细菌毒力基因的制作方法

专利名称：细菌毒力基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及参与胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacilluspleuropneumoniae)的毒力之基因的鉴定，胸膜肺炎放线杆菌减毒突变株的生产，以及靶向所鉴定的基因和它们产物的抗菌剂的鉴定。
胸膜肺炎放线杆菌是猪胸膜肺炎，一种接触传染性很高的猪呼吸疾病的病原体。该病常常是致命的，结果在猪生产工业中导致严重的经济损失。作为一种猪呼吸道的专性寄生虫，近年来胸膜肺炎放线杆菌感染的发生率在增加，尤其是在进行集中饲养条件下的动物。细菌的传播是通过气雾，或者通过与感染猪直接接触。
胸膜肺炎可在所有年龄的猪中发生，现在还不清楚与诱发疾病的病毒或细菌感染的联系。胸膜肺炎放线杆菌可以是慢性的或者是急性的，疾病的特点是逐渐严重的肺窘迫，其迅速进展到死亡，或者发展成为慢性感染导致衰竭以至于不能健康生长。典型地观察到出血、坏死性支气管肺炎，伴随纤维蛋白性胸膜炎。
基于它们荚膜多糖中抗原性差异以及它们的胞外毒素产物，已经鉴定了15种不同的胸膜肺炎放线杆菌血清型。血清型1、5和7是美国胸膜肺炎放线杆菌感染的最普通的类型，而血清型1、2、5、7和9在欧洲占优势。
感染胸膜肺炎放线杆菌的猪的治疗通常包括直接注射抗生素(典型地是四环素)。然而这种方法费时费力，而且昂贵，并且由于疾病的迅速进展可能常常使用受限。然而，来自田间和实验研究的证据已经显示胸膜肺炎放线杆菌的感染可提供抵抗随后再次感染的终生保护，因此提示接种疫苗可能是替代抗生素治疗的可行方法。有效疫苗的开发迄今为止一直被15种不同血清型的抗原多样性阻碍。
在生产疫苗组合物的尝试中，发现杀死的、整个细胞细菌仅提供血清型特异性保护，但是已经显示高毒力血清型的自然感染可刺激抗多种血清型的强烈的保护性交叉免疫[Nielsen，Nord Vet Med.31407-13(1979)；Nielsen，Nord Vet Med.36221-234(1984)；Nielsen，Can J VetRes.29580-582(1988)；Nielsen，ACTA Vet Scand.1580-89(1994)]。某些未明确的活的减毒突变体也已经显示有希望用于猪的交叉保护[Inzana等，Infect Immun.611682-6(1993)；Paltineanu等，InInternational Pig Veterinary Society，1992，p.214；Utrera等，InInternational Pig Veterinary Society，1992，p.213]，但是由于与包含具有这种不明确的、自发突变的细菌株的疫苗相关的不确定性，本领域中需要合理构建活的减毒株，其将安全地刺激针对同源物的保护性免疫，优选异源胸膜肺炎放线杆菌血清型。也需要鉴定参与胸膜肺炎放线杆菌的毒力的基因，以便于发展用于鉴定靶向那些基因和/或其产物的抗菌剂的方法。
公开的国际专利申请WO 00/61724(Pharmacia & Upjohn)描述了使用标签标记的诱变(STM)鉴定负责革兰氏阴性细菌毒力的基因。也讨论了含有减毒细菌的疫苗的开发。在Fuller等，MicrobialPathogenesisvol.26；pp.39-51中也描述了该项工作。
在STM技术中，通过转座子整合的方法产生了许多不同的细菌株，其中的每一个在其基因组中都携带随机突变。插入的转座子携带不同的DNA标记标签，以便单个突变体相互之间区分。标签中的每一个都包括可变的中央区，两侧是不变的“臂”，后者允许通过PCR扩增可变的中央部分。在微量滴定皿中收集多个标记的突变株，然后结合起来形成用于动物感染的“接种池”。
在感染后的适当时间，从感染动物中分离细菌，并将细菌结合起来形成“回收池”。将回收池中的标签和接种池中的标签分开扩增、标记、并用作探针检测排列有接种物中突变体的所有不同标签的滤膜。具有减毒的突变株通常是不能从感染动物中回收的那些菌株，即，具有当用接种池的标签探针检测时产生杂交信号，但是当用回收池的标签探针检测时不产生杂交信号的标签的菌株。STM的优点是可在单个动物中针对细菌毒力丧失同时筛选大量插入突变株。在例如WO 96/17951中更全面地描述了STM。
在相当多的研究后，本发明的发明人提供了一种用于鉴定参与胸膜肺炎放线杆菌毒力的基因的改良方法和手段。该方法鉴定出一个“毒力基因”新家族，家族成员中的每一个包含选自SEQ ID NO1-56所定义的那些核苷酸序列中的任何一种的核苷酸序列。如这里所使用的，术语“毒力基因”指这样的细菌基因，其正确的功能涉及，例如，是在宿主动物中建立和/或维持感染所必需的。因此，毒力基因和它们的产物(产物可能是多核苷酸(例如，rRNA)和/或多肽)参与细菌的致病性，但是可能不是其体外生长必需的。
毒力基因中的突变可导致“减毒细菌”，即，与相应的相同菌株和血清型的野生型细菌相比，其在宿主动物中建立和/或维持细菌感染的能力降低的细菌。可通过将其给予受试动物的方法证实细菌的减毒，其中其不能引起导致例如，可观察到的慢性感染或死亡的持续感染。猪胸膜肺炎的症状(例如，肺窘迫、出血坏死性支气管肺炎和/或纤维蛋白性胸膜炎)未产生也可作为细菌减毒的指标。减毒细菌在疫苗组合物中有很重要的商业价值。
在一个方面，本发明因而提供减毒的胸膜肺炎放线杆菌细菌。
在具体的实施方案中，本发明提供在包含选自SEQ ID NO.1-56的核苷酸序列的基因中具有突变的减毒胸膜肺炎放线杆菌细菌。
突变可抑制或妨碍基因的功能，例如，通过降低其表达的水平(例如，通过减少转录和/或翻译)，和/或通过削弱基因产物的生物学活性(例如，通过导致由突变基因所编码产生的基因产物的无活性型)。基因产物可能是多核苷酸或者多肽。
基因中的突变可以是插入、缺失或者取代。其可位于基因编码多肽的区域，或者位于负责(或者参与)基因表达调控的序列，例如位于启动子区。也考虑包括一个或多个插入、缺失和/或取代组合的突变。本发明的减毒胸膜肺炎放线杆菌株同样地包括那些具有两个或多个突变的菌株，突变中的每一个可能是插入、缺失、取代、或者其组合。多个突变可发生在单个基因中，或者它们可发生在相同细菌基因组内的不同基因中。它们可导致减毒水平的叠加或协同。多个突变可通过设计制备，或者可由于引入单个突变的技术偶然产生。
缺失突变体包括那些毒力基因的全部或者部分缺失的突变。在一个方面，突变导致缺失毒力基因的至少约10％，至少约20％，至少约30％，至少约40％，至少约50％，至少约60％，至少约70％，至少约80％，至少约90％，至少约95％，至少约98％，或者至少约99％。缺失可发生在SEQ ID NO.1-56所示的适当的核苷酸序列中，或者其可发生在基因的邻近区，例如，在相关的控制序列中。
可使用本领域技术人员公知的任何技术构建缺失突变体。一种策略是使用可反选择的标记，并在许多不同细菌中用于缺失基因。这种技术的细节，可参考例如Reyrat等，Infection and Immunityvol.66；pp.4011-4017，和Oswald等，FEMS Microbiol Lettvol.179；pp.153-160。
该方法使用双选择策略，其中构建编码可选择和可反选择标记两者标记的质粒，两侧具有来自细菌基因组中期望缺失位点两侧的DNA序列。可选择的标记用于选择其中质粒已经在适当位置和以适当方式整合到基因组中的细菌。接着可反选择的标记用于选择比例很少的自发消除整合质粒的细菌。那些所得细菌中的一部分将含有期望的缺失，不保留外源DNA。
在获得缺失的另一个技术中，使用cre-lox系统用于DNA的位点特异性重组。该系统由可被细菌cre重组酶识别的34个碱基对的lox序列构成。如果将lox位点以适当的方向引入到基因组DNA中，可通过cre重组酶的表达切除两侧是lox位点的序列，保留lox位点的一个拷贝。使用标准重组技术，可能缺失胸膜肺炎放线杆菌基因组中感兴趣的序列，并且用两侧是lox位点的可选择的标记(例如，编码卡那霉素抗性的基因)置换。cre重组酶的瞬间表达(例如，来自含有在胸膜肺炎放线杆菌中有功能的启动子控制下的cre基因的电穿孔的自杀(非复制)质粒)接着将导致有效切除两侧是lox的标记。这种方法导致含有期望缺失以及一个lox序列拷贝的细菌突变体。
在提供缺失的另一个方法中，可用标记基因缺失(置换)胸膜肺炎放线杆菌基因组中的靶序列，例如，绿色荧光蛋白(GFP)、β-半乳糖苷酶或者荧光素酶。两侧是期望缺失的DNA片段通过PCR制备，并克隆到用于胸膜肺炎放线杆菌的自杀载体中。然后将含有在胸膜肺炎放线杆菌中有活性并可操作地连到合适的标记基因上的启动子的表达盒克隆到侧翼序列之间。将质粒引入到野生型细菌中，分离整合并表达标记基因的突变体，以及检验期望的重组事件(用标记基因置换野生型基因)。
如对于插入突变体，这些包括其中终止密码子被插入到天然，即内源性终止信号上游(5′)开放阅读框(ORF)内的基因。因此可通过该基因表达(多肽)毒力基因产物的截断的、无活性型。同样地考虑使用导致移码的插入生产无活性产物。胸膜肺炎放线杆菌的突变的毒力基因将也包括转座子被插入到基因的蛋白编码或调控序列中的那些基因。通过STM技术生产的减毒细菌是插入突变体，其中通过转座子序列，例如Tn10，的插入使毒力基因无功能。
因为插入突变体(例如，通过STM产生的那些突变体)将仍然含有细菌毒力所需遗传信息的全部，因此有它们恢复至致病状态的风险，例如，通过插入序列的自发缺失。因此，当制备基于插入突变体，例如，通过STM鉴定的突变体的疫苗或其它治疗性组合物时，其可能期望从STM衍生的菌株中获得信息，即，被破坏的毒力基因的鉴定，然后重新产生该毒力基因中的一些，大多数，或者全部被缺失的突变体。这应当排除细菌恢复到毒力状态并因此致病而不是将其向宿主动物施用获得预防性保护的可能性。
在相关的方面，本发明提供含有根据本发明第一方面的减毒胸膜肺炎放线杆菌的组合物。该组合物可能是免疫原性组合物，即，一种能在其施用的宿主动物中引起对引起抗体反应的组合物。组合物可能是治疗性(例如，预防性)组合物。其可能是疫苗，优选一种其给予动物后赋予保护不受随后不同于那些疫苗本身中存在的胸膜肺炎放线杆菌的血清型和菌株感染程度(交叉保护)的疫苗。本发明进一步提供本发明第一方面的减毒胸膜肺炎放线杆菌细菌用于生产预防或减轻动物胸膜肺炎放线杆菌感染和/或预防或减轻与这种感染相关症状，例如，用于预防性保护猪抗猪胸膜肺炎的药物(例如，疫苗)的用途。
