专利名称：2α，23－二羟基乌苏酸的医药新用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药领域，公开了2α，23-二羟基乌苏酸的医药新用途，即用于肝细胞保护、防治肝脏疾病的医药新用途。
背景技术：
2α，23-二羟基乌苏酸，全称2α，3β，23-三羟基乌苏烷型-28-酸，俗称2，23-二羟基乌苏酸，英文名为2α，3β，23-trihydroxyurs-12-en-28-oic acid(简称DHUA)，结构式如下，是一种存在于榄仁及Centella asiatica、Rhocloclenclron japonicum等植物中的有效成分。未见报道用于治疗疾病，更未见有肝细胞保护作用的报道，也没有在临床上应用。
R1R2ursolic acid(UA)(乌苏酸) HCH32α，3β，23-trihydroxyurs-12-en-28-oic acid(DHUA)(2α，23-二羟基乌苏酸) OH CH2OH发明内容本课题组发现了2α，23-二羟基乌苏酸(DHUA)的医药新用途，特别是其可以用于保护肝细胞的用途-预防和/或治疗肝病，所述肝病可以是肝损伤、肝炎、肝硬化或肝癌等；本课题组经过对DHUA进行的药理学研究中发现其具有保护肝细胞的作用，并且作用效果优于结构相似、已广泛应用于临床的齐墩果酸，可用于治疗肝损伤、肝炎、肝硬化或肝癌等肝脏疾病。
在细胞凋亡和细胞损伤的过程中，通常认为线粒体是一个决定性的细胞器，在细胞死亡中起关键作用，线粒体功能障碍已成为肝损伤的一个重要机制。一般地，在体外试验中，对肝脏线粒体肿胀的抑制率是评价治疗肝病的侯选药物的一个重要指标，同时超氧阴离子清除率和羟自由基清除率也是检测侯选药物对肝细胞保护作用的常用参数。
药理实验表明，DHUA能有效抑制肝脏线粒体肿胀、具有清除超氧阴离子、羟自由基的能力，并且作用比同类的齐墩果酸强，因此DHUA具有肝细胞保护作用，可用于预防和/或治疗肝损伤、肝炎、肝硬化或肝癌等肝脏疾病。
可用如下方法制备DHUA将1.1kg干燥榄仁叶剪碎，加乙醇回流提取1-3次，每次1小时。蒸发浓缩后加水稀释，依次用石油醚、氯仿萃取得32.0克氯仿提取物(TCCE)。TCCE用石油醚-乙酸乙酯经硅胶柱(100-200目)进一步分离得到不同部分。其中一部分先后用石油醚-乙酸乙酯(1∶4-0∶100)和乙酸乙酯-乙醇(6∶4-1∶4)进行硅胶柱层析(200-300目)，所得组分(1∶4洗脱物)用乙酸乙酯重结晶得70mg 2，23-二羟基乌苏酸(DHUA)。
用于临床治疗时可将DHUA与药学上可接受的载体混合制成不同的剂型。药学上可接受的载体是指一种或几种惰性的、非毒性的固体或液体填充物、稀释剂、助剂等，它们不逆向与活性化合物或病人发生作用。所说不同剂型可以是片剂、胶囊、丸剂、栓剂、软胶囊、口服液、混悬剂、注射液等药剂学上常用的剂型。
口服用药片和胶囊含有传统的赋形剂如填充物、稀释剂、润滑剂、分散剂以及粘合剂。可按照本领域中熟知的方法进行制备。
以上活性剂的剂量将因配方而异。一般地，临床上用于肝细胞保护的用量为10-100mg·kg-1，根据不同病情及剂型也可超过该剂量范围。
附图是2α，23-二羟基乌苏酸、空白对照组、阳性对照组对Ca2+诱发的线粒体肿胀的影响。(DHUAL，DHUAM及DHUAH分别代表50，150及500μM DHUA，n＝6)以下通过实施例对本发明作进一步描述。
具体实施例方式
实施例1线粒体肿胀度的测定线粒体的制备及线粒体肿胀度的测定。据Appril法，将肝脏在预冷的分离液(包括0.225mol·L-1甘露醇，0.075mol·L-1蔗糖，0.05mmol·L-1EDTA，10mmol·L-1Tris-HCl，pH7.4)中剪碎，洗净，匀浆，500×g离心5分钟，取上清液，8800×g离心10分钟，弃上清液，沉淀即为线粒体，用分离液洗3次，最终重悬于分离液中。考马氏亮蓝法测定蛋白浓度。
线粒体按1mg蛋白/mL重悬于测定液(125mmol·L-1蔗糖，50mmol·L-1KCl，2mmol·L-1KH2PO4，5mmol·L-1琥珀酸，50μmol·L-1CaCl2，5μmol·L-1鱼藤酮，10mmol·L-1Hepes，pH7.4)中。正常小鼠肝脏线粒体分6组，对照组不作处理，其余加或不加2α，23-二羟基乌苏酸(DHUA)及500μmol·L-1齐墩果酸(OA)孵育5min后加Ca2+诱发的线粒体肿胀，以5μmol·L-1环孢素(CsA)作阳性对照。30℃条件下0-5min测定线粒体悬液540nm处吸收值，以吸光度降低值作为线粒体肿胀的指标。肿胀抑制率计算公式(ΔAcontrol-ΔAdrug)/ΔAcontrol×100％，ΔA＝A-A0min。
