专利名称：具备生物活性同种骨组织的制备及保存方法
技术领域：
本发明涉及一种修复和重建骨缺损的生物材料，特别是一种具备生物活性同种骨组织的制备及保存方法。
背景技术：
同种骨组织具有来源广、提供生物愈合以及治疗费用低等优点，因此广泛应用于各种原因引起的骨关节缺损修复与重建治疗。欧美国家，每年大约使用100万件，我国同种骨移植的临床应用从上个世纪五十年代开始，近10年才建立正规的骨组织组织库，每年大约使用2万件。
目前骨组织库提供的产品，包括新鲜冷冻骨、冷冻干燥骨和脱钙骨。制备过程取材、修整、脱脂/脱钙、灭菌、冷冻和深低温保存，其制备方法为直接冷冻和钴源辐射灭菌，经处理后的骨组织失去其生物活性，同时钴源辐射后骨的生物力学强度明显降低。依据组织冻伤理论，如果将常温下骨组织直接放入-80℃或更低温的环境下，骨表层和深层降温速率的不一致将导致骨组织细胞内冰晶形成的不一致，出现细胞内冰晶形成(intracellular ice formation，IIF)、细胞的冷休克、细胞外液的玻璃样变以及冻融过程中对细胞的影响是细胞损伤的重要因素。导致制备后同种骨组织的生物诱导活性消失，生物力学强度下降，移植后出现骨折、骨不愈合和关节功能障碍等并发症，严重制约临床应用。在游离细胞的冻存研究中，冷冻生物学家们发现缓慢降温和快速复温有利于细胞的存活，在欧美等国正在进行器官方面包括心脏、肾脏和肝脏等的应用基础研究，在骨组织方面未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具备良好的生物诱导活性和生物力学强度，维持一定数量具有生物活性的软骨细胞，增加移植后同种骨的愈合能力，减少并发症的发生率，改善移植后的关节功能，为临床提供适宜的生物移植材料的具备生物活性同种骨组织的制备及保存方法。
实现本发明目的的技术解决方案为一种具备生物活性同种骨组织的制备及保存方法，其步骤为1、生物活性骨组织的获取在无菌条件下获取同种骨关节组织；2、生物活性骨组织的修整剔除软组织及骨膜，清除骨髓组织，保留部分关节囊、韧带和肌肉的附着点；3、生物活性骨组织的脱脂氯仿甲醇浸泡，生理盐水冲洗后包装；4、梯度降温将预处理后的骨组织放置程序降温仪中，以0.5～2℃/min的速率梯度降温至-40℃～-60℃，历时20-80min；5、保存将降温后的骨组织投入-60～80℃冰箱中保存。
本发明与现有技术相比，其显著优点是经梯度降温、深低温保存的同种骨关节能够保持骨的超微结构的完整性、骨诱导活性、生物力学强度，同时维持一定数量的成活的软骨细胞，能够增加移植后与宿主的愈合能力，减少并发症的发生率，改善移植后的关节功能，为临床提供具备生物活性的同种骨关节。
四说明书附图
附图是本发明的具备生物活性同种骨组织的制备及保存方法的流程示意图。
五
具体实施例方式
下面结合附图对本发明作进一步描述。
实施例1。结合附图，一种具备生物活性同种骨组织的制备及保存方法，其具体的实施过程为在无菌条件下获取同种骨关节组织，剔除软组织及骨膜，清除骨髓组织，保留部分关节囊、韧带和肌肉的附着点，用氯仿甲醇浸泡，生理盐水冲洗后包装，将预处理后的骨组织放置程序降温仪中，以2℃/min的速率梯度降温至-40℃，历时80min，将降温后的骨组织投入-80℃箱中保存。
经本发明制备和保存后一月的同种骨组织的力学数据如下拉伸弹性模量压缩弹性模量拉伸 压缩处理(Gpa) (Gpa)泊松比μ 泊松比μ本发明制备、18.23 13.630.32 0.345保存同种骨Reilly测试17.918.3正常新鲜股骨数据表明以本发明制备、保存的同种骨组织的弹性模量与新鲜骨组织无明显差异，说明经制备、保存后骨组织的生物力学特性与新鲜骨相近。
实施例2。结合附图，一种具备生物活性同种骨组织的制备及保存方法，用于骨肿瘤切除后修复、重建大段骨缺损的保肢治疗。
患者，男性，16岁。右大腿下部疼痛一月，经影像学和病理学检查证实为右股骨下段骨肉瘤，经手术切除完整右股骨下段的肿瘤骨关节，切除长度16公分，切除后遗留的股骨下段缺损，采用本发明方法制备的同种异体股骨下段进行骨骼重建，不仅彻底地切除了肿瘤组织，而且保留了患肢的功能。采用同种异体骨移植是肢体肿瘤保肢治疗的主要方法之一，国外文献统计90％以上的肢体恶性骨肿瘤都获得保肢治疗。
恶性骨肿瘤保肢治疗的重要环节，是如何重建恶性骨肿瘤切除后的大段骨缺损，大段同种骨移植是最常用的方法。其具体的实施过程为在无菌条件下获取同种骨关节组织，剔除软组织及骨膜，清除骨髓组织，保留部分关节囊、韧带和肌肉的附着点，用氯仿甲醇浸泡，生理盐水冲洗后包装，将预处理后的骨组织放置程序降温仪中，以1.0℃/min的速率梯度降温至-50℃，历时50min，将降温后的骨组织投入-100℃冰箱中保存。