为了减毒细菌在疫苗组合物中有效，毒力基因中的(一个或多个)突变应当足够明显以防止病原体引起严重的临床症状，但是不应当显著多以便允许在宿主动物中细菌的有限复制和生长，由此引起导致免疫学记忆的适当的防御机制。优选毒力所必需的(明显不同于仅仅参与)基因中的突变。
本发明的组合物可含有许多不同的减毒胸膜肺炎放线杆菌细菌，例如，在相同的毒力基因中具有不同突变的细菌，和/或在两个或多个不同基因中具有相似或不同突变的细菌。虽然可能单独施用本发明的无毒力(减毒)细菌，如在本文别处讨论的，优选以含有一种或多种合适的佐剂、稀释剂、载体、运载体和/或赋形剂的固体或液体组合物施用。根据，以及在本发明中使用的组合物，因此可包括这些物质中的一种或多种，其应当在与减毒细菌相容以及对免疫的动物无害的意义上是药理学“可接受的”。另外的物质优选是无菌和无致热原。
可在本发明中使用的佐剂的实例包括基于油的佐剂，如弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂、基于霉菌酸酯的佐剂(例如，海藻糖二霉菌酸酯)、细菌脂多糖(LPS)、肽聚糖(例如，胞壁质、粘肽、或者糖蛋白如N-Opaca、胞壁酰二肽[MDP]、或者MDP类似物)、蛋白聚糖(例如，那些从肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)中提取的蛋白聚糖)、链球菌制剂(例如，OK432)、Biostim TM(例如，O1K2)、EP 109 942，EP 180 564和EP 231 039的“Iscoms”、氢氧化铝、皂甙、DEAE-葡聚糖、中性油(如miglyol)、植物油(如花生油)、脂质体、多聚醇、Ribi氏佐剂系统(见例如，GB-A-2 189 141)以及白介素、特别是那些刺激细胞介导的免疫佐剂。已经描述了由放线菌目中的一个细菌属，无枝酸菌目(Amycolata)的提取物构成的佐剂(U.S.4,877,612)。佐剂混合物都可商业获得。使用的佐剂将取决于，至少部分取决于受体动物。施用佐剂的量也将取决于动物的种类和大小。可以很容易地通过本领域技术人员公知的常规方法确定最佳剂量。
对于任何稀释剂、载体、运载体和/或赋形剂，那些物质性质上可以是液体、半固体、或者固体。可使用本领域技术人员已知的任何适当的物质。示范性的物质包括聚氧乙烯山梨聚糖单月桂酸酯、硬脂酸镁、甲基和丙基羟基苯甲酸酯(propylhydroxybenzoate)、滑石粉、藻酸盐、淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、山梨糖醇、甘露醇、阿拉伯胶、磷酸钙、矿物油、可可脂以及可可油。
本发明的组合物可包装成便于或者适合具体给药途径的各种形式。治疗性组合物(例如，疫苗)可适于通过例如静脉内、真皮内、肌肉内、乳房内、腹膜内和/或皮下注射，和/或通过口服、舌下、鼻、肛门或阴道输送施用给受试动物。治疗可由单剂量或者由在一段时间中多剂量构成。对给药方案的决定在本领域技术人员的范围内是公知的。组合物可配制和包装成适当的形式。
在另一个方面，本发明提供一种分离的多核苷酸，其编码参与胸膜肺炎放线杆菌的毒力(例如，必需的)的基因产物。该多核苷酸的序列因此发现于胸膜肺炎放线杆菌的毒力基因中。本发明也提供编码基因产物的多核苷酸，其不是在胸膜肺炎放线杆菌中天然发现的，但是其表达能够调节(例如，降低)该细菌的毒力。可将这种多核苷酸引入到细菌中产生这种表达(例如，通过转化、转染或者电穿孔)。表达可产生细菌的减毒株，例如用于疫苗或者其它免疫原性组合物。也考虑不是在胸膜肺炎放线杆菌中天然发现的，但是其能够通过它们与胸膜肺炎放线杆菌毒力基因或者基因产物的直接相互作用(而不是由它们自己的基因产物通过间接作用)调节该细菌毒力的多核苷酸。
根据本发明的多核苷酸的任何基因产物可以是多核苷酸(例如，RNA)或者多肽。多肽基因产物这里称作“毒力多肽”，参与/能够调节胸膜肺炎放线杆菌的毒力，无论它们是否由野生型细菌基因组天然编码。可影响胸膜肺炎放线杆菌毒力的多核苷酸基因产物包括例如，反义RNA和核酶。可通过测定对表达能在动物中建立和/或维持感染的产物的胸膜肺炎放线杆菌菌株的影响程度与不表达该产物的相同株和血清型的胸膜肺炎放线杆菌比较，证明任何基因产物对细菌毒力的影响。
根据这个方面，本发明更具体地提供分离的多核苷酸，包括(例如，由下列序列构成)(a)选自SEQ ID NO.1-56的核苷酸序列(这些序列是如本文别处鉴定的胸膜肺炎放线杆菌的毒力基因内发现的)；(b)编码由(a)中所述的核苷酸序列所编码的多肽的核苷酸序列；(c)在中等至高度严格条件下，与(a)和/或(b)的核苷酸序列，或与其互补链杂交的核苷酸序列；或者(d)(a)-(c)的核苷酸序列中的任何一种的片段，其片段保留(a)-(c)所述的核苷酸序列的免疫学性质和/或生物学活性。本发明的多核苷酸可以是DNA或者是RNA，如本文别处所描述的。
一旦从(a)的核苷酸序列中获得氨基酸序列，可以很容易地鉴定(b)型核苷酸序列，并且列出遗传密码。
至于(c)，示范性的中等严格条件包括在35℃到45℃，在包含2xSSC/0.1％SDS的缓冲液中的最后冲洗。示范性的高度严格条件包括在65℃到75℃，在包含2xSSC/0.1％SDS的缓冲液中的最后冲洗。应当理解的是在本领域中，可通过改变温度和缓冲液或者盐浓度的方法获得同等严格的条件。在这点上，可参考Ausubel等，Protocols inMolecular Biology，John Wiley & Sons(1994)，pp.6.0.3 to 6.4.10。杂交条件的修改可根据经验决定或者基于鸟苷/胞嘧啶(GC)碱基对的长度和百分率精确计算。可根据Sambrook等，Molecular CloningALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory PressColdSpring Harbor，New York(1989)，pp.9.47 to 9.51描述的方法计算杂交条件。
对于(d)型的片段，根据(a)，(b)或者(c)的核苷酸序列的知识，技术人员能够得到该核苷酸序列的每个可能的片段。片段可以是至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、或者至少50个核苷酸长。它们可以在中等到高度严格条件下能与(a)、(b)或(c)的核苷酸序列，或者与其互补序列杂交，可选择地在存在竞争性核酸时，例如，在存在来源于胸膜肺炎放线杆菌的cDNA或mRNA文库的核酸时。保留的免疫学性质可能是该片段能够被特异性结合全长核苷酸序列的抗体特异性结合。构思了至少107M-1的结合亲和力。片段保留的生物学活性可以是能够编码与全长核苷酸序列所编码的多肽具有相同结合能力的多肽，例如能够结合到其在体内天然结合配体中的一种，或者相同抗体。
由于对于本领域技术人员将很显而易见，胸膜肺炎放线杆菌毒力基因的鉴定能够鉴定其它相关细菌，例如，巴斯德氏菌科(Pasteurellaceae)的其它成员中的相应(即，同源)基因。以分离的形式，这种基因序列可能包括在所要求的包含根据上述(c)型核苷酸序列(或者由其构成)的多核苷酸内。使用(a)型核苷酸序列(或其片段)作为探针的Southern杂交可鉴定其它细菌的基因组、cDNA或者mRNA文库中这种相关序列。另外，使用PCR，使用包含胸膜肺炎放线杆菌序列或其片段的引物，可以跨过物种分界线同样有效地鉴定毒力基因。作为另一种可供选择的方法(其不依赖杂交但是仍然能鉴定同源基因)，可使用胸膜肺炎放线杆菌突变体株与其它物种的多核苷酸(例如，DNA或mRNA)文库的互补来鉴定具有相同，或者相关生物活性的基因。总之，本发明的多核苷酸，其包含根据(c)型的核苷酸序列，可能发现位于，或者构成与胸膜肺炎放线杆菌相关的其它细菌的毒力基因。
相关毒力基因的鉴定可通过该基因的突变导致产生其它生物的减毒株，以及可能因此用于生产疫苗和其它免疫学组合物。在另一个方面，本发明因此提供(1)在包括在中等到高度严格条件下，能与SEQ IDNO1-56所定义的核苷酸序列中的任何一种杂交的核苷酸序列的基因中含有突变的减毒细菌(例如，巴斯德氏菌科的细菌)；(2)含有这种细菌的组合物(例如，疫苗)；以及(3)这种细菌用于生产治疗性治疗或预防性保护动物避免相应野生型细菌(或者不同的菌株或其血清型)感染的药物(例如，疫苗)的用途。
如本文别处所解释的，(a)-(d)型的本发明的多核苷酸可以是例如，DNA、RNA、或者肽核酸，根据例如在Corey，TIBTECH 15224-229(1997)中所描述的。DNA序列包括来源于(提取或者扩增的)基因组DNA，或者cDNA，以及完全地或者部分化学合成的核苷酸序列的那些DNA序列。可通过本领域技术人员公知的任何方法完成扩增，例如，通过PCR。
与生产多核苷酸的酶促(例如基于PCR)方法相对，这里使用的“化学合成”指纯粹地化学方法。“完全地”合成的多核苷酸是完全通过化学方法生产的那些多核苷酸，“部分地”合成的多核苷酸包括那些其中仅部分所得的序列是通过化学方法生产的。
本发明的多核苷酸，或者它们的基因产物，可以是核酶。这种多核苷酸可能包括或者由根据上述(c)型的(RNA)核苷酸序列构成，即一种能够与(a)或(b)中所述核苷酸序列中的任何一种在中等到高度严格条件下杂交的多核苷酸。对于核酶技术的回顾，参考Gibson和Shillitoe，Mo1.Biotech.7125137(1997)。可利用核酶以序列特异性方式抑制mRNA的翻译(例如从毒力基因中转录的mRNA)，例如，通过(i)核酶的互补RNA序列与靶mRNA的杂交；以及(ii)通过核酶固有的核酸酶活性切割杂交的靶mRNA。本发明的多核苷酸因此可用于抑制胸膜肺炎放线杆菌或者其它相关细菌，例如巴斯德氏菌属细菌的毒力基因的表达。核酶可通过根据经验的方法鉴定，但是它们可能不是基于靶mRNA上的可及位点特异性设计，例如，基于SEQ ID NO1-56所定义的核苷酸序列的mRNA转录产物(也见Bramlage等，Trends in Biotech16434-438(1998))。
为了控制mRNA翻译，可使用本领域技术人员公知的输送技术靶细胞输送核酶。外源性输送方法可包括使用靶向脂质体或者直接局部注射。内源性方法包括使用病毒载体和使用非病毒质粒。
