专利名称：玉足海参多糖在制备抗凝血药及血管生成抑制剂中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及中药提取物的用途，尤其是涉及一种从玉足海参(Hojothurialeucospilota)中提取的多糖YC在制药领域中的应用。
背景技术：
玉足海参(Hojothuria leucospilota)，又称乌参。系广东省、海南岛一带的民间药。由玉足海参中提取的总多糖中分离纯化得到的一种硫酸粘多糖(以下简称多糖YC)，其主要功能为滋阴养血，温经通络，补肾益精。对从玉足海参中提取的多糖(YC)在抗凝血、改善血液流变学及抑制血管生成方面的研究目前尚未见报道，临床上也未见玉足海参多糖(YC)进行抗凝血，改善血液流变学及抗血管生成的应用。
发明内容
1.发明目的本发明的目的在于提供玉足海参多糖YC的新用途，即在制药领域中的新应用。
2.技术方案本发明涉及玉足海参多糖YC在制备抗凝血药中的应用。
还涉及玉足海参多糖YC在制备血管生成抑制剂的药中的应用。
为了更好地理解本发明的实质，下面将玉足海参多糖YC的药理试验及实验结果来说明其在制药领域中的新用途。
以下是玉足海参多糖YC抗凝作用及抗血管生成作用的研究，实验方法及结果如下(1)取健康ICR小鼠按不同剂量(41.6mg/kg、10.4mg/kg、5.2mg/kg、2.6mg/kg、1.3mg/kg)尾静脉注射玉足海参多糖YC，给药30分钟后眼眶取血，用玻片法和毛细管法同时测量其凝血时间，以41.6mg/kg剂量尾静脉注射受试小鼠，其凝血时间均大于10分钟，与对照组相比，均有显著性差异(P＜0.01)。
(2)按不同剂量给家兔连续灌胃玉足海参多糖YC10天。于第10天给药1h后，取动脉血，抗凝，分离血浆，测定白陶土部分凝血活酶时间(APTT)。有效剂量范围为25～100mg/kg，结果表明，玉足海参多糖可以延长家兔白陶土部分凝血活酶时间，与对照组相比，有显著性差异(P＜0.01)。
(3)按不同剂量给家兔连续灌胃玉足海参多糖YC10天。于第10天给药1h后，取动脉血，抗凝，分离血浆，测定凝血酶原时间(PT)。有效剂量范围为25～100mg/kg，结果表明，玉足海参多糖可以延长家兔凝血酶原时间，与对照组相比，有显著性差异(P＜0.01)。
(4)按不同剂量给家兔连续灌胃玉足海参多糖YC10天。于第10天给药1h后，取动脉血，抗凝，分离血浆，测定血浆复钙时间。有效剂量范围为25～100mg/kg，结果表明，玉足海参多糖可以延长家兔血浆复钙时间，与对照组相比，有显著性差异(P＜0.01)。
(5)按不同剂量给家兔连续灌胃玉足海参多糖YC10天。于第10天给药1h后，取动脉血，抗凝，分离血浆，测定ADP和AA诱导的血小板聚集率。有效剂量范围为25～100mg/kg，结果表明，多糖YC终浓度为41.48和20.74mg/kg两个剂量均有抑制ADP诱导的体外血小板聚集的作用，与正常组比较有显著性差异。当用大剂量时(154mg/kg)，对AA诱导的血小板聚集率有一定的抑制作用。
(6)按不同剂量给家兔连续灌胃玉足海参多糖YC10天。于第10天给药1h后，取动脉血，用血栓仪测定5分钟内体外血栓形成度。有效剂量范围为25～100mg/kg，结果表明，多糖YC可以降低家兔体外形成血栓长度(P＜0.05)，减轻血栓湿重(P＜0.01)和干重(P＜0.01)。
(7)采用体外三位立体血管生成模型，向培养体系中加入不同浓度的玉足海参多糖YC，观察玉足海参多糖YC对血管生成的作用。有效剂量范围为1.7～166.7μg/ml。结果表明，玉足海参多糖YC能显著抑制芽生高峰期时的芽生内皮细胞数，各给药组管腔结构较正常组显著减少，表明多糖YC有明显的抗血管生成作用。
(8)采用[3H]掺入法测定玉足海参多糖YC对体外培养的内皮细胞的增殖有何作用。有效剂量范围为10～500μg/ml。结果表明，各给药组能显著抑制人脐静脉内皮细胞的DNA、RNA和蛋白质的合成，对内皮细胞增殖呈显著的抑制作用。
3.有益效果(1)玉足海参多糖YC具有明显的抗凝血作用。玉足海参多糖YC能显著性延长APTT、PT、血浆复钙时间、对血小板聚集也有一定抑制作用，能显著性减少体外血栓的形成。其抗凝血作用呈良好的量效关系，且作用与肝素相似，表明玉足海参多糖YC可用于抗凝血。
