫代钼酸烷基铵化合物都可用于所述方法中，包括四硫代钼酸四烷基铵化合物，诸如四硫代钼酸四甲铵、四硫代钼酸四乙铵或四硫代钼酸四丁铵，在某些实施方案中优选四硫代钼酸四丙铵。
在某些实施方案中，本发明提供了治疗或预防与异常血管形成或血管发生相关的疾病(包括黄斑变性、类风湿性关节炎和癌症)的方法，包括对患有或有风险患上所述病症的动物或患者施用至少第一种硫代钼酸烷基铵化合物，所述的硫代钼酸烷基铵化合物在水中是充分可溶性的，在暴露于空气和湿气中时基本上保持稳定，所用量在施用于动物或患者时可以有效释放治疗剂量的生物活性硫代钼酸盐化合物。
在其它实施方案中，本发明提供了治疗或预防与异常血管形成或血管发生相关的疾病(包括黄斑变性、类风湿性关节炎和癌症)的方法，包括对患有或有风险患上所述病症的动物或患者施用至少第一种四硫代钼酸烷基铵化合物，所述的四硫代钼酸烷基铵化合物包含基本上足以保护四硫代钼酸盐在施用前的贮存期间免于被氧化的许多烷基；其中的四硫代钼酸烷基铵化合物在施用于动物或患者时释放治疗有效量的有生物活性的四硫代钼酸盐。
在更多的实施方案中，本发明提供了治疗或预防与异常血管形成或血管发生相关的疾病(包括黄斑变性、类风湿性关节炎和癌症)的方法，包括对患有或有风险患上所述病症的动物或患者施用药物组合物，所述的药物组合物包含至少第一种四硫代钼酸四烷基铵化合物，其中的烷基实质性延长了四硫代钼酸盐化合物的贮藏寿命；其中的四硫代钼酸四烷基铵化合物保持可溶性并且在施用于动物或患者时释放有效量的有充分治疗活性的四硫代钼酸盐和基本上无毒的烷基铵基团。
本发明的药物组合物可通过合适的途径施用于动物或患者，诸如非肠道的施用、口服、通过眼部施用等等。在某些情况下，优选口服。不过，其它的施用途径也在考虑的范围内，包括、但不局限于静脉内、肌肉内和皮下注射；直肠、鼻、局部和阴道给药；缓释制剂等等。
无论疾病的类型为何，本发明还提供了延迟或预防异常血管形成或血管发生相关性疾病(包括黄斑变性、类风湿性关节炎和癌症)发作的方法。这样的方法包括对有风险患上异常血管形成或血管发生相关性疾病(包括黄斑变性、类风湿性关节炎和癌症)的动物或患者施用含有预防有效量的至少第一种硫代钼酸烷基铵化合物的至少第一种药物组合物。在这样的预防性方法中，可能“选择”或鉴别有风险患上异常血管形成或血管发生相关性疾病(包括黄斑变性、类风湿性关节炎或癌症)的患者，诸如通过鉴别已有患者的亲属、通过遗传检测鉴别疑似患者等等。
“预防有效量”是指在施用于动物或患者时能有效延迟或充分预防异常血管形成或血管发生相关性疾病(包括黄斑变性、类风湿性关节炎和癌症)发作的一种或多种硫代钼酸烷基铵化合物的量。
本发明还提供了公开的治疗方法，它可应用于全部范围的血管发生性疾病。本发明由此提供了治疗异常血管形成或血管发生相关性疾病(包括黄斑变性、类风湿性关节炎和癌症)的方法，包括对患有或有风险患上异常血管形成或血管发生相关性疾病(包括黄斑变性、类风湿性关节炎或癌症)的动物或患者施用含有治疗有效量的至少第一种硫代钼酸烷基铵化合物的至少第一种药物组合物。
本发明的“治疗有效量”因此是指在施用于动物或患者时有效延迟或充分预防异常血管形成或血管发生相关性疾病(包括黄斑变性、类风湿性关节炎或癌症)发展和/或减轻其症状的一种或多种硫代钼酸烷基铵化合物的量。例如，在施用于动物或患者时，治疗有效量可以减缓患病组织例如肿瘤的生长；实质上抑制这样的生长；在患病组织或肿瘤的至少一部分特异诱导坏死；以及/或引起疾病减轻或缓解。
优选在实现这些治疗效果的同时，在动物或患者的正常、健康组织上只显示可忽略的或易处理的不利副作用。因此，“治疗有效量”可以随动物个体的不同、或患者个体的不同而变化，这取决于许多因素，包括(但不限于)疾病状况和患者体型。主治医师根据本发明公开内容可以常规解决所有这些给药问题。
在本发明的某些方面，所述至少第一种硫代钼酸烷基铵化合物的生物学或治疗有效量是每个患者大约10mg至大约300mg之间。在本发明的某些方面，所述的生物学或治疗有效量是在治疗有效时间或阶段中每个患者大约20mg至大约200mg之间。一般而言，每天给患者施用试剂，因而在本发明的这些实施方案中，该至少第一种试剂的生物学或治疗有效量是每个患者每天大约10mg至大约300mg之间，或者大约20mg至大约200mg之间。某些优选的剂量在大约125mg至大约190mg之间，和大约150mg至大约180mg之间。
“大约10mg至大约300mg之间”包括该范围内的所有值，因而包括大约20mg、大约25mg、大约30mg、大约40mg、大约50mg、大约60mg、大约70mg、大约75mg、大约80mg、大约90mg、大约100mg、大约110mg、大约120mg、大约125mg、大约130mg、大约140mg、大约150mg、大约160mg、大约170mg、大约180mg、大约190mg、大约200mg、大约210mg、大约220mg、大约230mg、大约240mg、大约250mg、大约260mg、大约270mg、大约280mg、大约290mg和大约295mg的量。“大约”将理解为包括略大和略小于该给定值的数值。因此，“大约20mg”将理解为包括大约18mg、大约19mg、大约21mg、和大约22mg等等，而“大约200mg”将理解为包括大约201mg、大约202mg、大约203mg、和大约204mg等等。
在本发明的其它实施方案中，所述至少第一种试剂的生物学或治疗有效量是每个患者每天大约20mg至大约190mg之间，大约20mg至大约180mg之间，大约20mg至大约170mg之间，大约20mg至大约160mg之间，大约20mg至大约150mg之间，大约20mg至大约140mg之间，大约20mg至大约130mg之间，大约20mg至大约120mg之间，大约20mg至大约110mg之间，大约20mg至大约100mg之间，大约20mg至大约90mg之间，大约20mg至大约80mg之间，大约20mg至大约70mg之间，大约20mg至大约60mg之间，大约20mg至大约50mg之间，大约20mg至大约40mg之间，大约20mg至大约30mg之间，大约30mg至大约200mg之间，大约40mg至大约200mg之间，大约50mg至大约200mg之间，大约60mg至大约200mg之间，大约70mg至大约200mg之间，大约80mg至大约200mg之间，大约90mg至大约200mg之间，大约100mg至大约200mg之间，大约110mg至大约200mg之间，大约120mg至大约200mg之间，大约130mg至大约200mg之间，大约140mg至大约200mg之间，大约150mg至大约200mg之间，大约160mg至大约200mg之间，大约170mg至大约200mg之间，大约180mg至大约200mg之间，大约190mg至大约200mg之间，大约30mg至大约190mg之间，大约40mg至大约180mg之间，大约50mg至大约170mg之间，大约60mg至大约160mg之间，大约70mg至大约150mg之间，大约80mg至大约140mg之间，大约90mg至大约130mg之间，大约100mg至大约120mg之间，大约125mg至大约200mg之间，或大约150mg至大约180mg之间。
上述值还可以用mg/kg体重表示。如上所述，生物学或治疗有效量可以随动物或人类患者的体型变化。然而，假设男性的平均体重是大约70kg，可以很容易的计算出以mg/kg表示的化合物的生物学或治疗有效量。
生物学和治疗有效量也能够用铜降低水平进行有效表述。就此而言，本发明优选涉及对患有异常血管形成或血管发生相关性疾病(包括黄斑变性、类风湿性关节炎和癌症)的动物或患者施用至少第一种硫代钼酸烷基铵化合物，施用量和施用的持续时间可以使动物或患者体内的铜水平降低至施用该硫代钼酸烷基铵化合物前动物或患者的体内铜水平的约10％至约40％之间。铜水平降低至约15％至约30％之间、约10％至约20％之间、或约15％至约20％之间是特别有效的，对于大部分动物和患者而言降低至治疗前水平的约20％是有效的。
动物和患者体内的铜水平是可以方便的测定的，优选的方法是测定血清铜蓝蛋白的水平。
在另外的实施方案中，在进行本发明的最初治疗后，随之对动物或患者施用可以有效地实质性保持动物或患者中已降低的铜水平的铜结合剂用量。所述的随后的施用优选其施用量和时间能够有效地使动物或患者体内的铜水平维持在最初施药前体内铜水平的大约10％-20％之间。
因此，本发明包括这样的治疗方法，其中首先对动物或患者施用至少第一种硫代钼酸烷基铵化合物的负荷剂量，其施用量和时间可以最初有效地使动物或患者体内的铜水平降至施药前体内铜水平的大约20％-40％；其中随后对动物和患者施用维持剂量的铜结合剂，其施用量和持续时间可以有效地使动物或患者体内的铜水平维持在最初治疗前体内铜水平的大约10％-20％之间。
本发明的这些方法可应用于治疗或预防异常血管形成或血管发生相关性疾病，包括黄斑变性、类风湿性关节炎和癌症。这样的方法包括对患有或有风险患上所述疾病的动物或患者施用a)其用量足以有效降低动物或患者体内铜水平的至少第一种硫代钼酸烷基铵化合物，优选降低至治疗前铜水平的约10％至约40％之间，更优选降低至治疗前铜水平的约20％；和b)基本上维持动物或患者体内已降低的铜水平。
在所有这样的实施方案中，随后施用的铜结合试剂可以是有效结合并降低动物中铜水平的的任何试剂。适当的铜结合试剂是硫代钼酸盐化合物，包括最初治疗中所用的硫代钼酸烷基铵化合物。不过，其它的铜结合试剂也可以被有效的利用，尤其是锌化合物，诸如醋酸锌。铜水平优选通过血清铜蓝蛋白水平指示。
任一种前述方法都可进一步包括对动物或患者施用治疗有效量的至少第二种治疗剂。第二种治疗剂可以是第二种抗血管发生试剂或第二种抗癌剂。第二种治疗剂还可以是用除了抗血管发生以外的方式对抗待治疗疾病的试剂，例如抗关节炎性化合物。例证性的第二种抗血管发生试剂是不同的铜鳌合试剂和锌化合物。例证性的第二种抗癌剂是化疗试剂、放疗试剂、不同的抗血管发生试剂和凋亡诱导试剂。
所述的至少第二种治疗剂、抗血管发生试剂或抗癌剂可与至少第一种硫代钼酸烷基铵化合物基本上同时施用于动物或患者，这样的第一种试剂和第二种试剂可以来自单一的药物组合物或来自紧接着一起施用的两种药物组合物。
或者，所述的至少第二种治疗剂、抗血管发生试剂或抗癌剂可以与至少第一种硫代钼酸烷基铵化合物相继施用于动物或患者。“在相继的时间”用于此处时指“交错的”，从而使所述的至少第二种试剂在不同于硫代钼酸烷基铵化合物施用时间的时间点施用于动物或患者。
一般而言，所述的两种试剂以允许这两种试剂有效发挥其各自治疗效用的时间间隔施用，即，它们以“生物学有效的时间间隔”施用。所述的第二种试剂可以在施用硫代钼酸烷基铵化合物之前的生物学有效时间点施用于动物或患者，或者在施用所述化合物之后的生物学有效时间点施用。其它的组合疗法，包括外科切除术和放疗，如X-射线疗法，也包括在本发明内。
附图简述下面这些图构成了本说明书的一部分，并被用于进一步论证本发明的某些方面。通过参考其中一幅或多幅附图，结合此处介绍的特定实施方案的详细描述，可以更好的理解本发明。


图1.(n-Pr4N)2MoS4(TP-TM)的晶体包装投影图。
图2.以获自单一晶体X-射线结构测定的原子座标为基础计算的X-射线粉晶谱。
图3.实验上获自结晶(n-Pr4N)2MoS4(TP-TM)的X-射线粉晶谱。
图4A.TP-TM相对于TM(AmmTM)增强的稳定性。在增加不稳定性的条件下，即，将药物在室温下置于开盖皮氏培养皿中，研究各化合物的稳定性。以活性的百分数对作用的天数作图。
图5.TP-TM与TM一样有效抑制了人肿瘤外源移植物在体内的生长。将106个乳腺癌细胞注射入4组(每组5只小鼠)无胸腺裸鼠的乳房脂垫中。对照小鼠不接受治疗。3组实验组在指定时间开始进行处理，各接受1mg/天的原始TM，AmmTM；1mg/天的TP-TM，四丙基-四硫代钼酸盐(在图中标示为“TP 1mg”)；或1.5mg/天的TP-TM(在图中为“TP 1.5mg”)。误差范围在所给出数值的5％以内。被处理动物的生长曲线明显不同于对照动物，p＜0.01。TP-TM(TP)的生长曲线在统计学上不能与TM曲线区别开来。
例证性实施方案的描述实体瘤占人类所有癌症的90％以上(Shockley等人，1991)。单克隆抗体和免疫毒素的治疗性应用已经在淋巴瘤和白血病中进行了研究(Lowder等人，1987；Vitetta等人，1991)，但是在实体瘤的临床试验中令人失望的无效(Byers和Baldwin，1988；Abrams和Oldham，1985)。
抗体疗法无效的主要原因是大分子不容易转运进入实体瘤(Sands，1988；Epenetos等人，1986)。即使这些分子进入了肿瘤块，由于存在肿瘤细胞(Dvorak等人，1991)、纤维基质(Baxter等人，1991)之间的紧密连接、间质压力梯度(Jain，1990)和结合位点屏障(Juweid等人，1992)，它们仍不能均匀分布。
在癌症对照中，高度发挥功能的个体通常需要应付很大可能性的临床癌症诊断或很大程度上的无症状癌症无情发展至致死阶段。在细胞水平上，尽管临床背景存在多样性，但是早期的和存在的肿瘤都需要新的血管生长或血管生成，从而影响它们宿主的生活质量。因此，成功的抗血管生成疗法的发展可能具有预防形成的肿瘤发展成临床相关症状的效果，或者可能延长具有稳定转移性疾病的无症状状态。另外，这些疗法还可能具有使明显的肿瘤消退的效果。
二十世纪七十年代就已经知道，铜是血管生成中的辅助因子。许多关键血管生成介质，诸如FGF、血管生成素、和SPARC，以它们的前血管生成状态与铜结合或相互作用。用于实体瘤的抗血管生成疗法的概念(Folkman，1972；1995c；1997)具有坚实的理论基础，而且已经在动物肿瘤模型中显示了功效(Volpert等人，1996；Millauer等人，1996；Warren等人，1995；Borgstom等人，1996；1998；Yuan等人，1996；O’Reilly等人，1997；Benjamin等人，1999和Merajver等人，1998)。阻碍血管生成级联反应中关键步骤的化合物正进入临床(Marshall等人，1997)。在原发和转移位点的成功的肿瘤血管生成需要的步骤是多样的，它们取决于血管生成激活剂(Iruela-Arispe和Dvorak，1997；Hanahan和Folkman，1996)诸如VEGF和bFGF与诸如血小板反应蛋白-1(TSP-1)(Volpert等人，1995；Salnikow等人，1997；Guo等人，1997；Schapira和Schapira，1983；Qian等人，1997)、制管张素(angiostatin)(O’Reilly等人，1994；Lannutti等人，1997；Sim等人，1997)和endostatin(O’Reilly等人，1997)等抑制剂之间的不平衡。不同组织中不同血管生成调控分子的相对重要性可能决定了抗血管生成化合物在原发和转移位点引起应答的相对能力。
已经充分证明了铜是血管生成所必需的(Parke等人，1988；Raju等人，1982；Ziche等人，1982)。Brem等人(1990a，b)和最近Yoshida等人(1995)试图在动物肿瘤治疗的研究中使用抗铜方法。他们使用了结合青霉胺治疗的缺铜食谱，称为CDPT。研究显示，这种治疗的结果是，兔子大脑中的兔子VX2癌(Brem等人，1990b)和大鼠大脑中的大鼠9L神经胶质肉瘤(Brem等人，1990a；Yoshida等人，1995)的生长受到相对抑制，但是值得注意的是全面存活并没有改进。在Yoshida等人的研究中，动物是在能够评价全面存活之前处死的。在Brem等人的研究中，死亡原因是并发的脑内水肿，在处理动物中的严重程度足以引起死亡，其死亡速度与对照动物中未处理肿瘤的作用相同。此外，与兔子大脑模型相反，CDPT不能抑制VX2癌在大腿肌肉中和肺转移瘤中的肿瘤生长和血管形成。在大脑肿瘤植入模型中存活未得到改进，在非大脑肿瘤中缺乏效果，这些似乎使该领域的进一步工作令人气馁。
本发明人推理得出，为了能够普遍应用于人类肿瘤，很需要发展影响血管生成的多种激活剂的抗血管生成策略。许多抗血管生成思路针对的是单一目标。既然铜是许多血管生成关键介质(诸如bFGF(Watanabe等人，1990；Engleka和Maciag，1994；Shing，1998；Patstone和Maher，1996)、VEGF、和血管生成素(Badet等人，1989))发挥功能所必需的辅助因子，本发明人发展了用于治疗癌症和特征为异常血管生成的其它疾病、基于调控全身铜状况的抗血管生成策略。本发明者早期工作的根本基础是，鉴定其中血管生成受到削弱，但是其它依赖铜的细胞过程所受影响不足以引起临床毒性的铜不足范围。尽管使用动物模型的其他研究人员失败了，本发明人已经成功地实现了他们的临床目标。
本领域一个一直需要解决的问题是发展可降低体内铜水平的安全和有效的预防或治疗试剂。本发明人关于癌症治疗的抗铜、抗血管生成方法的假说是，血管生成需要的铜水平相对高于基本的铜依赖性细胞功能(诸如红血素的合成、细胞色素功能、和将铜掺入酶和其它蛋白质)需要的铜水平。本发明人首次推理得出，与其它抗铜药物相比，四硫代钼酸盐(tetrathiomolybdate，TM)作为抗铜试剂的独特和有利特征使之成为抗铜、抗血管生成疗法中的无毒的、有效的新武器。
如下文详述的，在过去的20年，本发明人已经发展了用于威尔逊病的新的抗铜疗法，威尔逊病是一种铜转运的常染色体隐性疾病，导致铜累积异常和毒性。现在正在使用的一种药物是TM，TM显示独特和期望的快速作用、铜特异性、和低毒性特性(Brewer等人，1991a；1994b；1996)，以及作用的独特机制。TM与铜和蛋白质形成稳定的三组分复合体。如果与食物一起施用，它将与食物铜和食物蛋白质发生复合反应，从而预防胃肠道对铜的吸收。唾液中存在铜的内源性分泌，还存在与食物摄取有关的胃分泌，这些铜也与通过食物摄取的TM发生复合反应，由此预防铜的再吸收。因此，当在食物中提供TM时，患者立即处于负性铜平衡中。如果TM是在就餐间隔提供的，它将被吸收进入血流，在那里或与游离的或与松散结合的铜和血清清蛋白发生复合反应。这种TM结合的铜部分将不再能够被细胞吸收，且不具有已知的生物学活性。
本发明者的早期研究确实显示了TM是安全和有效的抗癌试剂。TM在削弱HER2-neu转基因小鼠乳腺肿瘤的从头发展中显示有功效(实施例2)，而且当铜水平降低至基线的10％时不显示临床上明显的毒性。本公开书还详述了在患有转移性癌症的患者中使用四硫代钼酸盐的抗血管生成疗法抗铜方法的第一次人类试验(实施例3和4)。TM的I期试验(获得剂量信息、剂量反应、评价患者的铜状况、毒性和功效)令人惊讶的有利，相对于其它研究人员进行的令人失望的动物研究(Brem等人，1990a、b；Yoshida等人，1995)尤显突出。
尽管发明人的观念性突破以及将此观念发展成成功临床的研究工作无法低估，通过开发改良的“第二代”化合物，尤其是稳定性和贮存寿命改善的化合物，将能够显著促进广泛应用的治疗方法的直接、经济的发展。本发明提供了一系列的化合物，它们在暴露于空气和湿气后具有显著改善的稳定性，但仍保留了可溶性，并且在体内给药后可提供相同的治疗反应。
I.威尔逊病A.背景威尔逊病是铜代谢的常染色体隐性疾病。在这种疾病中，将铜排泄到胆汁中的功能是有缺陷的，而且肝将铜掺入血浆铜蓝蛋白的功能也降低了，导致铜在血浆和大多数身体组织中积累。威尔逊病通常导致肝和/或神经功能障碍。