本发明的某种多核苷酸也可用于调节胸膜肺炎放线杆菌中毒力基因的转录，例如，通过寡核苷酸指导的三螺旋结构形成的方法。对于这种技术的回顾，参考Lavrovsky等，Biochem.Mol.Med.6211-22(1997)。使用在主沟(根据在Watson-Crick模型中所定义的)与双链DNA杂交的序列特异性寡核苷酸完成三螺旋结构形成。这种序列特异性寡核苷酸的杂交可在此后调节DNA-结合蛋白，包括例如，转录因子和聚合酶的活性。优选的用于杂交的靶序列包括调节毒力基因表达的转录调节区。能够形成三螺旋的寡核苷酸也用于毒力基因中靶DNA序列的位点专一的共价修饰。根据例如Lavrovsky等，Biochem.Mol.Med.6211-22(1997)中所描述的方法将用于共价修饰的寡核苷酸偶联到DNA破坏剂上。
在另一个方面，本发明提供了包含根据本发明的多核苷酸的载体。载体性质上可以是DNA或RNA。为了在合适的宿主细胞中在适当的条件下，促进其转录，以及可选择地能使其翻译，其可含有可操作地连到多核苷酸上的一个或多个调控序列。载体可以是质粒，或者病毒载体。它们可能能够自主复制。调控序列可以是内源的(即，在本发明的多核苷酸来源的野生型细菌内发现的，例如胸膜肺炎放线杆菌)或者它们可以是外源的(例如，在相关的细菌中，例如在巴斯德氏菌科的另一个成员中发现的调控序列)。调控序列尤其包括启动子和转录终止子。
进一步构思了含有(例如，转化、转染、或者电穿孔)本发明的多核苷酸或载体的宿主细胞。这种宿主细胞是以允许多核苷酸的转录，以及可选择地使所得mRNA翻译的方式，用本发明的多核苷酸或载体稳定地或瞬时转化、转染、或者电穿孔的原核细胞或者真核细胞。本发明的宿主细胞包括细菌、酵母、真菌、无脊椎动物以及哺乳动物细胞。也考虑含有本发明的多核苷酸或载体的病毒。
本发明的宿主细胞可用于大规模生产毒力多肽(其中本发明的多核苷酸编码多肽序列)的方法。在有利的条件下在适当的培养基中培养细胞，通过本领域技术人员公知的任何纯化技术，例如，通过亲合柱上的捕获，从细胞中或者从细胞生长的培养基中分离期望的多肽。这种细胞可以是用于发展特异性结合毒力多肽的抗体的免疫原的有价值的来源。可使用任何合适的宿主细胞用于表达根据本发明的多核苷酸。
对于这种和其它目的，可使用在本领域技术人员的范围内公知的标准技术操作本发明的多核苷酸，例如，在Sambrook等，MolecularCloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory PressCold Spring Harbor，New York(1989)中所描述的技术。通过举例的方式，通过例如，PCR，例如，使用基因组DNA、cDNA或mRNA作为模板，可扩增和克隆本发明的多核苷酸。为了容易地将克隆的序列插入到载体中，例如表达载体，可选择PCR引物使得PCR扩增的序列在起始密码子ATG前的5’端具有限制性酶切位点，以及在终止密码子TAG、TGA、或TAA后的3’端有限制性酶切位点。根据Grosjean和Fiers，Guide，18199-209(1982)以及Konigsberg和Godson，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，80687-691(1983)所描述的方法，如果需要的话，根据想要转化宿主细胞例如大肠杆菌(E.coli)的优选密码子，可改变克隆序列中的密码子，而不改变氨基酸。当在该宿主中生产时，密码子使用的最优化可导致基因产物的表达增加。
如果在细胞外生产毒力多肽，例如，在宿主细菌的周质中，或者在宿主细胞周围的培养基中，那么可克隆无其起始密码子的本发明的多核苷酸，并在适当的信号序列后将其置于表达载体中。已知许多原核生物和真核生物的信号序列在重组蛋白的分泌中起作用。在蛋白分泌过程期间，可通过信号肽酶除去信号肽，产生成熟蛋白。
为了简化毒力多肽的纯化，可将纯化标签添加到多肽编码序列的5′和/或3′端。通常使用的纯化标签包括六组氨酸残基的一段序列(美国专利Nos.5,284,933和5,310,663)、Schmidt和Skerra，ProteinEngineering，6109-122(1993)所描述的链霉抗生物素-亲和性标签、FLAG肽(Hopp等，Biotechnology，612051210(1988))、谷胱甘肽S-转移酶(Smith和Johnson，Gene，6731-40(1988))、以及硫氧还蛋白(La Vallie等，BiolTechnology，11187-193(1993))。为了除去这些标签，可在融合接点插入蛋白酶剪切识别位点。通常使用的蛋白酶是Xa因子、凝血酶以及肠激酶。
在另一个方面，本发明提供生产本发明的多核苷酸编码的毒力多肽的方法。该方法可包括下列步骤(i)在允许多肽表达的条件下培养根据本发明的宿主细胞；以及(ii)从宿主细胞或者从其周围的培养基中回收并且可选择地分离所表达的多肽。本发明的多核苷酸的鉴定很容易获得它们所编码的多肽，因此这些多肽可选择地用化学方法合成。
本发明的多核苷酸所编码的多肽(和这种多肽的变体)是本发明的另一方面。这种多肽是如本文别处所讨论的“毒力多肽”。进一步考虑含有这种多肽的组合物，这些包括疫苗和其它免疫原性组合物。这种组合物可含有如本文别处所讨论的一种或多种佐剂、载体、稀释剂、运载体或者赋形剂。
变体包括本发明的多核苷酸编码的多肽的生物学和/或免疫学活性片段，例如，在SEQ ID NO.1-56中任何一种所定义的多核苷酸序列所编码的多肽的片段、多肽或其片段与例如，异源多肽的融合(因此生产嵌合体)、以及多肽的类似物，例如，其中缺失、取代或添加一个或多个氨基酸的多肽(i)不丧失一种或多种对多肽特异的生物学活性和/或免疫学特性；或者(ii)特异性失去多肽的特定生物学活性。可使用保守的氨基酸进行置换。
考虑在-1位置上有额外蛋氨酸残基的毒力多肽，以及在-2和-1位置上有额外甲硫氨酸和赖氨酸残基的毒力多肽。这些类型的变体在细菌细胞类型中对于重组蛋白生产特别有用。本发明也包含使用特殊表达系统产生具有额外氨基酸残基的变体。例如，使用表达期望多肽为与谷胱甘肽-S-转移酶(GST)融合蛋白的商业可获得的载体，提供从期望多肽上切除GST元件后在-1位置上具有额外甘氨酸残基的期望多肽。本发明的多肽的变体也包括已经除去前导或信号序列的那些变体，例如，成熟形式。
变体多肽包括与SEQ ID NO.1-56中的任何一个所定义的核苷酸序列编码的毒力多肽具有至少约99％、至少约95％、至少约90％、至少约85％、至少约80％、至少约75％、至少约70％、至少约65％、至少约60％、至少约55％、以及至少约50％序列同一性和/或同源性的那些变体多肽。这里将氨基酸序列的“同一性”百分率定义为将序列和引入的缺口进行序列比对之后，候选序列中与毒力多肽中的残基完全相同的氨基酸残基的百分率，如果必要的话，获得最高序列同一性百分率，不考虑任何保守取代作为序列同一性的一部分。关于SEQ ID NO1-56中任何一个所编码的毒力多肽的氨基酸序列的“同源性”百分率是指将两个序列和引入的缺口序列比对之后，候选序列中与毒力多肽的残基完全相同的氨基酸残基的百分率，如果必要的话，获得最高序列同一性百分率，也考虑任何保守取代作为序列同一性的一部分。
保守取代意味着用一个氨基酸交换相同类型的氨基酸，类型如下脂肪族非极性 GAPILV极性-不带电硫 CM极性-不带电羟基ST极性-带电酸性 DENQ极性-带电碱性 KRH芳香族 FWY在另一个方面，本发明扩展到特异性识别本发明的多核苷酸或多肽的抗体。抗体可以是单克隆或多克隆抗体。它们包括嵌合抗体，例如人源化的抗体，例如互补决定区(CDR)-移植抗体，以及抗体(其可以是嵌合的)的片段，例如Fab，F(ab’)2，Fd和单链抗体。它们也包括具有CDR序列特异性识别本发明的多核苷酸或多肽的化合物。本发明也提供特异性结合本发明的抗体的抗独特型抗体。
术语“特异性”表示本发明抗体的可变区仅识别靶多肽或多核苷酸(即，它们能够从相关的多肽或多核苷酸中区别单一多肽或者多核苷酸)。考虑至少约107M-1，至少约108M-1，或者至少约109M-1的结合亲和力。那并不是说，抗体将不与其它蛋白(例如，金黄色葡萄球菌(S.aureus)蛋白A或者在ELISA技术中的其它抗体)通过与在抗体可变区外面的序列，特别的，在分子的恒定区中的相互作用而相互作用。筛选试验以确定本发明抗体的结合特异性是本领域技术人员公知的和常规实践的方法。为了全面讨论这种试验，可参考Harlow等.(编辑)，Antibodies.A Laboratory Manual；Cold Spring Harbor Laboratory；Cold Spring Harbor，NY(1988)，Chapter6。
根据本发明的另一个方面，提供用于鉴定能够调节本发明鉴定的胸膜肺炎放线杆菌毒力基因、或者相关物种中同源基因功能的抗菌剂的材料和方法。同样考虑能够调节这种毒力基因功能的药剂本身。更具体地，本发明的方法包括筛选能够干扰宿主细菌中SEQ ID NO.1-56中任何一个所示核苷酸序列所编码的基因产物的表达和/或生物活性的潜在药剂。干扰毒力基因产物表达的药剂包括(但不限于)含有与SEQ IDNO.1-56的核苷酸序列中的任何一个同源的核苷酸序列的反义多核苷酸和核酶(它们结合其互补链)。本发明进一步包括通过使用寡核苷酸指导的三螺旋形成调节这种毒力基因转录的方法。
除了通过给予这种抗菌剂或组合物治疗患巴斯德氏菌属(例如胸膜肺炎放线杆菌)感染的动物的方法，含有根据本发明鉴定的抗菌剂的组合物是本发明的另一方面。本发明也包含这种药剂或组合物用于生产治疗巴斯德氏菌属感染，例如胸膜肺炎放线杆菌感染和/或猪胸膜肺炎的药物的用途。
干扰毒力基因功能的药剂包括(i)可与野生型产物竞争其生理学结合位点的毒力基因产物的非功能性变体；以及(ii)毒力基因产物的结合配偶体，其螯合和任选地破坏所述产物。药剂也包括变构酶抑制剂，在毒力基因产物是酶时。
可通过使用本发明的多核苷酸或它们所编码的产物(其可能是RNA多核苷酸或者多肽)的高通量筛选试验的方法鉴定抑制剂。建立基于活性以及筛选能调节(例如，抑制)该活性的潜在药剂的试验，其中筛选使用具有酶促活性的多肽基因产物。对于通过与多肽或多核苷酸相互作用发挥它们功能的毒力基因产物，建立结合试验以测量这种相互作用，以及筛选能够调节，例如抑制该相互作用的潜在的试剂。
在结合试验的一个实施方案中，毒力基因产物固定在固体支持物上，在存在和缺乏推定的抑制剂化合物时，评定与(生理学的)结合配偶体的相互作用。在另一个实施例中，在存在和缺乏推定的抑制剂化合物时，在溶液鉴定中评定毒力基因产物和其结合配偶体之间的相互作用。在两个试验中，抑制剂被鉴定为降低毒力基因产物和其结合配偶体之间结合的化合物。当毒力基因产物和其结合配偶体都是多肽时，使用的试验包括双杂交试验的变通方式，其中根据例如在公开的国际专利申请WO 95/20652中所描述的方法，通过检测转化或转染的宿主细胞中的阳性信号鉴定蛋白/蛋白相互作用的抑制剂。