(2)玉足海参多糖YC有抑制血管生成的作用。许多疾病与血管生成异常关系非常密切，如肿瘤生长与血管生成密切相关，Folkman等认为肿瘤一旦出现，其体积增加之前必然伴随会聚于该肿瘤的新生血管的增加；患有视网膜病变的糖尿病病人视网膜上的血管是增生的。此外，诸如关节炎、牛皮癣等疾病也与血管生成过度相关。实验结果显示，大鼠主动脉环在玉足海参多糖YC的作用下，血管生成明显被抑制(P＜0.05，P＜0.01)。进一步的研究表明，玉足海参多糖YC还能够显著性抑制体外培养的内皮细胞的增殖。实验结果显示，玉足海参多糖YC可以通过抑制内皮细胞增殖来抑制血管生成。
具体实施例方式
本发明的有益效果可以通过以下实施例作进一步说明实施例1.玉足海参多糖YC抗凝作用研究。
(一)玉足海参多糖YC对小鼠凝血时间的影响。
1.实验材料动物ICR小鼠，由南京中医药大学实验动物中心提供。
试剂生理盐水、玉足海参多糖YC2.实验方法与结果取健康ICR小鼠55只，随机分成6组，除最大剂量组为5只外其余每组各10只。玉足海参多糖YC组尾静脉注射(41.6mg/kg、10.4mg/kg、5.2mg/kg、2.6mg/kg、1.3mg/kg)给予YC、正常组尾静脉注射等体积生理盐水。每只受试小鼠用玻片法及毛细管法测凝血时间，给药组与正常组比较，并根据所得数据画出量效关系图。
玉足海参多糖YC以41.6mg/kg剂量尾静脉注射，5只受试小鼠用玻片法及毛细管法所测凝血时间均＞10分钟(其中一只死亡)，除了最小剂量1.3mg/kg外，其余各组玻片法和毛细管法所测凝血时间与对照组相比，均有显著性差异(P＜0.01)。见表1和
图1。
表1玉足海参多糖YC对小鼠凝血时间的影响(X±SD，n＝10)组别 剂量 毛细管法(秒) 玻片法(秒)生理盐水组10ml/kg 107±76.8 125.2±71.5玉足海参多糖YC41.6mg/kg600±0**600±0**10.4mg/kg446.8±247.6**389.1±242.1**5.2mg/kg 422.4±190.2**420.8±199.5**2.6mg/kg 331.3±174.8**358±194.9**1.3mg/kg 113.1±59.6 172.9±140.7注与对照组相比，**P＜0.01。玉足海参多糖YC41.6mg/kg剂量组的小鼠数n＝5。
(二)玉足海参多糖对家兔白陶土部分凝血活酶时间的影响(APTT)1.实验材料动物青紫兰家兔，由南京中医药大学实验动物中心提供。
试剂生理盐水、玉足海参多糖YC、阿斯匹灵、白陶土2.实验方法与结果取家兔24只，随机分为4组，按5ml/kg连续灌胃10天。于第10天给药1h后，颈动脉放血。以1.34％草酸钠按9∶1抗凝采血，混匀后3000rpm离心10min，分离血浆备用。取试管5只，每管中加入充分混匀的白陶土部分凝血活酶和血浆各0.1ml摇匀，37℃水浴中孵育3min，其间轻轻振摇试管，再加入已加温到37℃的0.025mol/L氯化钙溶液0.1ml，同时开始计时，每隔15s取出试管轻轻倾斜，直到自陶土颗粒聚集变粗，凝固成块为止。
表2.玉足海参多糖对家兔白陶土部分凝血活酶时间的影响(X±SD，n＝6)组别给药途径剂量(mg/kg×d) 白陶土部分凝血活酶时间(S)对照组 ig 等体积蒸馏水23.08±7.86YC组ig 100×10 37.25±5.91**YC组ig 25×10 42.00±6.96**阿司匹林组 ig 82×10 35.17±3.95**与对照组比较**P＜0.01结果表明，玉足海参多糖可以延长家兔白陶土部分凝血活酶时间(P＜0.01)。
(三)玉足海参多糖对家兔凝血酶原时间的影响(PT)1.实验材料动物青紫兰家兔，由南京中医药大学实验动物中心提供。
试剂生理盐水、玉足海参多糖、阿斯匹灵、氯化钙2.实验方法与结果取家兔24只，分组及给药同前。于第10天给药1h后颈动脉放血，以3.8％枸椽酸钠按9∶1抗凝采血，混匀后3000rpm离心10min，分离血浆备用。取试管3支，先加入凝血活酶和0.025mol/L氯化钙各0.1ml，再加入血浆0.1ml，混匀后立即放入37℃水浴中温育，同时开始计时，每隔2～3s倾斜试管1次，记录纤维蛋白凝固液面不动所需时间。