威尔逊病的疗法可以分成两大类(Brewer和Yuzbasiyan-Gurkan，1992a)。即对于急性患者的初始治疗以及维持治疗。初始治疗指患者仍在遭受急性铜毒性的那段时间，一般指治疗的最初几周到几个月。维持治疗基本上指患者剩下的生命期，或铜水平已经降至亚毒性域值以下后的那段时间，患者进行治疗只是预防铜积累和铜毒性反复发作。
对于威尔逊病的维持治疗，现在可以获得3种药物。这包括最早可获得的药物青霉胺(Walshe，1956)、发展用于对青霉胺不耐受患者的叫做三乙四胺(trien)或曲恩汀的药物(Walshe，1982)、和醋酸锌(Brewer和Yuzbasiyan-Gurkan，1992a、b；Brewer等人，1983；Hill等人，1987；Hill等人，1986；Brewer等人1987b、c、d；Yuzbasiyan-Gurkan等人，1989；Brewer等人，1989；Lee等人，1989；Brewer等人，1990；Brewer等人，1991b；Brewer和Yuzbasiyan-Gurkan，1989；Brewer等人，1992a、b；Yuzbasiyan-Gurkan等人，1992；Brewer，1993a、b、c、d；Brewer，1993；Hoogenraad等人，1978；Hoogenraad等人1979；Hoogenraad等人，1987)。锌提供了有效的维持治疗，同时毒性水平极低。
大约2/3患有威尔逊病的患者有脑部症状(Brewer等人，1992a；Scheinberg和Sternlieb，1984；Danks，1989)。这可以是神经学症状，或者开始是精神病症状，稍后有神经学症状。这些患者的治疗并不像维持期患者那样直接。发明人发现，这些用青霉胺治疗的患者中有大约50％变坏而非变好(Brewer等人，1987a)。这些恶化的患者中的半数，或原始样本的大约25％，再未恢复到青霉胺治疗前的基线。换言之，青霉胺诱导了其它不可逆的损伤。
这种恶化的机制现在还不确知，但是很可能是药物对肝铜的活动作用进一步升高了脑铜。发明人指出，这可以在大鼠模型中发生。不管机制是什么，展示神经学症状的患者在用青霉胺进行初始治疗之后，通常以恶化告终。事实上，甚至症状发生前患者在用青霉胺进行初始治疗之后，也可以产生神经学疾病(Glass等人，1990；Brewer等人，1994a)。因为曲恩汀还没有多次用于这种情况，所以还不知道当它用于初始治疗时是否展示神经学恶化的现象。如果它在某种程度上展示这个问题，这也不会令人惊讶，因为它的作用机制与青霉胺相似，但是它的程度可能低得多，因为它对铜的作用似乎更温和些。
锌不是用于这种患者的初始治疗的理想试剂。锌的作用相对较慢，而且只产生微弱的负铜平衡。由此，在锌将铜降至亚毒性域值以下需要的几个月期间，患者可能有进一步铜中毒和疾病恶化的风险。
B.TM治疗的结果发明人已经在最近几年中进行了TM用于展示威尔逊病神经学症状患者的初始治疗的开放标记研究。发明人已经建立了测定药物活性、评价稳定性、和确认所施用药物的功效的分光光度法鉴定和生物鉴定(Brewer等人，1991a；Brewer等人，1994b)。当暴露于空气时，药物慢慢失去功效。氧分子与硫分子发生交换，使得药物失活。
在第一例研究的患者中的结果可以用于说明几点。在第一周，患者只随餐施用TM(每天三次，随餐)。这将产生根据第一种作用机制(当随餐施用时阻断铜吸收)所期望的即刻负铜平衡。第一周后，还在餐间施用TM(每天三次随餐，和每天三次餐间)。由于TM吸收进入血液并形成铜、TM、和清蛋白复合体，导致血浆铜立即上升。与TM和清蛋白复合的铜不再被细胞摄取，该铜因此无毒(Gooneratne等人，1981b)。在这种复合体中的钼和铜之间存在1∶1的化学计量关系。知道了血液中的钼水平和血浆铜蓝蛋白水平(血浆铜蓝蛋白还含有无毒的铜)之后，可以计算有多少血浆铜未被结合。这所谓的“游离铜”(非血浆铜蓝蛋白型血浆铜)是潜在有毒的铜。当降至零时，血浆铜-钼“缺口”被关闭。这在第一名患者中需要16天(添加餐间剂量后9天)。由于大脑(和其它器官)游离铜与血液是平衡的，所以将血液游离铜降至低水平即开始了降低大脑游离(有毒)铜水平的过程。
在开放标记研究中，发明人现在已经用TM治疗了合计51名威尔逊病患者，所有这些患者都展示神经学或精神病学疾病。这些患者都根据标准进行诊断。这些患者的肝铜或尿铜在诊断上有升高，一般二者兼之。他们中的一些人在进行这种试验前已经用其它试剂进行了简单治疗。2名患者具有精神病学但无神经学症状。
所有患者施用每天三次的随餐20mg剂量，或每日四次(随三餐和一次点心)，在研究的最早期有3个例外。由此，在施用120mg和140mg总剂量的患者之间的唯一差异是前者施用每天三次随餐的20mg，或60mg，而后者施用每天四次随餐加上一次点心的20mg，或80mg。每日总剂量的其余部分分成3份相等剂量并在餐间施用。
每日总剂量在患者中变化可观，由高水平410mg到低水平120mg。最后，发明人可以发现与铜变量或者在研究过程中或在1和2年时间点测量的功能性变量不存在剂量相关关系。
在这些患者中还使用了锌。施用锌的起始时间变化较大，而且与铜变化、后果变化、或毒性无关。早期锌治疗应当在理论上有助于保持肝功能。在这些患者中，肝功能在第1年恢复到正常，但是由于这些测试不衡量组织保持的程度，所以很可能锌是多少有些有益的。
测量血浆中的三氯乙酸(TCA)可溶性铜在评价TM治疗对成尔逊病中铜代谢的作用是多少有些有用的。通常，这些患者中的血浆铜的大部分是TCA可溶性的(在患者中平均为56％，即27μg/dl)。所有非血浆铜蓝蛋白型血浆铜是TCA可溶性的，而且部分(多少有些变化)血浆铜蓝蛋白铜也是TCA可溶性的。由于血浆铜蓝蛋白水平在威尔逊病中经常是较低的，所以大部分血浆铜是TCA可溶性的。血液中TM/清蛋白/铜复合体中的铜是TCA不溶性的。由此，随着治疗的进行，TCA可溶性血浆铜所占部分变小。在TM治疗的后期，患者血浆铜的TCA可溶性部分平均为15μg/dl，由起始值即27显著下降。TCA可溶性部分不能作为绝对终点(例如试图降至零)使用，因为血浆中的血浆铜蓝蛋白通常存在少许(有些浮动)的可溶性部分。然而，显著的平均由27降至15μg/dl，说明TM治疗对这些患者中潜在有毒的血浆铜状态有有益效果。TM治疗对铜代谢的期望影响的进一步证据可以由与基线值相比TM治疗后期平均尿铜值的降低显示。
TM迅速且有利的作用于铜代谢，降低潜在有毒的血液铜，理论上还包括身体其它部分的铜。最初的临床目标是得到对铜毒性的控制，同时临床上不恶化。换言之，最初目标是保护治疗开始时具有的所有神经学功能。通过定量性神经学和言语测验进行每周评价。已经发表了方法学和神经学分级系统(Young等人，1986)。在施用TM、铜代谢受到控制的几周里，由定量神经学测验评价的神经学功能受到保护。只有2名患者(样本的4％)显示超过5个单位的变化，这是显著恶化的标准。
在随后的几年里，患者进行维持治疗，其中原先由铜诱导的脑损伤至少被部分修复。这可以由跟踪期每年进行的神经学得分显示部分恢复而得到说明。显然，使用起始TM方法，长期恢复是极好的，大多数患者显示实质性的神经学恢复。这些极好的结果与青霉胺疗法形成对比。如以前指出的，大约50％的患者施用青霉胺后初始恶化，而且这些的半数，或原始样本的25％再未恢复到施用青霉胺前的基线水平。
TM治疗最初8周的定量言语测验结果如Brewer等人描述(Brewer等人，1996)进行。在施用TM、铜代谢受到控制的几周里，通过定量言语测验测量可知神经学功能正在受到控制。没有患者显示得分显著降低(超过2.0个单位)。跟踪期几年里的言语得分显示部分恢复的结果表明，在患者进行维持治疗的随后几年里，先前由铜诱导的脑损伤得到部分修复。长期恢复是极好的。没有患者显示长期功能显著(超过2.0个单位)低于初始治疗之时，而且大多数显示显著的改进。
在这些患者中观察到TM治疗的两种非期望的后果。一种是7名患者展示的可逆贫血症/骨髓抑制。所有这些患者中血红蛋白的降低是显著的，平均3.4g％。3名患者显示血小板计数降低，4名患者显示白血球计数降低，这种降低可能是显著的。在所有7名患者中停服TM。除了2名患者外，其余患者停药时间在TM 56天疗程的较晚时间。
当患上贫血症时，这些患者的非血浆铜蓝蛋白型血浆铜都是零，而且TCA可溶性铜极其低。后者在这些患者中平均为2.7，而且该变量在全组患者中的平均值起初是27，在治疗高潮降至15。贫血症/骨髓抑制的起因推断为骨髓中铜的耗尽。由于血红素合成和细胞增殖中的其它步骤需要铜，所以可以预计贫血症和骨髓抑制效果将是铜耗尽的第一指征。这种由铜耗尽引起的结果是众所周知的现象。
由此，对TM的非期望应答不是副作用，而是由于过度治疗引起的。可能令人惊讶的是，甚至在这样短的时间里在体内铜过量的威尔逊病中产生局部骨髓铜耗尽也是可能的。对TM的这种应答是独特的。没有其它抗铜药物能够在早期治疗中产生这种效果。由此，证明了TM的功效及其控制铜水平的迅速。也有可能骨髓特别依赖血浆铜，而且这是降至很低水平的第一部分铜。在180mg/天或更高的剂量下，37名患者的6名中发生了过度治疗。在150或更低的剂量下，13名患者中只有1名展示过度治疗，而且发生在很晚的时候(56天计划疗程的第53天)。
在这些患者中TM治疗的第二种非期望的后果是4名患者中转氨酶值的升高。血清AST和ALT值升高。1名患者由于这些升高而终止了TM治疗。在这些升高过程中，与其它患者中尿铜下降的一般趋势相反，其尿铜升高。这些数据支持当由受损肝细胞释放铜时将发生肝炎的观念。目前尚不清楚为什么会发生这种肝类。然而，未治疗的威尔逊病患者具有发作性肝炎历史。由于很少有方法能够观察诊断后未治疗的患者，所以有关疾病自然史中转氨酶升高多久发作一次的信息不充分。
或者，一些病例中，TM可能以高于可以允许被处置的速度移动肝铜，在这些病例中患者将根据显示治疗副作用进行分类。相反的观察结果是，铜中毒的羊在施用大剂量TM后迅速纠正了急性肝炎、肝坏死、和溶血性贫血。所有这4名患者均是用150mg TM/天或更高剂量进行治疗。用150mg或更低剂量治疗的患者没有展示该应答。没有观察到TM的其它负作用。
II.硫代钼酸盐化合物A.四硫代钼酸盐四硫代钼酸盐(tetrathiomolybdate，TM)是由被四个硫基团包围的钼原子构成的化合物。TM生物学作用的发现是从对牛和羊的观察结果开始的，当在高钼(Mo)区放牧时，这些牲畜发生缺铜(Ferguson等人，1943；Dick和Bull，1945；Miller和Engel，1960)。已经确认，施用补充的Mo能够削弱反刍动物的铜代谢(Macilese Ammerman等人，1969)；然而，Mo对非反刍动物(诸如大鼠)的作用很小(Mills等人，1958；Cox等人，1960)。Mo在瘤胃中转变成硫代钼酸盐(因其中的高硫代谢所致)和硫代钼酸盐是活泼的抗铜试剂的观察结果(Dick等人，1975)回答了这个难题。给大鼠施用硫代钼酸盐化合物也可产生抗铜效果，由此证实了该理论(Mills等人，1981a、b；Bremner等人，1982)。四硫取代化合物即TM是硫代钼酸盐化合物中最有效的一种。
TM作用的抗铜机制有两个部分(Mills等人，1981a、b；Bremner等人，1982；Gooneratne等人，1981b)。一种机制在GI道中起作用，第二种在血液中起作用。在GI道中，TM与铜和食物蛋白质(或其它蛋白质)形成不能吸收的复合体。该吸收阻断不仅涉及食物铜，还涉及唾液、胃液和其它GI道分泌物中可观量的内源性分泌铜(Allen和Solomons，1984)。由于锌只在能够诱导金属硫蛋白的小肠区中发挥作用(Yuzbasiyan-Gurkan等人，1992)，所以TM是比锌更有效的铜吸收阻断物。相反的，TM在所有GI道中起作用。与锌相比，TM在该背景中的其它优势是TM立即发挥作用。它不具有诱导金属硫蛋白必需的滞后期。
TM的第二种作用是针对血液的。在远离就餐时间提供的TM被相对较好的吸收到血液中。它在那里与铜和清蛋白形成复合体，使得复合的铜不能被细胞摄取(Gooneratne等人，1981b)。正常血浆铜位于两个主要部分中。正常人中的大部分血浆铜是血浆铜蓝蛋白分子的一部分。该铜基本上不能够与细胞交换，而且被认为是无毒的。另一部分铜与清蛋白和小分子(诸如氨基酸)松散结合。该部分铜在诸如威尔逊病等疾病的急性铜中毒过程中极度增加，而且能够被细胞摄取，因而有潜在的毒性(Scheinberg和Sternlieb，1984)。当TM进入血液后，它与后一种铜发生复合反应，使之像血浆铜蓝蛋白中的铜那样不能被细胞摄取且不具毒性。
有非常好的证据表明，TM复合的铜不能被细胞摄取。最直接的证据是，在羊中，在通常足以产生溶血性贫血的血浆铜水平当存在TM时却并不会如此(Gooneratne等人，1981b)。TM结合的铜不渗透红血球。这是TM复合的铜不渗透细胞的直接证据。
可以得到TM和TM盐；优选的一种TM盐是铵盐。购自AldrichChemical Company(产品目录号W180-0；Milwaukee，WI)的TM是中等水溶性的黑色粉末，溶解后产生明亮的红色溶液。购自AldrichChemical Company(散装以公斤计)的TM经证明是纯的，可用于人类。散装药物应当无氧保存，否则氧会逐渐与硫交换，使得药物随时间而失效。因此散装药物应保存在氩气中。本发明人进行的稳定性实验显示，药物在氩气中可以稳定保存几年(Brewer等人，1991a)。可以手工灌装胶囊，而且药物在胶囊中可以于室温稳定保存几个月。
TM通过与铜和蛋白质形成三组分复合体从而发挥作用(Mills等人，1981a、b；Bremner等人，1982)。TM具有两种作用机制。当与食物一起提供时，它与食物中的铜和内源性分泌的铜以及食物蛋白质发生复合反应，从而预防铜的吸收。可以通过与食物一起施用TM，使患者置于立即的负性铜平衡。当在就餐之间提供时，TM被吸收到血流中，并与血清铜和清蛋白发生复合反应，迅速使得铜不能被细胞摄取。由于器官中的游离铜与血液中的游离铜是平衡的，所以假如血液铜被结合了，则器官中和肿瘤组织中的游离铜将迅速降低至很低水平。该复合体通过肾和肝清除。TM是已知的最有效和最迅速作用的抗铜试剂。
B.TM的功效四硫代钼酸盐(TM)是发明人发展用于威尔逊病的孤独治疗的药物。该药效果极好，可快速控制铜毒性，并预防使用一般用于威尔逊病治疗的药物青霉胺时50％会发生的神经学恶化(Brewer等人，1991a；Brewer等人，1994b；Brewer等人，1996)。迄今为止，发明人用TM已经治疗了55名威尔逊病患者，通常需要8周时间。由此，TM填补了威尔逊病初始治疗中很重要的空白。有关威尔逊病的工作提供了在人类中使用TM的广泛经验，并有助于证明TM在人类中的毒性水平极低。
在人的威尔逊病研究中，偶尔观察到的一种副作用是TM的抗铜效果引起的可逆贫血症。如果施用太大的剂量，TM将使骨髓严重或完全缺铜。由于红细胞生成需要铜，所以引起贫血。这种贫血可以通过停服TM而迅速逆转。在威尔逊病的研究中，TM的过度治疗后果已经通过简单的将剂量降至20mg每天六次得到减小。在未患有威尔逊病的人中，诸如癌症患者，贫血前状态的轻度缺铜水平可以通过简单的在TM治疗过程中小心监测血浆铜蓝蛋白(Cp)水平得到建立。
TM最终代谢成硫代钼酸盐、钼酸盐、和钼氧化物，所以需要考虑这些化合物的潜在毒性。然而，已经证实，由此处描述的临床处境中使用的TM降解产生的这些钼化合物水平显得完全无毒。TM的重量中大约37％是Mo，所以在此处描述的研究中，有2周时间每天施用多至50mgMo，然后施用不超过大约25mg/天用于维持。350-1400mg/天的大剂量Mo，以前在威尔逊病患者中使用了4-11个月而无毒性(Bickel，1957)。由此，25-50mg/天的剂量范围没有明显问题，而且应当是完全安全的。
在大鼠中已经进行了关于TM潜在毒性的相当工作(Mills等人，1981a；Bremner等人，1982)。在大约6mg TM/kg食物时，大鼠显示对铜有实质性效果，包括血浆中血浆铜蓝蛋白的降低和肝及肾中铜的降低。在大约12mg TM时，所有这些变化都升高，而且肝中的Mo也升高。存在轻度贫血，而且6只动物中有1只存在骨骼损伤。在18mg TM时，贫血严重。头发的黑素原生成受损，存在腹泻，生长速度显著受损，而且所有动物具有特征为长骨的骺软骨细胞发育不良、小梁骨的再吸收、和韧带结构性变化的骨骼损伤。
后来显示，多至36mg TM/kg食物的所有TM毒性效果能够通过口服添加铜或腹膜内注射铜得到预防(Mills等人，1981b)。由此，似乎TM诱导的所有有毒损伤是由于TM诱导的缺铜引起的。作为支持，几乎所有上述损伤也可以由饮食缺铜诱导，两种例外是骨骼损伤和导致腹泻的肠细胞线粒体损伤。在施用TM中出现、但是在饮食缺铜中可能不出现的这后两种损伤的原因，可能与TM诱导的缺铜的严重性和迅速性有关。在缺铜饮食中，总有一些污染的铜可供利用，迅速分裂细胞(诸如肠细胞和骨骺细胞)可能得到足够预防损伤的铜。这两种损伤以及TM诱导的所有其它损伤可通过补充铜得到预防，这暗示损伤可能由缺铜引起。
另一研究小组检验了施用大约18mg TM/kg食物的大鼠中的肠道病理学(Fell等人，1979)。这些大鼠也施用大约3mg铜/kg食物。这些科学家发现了涉及细胞凋亡、浮肿、和坏死的肠道病理学，虽然没有得到证明，他们没有将此归结为铜不足(hypocuprosis)。根据所有这些问题可通过补充足够的铜得到预防的发现，推测有可能需要补充较多的铜用于保护(Mills等人，1981b)。
威尔逊病患者具有巨大的过量铜储备，所以在这些患者中不存在由于缺铜引起的TM毒性的风险。甚至在骨骼和肠细胞损伤的情况中，由于采取铜给药保护，具有过量铜储备的威尔逊病患者也应当受到保护。其它工作人员已经研究了TM对给予铜的羊的作用(Gooneratne等人，1981a)。众所周知，羊对铜毒性相当敏感，通常引起肝衰竭和溶血性贫血。该研究涉及通过饮食将铜给予羊至肝损伤开始发生，然后以50或100mg每周两次的剂量静脉内注射TM达11周。
26头羊中的5头在研究过程中死亡。所有的死因都归咎于尸检结果的铜中毒。5例死亡中的3例发生于施用铜而无TM的对照。1例死亡在动物只施用了1剂TM后发生，而另一头死亡动物只施用了4剂。显然，这2头动物在TM能够挽救它们之前已经死于铜毒性。如果动物在铜中毒的最初发作后幸存，那么它们将受到TM保护，免于进一步铜毒性，即使在一些情况中继续施用铜也如此。这些动物耐受多至22次TM注射而无临床问题。
研究还显示了对静脉内(Humphries等人，1986)或皮下(Humphries等人，1988)注射TM可保护羊免于严重的肝铜毒性的有益效果的支持。TM不仅降低肝铜的量，还降低实际的肝损伤。TM还用于在商业性羊群中预防铜毒性。超过400头动物已经用TM处理而没有不利的副作用(Humphries等人，1988)。
初步工作还指出，TM可能在LEC大鼠模型中对抗铜毒性有显著效果(Suzuki等人，1993)。最近显示这些大鼠的遗传缺陷是由于威尔逊病基因中的缺陷所致(Wu等人，1994)。大鼠发生严重的肝病，而且通常死亡。TM在治疗这些动物的晚期肝病中非常有效。
研究了静脉内注射99Mo标记的TM后羊中的Mo代谢(Mason等人，1983)。15分钟内有一个快速血浆消失期，然后是缓慢消失期，t1/2大约40h。TM逐步转化成钼酸盐，而且超过90％由尿而5％由粪便排泄。这一研究小组随后发表了有关羊静脉内注射双重标记的TM后99Mo和35S代谢的研究(Hynes等人，1984)。大部分99Mo和35S起初与清蛋白有关。被置换的或未结合的TM迅速水解成钼酸盐和硫酸盐。尽管出现了不溶于TCA的铜部分，没有证据表明35S和99Mo与铜和血浆存在不可逆的相互关系。