考虑的在本发明的方法中使用的候选抑制剂包括选自潜在抑制剂文库中的化合物。可使用许多不同文库作为小分子调节剂的来源，包括(1)化学文库；(2)天然产物文库；以及(3)由随机肽、寡核苷酸或者有机分子构成的组合文库。
化学文库由已知化合物的结构类似物构成。天然产物文库是用于产生所筛选混合物的微生物、动物、植物、或者海洋微生物的集合，其中混合物通过下列步骤进行筛选(i)土壤、植物或者海洋微生物的肉汤培养基的发酵和提取；或者(ii)植物或海洋微生物的提取。天然产物文库在例如Science 28263-68(1998)中进一步讨论。对于组合物文库，这些文库由大量肽、寡核苷酸、或者有机化合物作为混合物组成。它们相对容易通过传统的自动合成方法、PCR、克隆、或者专有合成方法制备。特别感兴趣的是肽和寡核苷酸组合文库。对于组合化学文库的回顾，可参考Myers，Curr.Opin.Biotechnol.8701-707(1997)。
可特异性设计考虑在本发明的方法中使用的其它候选抑制剂。这些包括毒力多肽的可溶形式的结合配偶体。如这里使用的术语“结合配偶体”包含包括片段和其衍生物的抗体(尽管在某些实施方案中它们被除外)，以及包括特异性结合靶基因产物的抗体结构域的修饰的化合物。
当毒力基因产物的多肽结合配偶体不是已知的时，可使用鉴定生理学，或者非生理学的以及因此螯合结合配偶体的试验，例如，使用其上固定毒力基因产物的亲和柱的试验。可选择地，可使用根据在Fields和Song，Nature，340245-246(1989)，以及Fields和Sternglanz，Trendsin Genetics，10286-292(1994)中所描述的酵母双杂交系统鉴定多肽之间的结合相互作用。其它可用于搜寻结合多肽毒力基因产物的试剂的试验包括在美国专利No.5,585,277中所描述的试验，其依靠蛋白通常以折叠和未折叠状态的混合物存在并且在这两个状态之间不断交替的原理。当试验配体结合到折叠形式的靶毒力多肽时，被配体结合的靶蛋白分子保持其折叠状态。因此，在存在结合靶蛋白的试验配体时，呈现出比缺乏配体时更高程度的折叠的靶蛋白。可通过区分靶蛋白的折叠和非折叠状态的任何方法测定配体对靶蛋白的结合。为了进行这种试验不必知道靶蛋白的功能。事实上可通过这种方法评估任何试剂作为试验配体，包括，但不限于金属、多肽，包括蛋白质，脂类，多糖，多核苷酸和有机小分子。
在Wieboldt等，Anal.Chem.，691683-1691(1997)中描述了鉴定毒力基因多肽配体的另一个方法。该技术在溶液相中每次筛选结合靶毒力多肽的20到30个试剂的组合文库。通过离心超滤将结合靶的试剂与其它较小的文库组分分离。随后将在滤器上保留的特异性选择的分子从靶蛋白中释放，并且通过，例如HPLC和充气促进的电喷射(离子喷射)离子化MS进行分析。这种方法选择对靶蛋白具有最高亲和力的文库组分，对小分子文库特别有用。
通过最初筛选鉴定的结合试剂也可评估它们在体内对毒力的影响。妨碍细菌毒力的药剂可预防产生感染，或者一旦产生感染逆转感染的结果。根据这里别处所描述的，结合试剂可包含在含有药学上可接受的佐剂、赋形剂、稀释剂、载体或运载体的组合物中。
一旦考虑其中描述了目前所准备的其实施方案的本发明的下列详细描述，本发明的许多另外的方面和优点现在对于本领域技术人员将是显而易见的。
实施例1A.材料和方法1.细菌菌株和生长条件使用常规方法选择毒性胸膜肺炎放线杆菌血清型1菌株4074的自发抗萘啶酮酸的衍生物，称作4074NalR。通过在猪中传代验证这种菌株的毒力。在37℃、5％CO2的在补充了10％Levinthal氏碱(BHIL)的脑心浸液(BHI)平板上，或者在37℃，在含有5μg/mlβ-烟酰胺嘌呤二核苷酸(NAD)和11mM氯化钙的Colombia肉汤培养基中繁殖胸膜肺炎放线杆菌株。
在本研究中使用的大肠杆菌(E.coil)株是在Miller和Mekalanos(1988)J.Bacteriol.170，pp.2575-2583中描述的S17λpir[用λpir噬菌体溶原化的recA thi pro hsdR-M+RP4∷2-Tc∷Mu∷Km Tn 7]；根据在deLorenzo等，(1990)J.Bacteriol.172，pp.6657-6667中所描述的CC118λpir[用λpir噬菌体溶原化的Δ(are-leu)araD ΔlacX74 galE galK pho A20thi-1 rpsE rpoB argE recA1]；以及XL1-Blue(recA1 endA1 gyrA96 thi-1hsdR17 supE44 relA1 lac [F′proAB laclqZΔM15 Tn10(Tetr)])。在含有适当抗生素的Luria-Bertani(LB)培养基中维持大肠杆菌株，其中抗生素使用下列浓度氨苄青霉素100μg/ml；卡那霉素100μg/ml；萘啶酮酸20μg/ml；四环素10μg/ml。
2.DNA操作、扩增、标记、以及标签的杂交根据生产商的使用说明，使用QIAamp mini DNA试剂盒(Qiagen)从胸膜肺炎放线杆菌中分离染色体DNA。再次根据生产商的使用说明，使用Qiagen质粒midi试剂盒从大肠杆菌(E.coil)中分离质粒DNA。根据Sambrook等，Molecular CloningA Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory PressCold Spring Harbor，New York(1989)中所描述的标准技术进行DNA操作。根据生产商所描述的方法，使用PCR DIG探针合成试剂盒(Roche)用[地高辛(DIG)-11]-dUTP标记DNA印迹的探针。根据在Hensel等(1995)Science 269 pp.400-403中所描述的方法进行DNA标记-标签的扩增和标记。使用下列引物通过PCR方法从基因组DNA中开始扩增标签P6(5′-CGACTACAACCTCAAGCT-3′)P7(5′-CGACCATTCTAACCAAGC-3′)扩增的标签在2％Nusieve GTG琼脂糖凝胶上纯化并在再次使用P6和P7的第二次PCR中用[32P]-dCTP进行放射性标记。两次PCR的循环条件如下在95℃变性和酶活化12分钟，随后进行20个循环95℃30秒，50℃ 45秒以及72℃ 10秒。使用1单位AmpliTaq Gold(Perkin-Elmer)聚合酶在Perkin-Elmer 2400热循环仪中进行反应。使用前，通过用HindIII在37℃消化18小时从可变的标记-标签中分离恒定的侧翼DNA。
对于集落印迹，使含有pLOF/TAG 1-48质粒中的每一个的大肠杆菌(E.coli)S17λpir株长到指数期的中期，将每种培养物的100μl培养物转移到微量滴定皿的孔中。使用复制平板器(Sigma)将细菌从微量滴定皿中转移到尼龙膜(Hybond N)上，并将接种的膜置于干燥的含有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB琼脂平板的表面。37℃过夜生长后，将膜用1.5M NaCl，0.5M NaOH处理10分钟。通过微波在最大功率处理30秒钟，将DNA固定到膜上，通过在2XSSC中洗涤除去细菌碎屑。在65℃ Rapid-hyb缓冲液(Amersham)中分别进行1小时预杂交和过夜杂交。根据标准方法洗涤印迹。为了鉴定潜在的减毒突变体，将从输入池(接种物)中制备的用标记的标签所探测的印迹上的杂交信号和与从至少两个不同动物的相应输出池中制备的标记标签杂交的完全相同的印迹进行比较。
3.DNA标记-标签和pLOF/TAG1-48的构建通过可变的寡核苷酸池RT1的PCR扩增获得双链DNA标记标签(Hensel等，1995 Science 269 pp.400-403)，使用下列引物P3SAL(5′-CGCCATGTCGACCATTCTAACCAAGCTT-3′)P5SAL(5′-CGCCTAGTCGACTACAACCTCAAGCTT-3′)其中的每一种在其5’末端含有限制性内切酶SalI识别位点。为了便于标记-标签在质粒pLOF/Km中的克隆，对质粒进行修饰以掺入唯一的SalI位点。这通过将下列互补寡核苷酸退火完成SALTOP(5′-GTCGACCCT-3′)和SALBTM(5′-GTCGACAGG-3′)产生含有两侧是SfiI-相容端的SalI位点的双链接头。质粒pLOF/Km用SfiI消化，用小牛肠碱性磷酸酶(CIAP)处理，并连接到磷酸化的双链接头上产生质粒pLOF/Sal。PCR扩增的双链DNA标记标签用SalI消化，凝胶纯化，并且克隆到SalI消化的，CIAP处理的pLOF/Sal上产生独特标记的pLOF/TAG质粒文库。
通过菌落印迹与它们相应的[32P]-dCTP标记的标签杂交，筛选大肠杆菌株CC118λpir中的单个转化体，鉴定高效扩增和标记的100个标签。然后检验这些标签是否缺乏交叉杂交，选择48个质粒(pLOF/TAG1-48)进一步使用。
4.标签-标记的突变体库的构建将在质粒pLOF/TAG 1-48上携带的48个标签-标记的mini-Tn10转座子通过接合各自引入到胸膜肺炎放线杆菌中。使胸膜肺炎放线杆菌4074NalR株和含有pLOF/TAG 1-48质粒中的每一种的大肠杆菌S17λpir在37℃过夜生长到生长静止期。通过3,000rpm离心15分钟收获细菌，并用10mM MgSO4洗涤两次。将大约相同数量的胸膜肺炎放线杆菌受体和大肠杆菌供体细胞混合，浓缩，并铺到0.22μM滤器上。将滤器置于含有1mM IPTG的BHIL平板上，在37℃，5％CO2孵育5小时。其后，将细菌移到5ml无菌PBS中，将等分试样铺于补充了萘啶酮酸(20μg/ml)和卡那霉素(100μg/ml)的BHIL平板上。对48个标签-标记的微型Tn10转座子中的每一个进行4个单独的接合。对转接合子突变体进行氨苄青霉素敏感性筛选，因此除去携带插入到染色体中的自杀载体的共合体的菌株。从48个单个接合中分离总共2064个转座子突变体，并将它们安排到43个池中，每个池中48个突变体。将突变体装于含有15％甘油的1.5ml冷冻管中-80℃贮藏。
5.感染研究将每个池中的48个胸膜肺炎放线杆菌标签标记的突变体中的单个菌株各自培养到生长对数期中期。在OD600大约0.3时，将单个突变体菌株组合起来，在HEPES中将汇集的培养物稀释到大约2×106cfu/ml。向6到10周龄以及通过细菌学和血清学分析确定无胸膜肺炎放线杆菌的大白十字(Large White Cross)小猪，气管内接种3ml稀释培养物。将接种物的连续稀释液铺在选择性BHIL后，通过活菌计数核实接种物中的cfu的数量。使用每个突变体池感染至少两个动物。