表3.玉足海参多糖对家兔凝血酶原时间的影响(X±SD，n＝6)组别给药途径剂量(mg/kg×d) 凝血酶原时间(s)对照组 ig 等体积蒸馏水 13.88±0.96YC组ig 100×1029.90±3.82**YC组ig 25×10 25.40±7.00**阿司匹林组 ig 82×10 21.93±1.78**与对照组比较**P＜0.01结果表明，玉足海参多糖可以延长家兔凝血酶原时间(P＜0.01)。
(四)玉足海参多糖YC对家兔复钙时间的影响1.实验材料动物青紫兰家兔，由南京中医药大学实验动物中心提供。
试剂生理盐水、玉足海参多糖YC、阿斯匹灵2.实验方法与结果取家兔24只，分组及给药同前。于第10天给药1h后颈动脉放血，以3.8％枸椽酸钠按9∶1抗凝采血，混匀后3000rpm离心10min，分离血浆备用。取试管3支，每管各先加入血浆0.1ml，随即放入37℃水浴中温育1分钟，然后加入0.025mol/L氯化钙各0.1ml，混匀后再次放入37℃水浴中温育，同时开始计时，每隔2～3s倾斜试管1次，记录纤维蛋白凝固液面不动所需时间。
表4.玉足海参多糖对家兔复钙时间的影响(X±SD，n＝10)组别给药途径剂量(mg/kg×d) 时间(s)对照组 ig 等体积生理盐水 23.83±5.53YC组ig 100×10 47.67±7.93**YC组ig 25×10 46.00±8.15**阿司匹林组 ig 82×10 43.50±3.89**与对照组比较**P＜0.01结果显示，玉足海参多糖YC多糖可以显著延长家兔复钙时间(P＜0.01)。
(五)玉足海参多糖YC对ADP和AA诱导的家兔血小板聚集的影响1.实验材料动物青紫兰家兔，由南京中医药大学实验动物中心提供。
试剂生理盐水、玉足海参多糖YC、阿斯匹灵、ADP、AA2.实验方法与结果青紫兰家兔用普鲁卡因颈部局部麻醉，颈动脉插管放血，3.8％的枸橼酸钠1∶9抗凝，以800r/min离心10min，取富血小板血浆(PRP)，剩余部分以3000r/min离心10min，取贫血小板血浆(PPP)，聚集诱导剂用ADP(浓度40nmol/L)和AA(浓度2mg/ml)，每管PRP中加入不同药物10μl，对照的PRP中加入缓冲液10μl，相对的PPP管中则加入相应的药物，37℃温育5分钟，然后按文献方法用PAPER-I型血小板聚集及血凝测定仪检测血小板聚集率。
(1)ADP诱导的血小板聚集率的影响结果玉足海参多糖YC终浓度为41.48和20.74μg/ml两个剂量均有抑制ADP诱导的体外血小板聚集的作用，与正常组比较差异有高度显著性，二个阳性对照药也有抑制血小板聚集的作用，其中又以脉络宁为最强(见表5)。
表5玉足海参多糖YC对ADP诱导的家兔体外血小板聚集率的影响(X±SD)组别 终浓度例1min聚集率 最大聚集率 5min聚集率 抑制率(μg/ml) 数(％) (％) (％) (％)正常 等容积1229.33±2.9338.51±3.98 32.63±7.86脉络宁100％ 6 3.67±1.51②5.72±1.79②0.33±0.82②85.15肝素钠18.52 6 19.50±2.88②22.17±2.56②16.67±4.27②42.43玉足多糖 41.48 6 19.33±1.97②③23.17±2.62②③20.33±2.58②③39.8320.74 6 21.67±0.52②③25.90±2.63②③18.33±2.88②③32.7512.96 6 30.00±4.60 34.97±4.14 29.17±4.75 9.19注与正常组比较①P＜0.05，②P＜0.01；与12.96μg/ml剂量组比较③P＜0.01(下同)。
(2)AA诱导的家兔体外血小板聚集率的影响结果提示玉足海参多糖YC在终浓度为41.48μg/ml和低分子肝素钠在18.52μg/ml时对AA诱导的体外血小板聚集均未见明显的抑制作用，在加大剂量后玉足海参多糖YC(154.1μg/ml)和低分子肝素钠(148.1μg/ml)才表现出微弱的抑制作用。脉络宁注射液则对AA诱导的体外血小板聚集有明显的抑制作用(见表6)。