结果见图1，可知2α，23-二羟基乌苏酸具对抗Ca2+诱发的肝线粒体肿胀的作用，并且其效果优于同类的齐墩果酸。
实施例2超氧阴离子清除率的测定利用黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶氧自由基发生系统检测2，23-羟基乌苏酸对超氧阴离子的清除作用。在3mL 10mmol·L-1KH2PO4-KOH缓冲液(pH7.4)中加入50μmol·L-1、150μmol·L-1、500μmol·L-12α，23-二羟基乌苏酸，100μmol·L-1黄嘌呤及0.02U/mL黄嘌呤氧化酶，加入四唑氮蓝(nitroblue tetrazolium，NBT)100μmol·L-1，于25℃条件下孵育5min，于550nm处测定吸光值。以500μmol·L-1齐墩果酸作阳性对照。超氧阴离子清除率计算公式如下(ΔAcontrol-ΔAdrug)/ΔAcontrol×100％，ΔA＝A0min-A5min。
表1 2，23-二羟基乌苏酸对黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶系统产生的超氧阴离子的清除作用。
组别 吸光值的减少(ΔA) 清除率对照 242.00±16.86齐墩果酸 500μmol·L-1147.00±18.93139.3％DHUA 50μmol·L-1172.14±21.89128.9％DHUA 150μmol·L-1127.86±18.56147.2％DHUA 500μmol·L-1107.29±10.951，256.7％n＝7.X±SD.1P＜0.01vs对照，2P＜0.01vs齐墩果酸。
表1结果表明，2α，23-二羟基乌苏酸具清除超氧阴离子的能力，且此清除能力超过相同剂量的齐墩果酸。
实施例3羟自由基清除率的测定利用CuSO4/细胞色素C自由基发生系统检测DHUA对羟自由基的清除作用。在3mL 0.15mmol·L-1磷酸缓冲液(含100μmol·L-1VitC、100μmol·L-1CuSO4及100μmol·L-1细胞色素C，pH7.4)中加入50μmol·L-1、150μmol·L-1、500μmol·L-1乌苏酸或DHUA，反应体系于25℃中孵育90分钟，于550nm处测定吸光值，以500μmol·L-1齐墩果酸作阳性对照。羟自由基清除率计算公式同上，其中，ΔA＝A0min-A90min。
表2 2，23-二羟基乌苏酸对vitamin C/CuSO4系统产生的羟自由基的清除作用。
组别 吸光值的减少(ΔA) 清除率对照 442.83±23.42齐墩果酸 500μmol·L-1241.33±27.2145.6％DHUA 50μmol·L-1404.83±31.7518.6％DHUA 150μmol·L-1219.33±18.46150.5％DHUA 500μmol·L-1160.50±30.351，263.8％n＝6.X±SD1P＜0.01vs对照，2P＜0.01vs齐墩果酸。
n＝6. X±SD.1P＜0.01vs对照，2P＜0.01vs齐墩果酸。
表2结果表明，2α，23-二羟基乌苏酸具清除羟自由基的能力，且清除能力与剂量相关。其清除能力强于相同剂量的齐墩果酸。
权利要求
1.2α，23-二羟基乌苏酸在用于制备肝细胞保护药物中的用途。
2.权利要求1所述的用途，其中肝细胞保护是指预防和/或治疗肝损伤、肝炎、肝硬化或肝癌。
全文摘要
本发明涉及天然药物领域，公开了2α，23－二羟基乌苏酸的医药用途，即用于肝细胞保护的用途，可用于治疗和/或预防肝损伤、肝炎、肝癌和肝硬化等肝脏疾病。
文档编号A61P1/16GK1543962SQ200310106318
公开日2004年11月10日 申请日期2003年11月18日 优先权日2003年11月18日
发明者汤新慧, 高静, 赵晓宁, 范怡梅, 徐力致, 王勇, 杨晓荷, 窦环, 王燕萍, 朱俐 申请人:南京大学