在感染后大约24小时，无痛处死存活的动物并分离肺。通过(i)用Hanks缓冲盐溶液(HBSS)充分灌洗；或者(ii)在500ml HBSS中将肺匀浆，从感染的肺中回收存活的细菌。将细菌悬液的等分试样铺于选择性培养基上，接着在7℃，5％CO2，过夜生长，汇集大约10,000个菌落(“输出池”)，制备全部染色体DNA。
6.竞争指数为了测定单个STM突变体的体内竞争性指数(CI)，使突变体和野生型细菌在含有5μg/ml NAD和11mM CaCl2的Colombia肉汤培养基中生长到OD600为0.3。然后将培养物组合起来产生相等数量的突变体和野生型微生物，稀释到2×106cfu/ml，并且气管内接种到至少两个动物中。将接种物的连续稀释液平行铺于BHIL+20μg/ml萘啶酮酸(突变体和野生型)，以及BHIL+20μg/ml萘啶酮酸+100μg/ml卡那霉素(仅是突变体)后，通过活菌计数核实接种物中突变体与野生型的比例。感染后大约24小时，无痛处死存活的动物并分离肺。将肺在500ml HBSS中匀浆，将等分试样铺于选择性培养基(见上面所述)上以回收存活的细菌。根据突变体对野生型微生物的输出率除以突变体对野生型微生物的输入率，计算体内CI。为了测定体外CI，使突变体和野生型微生物生长到指数期中期，以相等数量混合，在37℃再振荡培养联合培养物3小时。在固定间隔采集样本，稀释，并同前面一样铺于选择性BHIL上，根据上面描述的方法计算体外CI。
7.毒力基因鉴定和DNA测序为了鉴定体内减弱的损害，通过反向PCR克隆或扩增转座子插入位点两侧的DNA。对于克隆，用一组限制性酶消化染色体DNA，通过琼脂糖凝胶电泳分离，转移到尼龙膜上，在DNA印迹中用DIG标记的对Tn10卡那霉素基因特异的探针探测。从凝胶中切下与探针杂交的适当大小的片段，纯化并克隆到适当消化的pBR322中。在含有100μg/ml卡那霉素的LB琼脂上选择大肠杆菌株XL1-Blue中的转化体。
为了便于测序，使用Tn10特异性寡核苷酸引物BS401(5′-GACAAGATGTGTATCCACC-3′)将克隆的插入片段进一步亚克隆到质粒pBCKS(Stratagene)中。根据在Fuller，(2000)Microb.Pathog.29，pp.25-38中所描述的方法进行转座子插入位点两侧DNA的反向PCR扩增，用SspI(其在转座子中一次切割)消化染色体DNA，稀释到150ng/ml，使用快速DNA连接试剂盒(Roche)自我连接15分钟。然后使用引物对BS401+TEF48，以及BS401+TEF62扩增连接的DNA(Fuller，2000 Microb.Pathog.29，pp.25-38)。反向PCR的反应条件同以前所描述的一样(Fuller，2000Microb.Pathog.29，pp.25-38)。琼脂糖凝胶电泳后，使用QIAQUICK凝胶提取试剂盒(Qiagen)纯化得到的扩增子。使用BigDye终止子循环测序试剂盒(Perkin-Elmer)进行DNA测序反应。使用相似搜索程序的BLAST设置，用减毒突变体中的每个序列查询未过多公开的DNA和蛋白质数据库(Altschul等1990J.Mol Biol.15，pp.403-410)。
B.结果和讨论1.标签标记的胸膜肺炎放线杆菌突变体的增殖修饰在胸膜肺炎放线杆菌中有功能的质粒pLOF/Km，使通过在微型-Tn10元件中插入唯一SalI位点接受标记-标签。将PCR扩增的随机标记-标签克隆到SalI位点，在大肠杆菌CC118λpir中获得大约30,000个标记质粒的文库。通过与它们相应放射性标记标签的菌落印迹筛选这些转化体的子集，选择含有强烈杂交信号的标签标记的质粒。除去含有交叉杂交的质粒，收集48个独特标签标记质粒的池。将这些质粒(pLOF/TAG 1-48)转化到大肠杆菌S17λpir中，通过接合独立转移到胸膜肺炎放线杆菌4074NalR株中。
除去氨苄青霉素抗性质粒共整合体(0.5-1％)后，从48个单独的接合中分离2064个转座子突变体，然后安排到43个池中，每个池中48个突变体。10个随机选取的含有微型-Tn10-特异性探针的接合后体的DNA印迹分析证实标记转座子是单一、随机插入(数据没有显示)。然而，减毒克隆随后的序列分析显示在胸膜肺炎放线杆菌中微型-Tn10的插入不完全是随机的。
2.胸膜肺炎放线杆菌突变体在猪中的标记标签的筛选使用猪气管内感染模型筛选标签标记的胸膜肺炎放线杆菌突变体，鉴定毒力中所包含的基因。根据以前的研究将细菌直接滴注进气管已经显示喷嚏所产生的气雾颗粒足够小以至于能够渗透到下呼吸道内，避免需要定居到上呼吸道(Kaltreider HB.，Immunologic and infectiousdiseases，the lung.(1976)pp.73-97，Kirkpatrick & Reynolds(Eds)Marcel Dekker，New York)。
按照猪宿主体内选择能够可重复地回收大多数单个突变体前，研究了包括感染剂量以及回收方法的一系列试验因素。使用例如103、104或105cfu的攻击剂量，感染剂量和出现疾病的临床或形态学体征之间相关性差。此外，当用相同的池感染不同猪时，传代后池的杂交模式提示指定池通过不同动物的传代后，失去不同克隆(数据没有显示)。这种不一致可通过将攻击量增加到106-107cfu/猪克服。
在猪中进行的胸膜肺炎放线杆菌感染的较早的STM研究中[Fuller，2000 Microb.Pathog.29，pp.39-51]，实验性感染后通过肺灌洗回收细菌。然而，发现这种方法不可靠，产生基本上随机回收单个标记标签。相反，我们观察到整个肺在HBSS中匀浆后，持续回收活菌。这两个决定性参数的最优化导致回收大多数单个克隆(＞90％，感染后20-48小时)，动物之间具有极好的重复性(见

图1；比较A和B)。
筛选总计2064个转座子突变体(43个池，每个池48个突变体)用于体内减毒，每个池接种至少两个不同动物。通过在无菌HBSS中肺的匀浆回收存活的细菌。这种初步筛选鉴定了在输入池中存在但是在输出池中失去或者显著减少的550个突变体。将这些潜在的减毒突变体重新汇集成新池，将每个新池用于感染另外两个动物。这种第二次筛选后，发现105/410个突变体在输出池中始终缺乏，保留这些突变体进行进一步分析。
3.胸膜肺炎放线杆菌毒力基因的鉴定和分析获得上述105个减毒突变体中每一个的转座子插入位点两侧DNA的核苷酸序列，并用于搜索GenBank数据库寻找同源基因。在表1中显示这种分析的结果，基因被分配到5个功能种类之一细胞表面、运输、代谢、应激反应、以及调控。将在编码与数据库中的蛋白无显著同源性，或者与未知功能的蛋白或预测蛋白同源的蛋白的基因中的插入归为“未知的”一类。鉴定了含有在53个单个基因中的转座子插入和许多Tn10插入热点的105个减毒突变体。特别是，在推定的rfbP基因(在第444密码子中的Tn插入)中独立地分离了7个相同的插入，在胸膜肺炎放线杆菌fur基因中的4个插入中，3个位于第128密码子。有趣地是，在本研究中鉴定的3个热点两侧的DNA序列彼此不相似，也不与以前已经鉴定的插入到胸膜肺炎放线杆菌中的Tn10插入的共有序列相似(Fuller等(2000)Microb.Pathog.29，pp.25-38)。
(i)细胞表面已知荚膜和脂多糖(LPS)基因中的突变降低胸膜肺炎放线杆菌的毒力(Rioux等，Can.J Microbiol.45pgs1017-1026，1999)(Rioux等，Microb Pathog 28pgs 279-289，2000；Ward等，Infect Immun 66pgs3326-3336，1998)。突变体9C2在cpxC基因中含有转座子插入，其中该基因编码在胸膜肺炎放线杆菌荚膜输出中所包含的蛋白(Ward和Inzana，1997)。这种突变体在体内CI试验中用作对照(已知减毒)株。在这个STM筛选中鉴定了在胸膜肺炎放线杆菌血清型1的O-抗原的合成中所包含的5个基因。在O-抗原操纵子的基因9(突变体10B11)、12(突变体25B7)、15(突变体15A9)、17(突变体12D5)、以及18(突变体21B8)中含有插入的突变体(Labrie等，2002，J.Endotox Res.827-38)全部都是减毒的。另一个突变体9B7具有编码在LPS核心的合成中所包含蛋白的胸膜肺炎放线杆菌galU基因上游20个碱基的转座子插入。以前证明galU的突变降低胸膜肺炎放线杆菌的毒力(Rioux等，1999)。最后，突变体26A9在与lcbB同源的基因中含有插入，一种在脑膜炎奈瑟氏球菌(N.meningiditis)血清型L荚膜或LPS生物合成中所涉及的推定的双功能聚合酶。
4D4株在编码推定的脂蛋白的基因中含有转座子插入。4D4株显示与多杀巴斯德氏菌(P.multocida)的未知蛋白有最高的同源性，但是其与流感嗜血杆菌(H.influenzae)和睡眠嗜血菌(H.somnus)的脂蛋白和推定的脂蛋白相似[Theisen(1993)Infect Immun 611793-1798]。睡眠嗜血菌LppB结合刚果红染料(一种血红素的结构类似物)，并且提示是毒力因子，但是这一直没有被正式地证明[Theisen(1993)InfectImmun 611793-1798]。最后，17A4株在与流感嗜血杆菌的P2膜孔蛋白同源的ORF中含有插入[Duim等(1993)Microb.Pathog.14，pp.451-462]。P2蛋白构成大约流感嗜血杆菌全部外膜蛋白中的一半，代表对无法分型的流感嗜血杆菌感染的免疫反应的重要靶[Yi等(1997)Infect-Immun-65，150-155]。
(ii)代谢10B12株在ADP-核糖焦磷酸酶(adpP)基因同系物中含有转座子插入。ADP-核糖(ADP-核糖来自NAD)的细胞水平的调节在预防蛋白的非酶促ADP-核糖基化中很重要。大肠杆菌ADP-核糖焦磷酸酶催化ADP-核糖水解成核糖-5-P和AMP，化合物可作为核苷酸代谢的一部分再循环[Gabelli等(2001)Nat Struct.Biol.8，pp.467-472]。