表6玉足海参多糖YC对AA诱导的家兔体外血小板聚集率的影响(X±SD)组别终浓度例 1min聚集率 最大聚集率 5min聚集率抑制率(μg/ml) 数 (％) (％) (％) (％)正常等容积832.88±3.8351.59±2.64 51.59±2.64脉络宁 25％ 59.80±2.78②18.94±8.24②15.20±9.73②63.29肝素钠 148.1 631.00±1.1648.05±4.10①48.05±4.10①6.8618.52 525.20±5.59①50.00±3.3550.00±3.35 3.08YC组154.1 628.75±3.9545.70±5.08①45.70±5.08①11.4241.8 527.20±3.90①50.02±2.9550.02±2.95 3.04实验结果提示玉足海参多糖YC对弱诱导剂ADP诱导的体外血小板聚集有一定的抑制作用，而对强诱导剂AA诱导的血小板聚集抑制作用不明显，说明本品抑制血小板聚集的作用较弱。
(六)玉足海参多糖YC多糖对家兔体外血栓形成的影响1.实验材料动物青紫兰家兔，由南京中医药大学实验动物中心提供。
试剂生理盐水、玉足海参多糖YC、阿斯匹灵2.实验方法与结果青紫兰家兔用普鲁卡因颈部局部麻醉，颈动脉插管放血，3.8％的枸橼酸钠1∶9抗凝，以800r/min离心10min，取富血小板血浆(PRP)，剩余部分以3000r/min离心10min，取贫血小板血浆(PPP)，聚集诱导剂用ADP(浓度40nmol/L)和AA(浓度2mg/ml)，每管PRP中加入不同药物10μl，对照的PRP中加入缓冲液10μl，相对的PPP管中则加入相应的药物，37℃温育5分钟，然后按文献方法用PAPER-I型血小板聚集及血凝测定仪检测血小板聚集率。
表7.玉足海参多糖YC对家兔体外血栓形成的影响(X±SD，n＝6)组别剂量(mg/kg×d) 长度(cm) 湿重(g)干重(mg)对照组 等体积生理盐水 11.58±3.44 0.4597±0.082 122.33±48.45YC组100×10 6.23±2.61*0.1663±0.078**26.62±22.69**YC组25×10 7.03±3.13**0.1998±0.0086***19.45±18.31**阿司匹林组 82×10 3.47±2.09**0.1093±0.0082***18.98±21.69***与对照组比较*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001结果表明，玉足海参多糖YC可以降低家兔体外形成的血栓长度(P＜0.05)，减轻血栓湿重(P＜0.01)和干重(P＜0.01)。
实施例2.玉足海参多糖YC抗血管生成作用研究方法及剂量如下1.实验材料动物雄性SD大鼠，由南京中医药大学实验动物中心提供试剂M199培养基、碱性成纤维母细胞生长因子(bFGF)、Fibrinogen、乌拉坦、玉足海参多糖YC器械手术器械、高压灭菌锅、培养皿、48空培养板、超净工作台、恒温细胞培养箱、倒置显微镜2.实验方法及结果取8～12周龄的SD雄性大鼠2只，乌拉坦麻醉后打开胸腔，剪取胸主动脉。在预冷的PBS液中分离除去血管外组织并洗去管内淤血，将动脉条剪成1mm后的动脉环备用。吸取400μl用M199配制的Fibrinogen，加2μl 25U/ml的thrombin混匀后立即加入到48孔板内，放入血管环。待胶凝固后加入600μ1的无血清M199培养基。给药组培养基由550μl无血清M199培养基加50μl药液组成；联合给药组则由500μl无血清M199培养基加50μl A药及50μl B药组成。隔天换液并计数芽生细胞数及管腔结构数，作统计学处理。
结果显示，玉足海参多糖YC能够显著性抑制芽生高峰期(7day)时的芽生内皮细胞数。各给药组管腔结构较正常组显著减少，见表8和表9。表明玉足海参多糖YC有明显的抗血管生成作用。
表8玉足海参多糖YC对芽生内皮细胞数的影响组别 剂量 3day 5day 7day正常组等量培养基 1.52±1.152.72±1.61 2.82±1.84bFGF组41.7ng/ml 2.01±1.443.61±2.03*3.64±1.37*YC大剂量组166.7μg/ml1.34±1.042.36±1.66 2.23±1.26YC中剂量组16.7μg/ml 1.22±0.682.63±1.43 1.90±0.91**YC小剂量组1.7μg/ml 1.23±0.872.58±1.85 1.77±1.12**与对照组比较*p＜0.05 **P＜0.01表9玉足海参多糖YC对管腔结构数的影响组别剂量 7day 9day 11day 13day 15day正常组 等量培养基 1.12±0.72 1.42±0.82 1.44±0.75 1.27±0.721.13±0.54bFGF组 