显然，当存在高水平铜时，施用TM将导致与TM复合的铜在肝和肾中积累(Jones等人，1984；Bremner和Young，1978)。然而，没有证据表明存在与此复合体有关的贮存疾病。目前的理论认为复合体被解离，TM代谢成氧钼酸盐并排泄出去(Mason等人，1983)。然后铜在肝中进入其它途径。当存在高水平金属硫蛋白时，它很可能被金属硫蛋白吸收。在肾中，有证据表明铜只是简单的排泄。
在施用TM用于维持治疗的患者中，有2例可逆性骨髓抑制的报导(Harper和Walshe，1986)。发明人在7名患者中发现有可逆性贫血。这些患者对治疗有强烈反应，而且可能以局部的骨髓缺铜告终。由于血红素合成需要铜，所以这似乎是过度治疗的表现，至少就骨髓而言是如此。由于在使用TM的维持治疗过程中TM是如此有效的抗铜试剂，正如在Harper和Walshe的案例中(Harper和Walshe，1986)所示，所以过度治疗的发生并非如此出乎意料。
TM的大约37％是Mo。Mo的正常摄取是大约350μg/天(Seelig，1972)，即相当于大约1.0mg TM中的Mo。人似乎能够相当好的耐受钼。5-20mg/kg/天的相对大剂量Mo(相当于1-4g TM中的Mo)在1957年的一项研究中被用于威尔逊病患者达4-11个月，而没有已知的毒性(Bickel等人，1957)。然而，这是无效的，因为正如以前指出的，TM是活泼代谢物，而且只在反刍动物中由Mo有效形成。
C.其它硫代钼酸盐化合物在降低游离铜中具有相似作用模式的其它硫代钼酸盐化合物包括十二硫代二钼酸盐、三硫代钼酸盐、二硫代钼酸盐、和单硫代钼酸盐。这些化合物与四硫代钼酸盐一样，与铜和蛋白质形成三组分复合体，使得铜不可利用，并最终导致铜复合体被消除出去。
已经描述了大量硫代钼酸盐复合体、氧代/硫代钼酸盐复合体、以及含铁、钼和硫并有或无氧的杂金属复合体的合成和表征(CouCouvanis，1998；Coucouvanis等人，1989；Coucouvanis等人，1988；Hadjikyriacou和Coucouvanis，1987；Coucouvanis等人，1984；Teo等人，1983；Coucouvanis等人，1983；Kanatzidis和Coucouvanis，1983；Coucouvanis等人，1982；Coucouvanis，1981；Coucouvanis等人，1980a、b)。这些复合体显示可结合铜，因此也可以用于本发明的某些实施方案。
优选的是包含一个、两个、或三个钼原子，一个钼原子和一个铁原子，两个钼原子和一个铁原子，以及一个钼原子和两个铁原子的那些硫代钼酸盐化合物或复合体。三种常见类型硫代钼酸盐化合物和两种优选的硫代钼酸盐化合物的结构如文献WO 00/13712中所述。
可用于本发明的硫代钼酸盐复合体的范例包括(但不限于)九硫代钼酸盐([MoS9]2-)、六硫代二钼酸盐([Mo2S6]2-)、七硫代二钼酸盐([Mo2S7]2-)、八硫代二钼酸盐([Mo2S8]2-)、九硫代二钼酸盐([Mo2S9]2-)、十硫代二钼酸盐([Mo2S12]2-)、十一硫代二钼酸盐([Mo2S11]2-)、十二硫代二钼酸盐([Mo2S12]2-)、十二硫代二钼酸铵盐((NH4)2[Mo2(S6)2]；Muller等人，1980；Muller和Krickemeyer，1990)、十三硫代三钼酸铵盐((NH4)2[Mo3(S)(S2)6]；Muller和Krickemeyer，1990)、和具有[FeCl2S2MoS2FeCl2]2-、[S2MoS2FeS2MoS2]3-、和[S2MoS2FeCl2]2-核心结构的硫代钼酸盐。
另外，发明人发现，葡糖酸铁是不含卤离子的铁源。当存在氢氧化铵时，它与四硫代钼酸盐的反应产生另一种硫代钼酸盐化合物，即极易溶于水的铁八硫代二钼酸的新铵盐((NH4)3[S2MoS2FeS2MoS2])。这些化合物中的某些在降低体内铜水平方面的能力可能低于四硫代钼酸盐，即使如此，它们在特殊的疗法中仍然是有用的。
D.硫代钼酸盐-碳水化合物复合物发明人早先发现，通过在硫代钼酸盐化合物和碳水化合物(诸如蔗糖)之间形成复合体，可以产生硫代钼酸盐化合物的稳定形式。在这些硫代钼酸盐-碳水化合物复合体中，碳水化合物分子层以阵列形式排列在硫代钼酸盐化合物周围，通过氢键使之稳定。这些层可保护硫代钼酸盐核心免受氧化和水解作用。能够与硫代钼酸盐化合物以氢键键合的其它分子(诸如氨基酸)，也被认为是可应用的。
这种稳定化的硫代钼酸盐化合物的一个范例是用蔗糖稳定的四硫代钼酸盐。为了制备蔗糖-四硫代钼酸铵复合体，在20ml蒸馏水中溶解25克蔗糖。加入1g四硫代钼酸铵(TM)，并在氩气下搅动混合物直至TM溶解。然后通过闪蒸在高真空条件下将水从混和物中除去。
术语“碳水化合物”包括具有通式(CH2O)n的众多化学化合物，包括诸如单糖、二糖、三糖、寡糖、多糖及其胺化、硫酸化、醋酸化和其它衍生形式的化合物。寡糖是包含糖单位(也称为单糖)的链。糖单位可以以任何顺序排列，并以任何不同方式通过它们的糖单位连接。因此，不同的立体异构寡糖链的数目是相当巨大的。
如本领域已知的，单糖是包含1个糖单位的糖分子。如此处使用的，术语“糖单位”指单糖。也如本领域已知的，二糖是包含2个糖单位的糖分子，三糖是包含3个糖单位的糖分子，寡糖是包含通常大约2个-大约10个糖单位的糖分子，而多糖是包含超过10个糖单位的糖分子。二糖、三糖和寡糖中的糖单位都是通过糖苷键连接的。即使这样，术语“寡糖”指包含至少2个糖单位的糖分子。
“单糖”将理解为包括(但不限于)丙糖、戊醛糖、己醛糖、丁醛糖、戊酮糖、和己酮糖的D-或L-异构体。提及的化合物也可以是内酯形式。戊醛糖的范例包括(但不限于)核糖、阿拉伯糖、木糖、和lyose；己醛糖的范例包括(但不限于)阿洛糖、阿卓糖、葡萄糖、甘露糖、古洛糖、艾杜糖、半乳糖、塔罗糖、岩藻糖、和鼠李糖。戊酮糖的范例包括(但不限于)核酮糖和木酮糖，丁糖的范例包括(但不限于)赤藓糖和苏阿糖，己酮糖的范例包括(但不限于)阿洛酮糖、果糖、山梨糖、和塔格糖。
二糖的范例是海藻糖、麦芽糖、异麦芽糖、纤维二糖、龙胆二糖、蔗糖(saccharose)、乳糖、壳二糖、N，N-二乙酰壳二糖、palatinose、或蔗糖(sucrose)。三糖的范例是棉子糖、潘糖(panose)、松三糖、或麦芽三糖。寡糖的范例是麦芽四糖、麦芽六糖、或壳七糖。术语“碳水化合物”，如此处使用的，还意欲包括糖醇，诸如甘露糖醇、乳糖醇、木糖醇、丙三醇、或山梨糖醇)。多糖的范例包括(但不限于)多聚葡糖和麦芽糖糊精。
预计以每个硫代钼酸盐金属核心大约5个糖单位-大约100或200个糖单位等等比率使用任何碳水化合物(如此处定义的)的这种稳定作用是有效的。该范围将理解为包括该范围内的所有值，诸如每个硫代钼酸盐金属核心大约10个糖单位、每个硫代钼酸盐金属核心大约20个糖单位、每个硫代钼酸盐金属核心大约25个糖单位、每个硫代钼酸盐金属核心大约30个糖单位、每个硫代钼酸盐金属核心大约40个糖单位、每个硫代钼酸盐金属核心大约50个糖单位、每个硫代钼酸盐金属核心大约60个糖单位、每个硫代钼酸盐金属核心大约70个糖单位、每个硫代钼酸盐金属核心大约75个糖单位、每个硫代钼酸盐金属核心大约80个糖单位、每个硫代钼酸盐金属核心大约90个糖单位、每个硫代钼酸盐金属核心大约110个糖单位、每个硫代钼酸盐金属核心大约125个糖单位、每个硫代钼酸盐金属核心大约150个糖单位、每个硫代钼酸盐金属核心大约175个糖单位、或每个硫代钼酸盐金属核心大约190个糖单位的比率。
III.稳定化的硫代钼酸盐化合物当暴露于空气时，硫代钼酸盐复合体对氧化作用敏感。这对于制剂的准备和所述化合物在临床中的应用造成了一定程度的实际障碍。因此，为了改进利用铜络合作用对血管发生型疾病进行临床治疗的技术，发明者开发了一系列稳定性增强的改良硫代钼酸盐化合物。所产生的化合物更易于配制入药用可接受载体中，并且，当如此制备时，它具有更长的贮藏寿命。
在设计和选择新分子时，重要的一点是不要在获得稳定性的同时降低了溶解度或功效。本领域普通技术人员应理解，给定种类化合物的物理、化学和生物学特性之间的相互关系是这样的，即，直至已制备并检测出超前的化合物，否则不能预知有预期特性的存在且无任何新的缺点。本发明因此提供了一系列新的化合物，其中已证实它们在对照试验中稳定性有所提高，但没有溶解度、抗铜特性或治疗活性的任何丢失。本发明提供的化合物、药用制剂和试剂盒由此具有易于制备和处理、贮藏寿命延长、疗效无任何降低的优点。
新化合物是以硫代钼酸烷基铵化合物为基础的，其优选的例子是四硫代钼酸四丙铵(TP-TM)。此术语简明的应用于本申请全篇中，本领域普通技术人员应理解，更准确的名称是“双-四丙铵-四硫代钼酸盐”[N(C3H7)4]+MoS42-[N(C3H7)4]+。四硫代钨酸盐化合物的类似衍生物也可应用于本发明中，其中将钨代替钼使用。
这种新的盐和相关的硫代钼酸烷基铵化合物稳定了分子的硫代钼酸盐中心，同时保持了可溶性、低毒性和抗铜特性。在发明者早期研究所用的四硫代钼酸铵盐(AmmTM或TM)中，当暴露于空气中时，氧取代了硫，致使化合物在其重要的抗铜特性方面失活。此过程由于空气中任何程度的潮湿而被进一步催化。
在新的分子家族中，烷基包围硫代钼酸盐核心，保护其免受空气和潮湿的侵蚀。在预备试验中，在潮湿热空气中(约比环境条件高10倍的水平增加AmmTM活性的丢失)稳定性显然至少为7天。随后证实了稳定性超过2个月。例如，TP-TM的半寿期在室温下的开盖培养皿中是大约180天，相反，AmmTM的半寿期只有大约40天。
不过，所述化合物保持了足以达到药用目的的可溶性，以TP-TM为例，它至少能够以1mg/ml的浓度溶于水中，这已超过了足够的程度。在体外试验中，诸如TP-TM等新化合物显示了预期具有生物学抗铜活性的亲本AmmTM化合物的标准铜-血清-TM三组分结合。在保持可溶性和铜结合特性的同时其稳定性的差异使TP-TM成为比AmmTM优越许多的药物。
不过，本发明不完全依赖于这样的体外试验数据，还证实了该新化合物的体内效力以及缺乏毒性。在本领域公认的体内模型研究中，代表了新化合物的TP-TM的效力在抑制肿瘤生长方面与AmmTM的效力并无区别。
发明者还提供了体内数据，显示了新类型化合物(尤其是TP-TM)的安全性。尽管释放自相关化合物的四甲铵和较低程度的四乙铵可能具有某些CNS神经节阻断活性，但这可以由主治医师控制，尤其是可根据以下TP-TM研究中所确定的安全范围进行。四丙铵组分从TP-TM中的释放通过氯化四丙铵的简单施用而体现于体内试验中。在比达到人体内抗肿瘤效果所需剂量高466倍的剂量时，服用58剂后所有动物均存活并且健康。因此这些资料证实了在施用剂量比用该化合物在人体内进行铜水平降低疗法可能需要的量高许多倍的情况下，释放自TP-TM的盐仍然是无毒性的。
因此，所述的新化合物是稳定的、可溶的、有疗效的和基本上无毒的，并且体现了超越现存AmmTM和相关的第一代化合物的惊人进步。
IV.监测铜水平血清中直接依赖肝铜状态的血浆铜蓝蛋白，是铜状态的精确指示剂。以前在啮齿动物研究中使用的TM平均剂量在平均重量的大鼠中大约0.5mg/天。发明人在小鼠和大鼠中的研究和在人威尔逊病患者和人癌症患者中的广泛经验指出，大鼠需要该剂量的4倍以将血清中的血浆铜蓝蛋白降至正常值的大约10％，这是啮齿动物中低铜状态的最佳标准。最佳Cu状态监测和TM给药的这些概念随后被引入实施例2中描述的TM动物研究中。
根据此处的研究，和发明人关于TM的经验，将血浆铜蓝蛋白(Cp)水平降至治疗前基线值的大约40％至大约10％之间将导致至少一定水平的有益的临床抗血管发生效果。然而，Cp水平降至治疗前基线值的大约20％在大多数临床指示中是优选的。本文所提供的有关TP-TM的资料表明TP-TM在体内抑制肿瘤生长方面至少与TM一样有效(图5)。因此，有关TM可获得的大量资料可方便的应用于TP-TM和相关化合物的临床使用中。
V.联合治疗本发明的方法可以与在患者具有的特定疾病或紊乱的治疗中通常采用的任何其它方法组合使用。例如，在实体瘤的治疗中，本发明的方法可以与传统方法(诸如外科手术、放疗等等)组合使用。只要特定的治疗方法自身不是有害的，或与本治疗的效果不抵触，就可以与本发明组合使用。当一种或多种试剂与诸如TP-TM等更稳定的硫代钼酸盐化合物组合使用时，组合结果不必是单独进行治疗时观察到的结果的加和(虽然这显然是期望的)，而且对联合治疗是否展示协同效应没有特殊要求(虽然这显然是可能的而且有利的)。
就外科手术而言，由于伤口愈合需要血管生长，所以在缺铜期间进行外科手术不是优选的。然而，由于铜可以在中止治疗后大约24小时内补充，所以任何外科手术干预可以在铜补充后进行。然后本发明可以在伤口愈合后(通常是手术后大约1-2周)恢复。就放疗而言，可以包括在肿瘤细胞内诱导局部DNA损伤的任何机制，诸如γ照射、X射线、UV照射、微波和甚至电子发射等等。也包括向肿瘤细胞直接投递放射性同位素，而这可以与靶向抗体或其它靶向方法组合使用。
细胞因子疗法也已经证明是联合治疗方案的有效成分之一。在这种组合方法中可以采用多种细胞因子。细胞因子的范例包括IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、TGF-β、GM-CSF、M-CSF、G-CSF、TNFα、TNFβ、LAF、TCGF、BCGF、TRF、BAF、BDG、MP、LIF、OSM、TMF、PDGF、IFN-α、IFN-β、IFN-γ。细胞因子根据标准方案，参考临床指征(诸如患者状态和细胞因子的相对毒性)进行施用。
A.铜螯合试剂1.锌为了长期维持适度的铜缺乏状态，发明者考虑在达到低铜水平状态后将锌用于癌症患者中。发明人已经将锌开发成用于威尔逊病的抗铜试剂，而且美国食品和药物管理局(FDA)已经于1997年1月批准了该用途。锌通过在肠粘膜细胞中诱导金属硫蛋白、由此阻断铜的吸收而发挥作用(Brewer和Yuzbasiyan-Gurkan，1992a)。锌同样是极其安全的。在至今已达200例的威尔逊病患者的研究中，剂量为150mg/天的锌根本不产生毒性(Brewer和Yuzbasiyan-Gurkan，1992a)。
锌化合物，诸如醋酸锌，正被广泛用于威尔逊病的治疗，包括初始治疗(Hoogenraad等人，1978；Hoogenraad等人，1979；Hoogenraad等人，1987)。然而，锌自身对于初始治疗并不理想，很大程度上是因为它的作用相当慢。由此，它需要大约2周时间达到肠内金属硫蛋白诱导和铜负平衡(Yuzbasiyan-Gurkan等人，1992)。在2周这个时间点上，锌立即逆转这些患者的平均+0.54mg/天(正)铜平衡，但是诱导铜负平衡相当微弱，平均为-0.35mg/天(负)铜平衡(Brewer等人，1990；Brewer等人，1993b)。由于这种低速铜清除，锌治疗需要长达6个月的时间将尿铜和非血浆铜蓝蛋白型血浆铜(血液中测量的潜在有毒铜)降至亚毒性水平。
尽管如此，在达到低铜状态后利用锌作为维持治疗剂保持了本发明的优选方面。由于锌化合物相对便宜且易于制备以及它们的普遍实用性，还可以使用锌化合物达到最初的低铜状态，这也是整个发明中的一个方面。
2.青霉胺青霉胺是使用得最多的药物，而且了解得也最多。然而，这应当是神经学患者初始治疗的最后选择，因为有非常高的风险会使他们在神经学上恶化(Brewer等人，1987a；Glass等人，1990；Brewer等人，1994a)。青霉胺的另一个问题是1/4-1/3的患者会发生初始过敏综合症，需要显著干预，诸如暂时停止药物并以较低剂量重新开始，一般并行施用皮质类固醇。这对于早已患病的患者来说多少是令人害怕的经历，并使发明人研究的主治医生避免盲目。最后，在治疗的最初几周施用青霉胺可能发生的其它副作用有一长串。这包括骨髓抑制、蛋白尿、和自身免疫紊乱。
3.曲恩汀(trientine)曲恩汀通过螯合作用并由尿排泄铜从而发挥作用(Walshe，1982)。治疗性剂量(1,000-2,000mg/天)一般只产生相似剂量青霉胺引起的尿铜的大约一半。虽然如此，曲恩汀能够初始产生几毫克的负铜平衡，比锌高得多。通常，这种4-5mg尿铜在治疗的最初几周后降至更微弱，但是基本上仍有2-3mg。铜摄取是大约1mg/天，而专性非尿损失大约0.5mg。由此，2-3mg的尿铜产生1.5-2.5mg/天的负铜平衡。
曲恩汀经官方批准用于不耐受青霉胺治疗的患者。因为这个原因，并因为它的采用比青霉胺晚得多，所以关于它的使用和报导不是很广泛。它还没有正式的毒性研究。它的副作用风险似乎比青霉胺要明显少得多。没有关于初始过敏问题的报导。在使用几周后，它确实在大约20％的患者中引起蛋白尿。它还可以偶尔引起骨髓抑制和自身免疫异常，但是后者通常发生于长期使用之后。
迄今为止，没有报导说曲恩汀在神经学患者中会引起初始恶化，但是它在这类患者中单独使用可能很受限制。有一件轶事，发明人收到过这样的转院患者，其青霉胺治疗后发生恶化，简单的换成曲恩汀后仍恶化(或没有改进)，最后转院到发明人处进行TM治疗。在这类患者中，很难能够了解曲恩汀在恶化中是否有任何作用。理论上是可能的，因为与使用青霉胺一样，它可使铜迁移，产生更高的血液水平以实现尿排泄。但是这种升高的血液铜水平是否转变成升高的脑水平和升高的神经毒性，仍是未知的。
B.化疗组合和治疗不管是何种机制实现了肿瘤破坏的增强，本发明的组合疗法方面在疾病的有效治疗中具有明显的用处。为了将本发明与化疗试剂的给药组合使用，可以以能够在动物体内有效达到联合抗肿瘤作用的方式，简单的对动物给予诸如TP-TM等更稳定的硫代钼酸盐化合物和化疗试剂的组合。由此，这些试剂的给药量和给药时间将能有效地使它们在肿瘤血管中组合存在并在肿瘤环境中组合作用。为了实现这个目标，可以给动物同时施用诸如TP-TM等更稳定的硫代钼酸盐化合物和化疗试剂，它们抑或以一种组合物抑或以两种不同的组合物使用不同施用途经完成给药。
或者，使用诸如TP-TM等更稳定的硫代钼酸盐化合物的治疗可以早于或晚于化疗试剂的治疗进行，间隔范围从几分钟到几周。在对动物分开使用化疗因子和更稳定的硫代钼酸盐化合物的实施方案中，一般需要确保每次服药之间没有太长的间隔，以使得化疗试剂和该更稳定的硫代钼酸盐化合物仍能够发挥对肿瘤的有利组合效果。在这种情况中，预计应使肿瘤在大约5分钟-大约1周时间内接触到这两种试剂，更优选的是大约12-72小时，最优选的延迟时间是仅大约12-48小时。
然而，在某些情况中，可能需要显著延长治疗时间，两次服药间隔可达几天(2、3、4、5、6、或7)甚至几周(1、2、3、4、5、6、7、或8)。另外，本发明的优选实施方案是在几轮化疗之间施用或在化疗后的维持方案中施用诸如TP-TM等更稳定的硫代钼酸盐化合物。由此可以想象，诸如TP-TM等更稳定的硫代钼酸盐化合物和/或化疗试剂的施用次数可以超过一次。为了实现肿瘤衰退，以能够有效抑制肿瘤生长的组合量投递这两种药，而不管施用次数如何。
多种化疗试剂意欲在此处公开的联合治疗中使用。作为范例涵盖的化疗试剂包括依托泊甙(VP-16)、阿霉素、5-氟尿嘧啶(5FU)、喜树碱、放射菌素-D、丝裂霉素C、羧苄青霉素(carbaplatin)、紫杉醇、多西他赛、和甚至过氧化氢。本领域技术人员应当理解，化疗试剂的适当剂量一般就是早已在临床治疗中单独使用或与其它化疗试剂组合使用时该化疗试剂所采用的大致剂量。