10A11株在精氨琥珀酸合酶，argG，基因同系物中携带插入。精氨琥珀酸合酶催化瓜氨酸和天冬氨酸转化成精氨琥珀酸，经所谓的天冬氨酸-精氨琥珀酸支路连接尿素循环和柠檬酸循环。天冬氨酸-精氨琥珀酸支路提供加工氨基酸的氨基和碳骨架路径之间的代谢连接。(Glansdorff(1996)，精氨酸和多胺的生物合成，Escherichia coli andSalmonella(Vol.1)(Neidhardt，F.C.等人，编)，pp.408-433，ASM Press)。
在33C7株中，发现减小的损害发生在与编码F1F0ATP合成酶的F1α亚单位的流感嗜血杆菌atpA同源的基因中。ATP合酶负责在需氧或者厌氧生长的细胞中利用跨细胞质膜的质子电化学梯度合成ATP。通过atp操纵子编码细菌酶的所有8个亚单位。在多杀巴斯德氏菌中atpA基因两侧是atpH和atpG，而在胸膜肺炎放线杆菌中基因顺序是未知的，以前在胸膜肺炎放线杆菌感染的发病机理中已经涉及了atpH和atpG两者[Fuller(2000)Microb.Pathog.29，pp.39-51]。
在0A7株中，转座子使编码NAD(P)转氢酶β亚单位的pntB基因失活。转氢酶是一种固有膜蛋白，其由两个亚单位α和β构成，组织起来成为α2β2四聚物。转氢酶将NAD(H)和NADP(H)之间的氧化还原反应与跨内膜的质子转运偶联(Penfound & Foster(1996)，NAD的生物合成和再循环Escherichia coli and Salmonella(Vol.1)(Neidhardt，F.C.等，编)，pp.408-433，ASM Press)。它在能量代谢、生物合成以及解毒作用中起关键作用。
在19D5株中，转座子在胸膜肺炎放线杆菌mrp基因中插入。可得到的部分胸膜肺炎放线杆菌mrp基因序列与流感嗜血杆菌和大肠杆菌的mrp基因高度同源。在流感嗜血杆菌中，在LPS的Gala(1-4)βGal成分的生物合成中涉及mrp基因，而在大肠杆菌中mrp中的突变影响硫胺素的合成[High等(1996)FEMS Microbiol.Lett.145，pp.325-331；Petersen(1996)J.Bacteriol.178，pp.5676-5682]。在胸膜肺炎放线杆菌中，mrp基因位于编码体内诱导RTX毒素ApxIV的apxIVA基因上游大约1kb处[Schaller(1999)Microbiology 1452105-2116]。
29B11株在napB基因同系物中含有转座子插入，该基因编码异二聚体周质硝酸还原酶(NAP)的较小的dihaem细胞色素c亚单位。在流感嗜血杆菌(和假单胞菌属(Pseudomonas sp))中，NAP是唯一的硝酸还原酶，功能可能是在存在硝酸时支持厌氧性生长[Brige(2001)Biochem.J.356，pp.851-858；Fleischmann(1995)Science 269，pp.496-512；Bedzyk(1999)J Bacteriol 1812802-2806]。在大肠杆菌中情况更复杂，除了NAP外，存在两个膜结合的呼吸硝酸还原酶[Moreno-Vivian(1999)J Bacteriol 1816573-6584]。有证据提示NAP是用于氧化还原平衡的异化(dissimilatory)酶。此外，提示NAP在从需氧条件转变到厌氧条件后对厌氧代谢的适应，替代还原剂的利用，或者甚至在形成高硝酸水平作为一种自我防御机制抑制竞争细菌的生长中起作用[Moreno-Vivian(1999)J Bacteriol 1816573-6584]。与在厌氧适应中的作用一致，在暴露于厌氧条件的细胞中，以Fnr-依赖方式诱导鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)napB基因的转录[Wei和Miller(1999)J.Bacteriol.181，pp.6092-6097]。
17B8株，在与流感嗜血杆菌ccmH同源的基因中含有插入，其中该基因是肠细菌中包括NAP的C-型细胞色素的装配所必需的[Thony-Meyer(1995)J.Bacteriol.177，pp.4321-4326；Kranz(1998)Mol Microbiol 29，pp.383-396]。CcmH是由ccm操纵子的最后基因编码，并含有CcmF和CcmG，据信能催化细胞色素c脱辅蛋白质中二硫键的还原并便于血红素附着[Kranz(1998)Mol Microbiol 29，pp.383-396]。而在大肠杆菌中nap和ccm操纵子相邻，并可能共转录[Grove(1996)Mol Nicrobiol 19，pp.467-481]，它们在流感嗜血杆菌和多杀巴斯德氏菌中位于不同的基因座[Fleischmann(1995)Science 269，pp.496-512；May(2001)Proc Natl Acad Sci USA 98，pp.3460-3465]。
4B9株在moaA基因同系物中含有转座子插入。在大肠杆菌中moaA-E基因是从GTP合成molybdopterin必需的[Rivers(1993)MolMicrobiol 81071-1081]。Molybdopterin(molybdopterin鸟嘌呤二核苷酸)是在包括周质硝酸还原酶的原核molybdopterin中发现的主要辅因子。厌氧生活诱导moa基因的表达[Anderson(2000)J.Bacteriol.182，pp.7035-7043]，鼠伤寒沙门氏菌moaA突变体削弱了它们在上皮细胞中复制的能力[Contreras(1997)Microbiology 143，pp.2665-2672]。
突变体29B12在胸膜肺炎放线杆菌recR基因同系物中含有插入。RecR蛋白是在重组(recombinatorial)DNA修复的RecF途径中包含的蛋白；recR突变体在补平最新合成的DNA的子代链缺口中有缺陷[Kuzminov(1999)Microbiol Mol Biol Rev 63，pp.751-813]。RecR中的突变延迟大肠杆菌中SOS应答的诱导，这种突变体对UV照射和丝裂霉素C敏感[Keller(2001)Mutat Res 486，pp.21-29]。
在26A10株中，转座子插入到与流感嗜血杆菌的thrC高度同源的基因中。thrC基因编码苏氨酸合酶，在导致产生苏氨酸的生物合成途径中的决定性酶(Patte(1996)，苏氨酸和赖氨酸的生物合成，Escherichiacoli and Salmonella(Vol.1)(Neidhardt，F.C.等人，编)，pp.408-433，ASM Press)。肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)thrC基因同系物中的突变在肺炎的鼠模型中降低这种生物体的毒力[Lau(2001)MolMicrobiol 40，pp.555-571]。
在26D12株中，转座子使GMP合酶，guaA，基因同系物失活。GMP合酶催化从XMP合成GMP，作为嘌呤生物合成途径的一部分。GuaBA操纵子中的突变降低包括大肠杆菌、福氏志贺氏菌(S.flexneri)、和鼠伤寒沙门氏菌的多种肠病原体的毒力，ΔguaBA鼠伤寒沙门氏菌衍生物显示有望作为活性减毒载体[Wang(2001)Infect Immun 69，pp.4734-4741；Noriega(1996)Infect Immun 64，3055-3061；Russo(1996)Mol Microbiol 22，pp.217-229]。此外，以前在中无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)和多杀巴斯德氏菌中的STM筛选在体外生长和发病机理中分别涉及guaA和guaB[Jones(2000)Mol Microbiol 37，pp.1444-1455；Fuller(2000)Microb Pathog 29，pp.39-51]。
突变体27A12在以前在胸膜肺炎放线杆菌中鉴定为tonB的基因中含有转座子插入(Tonpitak等，Infect Immun 681164-1170 2000)(现在称作tonB1)。发现该基因紧靠exbB，exbD以及转铁蛋白结合蛋白(tbp)基因的上游，并且与它们共转录。相反，0F6株在编码与多杀巴斯德氏菌和嗜血杆菌属(Haemophilus sp.)的TonB蛋白(现在称作tonB2)同源的蛋白的ORF中含有转座子插入。此外，在0F6中转座子插入上游区的序列分析显示存在独特的exbB和exbD基因同系物，提示胸膜肺炎放线杆菌，同包括霍乱弧菌(V.cholerae)和铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)的其它细菌病原体一样，具有两个独立的TonB系统(Occhino等，Mol Microbiol 291493-15071998；Zhao和Poole，FEMSMicrobiol Lett 184127-132 2000)。
35D11株在与流感嗜血杆菌dsbA同源的基因中含有插入。DsbA是小周质蛋白并且是硫氧还蛋白超家族的成员[Debarbieux(1999)Cell 99，pp.117-119]。DsbA中的突变是多效的，影响包括细菌毒力因子、III型分泌体系的组分、以及包括NAP的c-型细胞色素的多种传导型(translocated)蛋白的产生[Yu和Kroll(1999)Microbes Infect 1，pp.1221-1228]。在福氏志贺氏菌[Yu(1998)Infect Immun 66，3909-3917]和多杀巴斯德氏菌[Fuller(2000)Microb Pathog 29，pp.25-38]的毒力中已经分别涉及在dsbA和dsbB中的突变。
在26C3株中，转座子使谷氨酰-tRNA还原酶，hemA，基因同系物失活，而在26D5株中，转座子在推定的尿卟啉原脱羧酶uroD/hemE基因同系物中插入。谷氨酰-tRNA还原酶催化谷氨酸还原成谷氨酸1-半醛，从谷氨酸形成δ-氨基乙酰丙酸(ALA)独有的第一关键步骤。从ALA形成的下游，尿卟啉原脱羧酶催化尿卟啉原III脱羧产生粪卟啉原，是在尿卟啉原III经原卟啉IX转化成正铁血红素中的第一步。血红素，包括正铁血红素，是电子转移装置的关键组分，另外作为酶修复基在矿物营养和氧化催化中起重要作用(Beale，，血红素的生物合成，Escherichia coli and Salmonella(Vol.1)(Neidhardt，F.C.et al.，eds)，pp.408-433，ASM Press)。