41.7ng/ml1.24±0.62 1.47±0.79 1.46±0.68 1.61±0.80*1.32±0.67YC大剂量组 166.7μg/ml 0.84±0.42*0.85±0.34***0.89±0.36***0.88±0.33**0.82±0.25**YC中剂量组 16.7μg/ml 0.82±0.32*0.86±0.40***0.87±0.37***0.85±0.31**0.80±0.32**YC小剂量组 1.7μg/ml0.84±0.35*1.03±0.45*0.93±0.44**0.97±0.480.96±0.48与对照组比较*p＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.01实施例3.玉足海参多糖YC抑制体外培养的内皮细胞的增殖作用的研究。
1.实验材料细胞株HUVEC(人脐静脉内皮细胞)试剂1640培养基、碱性成纤维母细胞生长因子(bFGF)、[3H]-TdR、[3H]-UdR、[3H]-Leu、玉足海参多糖YC器械计数器、烘箱、96孔细胞培养板、倒置显微镜2.实验方法及结果取对数生长期的HUVEC细胞，消化计数，配成4×104个/毫升的细胞悬液，以0.2ml/孔接种于96孔板，置37℃、5％CO2培养箱中培养12小时。弃上清，换含不同药物浓度的培养液继续培养24小时。在终止作用前6小时加放射性同位素0.5μGi/孔，6小时后弃去培养液，每孔加0.1ml消化液，于37℃消化30分钟。用多头细胞样品收集器将每孔细胞分别收集于醋酸纤维滤膜上，蒸馏水冲洗20次。取下此膜，置80℃烘箱中干烤15分钟。置闪烁杯中，加闪烁剂4ml。暗处放置15分钟后测cpm值，计算药物对内皮细胞增殖的影响。
结果发现，各给药组能显著性抑制HUVEC的DNA、RNA及蛋白质的合成，对内皮细胞增殖呈显著的抑制作用，见表10。
表10玉足海参多糖YC多糖对内皮细胞增殖的影响(X±SD，n＝4)组别 剂量 DNA RNA 蛋白质正常组等量培养基781.9±192.28675.3±82.89 4249.4±468.5725ng/ml 915.0±358.84992.2±31.36***4572.7±369.87bFGF组50ng/ml 1280.9±325.07*1080.0±71.90***5195.6±214.81*100ng/ml 1121.9±178.12*978.4±61.39**5143.9±308.16*1μg/ml 748.8±213.20748.6±74.87 3546.3±778.67YC组 10μg/ml 477.6±57.62*710.0±55.54 3207.0±236.83**100μg/ml 393.9±126.69*466.9±84.81*3404.4±234.47*500μg/ml 371.7±73.01**420.3±56.20**2963.7±169.16**与对照组比较*p＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.00权利要求
1.玉足海参多糖YC在制备抗凝血的药中的应用。
2.玉足海参多糖YC在制备用于血管生成抑制剂的药中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种从玉足海参(Hojothurialeucospilota)中提取的总多糖中分离纯化得到的一种硫酸粘多糖(YC)在制药领域中的新用途。该多糖具有明显的抗凝血、抑制血小板聚集、抗血栓作用，表现为玉足海参硫酸粘多糖对小鼠凝血时间影响的量效关系明显；能显著性延长家兔白陶土部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)、家兔复钙时间；能显著性抑制ADP诱导的家兔体外血小板聚集，显著减少家兔体外血栓的形成，改善血液流度学，同时还具有显著性抑制血管的芽生及血管网络的形成、抑制内皮细胞增殖的作用，从而抑制体外血管的生成。可用于抗凝血，血液流变异常及血管生成增多密切相关疾病的防治。
文档编号A61P7/00GK1554360SQ20031011271
公开日2004年12月15日 申请日期2003年12月22日 优先权日2003年12月22日
发明者陆茵, 王爱云, 陈文星, 孟政杰, 赵万洲, 陆 茵 申请人:南京中医药大学