其它有用的试剂包括干扰DNA复制、有丝分裂、和染色体分离的化合物。这种化疗试剂包括阿霉素(也称羟基红比霉素)、依托泊甙、维拉帕米、鬼臼毒素等等。在广泛用于肿瘤治疗的临床背景中，阿霉素是通过间隔21天的大剂量静脉内注射给药的，剂量范围是25-75mg/m2；依托泊甙静脉注射的剂量范围是35-50mg/m2，或口服加倍。
还可以使用破坏多核苷酸前体的合成和保真性的试剂。特别有用的是经过广泛测试且容易获得的试剂。因此，由于诸如5-氟尿嘧啶(5-FU)等试剂优先被肿瘤组织使用，使得这种试剂对靶向肿瘤细胞特别有用。虽然5-FU毒性很大，但它仍可以在多种载体中应用，包括局部应用，然而一般使用剂量范围是3-15mg/kg/天的静脉内注射给药。
在联合治疗中有用的化疗试剂的范例列于表1。其中所列的每种试剂只是范例而不是限制。熟练技术人员可以查阅“雷明顿药物科学”(Remington’s Pharmaceutical Sciences)，第15版，第33章，特别是第624-652页。根据治疗对象的病情进行一些剂量变化是必要的。在任何情况下，负责给药的人将决定用于各个对象的合适剂量。此外，给人施用的制剂应当达到FDA的生物学标准要求的无菌、热原、全面安全性和纯度标准。
表1用于瘤性疾病的化疗试剂
C.抗血管发生术语“血管发生”一般指向组织或器官内的新血管的产生。在正常生理学条件下，人或动物只在非常特殊的情况下进行血管发生。例如，一般在创伤愈合、胎儿和胚胎发育、以及黄体、子宫内膜和胎盘形成中能够观察到血管发生。
受控制和不受控制的血管发生被认为是以相似方式进行的。由基底膜包围的内皮细胞和外膜细胞形成毛细血管。血管发生由内皮细胞和白血球释放的酶对基底膜的侵蚀开始。然后排列于血管腔上的内皮细胞穿过基底膜形成突出。血管发生刺激物诱导内皮细胞穿过被侵蚀的基底膜迁移。迁移细胞在内皮细胞进行有丝分裂和增殖的亲本血管外形成“芽”。内皮芽彼此合并形成毛细管环，从而产生新的血管。
诸如TP-TM等本发明的更稳定的硫代钼酸盐化合物可与任何一种或多种其它抗血管发生疗法组合使用。尤其是包括与抑制VEGF的试剂相组合，诸如抗VEGF或VEGF受体的中和抗体、可溶性受体构建体、酪氨酸激酶抑制剂、反义核酸、RNA aptamers和核酶。如WO 98/16551中所述，也可以应用具抗血管发生特性的VEGF变体。
一般而言，抗血管发生疗法可以以提供抗血管发生试剂或抑制血管发生试剂为基础。例如，如特别收编于此作为参考的美国专利5,520,914中所述，可以应用抗血管生成素的抗体。FGF与血管发生相关，所以还可以使用FGF抑制剂。某些实施例是具有N-乙酰葡萄糖胺与2-O-硫化糖醛酸作为其主要重复单元交替存在的化合物，包括糖胺聚糖，诸如archaran sulfate。这样的化合物可参阅特别收编于此作为参考的美国专利6,028,061，在本文中可以组合使用。
正如多种疾病状况中所表明的，现已知许多酪氨酸激酶抑制剂可用于血管发生的治疗中。这些抑制剂包括，例如，特别收编于此作为参考的美国专利5,639,757的4-氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶，它也可以与本发明组合使用。另外能通过VEGF2受体调控酪氨酸激酶信号转导的有机分子的例子有美国专利5,792,771中的喹唑啉化合物和组合物，为了进一步说明与本发明一起联合应用于血管发生疾病治疗中，特别将此文献收编于此作为参考。
还有其它的化学类型化合物也显示出抑制血管发生，并且可与本发明组合使用。例如，如特别收编于此作为参考的美国专利5,972,922中所述，诸如制管张素-4，9(11)-类固醇和C21-氧化类固醇等类固醇可应用于组合疗法中。分别收编于此作为参考的美国专利5,712,291和5,593,990描述了瑟利德米和相关化合物、前体、类似物、代谢物和水解产物，它们也可以与本发明组合使用以抑制血管发生。美国专利5,712,291和5,593,990中的化合物能口服。与组合疗法联合使用的其它例证性抗血管发生试剂列举于表2中。此处所列举的各种试剂是为了举例说明而并非表示局限于此。
表2血管发生的抑制剂和负调控剂
用于与诸如TP-TM等本发明更稳定的硫代钼酸盐化合物联合而抑制血管发生的某些组分是制管张素、endostatin、vasculostatin、canstatin和maspin。制管张素公开于美国专利5,776,704、5,639,725、和5,733,876，此处引用每一项作为参考。制管张素的分子量在大约38kDa和45kDa之间(通过还原性聚丙烯酰胺凝胶电泳测定)；大致包含纤溶酶原分子的指环(Kringle)区1-4。制管张素的氨基酸序列与完整鼠类纤溶酶原第98位氨基酸起始的片段基本相似。
制管张素的氨基酸序列在物种间略有变化。例如，人制管张素的氨基酸序列与上述鼠类纤溶酶原片段的序列基本相似，但是有活性的人制管张素序列可能从完整人纤溶酶原氨基酸序列的第97位或第99位氨基酸开始。而且，由于人纤溶酶原在如小鼠肿瘤模型中所示具有相似的抗血管发生活性，所以也可以使用。
制管张素和endostatin已成为研究的热点，因为它们是首先被证实不仅能抑制小鼠内肿瘤生长而且还能使肿瘤消退的血管发生抑制剂。有多种蛋白酶已被证实可以从纤溶酶原产生制管张素，包括弹性蛋白酶、巨噬细胞金属弹性蛋白酶(MME)、matrilysin(MMP-7)和92kDa的B型明胶酶/IV型胶原酶(MMP-9)。
在肿瘤中MME可从纤溶酶原产生制管张素，且粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)使巨噬细胞中MME的表达上调，诱导制管张素的产生。MME事实上表达于肝细胞癌患者的临床样品中的发现证实了MME在制管张素产生中的作用。另一被认为能产生制管张素的蛋白酶是溶基质素-1(MMP-3)。MMP-3已显示出在体外从纤溶酶原中产生出制管张素样片段。制管张素的作用机制目前尚不清楚，猜测它与内皮细胞上未确定的细胞表面受体结合，诱导内皮细胞经历细胞程序性死亡或有丝分裂的抑制。
endostatin表现出是更强的抗血管发生和抗肿瘤试剂。endostatin有效的引起了小鼠中许多肿瘤模型的消退。肿瘤不会对endostatin产生抗性，且在多个治疗循环后，肿瘤进入体积不再增大的休眠状态。在此休眠状态下，经历凋亡的肿瘤细胞的百分数增加了，产生了基本上停留在同一尺寸的群体。
特别收编于此作为参考的Folkman和O’Reilly等人的美国专利5,854,205涉及endostatin及其它作为内皮细胞增殖和血管发生抑制剂的用途。endostatin蛋白相应于XVIII型胶原蛋白的C-末端片段，且该蛋白质可自多种来源分离。美国专利5,854,205还提出了endostatin可具有XVIII型胶原蛋白、XV型collasen或BOVMPE 1 pregastric酯酶片段的氨基酸序列。endostatin与其它抗血管发生蛋白质(尤其制管张素)的组合在美国专利5,854,205中有所描述，从而使联合的组合物能有效消退血管发生依赖型肿瘤的质量。vasculostatin、canstatin和maspin也适于与本发明组合使用。
某些抗血管发生疗法已表现出能引起肿瘤消退，包括细菌多糖CM101和抗体LM609。CM101是已很好的证实其能诱发肿瘤中新血管炎症的细菌多糖。CM101与刺激补体系统活化的去分化内皮上表达的受体结合和交联。它还起始了选择性定向于肿瘤且由细胞因子驱动的炎性反应。它是使VEGF和其受体表达下调的唯一抗病理性血管发生试剂。CM101目前在临床试验中被用作抗癌药物，并且可与本发明组合使用。
血小板反应蛋白(TSP-1)和血小板因子4(PF4)也可与本发明组合使用。它们都是与肝素相关的血管发生抑制剂，并且发现存在于血小板α-颗粒中。TSP-1是作为细胞外基质组分的450kDa的大型多结构域糖蛋白。TSP-1与细胞外基质中发现的许多蛋白聚糖结合，包括HSPG、纤连蛋白、层粘连蛋白和不同类型胶原蛋白。TSP-1抑制了内皮细胞的体外迁移和增殖以及体内的血管发生。TSP-1还抑制了被转化内皮细胞的恶性表型和肿瘤形成。已证实肿瘤抑制基因p53直接调节TSP-1的表达，因而p53活性的丧失引起了TSP-1产量显著下降并伴随着肿瘤中引发的血管发生的增加。
PF4是70个氨基酸长的蛋白质，它是趋化因子CXC ELR家族的成员，能强烈抑制体外内皮细胞的增殖和体内的血管发生。肿瘤内施用或通过腺病毒载体投递的PF4能造成对肿瘤生长的抑制。
干扰素和金属蛋白酶抑制剂是能与本发明组合使用的另外两类天然存在的血管发生抑制剂。从二十世纪八十年代早期开始已知干扰素具有抗内皮细胞活性，不过，抑制作用的机制尚不清楚。已知它们能抑制内皮细胞迁移，并且它们确实具有一定程度的体内抗血管发生活性，这可能是通过其抑制肿瘤细胞产生血管发生启动物的能力介导的。血管化肿瘤对干扰素尤其敏感，例如，用IFNα能成功的治疗增殖中的血管瘤。
金属蛋白酶的组织抑制剂(TMP)是天然存在的基质金属蛋白酶(MMP)家族，它们也能抑制血管发生并能用于组合疗法中。MMP在血管发生过程中起着关键作用，因为在延伸或改变血管网络时它们使内皮细胞和成纤维细胞穿越的基质降解。事实上，已证实MMP的一个成员，MMP-2，通过整合蛋白αvβ3与活化内皮联合，其目的大概如此。如果此相互作用被MMP-2的片段破坏，那么血管发生就被下调且肿瘤生长被抑制。
有许多抑制血管发生的药用试剂，其中的任何一种或多种都可与本发明组合使用。这些试剂包括AGM-1470/TNP-470、瑟利德米和羧基酰胺三唑(CAI)。1990年已发现烟曲霉素是血管发生的强抑制剂，从那时起已开发了合成的烟曲霉素类似物，AGM-1470和TNP-470。这两种药物均抑制体外内皮细胞的增殖和体内血管发生。已在人体临床试验中对TNP-470进行了广泛的研究，数据显示长期施用是最适宜的。
瑟利德米最初被用作镇静剂，但被发现是一种强致畸剂，因而被停止使用。1994年，它被发现是血管发生的抑制剂。瑟利德米目前在临床试验中被用作抗癌剂以及血管化眼疾的治疗剂。
CAI是小分子量的合成型血管发生抑制剂，它作为钙通道阻断剂阻止了肌动蛋白的重组、内皮细胞的迁移和IV型胶原蛋白的伸展。CAI以生理学可达到的浓度抑制新血管的形成，并且口服时是癌症患者能很好的耐受的。CAI的临床试验使49％的治疗前具有渐进性疾病的癌症患者的病情稳定下来。
可的松在肝素或肝素片段存在的情况下显示出能通过阻断内皮细胞的增殖而抑制小鼠中肿瘤的生长。类固醇和肝素的加成抑制效应中涉及的机制尚不清楚，尽管有人认为肝素可能增加了内皮细胞对类固醇的摄取。混合物已显示出可增加新形成的毛细管下的基底膜的分解，这还可能解释了抑制血管舒张的加成效应。肝素-可的松缀合物在体内也具有强的抑制血管舒张和抗肿瘤作用活性。
更多的特异血管发生抑制剂包括(但不限于)抗侵入因子、视黄酸和紫杉醇(美国专利号5,716,981；此处引用作为参考)；AGM-1470(Ingber等人，此处引用作为参考)；鲨鱼软骨提取物(美国专利号5,618,925；此处引用作为参考)；阴离子聚酰胺或聚脲寡聚体(美国专利号5,593,664；此处引用作为参考)；羟吲哚衍生物(美国专利号5,576,330；此处引用作为参考)；雌二醇衍生物(美国专利号5,504,074；此处引用作为参考)；和thiazolopyrimidine衍生物(美国专利号5,599,813；此处引用作为参考)也可以作为抗血管发生组合物与本发明组合使用。
含αvβ3整合蛋白拮抗物的组合物也可与本发明联合用于抑制血管发生。如美国专利5,766,591(收编于此作为参考)中所述的，含RGD的多肽及其盐，包括环式多肽在内，是αvβ3整合蛋白拮抗物的合适例子。
抗αvβ3整合蛋白的抗体LM609也引起了肿瘤的消退。诸如LM609等αvβ3整合蛋白拮抗物引起了血管发生型内皮细胞的凋亡，而静止血管未受影响。LM609或其它αvβ3拮抗物也可通过抑制αvβ3和MMP-2的相互作用而发挥功能，MMP-2被认为是在内皮细胞和成纤维细胞迁移中具有重要作用的蛋白水解酶。美国专利5,753,230特别收编于此作为参考，以说明与本发明联合用于抑制血管发生的抗αvβ3(玻连蛋白αvβ3)抗体。
在此情形下血管发生型内皮细胞的凋亡可能对其余的血管网络具有级联效应。事实上，抑制肿瘤血管网络完全响应肿瘤信号而扩展可能引发了该网络的部分或完全瓦解，从而导致肿瘤细胞死亡和肿瘤减小。有可能endostatin和制管张素以类似方式发挥作用。LM609不影响静止血管，但能引起肿瘤消退，这一事实强烈的暗示，为了达到抗肿瘤效果，无需对肿瘤中的所有血管定向治疗。
基于改变通过Tie2受体的信号传导的其它干预治疗方法也能与本发明组合使用，诸如利用能阻断Tie2活化的可溶性Tie2受体。利用重组腺病毒基因疗法投递这样的构建体已被证实可有效治疗癌症并减少转移。
D.凋亡诱导试剂诸如TP-TM等更稳定的本发明硫代钼酸盐化合物还可以与在肿瘤内任何细胞(包括肿瘤细胞和肿瘤血管内皮细胞)中诱导凋亡的治疗方法进行组合。虽然许多抗癌试剂可能具有凋亡诱导效果作为它们的作用机制的一部分，但是已经发现、设计或选择出了以此为主要机制的下面这些试剂。
已经描述了抑制凋亡或程序性细胞死亡的大量癌基因。这类癌基因的范例包括(但不限于)bcr-ab1、bcl-2(与bcl-1、细胞周期蛋白D1不同；GenBank编号M14745、X06487；美国专利号5,650,491和5,539,094；此处引用作为参考)，以及一些家族成员，包括Bcl-x1、Mcl-1、Bak、A1、A20。bcl-2的过度表达首先发现于T细胞淋巴瘤。bcl-2通过结合Bax(凋亡途径中的一种蛋白质)并使之失活而作为癌基因发挥功能。bcl-2功能的抑制避免了Bax的失活，使得凋亡途径进行下去。由此，这类癌基因的抑制，如使用反义核苷酸序列，也可以用于本发明中需要增强凋亡的方面(美国专利号5,650,491、5,539,094、和5,583,034；此处引用每一项作为参考)。
有报导说，癌症的许多形式在肿瘤抑制基因(诸如p53)中有突变。p53的失活导致不能促进凋亡。在这种情形中，癌细胞继续进行肿瘤发生，而非注定死亡。由此，在本发明中也包括提供肿瘤抑制基因以刺激细胞死亡。肿瘤抑制基因的范例包括(但不限于)p53、成视网膜细胞瘤基因(Rb)、Wilm肿瘤(WT1)、baxα、白介素1β转化酶及家族、MEN-1基因、1型神经纤维瘤基因(NF1)、cdk抑制基因p16、结直肠癌基因(DCC)、家族性多发性腺癌基因(FAP)、多肿瘤抑制基因(MTS-1)、BRCA1和BRCA2。
优选使用的是p53(美国专利号5,747,469、5,677,178、和5,756,455；此处引用每一项作为参考)、成视网膜细胞瘤、BRCA1(美国专利号5,750,400、5,654,155、5,710,001、5,756,294、5,709,999、5,693,473、5,753,441、5,622,829、和5,747,282；此处引用每一项作为参考)、MEN-1(GenBank编号U93236)和腺病毒E1A(美国专利号5,776,743；此处引用作为参考)基因。
可以使用的其它组合物包括编码肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配基、称为TRAIL的基因和TRAIL多肽(美国专利号5,763,223；此处引用作为参考)、24kDa凋亡相关蛋白酶(美国专利号5,605,826；此处引用作为参考)、Fas相关因子1(FAF1；美国专利号5,750,653；此处引用作为参考)的基因。在本发明的这些方面还包括提供白介素-1β转化酶及家族成员(据报导它们也刺激凋亡)。
诸如喹诺酮衍生物(美国专利号5,672,603和5,464,833；此处引用每一项作为参考)；branched apogenic peptide(美国专利号5,591,717；此处引用作为参考)；磷酸酪氨酸抑制剂和不能水解的磷酸酪氨酸类似物(美国专利号5,565,491和5,693,627；此处引用每一项作为参考)；RXR视黄酸受体激动剂(美国专利号5,399,586；此处引用作为参考)；甚至抗氧化剂(美国专利号5,571,523；此处引用作为参考)等化合物也可以使用。酪氨酸激酶抑制剂，诸如金雀异黄素，也可以与靶向细胞表面受体的配基进行连接(美国专利号5,587,459；此处引用作为参考)。
VI.药物组合物和试剂盒本发明的药物组合物一般包含有效量的溶解或分散于制药学可接受的载体或水性介质中的、稳定性有所增加的硫代钼酸盐化合物，尤其是硫代钼酸烷基铵化合物，诸如四硫代钼酸四丙铵。
术语“制药学或药理学可接受的”指恰当地给动物或人施用后不发生不利的、变应性的、或其它不良反应的分子实体和组合物。如此处使用的，“制药学可接受的载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、包被剂、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等等。这些介质和试剂对制药学活性物质的应用在本领域是众所周知的。除了与活性成分不相容的任何传统介质或试剂外，本发明也涵盖了其在治疗性组合物中的使用。组合物中还可以掺入附加的活性成分。
A.非肠道制剂本发明试剂，诸如TP-TM，通常配制成非肠道施用的制剂，如用于经静脉内、肌肉内、皮下或其它路径的注射，包括直接滴注到肿瘤或疾病位点。本领域技术人员根据本公开书应当知道含有一种或多种这样的试剂作为活性成分的水性组合物的制备。通常，这些组合物可以配制成可注射的液体溶液或悬浮液；还可以配制成适合用于在注射前通过加入液体而配制成溶液或悬浮液的固体形式；制剂还可以进行乳化。
可以在与表面活性剂(诸如羟丙基纤维素)适当混和的水中配制活性化合物以作为游离碱或药理学可接受盐的溶液。也可以在甘油、液体聚乙二醇、及其混和物中和在油中配制分散剂。在贮存和使用的常规条件下，这些制剂含有防腐剂以预防微生物的生长。
适合于注射使用的药物形式包括无菌水溶液或分散液；制剂，包括芝麻油、花生油或水性丙二醇；和用于新鲜配制无菌注射液或分散液的无菌粉末。在所有情况中，都必需是无菌形式，而且流动性必需足以容易的进行注射。在生产和贮存条件下，制剂必需是稳定的，而且必需保证不受微生物(诸如细菌和真菌)的污染作用。
包含本发明试剂(诸如TP-TM)的组合物可以配置成中性或盐形式的组合物。制药学可接受的盐包括酸加成盐(与蛋白质的游离氨基形成的)和与无机酸(诸如盐酸或磷酸)或有机酸(诸如醋酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等等)形成的盐。与游离羧基形成的盐也可以由无机碱(诸如钠、钾、铵、钙、或铁的氢氧化物)和有机碱(诸如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等等)衍生得到。
载体还可以是含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、和液体聚乙二醇等等)及其合适混和物、和植物油的溶剂或分散介质。例如通过使用包被(诸如卵磷脂)、通过维持所需的颗粒大小(在分散体的情况中)和通过使用表面活性剂，可以保持适当的流动性。预防微生物作用可以通过多种抗细菌和抗真菌试剂实现，例如对羟基苯甲酸酯类、氯代丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等等。在许多情况下，将优选包括等渗剂，例如糖或氯化钠。可注射组合物的延长吸收可以通过在组合物中使用延迟吸收试剂，例如单硬脂酸铝和明胶来实现。