在15A11株中，转座子插到与多杀巴斯德氏菌visC同源的基因中。VisC编码的蛋白编码属于UbiH/CoQ6家族的推定的单加氧酶。UbiH是泛醌生物合成必需的[Nakahigashi(1992)J.Bacteriol.174，pp.7352-7359]，在原核生物质膜的呼吸电子链中起作用的异戊二烯化的苯醌。泛醌和正铁血红素通过便于DsbA被DsbB的氧化，也在周质蛋白的二硫键的形成中起作用[Kobayashi(1997)Proc Natl Acad Sci USA 94，pp.11857-11862]。
29A10株在与流感嗜血杆菌的prfC同源的基因中含有转座子插入。prfC基因编码肽链释放因子3(RF3)，在存在GTP时，翻译终止后催化从核糖体除去RF1和RF2的GTP酶[Freistroffer(1997)EMBO J 164126-4133]。尽管在原核生物中不是生存必需的，但是经RF3-GTP的RF1和RF2的高效再循环对于最大生长率是必需的[Kisselev(2000)Trends Biochem Sci 25，pp.561-566]。
在26A6和33B7株中，转座子在与tRNA/rRNA甲基转移酶的trmH家族同源的基因中插入。26A3株中被破坏的ORF显示与流感嗜血杆菌yibK同源性最高，而在33B7株中显示与流感嗜血杆菌的yjfH最相似。
(iii)调节在这个筛选中鉴定了在环境的感应和协同调节中涉及的毒力基因。发现高铁摄入调节剂的胸膜肺炎放线杆菌同系物fur在6C12株中失活。显示Fur或Fur样蛋白在包括大肠杆菌(志贺样毒素)、白喉杆菌(Corynebacterium diptheriae)(白喉毒素)、以及铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)(外毒素A)的多种病原体中调节毒力因子表达[Prince(1991)Mol.Microbiol 5 pp.2823-2831；Schmitt(1991)Infect Immun 59，pp.1899-1904；Calderwood(1987)J.Bcateriol 169，pp.4759-4764]。21D3和19B10株分别在胸膜肺炎放线杆菌rpoE和上游mclA(rseA)基因同系物中含有转座子插入。RpoE编码σ因子，σE/σ-24，是σ因子的胞质外功能亚家族的成员，其中σ因子作为效应分子在对包括热休克和氧化应激的胞质外刺激的反应中起作用[Raina(1995)EMBO J 14，pp.1043-1055；Rouviere(1995)EMBO J.141032-1042；Ades(1999)Genes Dev 13，pp.2449-2461；Dartigalongue(2001)J Biol Chem 276，pp.20866-20875]。在鼠伤寒沙门氏菌中，σE是毒力和免疫原性的重要决定子[Humphreys(1999)Infect Immun 67，pp.1560-1568l。MclA(RseA)是作为σE特异性抗σ因子起作用的内膜蛋白。MclA(RseA)在对胞质外应激反应中迅速降解，导致σE浓度增加以及引发应激反应[Ades(1999)Genes Dev 13，pp.2449-2461]。最后，观察到在胸膜肺炎放线杆菌固有感应luxS同系物中的插入(26D3株)降低胸膜肺炎放线杆菌毒力。最近，在EHEC和EPEC两者中，在由肠细胞脱落致病性岛的基因座所编码的肠定居因子的调控中涉及大肠杆菌luxS同系物[Sperandio(2001)J Bacteriol 183，pp.5187-5197；Sperandio(1999)Proc Natl Acad Sci USA 96，pp.15196-15201]。
(iv)运输胸膜肺炎放线杆菌基因aopA在23C9株中失活。AopA基因编码被检验的胸膜肺炎放线杆菌中所有血清型共有的48kDa免疫原性外膜蛋白[Cruz(1996)Infect Immun 64pp.83-90]。有趣地是，AopA与流感嗜血杆菌的Nqr1(解藻朊酸弧菌(Vibrio alginolyticus)的NqrA)高度同源(75％相同，84％相似)，编码钠-转运NADH-泛醌氧化还原酶(NQR)复合体的α链[Hayashi(1996)FEBS Lett 381pp.174-176；Beattie(1994)FEBS Lett 356pp.333-338]。NQR酶是连接呼吸的建立跨膜钠离子电化学梯度的Na+泵。得到的钠动力可用于溶质转运、ATP合成、以及鞭毛的旋转。这种偶联钠离子而不是质子的交替能量使细菌在碱性环境中能将细胞质的pH维持在接近中性。在解藻朊酸弧菌中NQR酶是最广泛研究的酶，据认为其是在pH和离子稳态中包含的酶[Beattie(1994)FEBS Lett 356pp.333-338；Unemoto(1993)J.BioenergBiomembr 25pp.385-391]。在霍乱弧菌(Vibrio cholerae)中，通过其对ToxT表达的影响在毒力因子表达的调节中涉及NQR复合体[Hase(1999)Proc Natl Acad Sci USA 96 pp.3183-3187]。
鉴定了胸膜肺炎放线杆菌毒力必需的几种不同推定的ABC运输系统的组分。ABC运输系统是在高分子跨细菌和真核生物细胞质膜的不同排列的运输(摄入或流出)中包含的系统。这些系统通常由三个基本部分构成一个或两个ATP酶，一个或两个整合膜蛋白以及底物特异的结合蛋白。13B12，0C5，19D1，和24A4株在ABC转运装置的ATP酶组分中含有转座子插入。在0C5株中失活的基因编码与原核半乳糖转运装置的MglA具有显著同源性的蛋白(Richarme等，J Biol Chem 2689473-9437，1993)。这种突变体的体内CI表明在呼吸道环境内某些糖的有限的有效性。在19D1和24A4株中被破坏的ORF与多杀巴斯德氏菌(分别是PM1728和PM0996)中未知特异性的运输系统的假定的ATP酶同源。在20D10株中，转座子使与杜氏嗜血菌(H.ducreyi)的znuA和流感嗜血杆菌的pzp1具有广泛同源性的基因失活(Lewis等，InfectImmun 675060-5068，1999；Lu等，J Biol Chem 27229033-29038 1997and FEMS Microbiol Lett 165129-1371998)。ZnuA(PZP1)是在锌摄取中起关键作用的周质锌-结合蛋白。在杜氏嗜血菌中znuA基因的失活导致在实验性软下疳的兔子模型中毒力显著降低(Lewis等，InfectImmun 675060-5068，1999)。在0D6株中，转座子在编码与多杀巴斯德氏菌(PM0997)和脑膜炎奈瑟氏球菌(N.Meningitidis)(NMB0549)的推定的固有膜蛋白同源的蛋白的基因中插入。在多杀巴斯德氏菌中PM0997位于紧靠在24A4株中失活的ATP酶的上游，提示它们是相同运输系统的一部分(May等，Proc Natl Acad Sci USA 983460-34652001)。这个基因也被Fuller等鉴定为apvD(Fuller等，Microb Pathog 2939-51 2000)，其预测的产物显示与大环内酯特异性ABC型流出蛋白MacA同源(Kobayashi等，J Bacteriol 1835639-5644 2001)。在突变体9D10中，被破坏的基因序列编码与调节镁流入和流出以及钴流出的CorC同源的蛋白(Gibson等，Mol Microbiol.，5pgs 2753-2762，)。
(v)应激在13A3株中，转座子在dnaJ基因同系物中插入。DnaJ是细菌的Hsp70伴侣系统的基本组分，其中其作为共伴侣起作用，提供对其Hsp70伴侣，DnaK，底物特异性[Rudiger(2001)EMBO J 20 pp.1042-1050]。除了它们在蛋白折叠和运输中的基本作用外，DnaK/DnaJ构成大肠杆菌热休克反应的初级应激感应和转导系统[Tomoyasu(1998)MolMicrobiol 30 pp.567-581]，其中它们通过改变热休克σ因子σ32的稳定性，调节热休克反应的诱导。有意义地，以前已经证明DnaK中的突变降低胸膜肺炎放线杆菌毒力，降低猪布鲁氏菌(Brucella suis)在人巨噬细胞样细胞系中的存活[Fuller(2000)Microb Pathog 29 pp.39-51；Kohler(1996)Mol Microbiol 20 pp.701-712]。
26B6株在htpG基因同系物中含有插入。HtpG是热休克诱导的分子伴侣，其在大肠杆菌中有助于在适度应激的细胞中细胞质蛋白的正确折叠[Thomas(2000)Mol Microbiol 36 1360-1370]。HtpG似乎不与伴侣蛋白稳定联系，关于其作用机理知道很少。建议HtpG用作固定器伴侣，在可进入DnaK/DnaJ的构象中短暂地维持de novo合成蛋白的子集[Freeman(1996)EMBO J 15 pp.2969-2979]。
13D8株在lon基因同系物中含有转座子插入。Lon(也称作蛋白酶La)是可热休克诱导的，依赖于ATP的丝氨酸蛋白酶，在除去异常折叠蛋白中起重要作用[Gottesman(1996)Annu Rev Genet 30 465-506；Suzuki(1997)Trend Biochem Sci 22 pp.118-123]。除了其被证明的作为应激反应蛋白酶的作用外，Lon也通过降解不稳定的调节蛋白作为基因表达的多效调节剂起作用，其中调节蛋白包括RcsA，荚膜合成的正调节剂[Keenleyside(1992)J Bacteriol 174 pp.8-16]和SulA，细胞分裂的抑制剂以及大肠杆菌(E.coli)SOS反应的组分[Mizusawa(1983)Proc NatlAcad Sci USA 80 pp.358-362]。最近在流产布鲁氏菌(Brucella abortus)中的研究已经证明Lon是在鼠巨噬细胞中生存和在感染的小鼠模型中野生型毒力所必需的[Robertson(2000)Mol Microbiol 35577-588]。
13C1株在prc基因同系物中携带转座子插入。Prc是一种周质蛋白酶，其天然底物似乎是包括TonB的膜蛋白[Gottesman(1996)Annu RevGenet 30 pp.465-506]。据推测Prc作为蛋白在周质间隙中的折叠和转换中所包含的伴侣蛋白起作用[Bass(1996)J Bacteriol 178 pp.1154-1161]。
序列表<110>Imperial College Innovations，Ltd.