采用梯度降温、深低温保存的同种骨组织进行移植手术，在临床上具有良好的愈合能力，通常移植后的四个月在同位素锝99骨扫描片上可观察到移植部位骨浓聚的现象，特别在宿主骨与移植骨的结合部位，表明移植骨的骨代谢活跃，提示与宿主开始骨愈合。在移植后6个月普通X-线平片上可观察新生骨已形成并包绕移植骨。通常在8-10月宿主骨与移植骨的结合部位的间隙消失，表明宿主骨与移植骨已完全愈合，较直接冷冻骨和冷冻干燥骨相比，骨愈合的时间缩短约2-3个月，其中最长的随访时间达36个月，移植骨未发现骨折的现象。目前已在临床实验性已应用60余例，各种并发症的发生率低于25％。
实施例3。结合附图，一种具备生物活性同种骨组织的制备及保存方法，用于骨感染性骨缺损的修复、重建治疗。因骨髓炎引起骨缺损是临床上常见的感染性疾病，自体骨移植是常用的治疗方法，一方面给患者带来新的痛苦，另一方面自体骨往往满足不了缺损的需要，应用同种骨组织移植是新的治疗方法。其具体的实施过程为在无菌条件下获取同种骨关节组织，剔除软组织及骨膜，清除骨髓组织，保留部分关节囊、韧带和肌肉的附着点，用氯仿甲醇浸泡，生理盐水冲洗后包装，将预处理后的骨组织放置程序降温仪中，以1.5℃/min的速率梯度降温至-40℃，历时60min，将降温后的骨组织投入-90℃冰箱中保存。
采用梯度降温、深低温保存的同种骨组织进行感染性骨缺损的修复手术，在临床上能够修复因感染引起的骨缺损，恢复骨的连续性，同时能够有效的控制感染，使骨髓炎得到康复。目前已在临床实验性已应用20余例，临床有效率达96％。为临床治疗骨髓炎提供一种可靠、经济的修复手段。
外伤性骨缺损、骨肿瘤性和感染性骨缺损是临床常见的疾病，通常需要骨移植进行修复和重建。欧美国家应用广泛，每年大约使用100万件，而国内有记录的每年大约只有2万件。我国的人口基数大，同时处于发展中国家，骨的创伤、感染和肿瘤等疾病的发病率高，具有普遍的应用基础。本发明获得的同种骨组织的制备方法，所获得的同种骨移植材料，能够保持骨的超微结构的完整性、骨诱导活性、生物力学强度。能够加速移植后与宿主的愈合能力，减少并发症的发生率，改善移植后的关节功能，为临床提供具备生物活性的同种骨组织，具有广泛的应用前景，能够产生极大的经济和社会效益。
权利要求
1.一种具备生物活性同种骨组织的制备及保存方法，其特征在于其步骤为1.1生物活性骨组织的获取在无菌条件下获取同种骨关节组织；1.2生物活性骨组织的修整剔除软组织及骨膜，清除骨髓组织，保留部分关节囊、韧带和肌肉的附着点；1.3生物活性骨组织的脱脂氯仿甲醇浸泡，生理盐水冲洗后包装；1.4梯度降温 将预处理后的骨组织放置程序降温仪中，以0.5～2℃/min的速率梯度降温至-40℃～-60℃，历时20-80min；1.5保存将降温后的骨组织投入-80℃～180℃冰箱中保存。
2.根据权利要求1所描述的具备生物活性同种骨组织的制备及保存方法，其特征在于将预处理后的骨组织放置程序降温仪中，以1～2℃/min的速率梯度降温至-40℃～-50℃，历时20-80min，将降温后的骨组织投入-70～80℃冰箱中保存。
3.根据权利要求1所描述的具备生物活性同种骨组织的制备及保存方法，其特征在于将预处理后的骨组织放置程序降温仪中，以2℃/min的速率梯度降温至-40℃，历时80min，将降温后的骨组织投入-80℃～180℃冰箱中保存。
全文摘要
本发明涉及一种具备生物活性同种骨组织的制备及保存方法，其步骤为1.生物活性骨组织的获取在无菌条件下获取同种骨关节组织；2.生物活性骨组织的修整剔除软组织及骨膜，清除骨髓组织，保留部分关节囊、韧带和肌肉的附着点；3.生物活性骨组织的脱脂氯仿甲醇浸泡，生理盐水冲洗后包装；4.梯度降温将预处理后的骨组织放置程序降温仪中，以0.5～2℃/min的速率梯度降温至－40℃～－60℃，历时20－80min；5.保存将降温后的骨组织投入－60～80℃冰箱中保存。本发明能够保持骨的超微结构的完整性、骨诱导活性、生物力学强度，同时维持一定数量的成活的软骨细胞，能够增加移植后与宿主的愈合能力，减少并发症的发生率，改善移植后的关节功能。
文档编号A61L27/00GK1528469SQ20031010603
公开日2004年9月15日 申请日期2003年10月9日 优先权日2003年10月9日
发明者施鑫, 吴苏稼, 赵建宁, 周光新, 陆盟, 施 鑫 申请人:中国人民解放军南京军区南京总医院