通过在适当溶剂中掺入需要量的活性化合物，随后过滤除菌从而配制无菌注射液。一般通过在装有上文列举的基本分散介质和需要的其它成分的无菌容器中掺入多种无菌活性成分来配制分散剂。至于配制无菌注射液用的无菌粉剂，优选的配制方法是真空干燥和冻干技术，由它们的事先无菌过滤的溶液产生含有活性成分加上任何需要的额外成分的粉末。
配制完成后，溶液将以与剂型相容的方式并以治疗上有效的量施用。可以以多种剂型容易的施用制剂，诸如上述注射液类型，但是也可以采用药物释放胶囊等等。
本发明的合适药物组合物一般包含一定量的一种或多种稳定性增强的硫代钼酸盐化合物，尤其是硫代钼酸烷基铵化合物，诸如TP-TM，并与可接受的制药稀释剂或赋形剂混和，诸如无菌水溶液，并根据用途而达到一定范围的终浓度。配制技术在本领域是众所周知的，例示于雷明顿药物科学(Remington’s Pharmaceutical Sciences，第16版，Mack出版公司，1980)，此处引用作为参考。需要理解的是，内毒素污染至少应当保持在安全水平，例如低于0.5ng/mg蛋白质。此外，给人施用的制剂应当达到FDA生物学标准要求的无菌、热原性、全面安全性和纯度标准。
如此处详述的研究中所示，使用动物模型易于测定治疗有效剂量。在用于临床环境之前，通常使用携有实体瘤的实验动物使恰当的治疗剂量最优化。已知这样的模型在预测有效抗癌策略中是非常可靠的。例如，诸如本文工作实施例中使用的携有实体瘤的小鼠被广泛用于临床前测试。发明人已经使用了这种本领域接受的小鼠模型来测定诸如四硫代钼酸盐和TP-TM等试剂产生有利抗肿瘤效果且只有最小毒性的工作范围。
除了将化合物配制用于非肠道施用、诸如静脉内或肌内注射之外，还包括其它制药学可接受的形式，如片剂或用于口服的其它固体、缓释胶囊、脂质体形式等等。也可以根据治疗状况使用其它药物制剂。例如局部制剂适用于治疗诸如皮炎和牛皮癣等病理学状态；而眼制剂适用于诸如糖尿病性视网膜病等状况。当然，根据本说明书中公开的剂量优化方法学和熟练技术人员的知识，测定用于这些状态的最佳剂量的方法对本领域技术人员将是显而易见的。
如此处详述的，预计对本发明试剂(诸如TP-TM)进行加工，以使其延长体内半衰期，将能够提供某些好处。缓释制剂通常被设计成在较长期间产生持续的药物水平。提高药物的半衰期，能够在给药后达到较高的血浆水平，这种水平可维持较长时间，但通常根据构建物的药物动力学衰减。虽然目前不是优选的，该组合物及其组合的缓释制剂绝不排除在本发明的使用之外。
B.眼部施用制剂许多具有血管发生组分的疾病是与眼睛相关的。例如，可按本发明进行治疗的与角膜新血管形成相关的疾病，包括，但不局限于糖尿病性视网膜病变、早产儿视网膜病变、角膜移植排斥、新血管性青光眼和晶体后纤维增生症、流行性角膜结膜炎、维生素A缺乏症、隐形眼镜过度磨损、特应性角膜炎、上边缘性角膜炎、翼状胬肉干燥性角膜炎、sjogrens、酒糟鼻、phylectenulosis、梅毒、分枝杆菌感染、脂质变性、化学烧伤、细菌性溃疡、真菌性溃疡、单纯疱疹感染、带状疱疹感染、原生动物感染、卡波西肉瘤、Mooren溃疡、Terrien’s边缘性变性、边缘性角质层分离、外伤、类风湿性关节炎、系统性狼疮、多动脉炎、魏格纳氏结节病、巩膜炎、Steven’s Johnson disease、放射状角膜切开术和角膜移植排异。
可按本发明进行治疗的与视网膜/脉络膜新血管形成相关的疾病，包括，但不局限于糖尿病性视网膜病变、黄斑变性、镰状细胞贫血症、类肉瘤、梅毒、弹性假黄色瘤、派杰病、静脉栓塞、动脉栓塞、颈动脉梗阻性疾病、慢性葡萄膜炎/玻璃体炎、分枝杆菌感染、Lyme氏病、系统性红斑狼疮、早产儿视网膜病变、Eales disease、Bechetsdisease、引起视网膜炎或脉络膜炎的感染、假性眼组织胞浆菌病、Bests病、近视、眼凹陷、Stargarts disease、pars planitis、慢性视网膜脱落、高粘滞综合征、弓形体病、外伤和激光后并发症。
可按本发明进行治疗的其它疾病包括，但不局限于与潮红(眼角的新血管形成)相关的疾病和由微管或纤维组织异常增殖引起的疾病，包括所有形式的增殖性玻璃体视网膜病变，可以与糖尿病相关或不相关。
本发明的硫代钼酸盐化合物(例如TP-TM)由此可以有利的用于制备适合作为眼科用液使用的药物组合物，包括玻璃体内和/或眼房内(intracameral)施用的眼科用液。可为了治疗任何上述或其它疾病，可以按照传统制药学实践(参阅例如《雷明顿制药科学》(Remington’s Pharmaceutical Sciences)，第15版，第1488-1501页(Mack出版公司，Easton，PA))制成的眼科制剂形式将本发明的化合物施用于需要治疗的个体的眼部。
眼科制剂在制药学可接受的溶液、悬浮液或油膏中含有本发明的硫代钼酸盐化合物，其浓度为大约0.01-大约1％(重量百分比)，优选大约0.05-大约0.5％。根据采用的具体化合物、待治疗个体的状况诸如此类，可能需要改变浓度。负责治疗的人员将为该个体确定最适浓度。眼科制剂通常优选无菌水性溶液的形式，如果需要，还可以包含额外成分，例如防腐剂、缓冲液、张力剂、抗氧化剂和稳定剂、非离子型湿润剂或澄清剂、增稠剂、等等。
适用于这种溶液的防腐剂包括苯扎氯铵、苄索氯铵、三氯叔丁醇、硫柳汞等等。合适的缓冲液包括硼酸、碳酸氢钠和碳酸氢钾、硼酸钠和硼酸钾、碳酸钠和碳酸钾、醋酸钠、磷酸氢钠、等等，其量足以将pH维持在大约pH6-pH8，优选大约pH7-pH7.5。合适的张力剂是dextran40、dextran70、右旋糖、甘油、氯化钾、丙二醇、氯化钠、等等，使得眼科用液的氯化钠当量为0.9±0.2％。
合适的抗氧化剂和稳定剂包括亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、硫代亚硫酸钠、硫脲等等。合适的湿润剂和澄清剂包括polysorbate80、polysorbate20、poloxamer282、和泰洛沙泊(tyloxapol)。合适的增稠剂包括dextran40、dextran70、明胶、甘油、羟乙基纤维素、羟甲基丙基纤维素、羊毛脂、甲基纤维素、凡士林、聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纤维素等等。眼科制剂将通过传统方法局部施用于需要治疗的个体的眼部，例如以滴液的形式或以眼科用液洗眼。
C.局部制剂在最广的意义上，局部施用制剂包括用于经口(口腔)和经皮肤投递的制剂。“局部投递系统”还包括含待施用成分的穿真皮贴剂。如果需要，还可以通过离子电渗或电转移来实现经皮肤的投递。
适用于口局部施用的制剂包括在调味基质(通常是蔗糖与阿拉伯胶或黄芪胶)中包含活性成分的锭剂、在惰性基质(诸如明胶与甘油或蔗糖与阿拉伯胶)中包含活性成分的软锭剂、和在合适液态载体中包含待施用成分的漱口剂。
适用于皮肤局部施用的皮肤包括在制药学可接受载体中包含待施用成分的油膏、乳膏、凝胶、和糊剂。正如本领域众所周知的，用于局部施用的制剂，诸如乳膏、油膏、和凝胶，包括油质或水溶性油膏基底的制剂。例如，这些组合物可以包含植物油、动物脂肪、和更优选的得自石油的半固体碳氢化合物。所用具体成分可以包括白色油膏、黄色油膏、十六烷基酯蜡、油酸、橄榄油、石蜡、凡士林、白色凡士林、鲸蜡、甘油淀粉、白蜡、黄蜡、羊毛脂、无水羊毛脂、和甘油单硬脂酸酯。还可以使用各种水溶性油膏基底，包括乙二醇醚及其衍生物、聚乙二醇、硬脂酸40聚烃氧基酯、和polysorbate。
用于直肠施用的制剂可以是在合适基底中包含例如可可脂或水杨酸酯的栓剂。适用于阴道施用的制剂可以是除了活性成分之外还包含本领域已知的适当载体的阴道栓剂、塞子、乳膏、凝胶、糊剂、泡沫或喷雾剂制剂。
D.鼻科制剂经鼻和呼吸路径的局部投递可用于治疗各种状况。这些投递路径还适用于将药剂投递到系统循环中。本发明因此包括在适用于鼻施用的载体中包含活性成分的制剂，例如鼻科用液、喷雾剂、气雾剂、和吸入剂。当载体是固体时，制剂包括具有20-500微米颗粒大小的粗粉，当施用时，将装有粉末的容器置于鼻下由鼻孔快速吸入。
载体是液体的合适制剂可用于鼻施用。鼻科用液常常是设计并制备成滴液或喷雾剂、经鼻孔施用的水性溶液，它们在许多方面与鼻分泌物相似，使得能够维持正常的纤毛作用。由此，水性鼻科用液通常是等渗并略有缓冲的，维持于pH5.5-6.5。另外，如果需要，制剂中可以包含与用于眼科制剂相似的抗微生物防腐剂和合适的药物稳定剂。已知多种商品化的鼻科制剂，包括例如抗生素和抗组胺剂，并用于预防哮喘。
吸入剂是设计用于将药物或化合物投递至患者呼吸树的药物制剂。施用水汽或水雾并使之到达受疾病侵袭区域。此路径还可用于将药剂投递至系统循环中。可以通过鼻或口呼吸路径施用吸入剂。只有当小液滴足够细小且大小均一从而水雾能够到达细支气管时，吸入液的施用才会有效。
同样称为吸入剂、有时称为吹入剂的另一组产品包含精细粉状或液体药物，它由特殊投递系统(诸如在液化气体推进剂中包含药物溶液或悬浮液的药物气雾剂)携带进入呼吸通路。当经合适阀门和口接管释放时，将计量剂量的吸入剂推进到患者呼吸道中。颗粒大小在这种类型制剂的施用中特别重要。据报导，渗透进入肺腔的最佳颗粒大小范围为0.5-7μm。通过对气雾剂增压而产生精细水雾，由此使其应用具有上述优点。
E.试剂盒本发明还提供了包含稳定性增强的硫代钼酸盐化合物(尤其是诸如TP-TM等四硫代钼酸烷基铵化合物)的治疗性试剂盒和组合疗法及诊断试剂盒。这些试剂盒一般在合适的容器设备中含有至少一种本发明所述化合物的制药学可接受的制剂。试剂盒中还可能含有其它制药学可接受的制剂，诸如一定范围的化疗药物中的任何一种或多种。
试剂盒可能包含装有诸如TP-TM等稳定性增强的硫代钼酸盐化合物、含或不含任何其它成分的单个容器，或者它们可能含有多个不同的容器，各含所需的试剂。本发明的某些优选试剂盒包含诸如TP-TM等稳定性增强的硫代钼酸盐化合物，其装在试剂盒中用于与第二种抗癌试剂(诸如化疗试剂、放疗试剂、不同的铜螯合试剂、抗血管发生试剂或凋亡诱导试剂)一起组合施用。在这些试剂盒中，各成分可以预先进行复合，它们抑或以等摩尔混合，抑或一种成分过量；或者在给患者施用前，试剂盒的每一种成分分装于不同的容器中。
当试剂盒的各成分以一种或几种溶液提供时，溶液是水性溶液，尤其优选无菌水性溶液。然而，试剂盒的各成分可以以干粉提供。当各试剂或成分以干粉提供时，干粉可以通过加入合适的溶剂重溶。预计也可以在另一种容器中提供溶剂。试剂盒的一种成分可以由胶囊提供，以用于口服。
试剂盒的容器通常将包括至少一个药水瓶、试管、烧瓶、瓶、注射器或其它容器，其中装有诸如TP-TM等本发明中更稳定的硫代钼酸盐化合物和任何其它想要的试剂，优选进行恰当分装。当包含其它成分时，试剂盒一般还包含第二种瓶或其它容器，其中装有所述成分，使得可以施用设计的不同剂量。试剂盒中还可以包含用于装入无菌的、制药学可接受的缓冲液或其它稀释剂的第二种/第三种容器。
试剂盒还可以包含用来给动物或人施用本发明硫代钼酸盐化合物的容器，如一种或多种注射针头或注射器，甚至眼药水点滴器、移液器、或其它这类装置，由此将制剂注射到动物体内或应用到身体的患病部位。本发明试剂盒一般还包含含有药水瓶等和其它组件以供出售的密封容器，如装有所需药瓶和其它器械的注射或吹制成型的塑料容器。
试剂盒另外还可以包含用于测定血清血浆铜蓝蛋白水平的装置或检测体系的一种或多种组分和/或其说明书，优选所有必需的检测体系组分和进行该检测的说明书。在用于测定血清血浆铜蓝蛋白水平、优选人的血清血浆铜蓝蛋白水平的装置或检测体系中，可以使用氧化酶方法中所用的组分、装置和检测体系。例如，如特别收编于此的Brewer等，1987b，Brewer等，1987c，Brewer等，1989和Sunderman和Nomoto，1970等文献中所报道的，用于Wilson’s病的诊断和治疗中。
VII.癌症及治疗本发明提供的组合物和方法可广泛应用于治疗具有血管成分的任何恶性肿瘤。典型的血管化肿瘤是实体瘤，特别是需要血管成分提供氧和营养的癌和肉瘤。血液学恶性瘤的发展也似乎需要血管发生，由此也潜在的适合使用本发明的铜降低试剂进行治疗。可以使用本发明进行治疗的实体瘤的范例包括(但不限于)肺癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌、胰癌、喉癌、食道癌、睾丸癌、肝癌、腮腺癌、胆道癌、结肠癌、直肠癌、宫颈癌、子宫癌、子宫内膜癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、甲状腺癌、鳞状细胞癌、腺癌、小细胞癌、黑素瘤、神经胶质瘤、成神经细胞瘤、肉瘤(诸如血管肉瘤和软骨肉瘤)等等原发性癌症。转移性肿瘤也可以使用本发明的方法和组合物进行治疗。
预计本发明可用于治疗患有实体瘤的任何患者。然而，本发明在中等或大型实体瘤的治疗中特别成功，这类患者很可能由此处提供的方法和组合物得到更显著的好处。一般而言，本发明可以用于治疗大约0.3-0.5cm和更大的肿瘤，但是更大的肿瘤和人中发现的最大肿瘤也可以进行治疗。
在本发明的某些方面，诸如TP-TM等本发明更稳定的硫代钼酸盐化合物意欲作为预防性治疗和维持试剂使用。在本发明范围的这个方面有许多原因。例如，患有中等或以上大小的原发性肿瘤患者还可能患有多种其它转移性肿瘤，它们被认为是小型的或甚至处于转移性肿瘤植入的更早阶段。考虑到本发明的TP-TM和各种组合通常是口服的或进入患者的全身循环，自然的，它们将对次生的、较小的、和转移性肿瘤产生效果，虽然这可能不是治疗的最初目的。此外，甚至在整个肿瘤块仍是单个小肿瘤的情况中，使用本治疗将产生某些有益的抗癌效果。
此处提供的关于使用本发明的最适患者的指导意欲说明，某些患者分布图可能有助于选择可以用本发明进行治疗的患者，或者用其它抗癌治疗策略效果可能更好的患者。虽然认识到对某类患者存在优选的或更有效的治疗，但是这个事实不能否定本发明在治疗患有血管化肿瘤的所有患者中的基本用途。进一步的考虑是，本发明治疗对肿瘤最初的攻击在任何可测和即时的效果方面可能是小的，但是可能使肿瘤对进一步治疗性治疗敏感或增强效果，以至于随后的治疗产生全面协同效果或甚至完全消除或治愈。
不应认为任何特殊类型的肿瘤需要排除在本发明治疗之外。应该这样理解，本方法学可以广泛或完全的应用于所有实体瘤的治疗，而不用考虑肿瘤细胞自身的特定表型或基因型。然而，肿瘤细胞的类型可能与本发明和第二种治疗性试剂的组合有关。
本领域技术人员应当理解，某些类型的肿瘤可能更适合使用本发明诱导肿瘤停滞、衰退、甚至坏死。在实验性动物中观察到该现象，而且可能也发生于人的治疗中。这种考虑将在进行实验性动物的临床前研究和优化用于治疗任何特殊患者或患者组的剂量时受到重视。
如此处详述的，有现实的目标可以作为临床治疗前试验的指导方针使用。然而，这更多的是花费-功效的问题而非全面有效性，还有就是选择最有利的化合物和剂量的机制。关于它们的基本效果，可产生任何一致抗肿瘤效果的任何构建物或其组合将仍定义为有用的发明。还要理解，甚至在本组合物或其组合的抗肿瘤效果在范围低限的环境中，仍有可能这种疗法与特殊肿瘤目标的所有其它已知疗法效果相同或甚至更好。对于临床医生来说，不幸的是显然某些肿瘤不能立即或长期获得有效治疗，但是那并不否定本疗法的有效性，特别是它与通常建议的其它策略同样有效、或者在所有其它传统策略都失败后它可能有效的情形中。没有预报说该疗法会形成抗性。
可以容易的由此处描述的动物研究推断出诸如TP-TM等本发明更稳定的硫代钼酸盐化合物及其组合的适当剂量，以得到用于临床施用的适当剂量。为了实现这个转化，需要考虑对单位重量的实验性动物施用的试剂量，还需要考虑实验性动物和人患者之间的体表面积的差异。所有这些计算对于本领域普通技术人员来说是众所周知和常规的。相应的，根据此处提供的所有信息，发明人预计诸如TP-TM等本发明更稳定的硫代钼酸盐化合物给人施用的有用的每日剂量是每人每天大约20mg至大约200mg之间。不管这个范围如何，考虑到上文的参数和详述的指导，可以理解，活性或最佳范围的其它变化将仍包含于本发明内。
因此预计每日剂量一般是大约20mg至大约180mg之间；大约130mg至大约200mg之间；大约25mg至大约160mg之间；大约50mg至大约150mg之间；大约150mg至大约180mg之间；大约30mg至大约125mg之间；大约40mg至大约100mg之间；大约35mg至大约80mg之间；大约140mg至大约190mg之间；大约20mg至大约65mg之间；大约125mg至大约195mg之间；大约30mg至大约50mg之间；大约150mg至大约200mg之间；或使用任何前述记录的例示性剂量的任何特殊范围，或具体所指范围内的任何值。
虽然大约60-120mg范围内和大致剂量在本发明的某些实施方案中现在是优选的，而且大约125-200mg范围内和大致剂量在本发明的其它实施方案中现在是优选的，可以理解，在与其它试剂的组合中、或在维持条件下，更低剂量可能是更恰当的，而且高剂量也可以耐受，考虑到以下事实更是如此本发明中使用的诸如TP-TM等本发明更稳定的硫代钼酸盐化合物自身没有细胞毒性；而且即使确实发生某些不利后果，这也不一定会产生不能被正常稳态机制对抗的毒性。这种机制被认为可降低对健康组织产生显著毒性的机会。
在本发明的某些优选实施方案中，给患者施用大约130mg或大约150mg等等至大约180mg或大约200mg等等之间的每日剂量，进行大约2周后，给予大约30mg或大约40mg等等至大约60mg或大约70mg等等之间的每日维持剂量，或者具体所述范围内的任何值。由此，在本发明的特殊方面，发明人预计可以使用超过大约125mg、超过大约130mg、超过大约140mg、超过大约150mg、超过大约155mg、超过大约160mg、超过大约170mg、超过大约175mg、超过大约180mg、超过大约190mg、或超过大约200mg等等直至此处描述的最大剂量的代表性日剂量大约1周、大约2周、大约3周、大约4周等等，随后改用大约20mg、大约25mg、大约35mg、大约40mg、大约50mg、大约55mg、大约65mg、大约75mg、大约80mg或大约90mg等等的每日维持剂量。
本发明治疗方案的目的一般是产生最大抗肿瘤效果，同时仍将剂量保持在与不可接受的毒性相关的水平以下。除了改变剂量自身，服药方案还可以进行调整以优化治疗策略。一种当前优选的治疗策略是施用大约20mg至大约200mg之间的诸如TP-TM等本发明更稳定的硫代钼酸盐化合物或其组合，每天施用大约3次、大约4次、大约5次、到大约6次或更多，大致上一半次数是随餐的，而大致上另一半次数是餐间的。在施用具体剂量时，优选向患者全身性提供制药学可接受的组合物。通常口服给药是优选的。
VIII.特征为血管发生异常的其它疾病除了预防或治疗癌症和实体瘤，此处公开的硫代钼酸盐组合物还可以用于预防或治疗与异常血管形成有关的其它疾病，包括(但不限于)关节炎、糖尿病、动脉硬化、动静脉畸形、角膜移植物新血管形成、延期创伤愈合、糖尿病性视网膜病变、年龄相关的黄斑变性、肉芽发生、烧伤、血友病性关节、类风湿性关节炎、肥大性瘢痕、新生血管性青光眼、不愈合性骨折(nonunion fracture)、Osier-Weber综合症、牛皮癣、脓性肉芽肿、晶状体后纤维组织形成、翼状胬肉、硬皮病、沙眼、血管粘连、眼新血管形成、寄生虫病、外科手术后肥大、和毛发生长抑制。
正如本文所述，前述各种疾病和紊乱以及各种类型的角膜新血管形成、类风湿性关节炎和所有类型的肿瘤都可以根据本领域的知识用本发明进行有效的治疗，如美国专利5,712,291(特别收编于此作为参考)中所述。美国专利5,712,291特别收编于此作为参考，以表明在某一模型、系统或疾病中抗血管发生活性的证据足以预知其能治疗非常广泛的血管发生性疾病。