<120>细菌毒力基因<130>MRM/PJG/24342<150>GB 0228691.2<151>2002-12-09<160>63<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>3344<212>DNA<213>胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)<400>1gaattctaaa ttgagctgcc aatgcttgtt gttcgtcaca attcacggtt gccaataaaa 60attgtgccgg attttcatcc gccaaccggc gtaataatga atccatttcc aatgaagcca 120cttctctcgg cgagataaaa ttaaacacga ccggcacttg tgtcgccgca ttccacactt 180cactaaaatt actttcggta acattgacaa aataattcat actcttttcc taatctaaaa 240aatcggcaaa ttatacttta tttttagtaa gccgtttcaa tcggtaaacc gcttctttcc 300caaccgtcga aaccgccttt cacgctatat acgcgatcaa aaccctgttc gactaaaaat 360tgtgcggtat tacgactgct cacgccgtga tagcacatga cgatgaccgg ttcttcataa 420tccacttcat ctaaaaaacg cccgtagctt tcattagtta aatggaacgc atcttgcgga 480tggctatagg cataacgacg tccatcacga atatccgcta aagtcgcacc ttcgttttcg 540attaattccc acgcctgatg cgggctgatc tcagtaaatg tttcactcat atttcatgct 600caataagaaa aataaaccaa ataaaattaa tcgactatac cataagacgt ttacaaaaat 660aaacgagaat acctattatt acgagttgaa ttttctgact tacttagtat aattgcaaac 720
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权利要求
1.一种减毒胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacilluspleuropneumoniae)细菌。
2.一种在细菌毒力所需基因中具有突变的减毒胸膜肺炎放线杆菌细菌。
3.一种在包含选自SEQ ID NO.1-56的核苷酸序列的基因中具有突变的减毒胸膜肺炎放线杆菌细菌。
4.一种具有在单个基因内或者在不同基因内发生多重突变的减毒胸膜肺炎放线杆菌细菌。
5.一种含有根据前面任何一项权利要求的减毒胸膜肺炎放线杆菌细菌的组合物。
6.根据权利要求5的组合物，包括许多不同的减毒胸膜肺炎放线杆菌细菌，其在相同毒力基因中具有不同突变和/或在两个或更多不同基因中具有相似，或不同突变的细菌。
7.根据权利要求5或6中任何一项的组合物，进一步包含一种或多种药理学上可接受的佐剂、稀释剂、载体、运载体和/或赋形剂。
8.根据权利要求5-7中任何一项的组合物，其被包装成适于通过静脉内、真皮内、肌内、乳房内、腹膜内和/或皮下注射、和/或通过口服、舌下、鼻、肛门或阴道输送施用的形式。
9.根据权利要求5-8中任何一项的组合物，其选自免疫原性组合物、治疗性(例如，预防性)组合物和疫苗。
10.根据权利要求9的组合物，其中该组合物是疫苗，所述疫苗施用给动物后赋予一定程度的交叉保护。
11.根据权利要求1-4中任何一项的减毒胸膜肺炎放线杆菌细菌在制备预防或减轻动物患胸膜肺炎放线杆菌感染的药物中的用途。
12.根据权利要求1-4中任何一项的减毒胸膜肺炎放线杆菌细菌在制备预防或减轻与胸膜肺炎放线杆菌感染相关症状的药物中的用途，如猪抗猪胸膜肺炎的预防性保护。
13.一种分离的多核苷酸，其编码在胸膜肺炎放线杆菌毒力中所天然涉及(例如，必需)的基因产物。
14.一种分离的多核苷酸，其编码不是在胸膜肺炎放线杆菌中天然存在的基因产物，但是在其中的表达能够调节(例如，降低)该细菌的毒力。
15.一种分离的多核苷酸，其不是在胸膜肺炎放线杆菌中天然存在的，但是其能够通过其与胸膜肺炎放线杆菌毒力基因或基因产物直接相互作用调节该细菌的毒力。
16.一种分离的多核苷酸，包括(a)选自SEQ ID NO.1-56的核苷酸序列；(b)编码多肽的核苷酸序列，其中多肽是由在(a)中所述的核苷酸序列编码；(c)与(a)和/或(b)的核苷酸序列或其互补链在中等到高度严格条件下杂交的核苷酸序列；或者(d)(a)-(c)的核苷酸序列中任何一种的片段，该片段保留(a)-(c)所述核苷酸序列的免疫学特性和/或生物学活性。
17.包含根据权利要求13-16中任何一项的多核苷酸的载体。
18.含有根据权利要求13-17的多核苷酸或载体的宿主细胞。
19.一种在基因中含有突变的减毒细菌，其中该基因包含在中等到高度严格的条件下能与SEQ ID NO1-56所定义的核苷酸序列中的任何一种杂交的核苷酸序列。
20.根据权利要求19的减毒细菌，具有在单个基因内或者在不同基因内发生的多重突变。
21.一种含有根据权利要求19或20的细菌的组合物。
22.根据权利要求21的组合物，包含许多不同的减毒细菌，其在相同毒力基因中具有不同的突变和/或在两个或多个不同基因中具有相似，或不同突变的细菌。
23.根据权利要求21或22中任何一项的组合物，进一步包含一种或多种药理学上可接受的佐剂、稀释剂、载体、运载体和/或赋形剂。
24.根据权利要求21-23中任何一项的组合物，其被包装成适于通过静脉内、真皮内、肌内、乳房内、腹膜内和/或皮下注射、和/或通过口服、舌下、鼻、肛门或阴道输送施用的形式。
25.根据权利要求21-24中任何一项的组合物，其选自免疫原性组合物、治疗性(例如，预防性)组合物和疫苗。
26.根据权利要求25的组合物，其中该组合物是疫苗，所述疫苗施用给动物后赋予一定程度的交叉保护。
27.根据权利要求19或20的细菌在制备治疗性治疗或预防性保护动物对抗相应野生型细菌(或者其不同的菌株或血清型)感染的药物中的用途。
28.一种分离的胸膜肺炎放线杆菌毒力多肽。
29.一种生产根据权利要求28的毒力多肽的方法，包括下列步骤(i)在允许多肽表达的条件下培养根据权利要求18的宿主细胞；以及(ii)从宿主细胞中，或者从其周围培养基中回收和任选地分离所表达的多肽。
30.根据权利要求13-16中任何一项的多核苷酸所编码的毒力多肽。
31.包含根据权利要求28或30的多肽的组合物。
32.根据权利要求31的组合物，进一步包含一种或多种药理学上可接受的佐剂、稀释剂、载体、运载体和/或赋形剂。
33.一种特异性识别根据权利要求13-16和权利要求28或30中任何一项的多核苷酸或多肽的抗体。
34.一种鉴定能够调节本发明的胸膜肺炎放线杆菌毒力基因，或者相关物种中同源基因功能的抗菌剂的方法。
35.根据权利要求34的方法，包括筛选在宿主细菌中能够干扰SEQ ID NO.1-56中任何一种所示核苷酸序列所编码的基因产物的表达和/或生物学活性的潜在的药剂。
36.通过权利要求34或35的方法鉴定的药剂。
37.一种通过使用寡核苷酸指导的三螺旋形成调节毒力基因转录的方法。
38.一种含有根据权利要求36的抗菌剂的组合物。
39.一种通过施用根据权利要求36或38中任何一项的抗菌剂或组合物治疗患巴斯德氏菌属(Pasteurellaceae)(例如，胸膜肺炎放线杆菌)感染动物的方法。
40.根据权利要求36或38的药剂或组合物在制备治疗巴斯德氏菌属感染和/或猪胸膜肺炎的药物中的用途。
全文摘要
减毒的胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacilluspleuropneumoniae)细菌在细菌毒力必需基因中具有突变。提供了基于该细菌的疫苗，以及分离的毒力基因和多肽及其用途。
文档编号A61K39/102GK1735689SQ200380108421
公开日2006年2月15日 申请日期2003年12月8日 优先权日2002年12月9日
发明者J·S·克罗尔, P·R·兰福德, J·博斯, A·贝德克, A·里克罗夫特, B·希恩 申请人:英皇学院创新有限公司