如收编于此作为参考的美国专利5,712,291中所述的，本发明的组合物、方法和用途是意图用于治疗患有或有风险患上以下疾病的动物和患者纤维血管组织的异常增殖、酒糟鼻、获得性免疫缺陷综合症、动脉栓塞、特应性角膜炎、细菌性溃疡、Bechets disease、有血肿瘤、颈动脉梗阻性疾病、化学烧伤、脉络膜新血管形成、慢性炎症、慢性视网膜脱落、慢性葡萄膜炎、慢性玻璃体炎、隐形眼镜过度佩戴、角膜移植排异、角膜新血管形成、角膜移植新血管形成、Crohn’sdisease、Eales disease、流行性角膜结膜炎、真菌性溃疡、单纯疱疹感染、带状疱疹感染、高粘滞综合征、卡波西肉瘤、白血病、脂质变性、莱姆病、边缘性角质层分离、Mooren溃疡、除麻疯病以外的分枝杆菌感染、近视、眼睛新血管疾病、眼凹陷、Osler-Weber综合症(Osler-Weber-Rendu)、骨关节炎、派杰病、pars planitis、类天疱疮、phylectenulosis、多动脉炎、激光后并发症、原生动物感染、弹性假黄色瘤、翼状胬肉干燥性角膜炎、放射状角膜切开术、视网膜新血管形成、早产儿视网膜病变、晶状体后纤维增生、类肉瘤、巩膜炎、镰状细胞贫血症、Sogrens综合症、实体瘤、Stargarts disease、Steven’s Johnson disease、超边缘性角膜炎、梅毒、系统性狼疮、Terrien’s边缘性变性、弓形体病、创伤、尤因肉瘤、成神经细胞瘤、骨肉瘤、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、溃疡性结肠炎、静脉栓塞、维生素A缺乏症和魏格纳氏结节病。
黄斑变性是年龄相关疾病的俗名，其中斑点状视网膜色素上皮细胞的功能不如正常细胞。结果是，视锥的废物清除和营养受损，引起中央视觉丧失。黄斑变性还可以分成两种“干型”和“湿型”。干型黄斑变性在持续脱落的感光视锥外层部分不能由斑点的色素上皮层消化时发生。随后色素上皮层肿大并在积累过多来自视锥的未消化物质后最终死亡。该废物的微黄色沉积物在视网膜下在脉络膜和色素上皮层之间逐渐形成。在这种“干型”黄斑变性中，视觉丧失的特征是中央视觉逐渐模糊或部分变暗，这是部分斑点已经开始死亡产生视锥不再发挥功能的区域的结果。临床上，患有这种类型疾病的患者可能经历相对轻度的中央视觉变形，即直线显得弯曲或波浪状。
该病症的第二种即“湿型”，更严重，而且可能发生突然视觉丧失。这发生于异常新血管或“新血管膜”在斑点下由脉络膜生长穿过受损的色素层之时。这些新血管膜是脆弱的，而且倾向于导致严重斑点组织变形的出血。结果是，光感觉细胞(视锥)与它们的营养来源分开，并由于出血后的结疤遭受进一步损伤。该类型的病症，由于这些出血性变化，中央视觉中黑暗的或“失踪的”点可能迅速出现而很少有先兆。幸运的是，在该进程早期进行激光治疗干预可能预防进一步的视觉丧失。
年龄相关的黄斑变性(AMD)是西方国家在65岁或更老的成人中引起视觉丧失的主要原因。虽然新血管AMD在所有病例中只占10％，但是它对80％-90％的由于该疾病引起的认定失明有关，而且是该年龄人群中脉络膜新血管形成(CNV)的最常见起因。导致CNV的病理学变化涉及脉络膜毛细血管、透明层、和视网膜色素上皮(RPE)的组织复合体，其次涉及神经感觉视网膜。基本上，改变视网膜色素上皮和透明层的任何事物都能够引起CNV。
除了AMD之外，已证明有多种状况与CNV有关，包括眼组织胞浆菌病综合症(POHS)、病理性近视、血管样条纹症、和特发性起因。在患有AMD的眼中已经进行了大多数组织病理学研究。许多患CNV的眼共同的组织病理学特征是透明层的断裂。毛细血管样新血管形成由脉络膜血管起始，并通过这些断裂延伸。年龄相关的黄斑变性是患有CNV的最大组患者的病因。大多数有症状的CNV位于中央凹下，且证明有极弱的疾病史。中央凹下的新血管形成定义为位于中央凹无血管区(FAZ)几何学中心下的病灶。对于进行了2年斑点光凝血术研究(MPS)的未治疗的眼，只有5％的最终视敏度好于20/100，而88％的最终视敏度为20/200或更差。
激光光凝血术是脉络膜新血管形成的主要疗法。通过一系列执行得很好的随机化预期临床试验，在多种背景的CNV观察中，MPS确定了光凝固术的优越性。具体而言，与无治疗组相比，发现对AMD和其它病症进行中央凹外和中央凹旁新血管膜的光凝固治疗是有益的。然而，为了治疗CNV的全部区域，眼科医师必需能够鉴定脉络膜新血管膜的边界。因此，只有在CNV边界得到很好的界定时才能做出治疗指示。不幸的是，隐蔽的或不确切的新血管是AMD中渗出性斑点病变展示的最常见模式。在一项研究中，可见的或典型的新血管膜只涉及治疗的眼睛的23％。MPS最近报导的光凝固术治疗AMD的中央凹下新血管病变的结果显示了激光治疗的优点，但是治疗组和观察组之间的差异较小，而且只在2和5年后发现。同样，由于激光能量摧毁了视网膜和视网膜下膜，因而视敏度存在与治疗有关的突然下降。这些结果说明光凝固术作为一种治疗方法存在限制以及这种病症的自然史较差。
与角膜新血管形成有关的其它疾病包括(但不限于)流行性角膜结膜炎、维他命A缺乏症、隐形眼镜过度磨损、特异反应性角膜炎、上边缘角膜炎、翼状胬肉角膜炎干燥、舍格伦综合症、玫瑰痤疮、phylectenulosis、梅毒、分支杆菌感染、脂质变性、化学烧伤、细菌性溃疡、真菌性溃疡、单纯性疱疹感染、带状疱疹感染、原生动物感染、卡波希肉瘤、莫伦溃疡、Terrien边缘性变性、边缘性角质层分离(mariginal keratolysis)、类风湿性关节炎、系统性狼疮、多动脉炎、创伤、Wegener结节病、巩膜炎、Steven’s Johnson disease、periphigoid radial keratotomy、和角膜移植物排斥反应。
与视网膜/脉络膜新血管形成有关的疾病包括(但不限于)糖尿病性视网膜病变、黄斑变性、镰刀状细胞贫血症、结节病、梅毒、弹性假黄瘤、佩吉特病、静脉阻塞、动脉阻塞、颈总动脉梗阻病、慢性眼色素层炎/玻璃体炎、分支杆菌感染、莱姆病、系统性红斑狼疮、早产儿视网膜病变、伊尔斯病、Bechet病、引起视网膜炎或脉络膜炎的感染、推测的眼组织胞浆菌病、Bests病、近视、眼凹陷、Stargart病、平坦部炎(pars planitis)、慢性视网膜脱落、高粘滞性综合症、弓形体病、创伤和激光后并发症。其它疾病包括(但不限于)与发红有关的疾病(角的新血管形成)和维管或纤维组织异常增生引起的疾病(包括所有形式的增殖性玻璃体视网膜病变)。
涉及血管发生的另一种疾病是类风湿性关节炎。类风湿性关节炎的特征是弥散和结节单核细胞渗入和基质结缔组织(包括成纤维样细胞和新血管)的巨大增生。关节滑膜内层中的血管经历血管发生。除了形成新血管网络，内皮细胞释放引起血管翳生长和软骨破坏的因子和活性氧。血管发生中涉及的因子可能积极促进形成和维持类风湿性关节炎的慢性炎症状态。
与血管发生有关的因子还可能在骨关节炎中发挥作用。血管发生相关因子对软骨细胞的激活有助于破坏关节。在较晚期，血管发生因子将促进形成新骨。慢性炎症还可能涉及病理性血管发生。这些疾病状态(如溃疡性结肠炎和Crohn病)显示有组织学变化，其中新血管向炎症组织内生长。巴尔通体病，在南美洲发现的一种细菌性感染，可以引起特征为血管内皮细胞增生的慢性阶段。在动脉粥样硬化中发现与血管发生有关的另一种病理性作用。血管腔内形成的斑块已经显示具有刺激血管发生的活性。
下列实施例用于证明本发明的优选实施方案。本领域技术人员能够理解，在实施例中公开的、代表发明人发现的技术，在本发明实践中可以很好的发挥作用，而且由此认为构成实践的优选模式。然而，本领域技术人员清楚，根据本公开书，在公开的特定实施方案中可以进行许多变化，仍得到相同或相似的结果，而不违背本发明的精神和范围。
实施例1TM的细胞毒性效果培养中的正常细胞和肿瘤细胞的内部是通过转运和利用分子由培养基得到营养的。该步骤不依赖血管的生长，因此TM、TP-TM和相关化合物应该在很宽的浓度范围对细胞生长速率和细胞生存能力没有影响，除非达到对大多数细胞产生毒性的水平。毒性的一种机制是游离铜水平被损耗到低于基本细胞功能需要的水平。对于高于该有毒水平的TM、TP-TM和相关化合物浓度，正常细胞和肿瘤细胞都将由于细胞毒性而不能够存活。
这在MML细胞(前列腺癌)和乳腺癌细胞的细胞毒性实验中得到了确认。将细胞以相同数目在含各种浓度TM(范围为0.001μM-1mM)的培养基中铺板后，在体内使用的浓度范围内没有观察到毒性。当TM浓度由1μg/ml升至10μg/ml时，存活细胞部分由100％迅速降至15％。显然，在细胞毒性作用要求的很高剂量下，肿瘤和正常细胞的死亡都将发生，因此使用时不应将TM视为直接细胞毒性试剂。实现有效降铜水平需要的血清TM、TP-TM和相关化合物浓度比细胞的致死临界水平低100-500倍。当在患有威尔逊病的小鼠和人中以有效降铜剂量使用时，TM不产生任何临床上明显的直接细胞毒性。
实施例2TM在鼠临床前抗癌研究中的使用发明人推理认为，比以前达到的程度更高的缺铜状态是显著抑制血管生成和阻滞肿瘤生长所必需的。这意味着，除了肿瘤块减小，还将观察到存活期延长或肿瘤消退。下文描述的使用了抗铜方法以在啮齿动物中抑制肿瘤生长的研究，没有完全体现由人和动物的微量元素研究(一般而言)和铜研究(具体而言)获得的方针(Dick和Bull，1945；Miller和Engel，1960；Macilese Ammerman等人，1969；Mills等人，1958；Cox等人，1960；Dick等人，1975；Mason，1990；McQuaid和Mason，1991；Mills等人，1981a；Mills等人，1981b；Bremner等人，1982；Gooneratne等人，1981a、b；Jacob等人，1981)。
相反的，本发明使用TM、TP-TM和相关化合物这些强抗铜剂。在实现有效缺铜的治疗方法开发中，采用了发明人关于使用锌进行镰形细胞贫血症治疗(其中发明人描述了锌诱导缺铜的第一个人病例；Brewer等人，1983)、利用锌进行威尔逊病的抗铜治疗(Brewer等人，1989；Brewer等人，1995a)、和利用TM进行威尔逊病的最初抗铜治疗(Brewer等人，1983；Brewer，1992；Brewer等人，1994b；Brewer等人，1995b)的丰富经验。作为TM用于临床的开发者，发明人获得了关于TM在动物和人中的重要经验。
A.给C567B1/C6小鼠注射肿瘤细胞在这些方针下，在小鼠肿瘤模型中使用TM，进行抗血管生成的治疗性研究。该研究涉及给年轻成熟C57B1/6J小鼠皮下或肌肉内注射肿瘤细胞。使用了两种肿瘤，一种是小鼠肉瘤MCA205，另一种是小鼠黑素瘤B16B16。将MCA205肿瘤细胞悬浮液皮下注射到C57B16小鼠中。当肿瘤可触知后，在半数动物中使用TM诱导缺铜，利用Cp水平监测铜状况。另一半进行假处理。比较未处理对照组和用足够TM处理而将Cp降至正常对照的约10％的小鼠之间的肿瘤生长。
观察到TM对降低肿瘤生长速率和降低最终肿瘤大小和重量有显著效果。在相对短暂的观察期(16天)中，虽然肿瘤生长没有停止，但该项处理还是减缓了肿瘤生长。TM处理小鼠中的肿瘤明显比对照小鼠中的肿瘤轻(经按动物总重量标准化)。两种肿瘤类型中的结果相似。由于在采用的剂量下没有细胞毒性作用，因此TM可能通过其抗血管生成机制降低了肿瘤生长和质量。
然而，根据下列原因，可以改进该实验设计以进一步评估TM作为抗肿瘤试剂的潜在功效1)在小鼠中，超过1cm的肿瘤能够成为危及生命的负担，而且经常溃烂。然而，在小鼠和人中，正是该大小和更大的肿瘤最依赖血管生成，以维持生长；和2)检测在2-3mm和1.5cm之间的肿瘤的时期对于小鼠相对短暂，只有几天。由于耗尽肿瘤块中的铜需要时间(尤其因为大多数肿瘤储存了高水平的铜)，在实现几乎完全耗尽铜之前，肿瘤可以由其自身的储备支持显著的血管生成。
B.HER2-neu转基因小鼠因此，设计了动物方案以测试TM在有患癌倾向的雌性HER2-neu转基因小鼠中阻滞或预防临床上明显的肿瘤的功效(Guy等人，1992；Muller等人，1988)。这些小鼠在出生和幼年时是正常的，但是由于转基因，百分之百的这些小鼠在4-8月龄(中值205天)形成乳腺肿瘤(Guy等人，1992)。选择该模型的另一个主要原因是这些鼠类动物乳腺肿瘤的疾病史与人中未处理乳腺癌的临床表现非常相似。HER2-neu小鼠肿瘤在长潜伏期(现在知道很可能是因为转基因的诱变而非过度表达)后形成，而且它们保持在最初的局部区域，直到它们达到大体积(通常＞2.5cm)而大部分转移到肺。在处理和对照组之间比较肿瘤发作的时间和肿瘤血管的质量和数量。
将3只建系的转基因雌性与3只转基因雄性配种之后，将雌性后代分成2组一组15只进行处理，另一组22只作为对照。将未处理对照组中无病小鼠所占百分比与从第100日龄开始每天用0.5-1.0mg TM强饲处理的一组相同转基因小鼠进行比较。TM处理肿瘤在临床上变得明显之前大约80-100天开始，使得处理的小鼠在可能开始需要血管生成的肿瘤形成整个关键期间缺铜。这预防了肿瘤储存大量铜以维持血管生成，甚至不惜降低全身铜。
跟踪期中值为260天，TM处理小鼠均未形成临床上明显的肿瘤，而70％的遗传上相同的对照在相同的跟踪期中显示有肿瘤。50％的对照小鼠在第218日龄形成了临床上明显的肿瘤(p＜0.02)。尽管对照于第153日龄开始显示肿瘤，经TM处理的动物没有形成肿瘤，直到TM治疗中止而铜水平上浮(p＜0.0146)均如此。
使用代用指示剂血浆铜蓝蛋白(Cp)(用分光光度活性检测法测定)对处理组中的血液铜水平进行监测，揭示出Cp降至基线的40％以下。在该品系小鼠中，当铜降至该水平时没有观察到贫血症。分开的1组4只处理动物施用更高剂量的TM，即1.0-1.5mg，2-4周。施用1.25-1.5mg的动物在治疗1-3周后死亡。尸体解剖揭示，1只动物死于吸入性肺炎(归咎于强饲法事故)，2只动物死于肾小管坏死和肺出血，进行尸体解剖的这些组织上有血管损伤的明显证据。这些研究说明，当计划进行长期处理时，1.0mg/天是TM在成年小鼠(平均体重32g)中的最大耐受剂量(maximum tolerated dose，MTD)。
为了测试对照小鼠中的乳腺肿瘤是否能够用TM缩小，当肿瘤形成(最大尺寸＞1.5cm)后对3只对照动物进行处理。在2/3的情况中，肿瘤显著萎缩了25％和50％。
其次，测定了长期TM治疗破坏乳腺组织以至于由于缺乏目标而不大可能在处理动物中形成肿瘤的可能性。当80％的对照动物、而无处理动物形成肿瘤后，将对照动物停止处理。临床上明显的乳腺肿瘤在18天内开始在该交换组小鼠中形成(以前是无病的)，说明事实上目标组织中的肿瘤起始已经发生，但是肿瘤扩展成临床上可检测的肿块在缺铜状态下是不可能的。
对经TM处理的小鼠的乳腺进行显微镜分析揭示有一些(1-8个)大约3-10层细胞厚的未能血管形成的小“微瘤”。然而，停止TM治疗后，这些微瘤非常迅速的长成可触知的、大量血管化的肿块。虽然还没有阐明所有的细胞和分子机理，由于处理小鼠的微瘤没有一个发生血管形成，显然在这种重要的致癌模型中，缺铜抑制了血管生成的开关或紧随其后的一个步骤。
概括而言，降低铜的可获得性，即可降低并最终阻滞实体瘤的生长，包括转移性肿瘤的生长。如下文所述确认降低未患威尔逊病的人中肿瘤生长所要求的铜可获得性的降低。TM、TP-TM和相关化合物作为抗肿瘤试剂的成功至少部分基于获得功效所需要的缺铜程度和该缺铜程度的毒性之间的关系。由于当轻微缺铜发生时，肿瘤血管生成不能发生，所以TM、TP-TM和相关化合物是多种不同肿瘤学应用中非常有效的试剂。可用TM、TP-TM和相关化合物治疗的其它情况包括(但不限于)化疗或骨髓移植(由于年老或其它原因不适合接受化疗的患者中)后的维持治疗、或者在高风险个体(炎症性癌症、多种阳性结)中作为抑制细胞生长试剂。
C.移植了肿瘤的裸鼠在该研究中，研究了原位注射人乳腺癌细胞后，四硫代钼酸盐(TM)消除或阻碍裸鼠乳腺垫中肿瘤生长的能力。选择称为SUM149的高度血管生成性炎性乳腺癌细胞系进行该研究。考虑到它在2周内在80-100％经注射裸鼠的乳腺中形成可触知肿瘤的高倾向性，该细胞系是对TM削弱肿瘤发展的能力的严谨测试。
将3组(每组5只)裸鼠放置在分开的笼中。第-7天，第2组和第3组开始通过饮用水施用TM，平均摄入1.2mg/天/只。第0天，向第1组、第2组和第3组的第二胸乳腺脂肪垫注射106个SUM149乳腺癌细胞。第34天，由于处理组的小鼠中均没有可触知的肿瘤，中止第2组和第3组的TM，然后第2组以0.6mg/天/只的剂量、第3组以全剂量(1.2mg/天/只)重新开始施用TM。
每周大约两次测量肿瘤形成，并且测定了每组的二维正交直径乘积的平均值对时间的曲线图。对照组中肿瘤的生长相对更迅速，而且所有动物都形成肿瘤。相反的，对于处理组，没有可触知的肿瘤，直到TM在第34天中止。此后，在接受已知只降低铜水平50％的半剂量TM的组中，肿瘤生长更迅速。相反的，在施用定义为1.2mg/天/只小鼠的全剂量TM的处理组中，只形成非常小的肿瘤。该剂量将铜降至大约基线水平的10-20％。正是在小鼠和人中都能很好耐受的该缺铜程度显示是抑制肿瘤血管生成所需要的。
该研究支持TM、TP-TM和相关化合物可能至少以两种方式抑制血管生成的观点一种是通过抑制“血管生成的开关”，另一种是通过抑制大量肿瘤血管生成。在第34天中止TM使得血管生成开关活化并开始使注射到缺铜裸鼠中的肿瘤群产生血管。该开关的活化使一些肿瘤能够生长，但是TM处理组中的肿瘤生长显然慢得多，而且似乎会达到一个平台。该研究还证实裸鼠可通过饮用水口服TM、TP-TM和相关化合物。
实施例3TM作为抗癌疗法的I/II期临床试验A.介绍由于减少细胞数的化疗的累积毒性和药物抗性，转移性实体瘤患者通常只有非常有限的治疗方法可供选择。上面详述的临床前工作显示抗铜方法在小鼠肿瘤模型中有功效后，在18名转移性癌症患者中进行I期临床试验，分成3种口服四硫代钼酸盐剂量水平(TM90、105、和120mg/天)，以6次随餐和餐间方式施用。血清中的血浆铜蓝蛋白(Cp)作为全身铜水平的代用标记。由于贫血症是缺铜的第一临床指征，所以该研究的目的是，在血细胞比容的降低不超过基线80％的前提下，将Cp降至基线值的20％。Cp是铜状态的可靠且灵敏的度量，而且当Cp降至基线的15-20％时，TM是无毒的。TM的剂量水平III(120mg/天)能够有效达到该目标Cp而无额外毒性。在缺铜在目标范围内至少90天的6名患者中的5名中，TM诱导的轻度缺铜实现了稳定疾病。
1.毒性TM、TP-TM和相关化合物的药理学效果对铜是完全特异的。由于没有检测到对其它矿物质的影响，所以它们的毒性是与缺铜直接相关的。除了缺铜，在采用的剂量下，对动物没有关于毒性的报导。对于人，在施用TM每天6次30-40mg作为维持治疗的威尔逊病患者中，有2例可逆贫血症的报导。在施用TM 8周作为威尔逊病起始治疗的45名患者中，观察到5例可逆贫血症(11.1％)。贫血症是由骨髓中铜耗尽导致血红素合成下降引起的。血液Cu水平下降最严重的患者显示有这种贫血症。
如上所述，进行TM、TP-TM和相关疗法治疗的动物或人的铜状态不能仅仅由血清铜追踪，因为TM、铜、和清蛋白的复合体从血液中清除的速度比累积的速度慢，直到达到了高铜稳定状态。然而该复合铜不能被细胞摄取，不参与任何依赖铜的细胞过程(诸如血管生成)，而是通过尿液和胆汁从体内逐步清除出去。根据如下公认的缺铜三阶段(Brewer，1992；Brewer等人，1991)，发明人已经建立了检测TM、TP-TM和相关疗法治疗过程中人的铜平衡的指导方针。
第一阶段-化学缺铜在此阶段，血清的血浆铜蓝蛋白(Cp)活性降至大约基线的5-10％。Cp(一种含铜蛋白质)是在肝中合成的，而在铜损耗过程中，Cp合成降低。此阶段的缺铜，虽然在实验室中能够测量，但是没有临床体征或症状。在早期临床缺铜发生之前，Cp肯定在正常值的几个百分点以下。
第二阶段-轻度临床缺铜Cp保持在0-5％达5-10天后，可能出现缺铜的第一临床体征。有轻度的中性粒细胞减少症和着色过浅的小红细胞改变。白血球计数和血细胞比容跌至大约基线的75-85％。血红素合成需要铜，所以外周血涂片中看见的形态学变化与缺铁的特征相似。缺铜更严重时，红细胞大小不均症和异形红细胞症也恶化。这种轻度贫血症和中性粒细胞减少症的发作是逐渐的，而且通常是完全无症状的。
第三阶段-中等到严重临床缺铜通常当Hct＜基线的70％时，会发生造血不足导致的更严重的临床体征和症状没有食欲、体重减轻、腹泻、黑色素生成削弱(随后发色减褪)，罕见的心律失常。
发明人推理认为，轻度化学缺铜(人完全能够长期耐受的状态)能够有效作为抑制实体瘤血管生成的策略。因此，以确立TM、TP-TM和相关化合物功效的代用终点为目的的缺铜状态的调控和细心监测，是本方法的重要因素。
关于相对缺铜的各阶段、化学和临床缺铜的分界线、和为了评价铜状态而进行测量的恰当方案，发明人有很好的有根据的知识。由于患者受到了严密监测，迄今为止I期研究已经证明是相对安全的。将要认识的主要治疗性问题是肿瘤的血管生成对铜的需要是否显著高于细胞对铜的基本持家需要。
2.药物动力学TM可以与食物一起或不一起口服，且在后一种条件下也吸收很好。TM与铜和蛋白质形成三组分复合体，由此与食物一起施用时结合食物中的铜，预防铜的吸收，或结合吸收后血流中的铜(TM-Cu-清蛋白)，从而预防细胞对铜的摄取。在铜代谢正常的患者中，6天每天施用10-20mg，预计非血浆铜蓝蛋白型血浆铜(潜在地可用于血管生成)和血浆钼之间存在1∶1的化学计量关系。对大多数个体而言，导致轻度缺铜稳定状态的TM、TP-TM和相关化合物的剂量水平在40-90mg/天的范围内变化。TM-Cu-蛋白质复合体主要在胆汁中缓慢排泄，也有少量在尿液中排泄。24小时尿液测量Mo和Cu将有助于测定三组分复合体的清除速率。
B.方法1.患者登记了患有转移性实体瘤、展示可测疾病、预期寿命为3个月或更长、且Karnofshy行为状态至少为60％的18名成人。排除临床表现只涉及渗出物或骨髓、有严重并发症需要密集治疗、或依赖输血的患者。患者必须已经从以前的中毒中恢复，并对实验室参数有下列要求WBC≥3,000/mm3、ANC≥1,200/mm3、Hct≥27％、Hgb≥8.0gm/dl、血小板计数≥80,000/mm3、胆红素＜2.0mg/dl、AST/ALT＜专业机构标准上限的4倍、血清肌酸酐＜1.8mg/dl或计算的肌酸酐清除率≥55ml/min、钙＜11.0、清蛋白≥2.5gm/dl、PT＜13sec、和PTT＜35sec。其它要求是常规治疗(诸如外科手术、化疗、放疗、和/或免疫治疗)后前3个月疾病有可证实的发展，或结束传统治疗形式后的进行性疾病。
2.治疗模式剂量和扩大评价了3种给药方案。所有剂量水平由每天3次随餐20mg加上3次餐间扩大服药(水平I、II、和III)组成，合计每天服药6次。除了所有剂量水平中相同的3次随餐服药20mg之外，剂量水平I、II、和III还分别提供了每天3次的餐间服药10mg、15mg、和20mg TM。
由于在施用TM之前对所有患者进行了取血，所以将基线Cp作为包括治疗第1天在内的与第1天最接近的Cp测量值。Cp降低目标定为基线Cp的20％。由于Cp试验的误差为大约2％，所以基线22％的Cp变化也认为达到了期望的降铜效果。另外，如果绝对Cp小于5mg/dl，那么认为患者已经达到了目标Cp。没有患者是由于Cp小于5mg/dl、同时并未由基线下降至少78％而达到该目标。达到目标缺铜状态之后，因人而异的调整TM剂量而将Cp维持在由基线下降70-90％的目标范围内。
每个剂量水平编入6名患者。当水平I编入了4名患者后，如果有1名患者遭受了剂量限制毒性(dose-limiting toxicity，DLT)(定义为Hct＜基线的80％)，则水平I再编入2名患者。如果没有观察到DLT，则将患者编入下一个剂量水平。如果患者经历了部分或完全临床应答，或者达到了如下定义的临床稳定疾病，则允许在诱导目标缺铜之后继续进行治疗。完全应答定义为活性疾病的所有临床和实验室体征和症状消失。部分应答定义为可测病变的大小(定义为病变的最大正交直径的乘积的和)降低50％或更多，并且不出现新病变或病变大小增加。较小应答定义为，一个或多个可测病变的最大正交直径的乘积的和降低25-49％而且病变不再扩大且不再出现新病变。稳定疾病是肿瘤测量中不由应答或疾病有发展的标准表示的任何变化，其中疾病有发展定义为与以前的最小测量值相比，任何可测的指示性病变的最大正交直径的乘积之和增加25％或更多，或者出现新病灶。因为缺铜不是细胞毒性治疗方法，所以在患有深度癌症的患者群中，提供关于TM作为长期治疗功效的信息的患者主要是维持在基线20±10％的目标Cp范围内超过90天且无疾病发展的那些患者。
3.铜状态的监测需要能够容易且可靠地监测铜状态的方法，使得在此试验过程中能够恰当的调整TM剂量。施用TM后，血清铜不再是全身铜的有用度量，因为TM-铜-清蛋白复合体不能被迅速清除，而事实上总血清铜(包括与TM-蛋白质复合体结合的部分)在TM治疗过程中上升(Brewer等人，1991a；1994b；1996)。将每周获得的血清中血浆铜蓝蛋白水平作为全身铜状态的代用度量。血清Cp水平受肝的Cp合成的控制，而肝的Cp合成反过来也由肝能够获得的铜决定(Linder等人，1979)。由此，当全身铜降低时，血清Cp水平也成比例降低。正常对照和癌症患者的血清Cp水平的范围分别为20-35mg/dl和30-65mg/dl。此试验的目的是将Cp降至基线的20％或以下，并维持该水平在基线的20±10％范围内，而典型的Cp值的范围为7-12mg/dl。似乎该降铜程度不产生不利的临床效果，所以该水平的缺铜命名为“化学缺铜”。真正的临床缺铜的第一指征是血细胞计数下降，主要是贫血症，因为血红素合成以及细胞增殖需要铜(Brewer等人，1996)。由此，此试验的缺铜目标是，在患者的血细胞比容或WBC不降至开始时基线值的80％以下的前提下，将Cp降至基线的20％或以下。
4.毒性、跟踪、和疾病评价治疗期间，全血计数、肝和肾功能测定、尿液分析、和Cp水平(使用氧化酶方法)每周进行一次，16周后改成两周一次；体检和毒性评价两周一次，8周后改成四周一次。使用国家癌症协会的常用毒性标准评价毒性。由于TM、TP-TM和相关化合物在采用的剂量下是无毒药物，而且TM已经给人施用并没有产生除上文详述外的任何其它毒性，所以如果有毒性，那么预计毒性的大部分不会是由TM、TP-TM和相关化合物引起的。虽然如此。如果观察到3级或更高等级的任何类型的毒性，无论病因是什么，都将停止治疗，患者将退出研究。对于2级毒性，将尝试确定病因。如果常规支持性护理措施不能减轻症状，则中止服药，且患者退出研究。
在开始时、在达到定义为Cp位于基线的20％或以下的缺铜的时间点、和之后每10-12周评价疾病程度。为了常规测量所有已知位点的疾病以及评价疾病任何潜在的新位点，适当时还使用计算机辅助的断层摄影术或磁共振成像术。在选择的个案中，进行血管发生敏感的超声和3维多普勒分析，作为传统成像技术的补充，用于评价不同时间点流向肿瘤的血液。
5.TM制备和贮存适合人施用的TM由Aldrich化学药品公司(Milwaukee，WI)大量购买。由于TM暴露于空气时，氧会取代分子中的硫，使之缓慢降解而失活(Brewer等人，1991a；1994b；1996)，所以将其以100g包装贮存于氩气中。当开出处方之时，将合适剂量的TM装于明胶囊中。发明人以前指出，分装于这种胶囊中的TM保存8周后仍保留至少90％的效力(Brewer等人，1991a)。由此，在试验过程中，为每位患者分装了8周剂量的TM。
6.血流测量对选择的患有易受影响病变的患者，在他们达到缺铜时和之后以8-16周的可变间隔，由超声法测量血流。在GE Logiq 700超声系统上用739L，7.5MHz线性排列扫描头进行3D扫描。扫描和血管量化技术如以前的描述(Carson等人，1998；LeCarpentier等人，1999)。
C.结果1.患者特征患有11种不同类型的转移性癌症的18名合格患者按照他们登记的顺序加入了本试验，其中10名男性，8名女性，他们的病症通过其它治疗方法都有发展，有1例衰退。依照剂量扩大模式的方案，将6、5、和7名患者依次编入90、105、和120mg/天的药物水平。由于疾病的迅速发展，1名起初编入105mg水平的患者很早就退出了，改而进行细胞毒性化疗。该患者后来很长一段时间在120mg水平重新治疗，由此在分析中只记入120mg药物水平。平均年龄59岁；平均基线Cp 47.8mg/dl，与正常相比升高了，反映了患者的疾病状态。
2.毒性当Cp水平处于基线的20％或以上时，没有观察到心、肺、GI、肾、肝、血液、感染、皮肤、粘膜、或神经毒性。当Cp水平位于基线10-20％时，在4名患者中观察到轻度(超过基线Hct的80％)可逆贫血症。其中2名患者已经用细胞毒性化疗法进行了治疗，而且有证据表明2名患者在加入试验时其疾病广泛涉及骨髓。虽然在后2例中，贫血症很可能由治疗外的其它因素引起，但仍暂停TM，直到输血2个单位的袋装RBC后Hct恢复到可接受水平时。在1名患者中，很可能是TM引起的缺铜导致了贫血。停服药物后，不需要输血，血细胞比容在5-7天内恢复；应患者的要求，TM以较低剂量重新开始施用，不再并发贫血。一些患者在摄入TM 30分钟内，经历了暂时、偶尔的硫味嗳气。在长期维持轻度临床缺铜的8-15个月中，没有观察到任何类型的其它毒性。值得注意的是，在长期治疗中，没有观察到GI或其它粘膜出血或较小外伤治愈削弱的证据。伴有广泛转移性肾癌的1名绝经前期患者在TM治疗过程中有正常月经周期，包括缺铜且Cp＜基线20％的2.5个月观察期。
3.血浆铜蓝蛋白作为铜状态的代用测量测定了Cp应答对TM治疗时间的函数，表述为编入90mg/天、105mg/天、和120mg/天剂量水平的每位患者在t时间的Cp与基线Cp水平的比率。Cp降低50％的平均时间为30天。将餐间剂量由每天3次10mg增加到每天3次15mg或20mg，对Cp水平的降低速率没有显著影响，达到基线50％水平的平均时间是30天(中值＝28天)。Cp对TM治疗的应答作为时间的函数只展示了较小的波动；当TM中止时，观察到48小时内Cp迅速上升。
由于在达到基线20％的目标Cp前疾病有发展，4名患者退出了研究，而剩下的14名患者达到了目标Cp水平。由于达到目标Cp水平的所有14名患者都希望继续研究，根据协议获得了批准，条件是他们不展示疾病发展或毒性。调整这些患者的TM剂量，以将Cp维持在基线的10-20％。这些患者提供了关于本方法的功效和长期耐受性的初步证据。
4.调整剂量以维持目标Cp为了维持基线20％的Cp目标和预防Cp绝对值低于5mg/dl，对TM剂量进行调整。由于Cp测试采用常规的7天周期，所以这些剂量变化也在Cp测量取血后大约7-10天进行。达到目标Cp后，餐间剂量通常降低20mg。在长期治疗中需要进一步降低15-30mg。除了进行长期放疗的乳腺癌还患有转移性软骨肉瘤的1名患者在缺铜12个月后疾病得到稳定，具有稳定的生活质量。经活组织检查证明的第三指转移性小瘤可以容易的测量，而且已经稳定。有趣的是，该患者只要求在相对较长的时间内，只对起始的装载剂量水平进行较小调整以维持目标Cp。
如以下代表性患者在超过大约100天用TM进行的治疗中所述的，用TM、TP-TM和相关化合物进行长期治疗时通过调控使Cp水平维持在基线的20％是容易达到的。某一患者到目前为止只要求以60天相隔减小剂量。为了防止Cp水平下降到5mg/d以下，该患者在未来可能需要降低TM的剂量。大多数患者在长期治疗中对剂量升高和降低都有要求。例如，TM剂量在第100天后已有所增加，以防止Cp漂移超出目标范围。饮食和肿瘤行为(诸如肿瘤细胞溶解)的不均一性可能造成了剂量调整需求中的个体差异。胸部有可疑疾病的其它位点也保持稳定。总而言之，每周评价的对TM治疗的Cp应答并不是暂时的或有大波动。
5.转移性癌症对TM的应答的测量临床评价虽然患者得到不同的TM起始装载剂量，但是无论装载剂量是多少，在所有组中都使用相同的Cp维持范围，即基线的20±10％。通过TM剂量的合适调整维持该缺铜程度达90天的患者，很可能反映TM、TP-TM和相关化合物对抗他们的肿瘤的抗血管发生活性。选择90天的持续时间是因为2个主要原因。首先，TM、TP-TM和相关化合物对癌症或内皮细胞都无细胞毒性，而且主要削弱内皮细胞功能和前血管发生因子的产生。预计这种作用机制对肿瘤块的大小具有很慢的影响。第二，由于肿瘤储存铜，预计使肿瘤微环境缺铜需要较长时间。
14名患者在疾病发展或并发其它疾病之前达到了目标缺铜状态。在这些患者中，8名患者抑或在达到缺铜的30天内疾病有发展，抑或疾病稳定时间短于90天；这些肿瘤的大多数所经历的抗血管发生环境的时间，不大可能足够用来评价对这种疗法的临床应答。在由于疾病发展或其它选择而退出实验方案的所有患者，和由于需要腹部外科手术以减轻微弱肠梗阻的一名患者中，在中止TM治疗后，临床记录到了迅速得多的疾病发展。
其余6名患者疾病稳定(5/6)或一个位点的疾病发展而其它位点疾病稳定(1/6)。根据标准具有稳定疾病的2名患者在120天和49天处于目标Cp的观察期中还经历了一些肺病变的完全消失和其它肺病变的大小减小。长期(90天以上)维持治疗中的5名稳定疾病患者在进行此分析时已经缺铜达120-413天。
放射学评价CAT扫描或MRI的传统成像技术对肿瘤块的系列评价揭示了，某些肿块的X光照相外观随时间变化显著。具体而言，在多种肿瘤类型中，最值得注意的是肾细胞癌、血管肉瘤、和乳腺癌中，观察到推测的中央坏死的区域(相应于X射线信号的较低衰减)。为评价流向肿瘤的血液在长期TM治疗的缺铜中作为时间的函数，在缺铜发作时和之后2-4个月的间隔将对易受超声影响的病变用彩色流3维超声进行成像。
达到目标缺铜时和8周后，在来自肾细胞癌的肋骨转移中，比较传统CAT扫描成像和血流敏感的3D超声。CAT扫描显示，虽然在达到目标缺铜8周后观察到(可能)中央坏死的更明显区域，但是该病变随时间而大小较稳定。相比而言，这个大约8周的时间内，通过3D超声检测到，流向该肿块的血流降低了4.4倍。除了这两种技术研究的肿块，该患者还在胸、骨盆、和股骨中有大范围疾病。
TM与其它治疗形式结合在缺铜的长期维持中，向TM加入认为对优化患者治疗恰当的其它治疗形式。患有以前未治疗的转移性乳腺癌的患者在治疗12个月后生活质量提高到好乃至很好。该患者在气管旁、颈后、和腹膜后淋巴结链中有转移，但是拒绝了所有细胞毒性治疗。患者在TM治疗中稳定疾病超过6个月，在可以购买到trastuzumab后，当气管旁和腹膜后节的二维大小略微增大(少于基线的25％)时，即开始进行并行的trastuzumab治疗。该患者显示，疾病的所有位点对trastuzumab迅速应答1个周期后，颈部出现临床完全应答，3个trastuzumab周期后，放射学确认了以前的所有疾病位点的完全应答。患者维持TM，但是trastuzumab在服药6次后中止。患者在中止trastuzumab治疗后仅仅施用TM继续维持状态达3个月。因为在加入trastuzumab治疗后达到完全应答，所以将该患者归入TM治疗只有稳定疾病的组。
具有脸部和头皮大范围血管肉瘤的2名患者在TM治疗中达到了稳定疾病。在眼部严重慢性出血威胁眼眶的1名患者中，向TM加入α-干扰素(IFN-α)以尝试增强肿瘤应答。根据进行性血管瘤发展的研究，使用小剂量干扰素可能对血管瘤治疗有效(Takahashi等人，1994)，因此给这两名患者一天两次皮下注射α-干扰素500,000单位。在TM治疗中还对这两名患者进行放疗，以尝试控制活跃出血、但没有发展的病变。两名患者都具有超过60天的疾病稳定期，其中1名患者在出于其选择而中止治疗之前维持稳定疾病超过5个月。在向TM加入的任何这些治疗形式中没有观察到毒性恶化。
这是用四硫代钼酸盐作为癌症的抗血管发生治疗而诱导和维持缺铜的第一例人试验。在一组深度癌症患者中，证明了当Cp降至基线水平的10-20％长达17个月时，TM显著无毒。观察到的仅有的药物相关毒性是1名患者中的轻度贫血症，而且还是将Cp水平调至期望目标的TM剂量调整可以容易逆转的。尽管铜在多种重要生物学过程(包括血红素合成、超氧化物歧化酶、和细胞色素功能)中具有多种作用，在Cp降至大约基线的20％时没有观察到持续的、显著的不利影响。该降铜水平构成了化学缺铜的下限和轻度临床缺铜(其第一表现是轻度贫血症)的起始。
由便宜和广泛可用的氧化酶方法得到的血清Cp水平，在TM治疗过程中经验证是全身铜状态的敏感和可靠的代用标记。使用每天六次的服药方案，起始TM剂量范围90-120mg/天，在治疗的18名患者中，17名患者的血清Cp可靠的降至基线的50％，14名患者降至基线的20％。降低至基线50％平均在30天内达到，进一步降低至5-10mg/dl Cp水平需要20-30天。虽然该Cp降低速率对于早期恶性病变的起始治疗或在佐剂设定中是合理的，但在广泛转移的严重癌症中，该降低速率将被加速以预防一些疾病在诱导缺铜过程中在大量患者中发展。由于90-120mg/天的装载剂量变化似乎不影响Cp降低速率，而且典型的每日铜摄入与食物一起提供，所以将需要更大的餐间剂量以加快诱导缺铜的速率。
由于Cp对TM诱导的缺铜的应答是单一的，并且很少有个体间的变化，所以基本上没有可能使剂量管理变得困难的突然变化或不可预测的波动的风险。每1-2周一次的跟踪Cp水平对于监测铜状态是足够的。因此必然可以容易检测到和纠正过度治疗。
作为此研究的结果，显然以此TM剂量给药方案，在TM治疗的起始和肿瘤内铜水平降至可能的抗血管发生水平之间存在可观的迟滞。进一步延迟达到抗血管发生水平的缺铜的能力是大多数肿瘤可能储存铜(Arnold和Sasse，1961；Apelgot等人，1986；Gullino等人，1990；Fuchs和Sacerdote de Lustig，1989)。由此，可能需要额外时间以耗尽肿瘤微环境达到有效低水平铜(定义为足够抑制血管发生的低水平)。患有非常迅速进展的大型肿瘤的患者可能因此需要除此处描述的抗血管发生治疗之外的其它治疗形式。
此外，最初有效的抗血管发生可能引起活泼的肿瘤坏死，导致由垂死细胞释放额外的铜。在1名患者中，在与暗示大型肿瘤块可能由于血流的显著降低而遭受中央坏死的超声大致相同的时间观察到Cp的短暂上升。由此，Cp处于基线20％的目标水平达60-90天是评价抗铜疗法应答的合理起点。在展示肺病变部分衰退的2名患者中，肿瘤控制可能开始得更早。同样有趣的注意到，在这2名患者中，肺实质转移是肿瘤衰退的位点。可能轻度临床缺铜削弱了超氧化物歧化酶的功能(Culotta等人，1997)，以至于在高氧化剂压力条件下，诸如肺中存在的那些，转移性病灶对氧化性损伤更易感。
尽管存在个体差异，通过使用3D超声测定流向选定肿块的总血流，证明了将至基线20％的轻度降铜维持至少8周对改变肿瘤血流似乎是足够的。由于计算机辅助断层摄影术对病变处的血流或代谢状态的相对不灵敏性，优选经平行成像形式(如此处为3D超声示范的)评定肿瘤大小及功能性应答。
这些研究显示，多种类型的实体瘤的大小可能由给予TM维持轻度临床缺铜状态(如此研究定义的，由Cp降至基线的20％或以下表示)足够时间而得到稳定或减小。在维持在目标Cp水平超过90天的患者中，病例的大部分(5/6)是稳定的，对他们的生活质量无害。在这群深度癌症患者中，经治疗患者中39％能够在此期间维持目标Cp。
在这些患者中观察到的进展模式和速度也提供了有用的信息。1名患者在除了一个之外的所有位点达到了稳定疾病，并由于在更威胁生命的疾病位点(肠和气管旁淋巴结)处疾病得到稳定，故选择继续TM治疗。有趣的是，患有黑色素瘤的该患者中的进展位点是正被照射的大型肾上腺转移。此试验中的这些观察结果说明，虽然缺铜通常可能抑制血管发生，但肿瘤类型的异质性和转移的特异定位可能调控对这种治疗形式的应答。由于铜耗尽时的病变进展显得比TM治疗中更快速，所以可以使用全身的或局部的辅助形式以定位到疾病进展的特异位点，同时使患者维持在缺铜状态。
这些研究还显示，可以进行TM与放疗、trastuzumab、和α-干扰素的结合治疗而没有添加明显的恶化毒性。从总体看，由此试验得到的安全性和初步功效数据说明可以将TM、TP-TM和相关化合物单独或联合用于治疗早期转移性疾病、微小疾病、和辅助高风险临床状况下(包括化学预防)。
实施例4TM作为抗癌疗法的II/III期临床试验A.介绍在设计本试验的药物剂量和时间表时，有4个考虑。第一，以前使用的给药方案虽然在降铜中有效，但是需要太长时间达到Cp终点以恰当评价功效。正如已知的，肿瘤储存铜(Apelgot等人，1986；Arnold和Sasse，1961)，所以只有在全身缺铜维持(可能)至少几周到几月后，才有可能检测到抗血管生成的效果。因此，重要的是尽可能快的达到全身缺铜的终点(0-20％Cp水平)以使功效尽可能最大。因此，本试验使用了2周的“装载”剂量，以达到Cp标准，随后使用较低的维持剂量以维持基线0-20％的目标Cp。此设计利用了I期试验中得到的知识，并将测定TM、TP-TM和相关化合物稳定疾病或肿瘤衰退的功效。
第二，本试验将评价有效应答是否依赖Cp水平控制的严格程度。因此，在第一组患者中，Cp水平维持在10-20％；而在第二组中，Cp水平维持在0-10％。
第三，本试验将测定用锌疗法维持低铜状态是否更容易。发明人已经将锌发展成FDA批准的威尔逊病疗法。它通过诱导肠金属硫蛋白并阻断铜的吸收从而发生作用。因此，通过每天三次施用25mg锌在6名患者中维持低铜状态，必要时调整剂量以维持Cp标准。
B.II期研究1.装载剂量发明人发现，随餐每天3次20mg和餐间每天1次60mg的服药时间表将Cp水平降至＜20％的速度，比随餐每天3次20mg和餐间每天3次20mg要快得多。因此，该服药时间表将在II期试验中进行研究。还研究了TM的其它3种装载剂量水平1，餐间每天3次20mg和随餐每天3次20mg，直到Cp＜20％(10名患者)；水平2，餐间每天3次25mg和随餐每天3次25mg，直到Cp＜20％(10名患者)；水平3，餐间每天3次30mg和随餐每天3次30mg，直到Cp＜20％(10名患者)。
装载剂量研究的目的是在2-3周内达到期望的Cp水平(＜基线的20％)。试验将从水平1开始。如果水平1达到了期望的Cp水平，那么30名患者都将以水平1的剂量服药。如果水平1没有达到期望的Cp水平，那么试验将换成装载剂量水平2。如果需要，再换成装载剂量水平3。这些剂量对于几周-几月是安全的。
2.TM的维持剂量将研究TM的2种维持水平水平1，将Cp维持在基线的10-20％需要的TM剂量(12名患者)；水平2，将Cp维持在基线的0-10％需要的TM剂量(12名患者)。
比较2种维持剂量水平的目的是了解更严格的铜控制能否增强功效。一般而言，肿瘤类型在2种水平之间随机化。
3.锌的维持剂量从每个装载剂量组中选取2名患者，合计6名患者，将用锌疗法治疗以获得维持对照。试验将从每天3次25mg锌(不与食物一起)开始，并调整剂量以将Cp维持在基线的20％以下。
锌研究的目的是了解在维持阶段用锌控制铜状态是否比用TM更容易，和一般性了解锌的功效是否与TM的功效基本可比。
4.患者选择标准患者选择标准将包括a)转移性腺癌、鳞状癌、或任何器官起源的肉瘤；b)通过胸部X射线、CAT扫描、或骨平片(plain bone films)可测量的疾病；c)在加入后3个月内至少证明了1次的进行性疾病；d)告知后能够表示同意；e)行为状态ECOG 0-1；和f)预期寿命≥6个月。
排除标准包括血细胞比容低于29，LFT高于正常的4倍，或需要加强管理的严重并发症。
5.参数在患者中追踪的参数是1)每周一次CBC血小板；2)每周一次电解质、BUN、肌酸酐、LFT；3)每周一次血样的血清铜、钼、血浆铜蓝蛋白；4)每周一次尿液分析；5)每两周一次临床状态检查；6)每4周一次肿瘤测量；和7)每8周一次研究血管生成敏感性超声。
6.毒性终点正如以前，当血细胞比容或WBC跌至基线的80％以下时停止服药。如果有证据表明可能有全身毒性，诸如肝或肾功能测试异常，或按NCI标准为任何其它3级或更高级别毒性，也将停止服药。
7.研究时间如果6个月内没有证据表明患者疾病稳定或减弱，该患者的研究将终止。否则，只要疾病控制在所有起始位点的25％内，没有显著毒性，且患者希望继续，治疗将继续。
实施例5四硫代钼酸四丙铵(TP-TM)A.制备将(NH4)2[MoS4](5.2g，20ml)溶于水中(100ml)并将过滤溶液加入1.0M nPr4NOH水溶液(40ml)中。溶液颜色变成亮红色且反应混合物形成了红色沉淀。搅拌1小时后，将沉淀过滤并进行空气干燥。用流动的N2去除滤出物的水份，得到更多产物。通常分离得到10-11g(84-92％产量)的结晶产物。化合物通过XRD、FT-IR、UV-VIS和CHN分析定性。各样品的CHN分析显示出稍低的C和N含量，这可能是由于水份造成的，但XRD检测则保证了所有化合物都具有相同的结晶方式。
B.X-射线结晶学分离获自浓缩水溶液的针晶状结晶并在CCD衍射仪上收集衍射数据。化合物以单斜晶方式结晶。单位晶格a＝32.067(3)b＝13.7236(15)c＝14.8379(16)和β＝109.241(2)°。结构解析于空间群中，C2/C。(NH4)2[MoS4]的晶体封装投影如图1中所示。
以获自单晶体X-射线结构测定的原子坐标为基础计算的X-射线粉晶谱如图2中所示，从实验中获自结晶(n-Pr4N)2MoS4的X-射线粉晶谱如图3中所示。可以推断结晶材料与结构测定中所用的单晶体相同。
表3(nPr4N)[MoS4]的晶体数据和结构精化
表4(nPr4N)[MoS4]的原子座标(×10^4)和同等物各向同性位移参数(A^2×10^3)，U(eq)被确定在正交Uij张量交点的三分之一处
表5(nPr4N)[MoS4]键的长度[A]和角度[°]
用于产生同等原子的对称变换#1-x，y，-z+1/2
现在参考图9，其是根据本发明实施例的、通过电话网络200实现节拍器20的示意图。在该实施例中，刺激产生器172通常包括传统有线或无线电话204的扬声器202，并且用户接口32包括该电话的键盘206。从用户30远程实现节拍器20的其他部件，例如在电话公司或在另一服务提供商。电话204无线地或通过电话线，通常通过至少一个电话交换机212，连接到这样的远程节拍器功能设备210。或者，用户接口32包括电话204的麦克风208，其功能为解释用户30语音命令，和/或用于对节拍器20进行编程来检测用户30的呼吸，如上述参考图6所描述的那样。
在本发明的一个实施例中，节拍器20是通过电话网络200、使用双音多频(DTMF)信号实现的，用户使用键盘206产生该双音多频信号，并且该双音多频信号被远程节拍器功能设备210解码。下表示出了该系统的示例性实现。本领域技术人员应该理解，这张表给出的细节只出于示例性目的，对于阅读了本申请的本领域技术人员，其他多种可替换方法也是显而易见的。
表7(nPr4N)[MoS4]的氢座标(×10^4)和各向同性位移参数(A^2×10^3)
C.稳定性在整个时间段检查4个不同的样品。干燥晶体保存于密封瓶和开口瓶中。干燥和潮湿的研磨晶体保存于开口瓶中。用UV-可见分光仪检测其稳定性，将1mg化合物溶于20ml水中以制备溶液。化合物在两个月内保持稳定，其吸收值的改变在实验误差范围内。
实施例6TP-TM已增强的稳定性在观察到稳定性增强的最初迹象后，进行研究以比较TP-TM相对于原始TM制剂(AmmTM)的稳定性。此研究在增加不稳定性的条件下进行，即，将药物在室温下放于开盖的皮氏培养皿中。两种药物随时间的活性差异如表8和图4中所示。
表8TP-TM稳定性的提高
从这些试验中可见，在这样的条件下，TPTM的半寿期被惊人的测定为约180天。相反，原始TM(AmmTM)在此条件下的半寿期经测定为约40天。此稳定性的差异使TPTM成为大大优于TM的改良药物，因为这意味着在制药学上它可以大量操作而不必非常注意空气的排除。这还意味着对于TPTM而言，在相似条件下其最终制剂的贮藏寿命将要长得多。
实施例7TP-TM的体内抗肿瘤作用因为TM在动物和人中具有安全有效的抗血管发生和抗肿瘤作用，而且因为TP-TM被设计成保持了重要的铜结合特性但具有更高的稳定性，所以预计TP-TM也能具有优越的抗血管发生和抗肿瘤效用。以下研究的设计就是为了在体内证实这些特性。
在此试验中，将106个乳腺癌细胞注射入4组无胸腺裸鼠(每组5只)的乳房脂垫中。对照小鼠不接受处理。其它三组用原始TM(AmmTM，1mg/天)或两种不同剂量的TP-TM(1mg/天和1.5mg/天)处理，检查整个处理过程中肿瘤的体积变化。
如图5中所示，被处理动物的生长曲线与对照动物显著不同(p＜0.01)，TM和TP-TM在整个试验过程中都有效抑制了肿瘤的生长。重要的是，TP-TM生长曲线(在图5中标示为“TP”)在统计学上与TM曲线是无差别的，表明该新化合物在抑制体内肿瘤生长方面具有与亲本化合物相等的生物学效用。此外，此试验还显示TP-TM以1.5mg/只小鼠/天的剂量足以发挥效用。
实施例8TP-TM在体内的安全性实施例6和7中的数据显示，TP-TM具有比亲本化合物TM更高的稳定性，但在体内对照试验中具有基本上相同的抗肿瘤效果。本实施例显示释放自TP-TM的盐在比临床治疗所需浓度高许多时对小鼠仍是无毒的。
为了证实TP-TM分解产物的无毒性特性，将剂量为2、20、40、60、80、100和200mg/只小鼠/天的氯化四丙铵施用于3-4只小鼠一组的实验组中。对于2和20mg/只小鼠/天的剂量而言，所有动物在施药58剂后仍健康存活(表9)。
表9氯化四丙铵急性和亚急性毒性试验(以单一每日剂量强饲小鼠)
表9还描述了人的氯化四丙铵同等物剂量，按较大的哺乳动物缩放。使用剂量比上述研究(实施例7)中肿瘤抑制所需剂量高20倍时在小鼠中仍未有可检测到的毒性。这些剂量水平代表了为获得TP-TM的同等生物学降铜效果而需使人暴露的四丙基水平高46.6和466倍的剂量。这些数据表明，释放自TP-TM的盐在比此化合物用于人的降铜疗法中可能需要的剂量高许多倍时对小鼠仍是无毒的。
***
此处公开和要求保护的所有组合物和/或方法，可以根据本公开书在无额外实验的情况下制备和实行。虽然本发明的组合物和方法已经根据优选实施方案进行了描述，但是对本领域技术人员显然的是，在不违背本发明的概念、精神和范围的前提下，此处描述的组合物和/或方法、和方法的步骤或步骤的顺序可以进行变化。更具体的说，显然可以用化学和生理上均相关的某些试剂取代此处描述的试剂，同时得到相同或相似的结果。所有这些对本领域技术人员显然的相似取代和修饰，如所附权利要求描述的，被认为是属于本发明的精神、范围和概念之内。
参考文献此处特别引用下列文献作为参考，它们提供了补充上文的例示性步骤和其它细节。
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权利要求
1.一种组合物，其中包含生物学有效量的至少第一种四硫代钼酸四烷基铵化合物以及药学上可接受的赋形剂。
2.权利要求1的组合物，其中所述组合物包含四硫代钼酸四甲基铵。
3.权利要求1的组合物，其中所述组合物包含四硫代钼酸四乙基铵。
4.权利要求1的组合物，其中所述组合物包含四硫代钼酸四丁基铵。
5.权利要求1的组合物，其中所述组合物包含四硫代钼酸四丙基铵。
6.一种组合物，其中包含药学上可接受的赋形剂和四硫代钼酸四烷基铵化合物，其中在暴露于空气和湿气时所述烷基可保护该四硫代钼酸根免于被氧化，由此提高四硫代钼酸盐化合物的稳定性，该四硫代钼酸四烷基铵化合物保持了可溶性，并且在水溶液中释放实质性生物学活性的四硫代钼酸根和实质性生物学惰性的烷基铵基团。
7.含生物学有效量的四硫代钼酸四烷基铵化合物和药用可接受赋形剂的组合物；其中所述四硫代钼酸四烷基铵化合物在潮湿的热空气中基本上保持稳定至少约7天；室温下暴露于空气中时半寿期至少是四硫代钼酸铵的两倍；能以至少约1mg/ml的溶解度溶于水中；在水溶液中释放具有基本上完整的铜结合特性的四硫代钼酸根。
8.权利要求1至7中任一项的组合物，其中所述组合物被配制成供静脉内给药的形式。
9.权利要求1至7中任一项的组合物，其中所述组合物被配制成供眼部施用的形式。
10.权利要求1至7中任一项的组合物，其中所述组合物被配制成供口服的形式。
11.任何前述权利要求的组合物，其中还包含至少第二种不同的治疗剂。
12.权利要求11的组合物，其中还包含锌化合物。
13.权利要求11的组合物，其中还包含至少第二种不同的抗血管发生试剂。
14.权利要求13的组合物，其中还包含至少第二种选自制管张素、内皮生长抑素、曲恩汀、青霉胺和锌的抗血管发生剂。
15.权利要求11的组合物，其中还包含至少第二种不同的抗癌剂。
16.权利要求15的组合物，其中还包含选自下组的至少第二种抗癌剂化疗剂、放疗剂、免疫毒素、抗血管发生试剂、凋亡诱导试剂、与铜结合的不同试剂和锌化合物。
17.包含至少第一种四硫代钼酸四烷基铵化合物的组合物用于治疗中。
18.包含至少第一种四硫代钼酸四烷基铵化合物的组合物用于治疗或预防异常血管形成相关性疾病。
19.包含至少第一种四硫代钼酸四烷基铵化合物的组合物用于治疗或预防癌症。
20.依照权利要求1至16中任一项的组合物，用于治疗癌症。
21.四硫代钼酸四烷基铵化合物在制备用于治疗或预防以异常血管形成为特征的疾病的药物中的用途。
22.依照权利要求21的用途，其中所述药物意图用于治疗或预防湿型黄斑变性或类风湿性关节炎。
23.依照权利要求21的用途，其中所述药物意图用于治疗或预防癌症。
24.依照权利要求1至16中任一项的组合物在制备用于癌症治疗的药物中的用途。
25.一种试剂盒，其在至少第一种容器中包含治疗有效量的至少第一种四硫代钼酸四烷基铵化合物以及a)治疗有效量的至少第二种不同的治疗剂；或b)测定血清血浆铜蓝蛋白水平的检测体系中的至少一种成分。
26.权利要求25的试剂盒，其中所述的至少第一种四硫代钼酸四烷基铵化合物包含于药用可接受组合物中。
27.权利要求25的试剂盒，其中所述的至少第一种四硫代钼酸四烷基铵化合物是四硫代钼酸四丙铵。
28.依照权利要求25-27中任一项的试剂盒，其中所述试剂盒包含至少第一种四硫代钼酸四烷基铵化合物和至少第二种不同的治疗剂。
29.依照权利要求28的试剂盒，其中所述至少第二种不同的治疗剂是锌化合物或者至少第二种不同的抗血管发生剂。
30.依照权利要求28的试剂盒，其中所述至少第二种不同的治疗剂是至少第二种不同的抗癌剂。
31.依照权利要求28的试剂盒，其中所述至少第一种四硫代钼酸四烷基铵化合物和所述至少第二种不同的治疗剂包含在单个容器内。
32.依照权利要求28的试剂盒，其中所述至少第一种四硫代钼酸四烷基铵化合物和所述至少第二种不同的治疗剂包含在不同的容器内。
33.依照权利要求25-27任一项的试剂盒，其中所述试剂盒包含所述至少第一种四硫代钼酸四烷基铵化合物和用于测定血清血浆铜蓝蛋白水平的测试体系的至少一种成分。
34.依照权利要求33的试剂盒，其中所述试剂盒还包含用于测定血清血浆铜蓝蛋白水平的测试体系的所有成分。
35.用于治疗或预防与异常血管形成有关的疾病的方法，包括对患有或有风险患上与异常血管形成有关的疾病的动物给予包含治疗有效量的至少第一种四硫代钼酸四烷基铵化合物的药物组合物。
36.依照权利要求35的方法，其中所述药物组合物包含治疗有效量的四硫代钼酸四丙基铵。
37.权利要求35或36的方法，其中通过胃肠外途径将所述药物组合物对所述动物给药。
38.权利要求35或36的方法，其中经眼部将所述药物组合物对所述动物给药。
39.权利要求35或36的方法，其中通过口服途径将所述药物组合物对所述动物给药。
40.权利要求35或36的方法，其中还包括对所述动物给予治疗有效量的至少第二种不同的治疗剂。
41.权利要求40的方法，其中所述至少第二种不同的治疗剂是锌化合物或者至少第二种不同的抗血管发生剂。
42.权利要求35或36的方法，其中所述动物患有或有风险患上湿型黄斑变性。
43.权利要求35或36的方法，其中所述动物患有或有风险患上类风湿性关节炎。
44.权利要求35或36的方法，其中所述动物患有或有风险患上癌症。
45.权利要求44的方法，其中所述动物患有癌症。
46.权利要求45的方法，其中还包括对所述动物施用治疗有效量的至少第二种不同的抗癌剂。
47.权利要求35-46中任一项的方法，其中将约10mg至约300mg之间的所述至少第一种四硫代钼酸四烷基铵化合物施用于所述动物。
48.权利要求35-46中任一项的方法，其中所述至少第一种四硫代钼酸四烷基铵化合物被施用于所述动物，施用量和施用持续时间可以有效的使所述动物中的铜水平降低到施用所述至少第一种四硫代钼酸四烷基铵化合物之前该动物中铜水平的约10％至约40％之间。
49.权利要求48的方法，其中将所述至少第一种四硫代钼酸四烷基铵化合物施用于所述动物，其施用量和施用持续时间可以有效的使所述动物中的铜水平降低到施用所述至少第一种四硫代钼酸四烷基铵化合物之前该动物中铜水平的约10％至约20％之间。
50.权利要求48的方法，其中随后将治疗有效量的铜结合试剂施用于所述动物，施药的持续时间可以有效的使所述动物中的铜水平保持在施用所述至少第一种四硫代钼酸四烷基铵化合物之前该动物中铜水平的约10％-20％之间。
51.权利要求50的方法，其中随后施用的铜结合试剂是硫代钼酸盐化合物。
52.权利要求50的方法，其中随后施用的铜结合试剂是锌化合物。
53.权利要求48的方法，其中首先将负荷剂量的所述至少第一种四硫代钼酸四烷基铵化合物施用于所述动物，施用量和施用持续时间可以有效的使所述动物中的铜水平最初降低到给药前铜水平的约20％至约40％之间，且随后将维持剂量的所述至少第一种四硫代钼酸四烷基铵化合物施用于所述动物，施用量和施用持续时间可以有效的使所述动物中的铜水平保持在施药前铜水平的约10％-20％之间。
54.权利要求35-53中任一项的方法，其中所述动物中的铜水平由血清血浆铜蓝蛋白水平指示。
55.权利要求35-54中任一项的方法，其中所述动物是人类受试者。
全文摘要
本发明公布了具有改良特性的与铜结合的化合物以及将这些化合物用于预防和治疗诸如癌症等血管发生性疾病的方法。本发明的优势包括，所述化合物的稳定性得到增强，而其功效却并未降低。本发明还提供了药物组合物、治疗试剂盒和联合治疗方法及用途。
文档编号A61K38/00GK1688303SQ03820746
公开日2005年10月26日 申请日期2003年7月23日 优先权日2002年7月23日
发明者G·J·布鲁尔, S·D·梅拉耶维尔, D·库库瓦尼斯 申请人:密歇根大学董事会