专利名称：促进皮肤、结缔组织、骨生长的组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种促进皮肤、结缔组织、骨生长的组合物及其制备方法，特别涉及一种促进皮肤、结缔组织、骨生长的生长因子类多肽组合物的制备方法和应用。
发明技术背景生长因子是一类以肽为基本单位的组合物，顾名思义它可促进体内各种细胞群的生长，细分起来，实际上其功能是多种多样的，其组成和功效类似，往往相辅相成。
血小板衍生因子(PDGF)是一种在循环血小板颗粒中发现的阳离子，热稳定物质，具有刺激旦白质合成和通过成纤维细胞刺激胶原旦白生成的作用，它还对成纤维细胞、平滑肌细胞和神经胶质细胞起促进细胞分裂和趋化作用。类胰岛素生长因子I和II(GIF-I、II)对细胞增殖、分化有促进作用，对伤口愈合有明显益处。表皮生长因子(EGF)能促进表皮细胞生长，对受损害皮肤修复有促进作用。转化生长因子α和β(TGFα、β)对粘膜生长和组织创伤修复过程有重要意义。纤维细胞生长因子(FGF)能促进组织正常生长、再生，加快衰老受伤的肌肉、皮肤胶原质、软骨和神经组织修复。神经生长因子(NGF)可刺激交感神经节生长。
已经有研究者提出利用血小板衍生因子(PDGF)来促进伤口愈合，GrotendorstG.(J.Trauma 24，No.9，549-552(1984))介绍了PDGF提高新胶原旦白的合成量，但未提出应用的方法和具体操作程序。此外，也有多个研究者报导了类胰岛素生长因子I能明显促进伤口愈合，但也未提出具体应用的途径及方法。已知的研究表明，其他多种生长因子均具有促进组织生长的作用。
多种生长因子包括PDGF和GIF均已能够通过基因重组的方式人工制备，但价格十分昂贵，保藏、贮存也较困难。
牛初乳中含有多种生长因子，包括类胰岛素生长因子、血小板衍生因子、表皮生长因子、神经生长因子、骨骼生长因子、成纤维生长因子、转移生长因子等丰富的生长因子群。
中国发明专利(申请号96116428)公开的技术，介绍了从牛初乳中提取与类胰岛素生长因子结合旦白相结合的类胰岛素生长因子的方法，但这种方法不能提取高纯度的类胰岛素生长因子。
本发明所要解决的技术问题是，从牛初乳中制备对皮肤、结缔组织、骨生长有促进作用的生长因子群制剂，降低生长因子制剂的制备成本，通过单独应用上述制剂或联合应用基因重组生长因子，设计有效促进皮肤、结缔组织、骨生长，促进伤口愈合的组合物，并应用于临床。
发明内容
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是，应用超滤技术从牛初乳中提取生长因子群，经超滤浓缩后冷冻干燥制备粉状物。应用牛初乳中制备的生长因子制剂，或联合应用基因重组生长因子，促进皮肤、结缔组织、骨生长，促进伤口愈合，并设计具体应用方案将这些组合物应用于治疗伤口、促进骨生长或牙齿生长，并应用于化妆品中。
本发明的技术特征是，从牛初乳中提取生长因子群的方法是，收集新鲜或冷冻保存的牛初乳，采用离心方式去除脂肪，去脂牛初乳用无菌蒸镏水稀释后，用低分子量超微滤膜分离过滤，收集上清液后用超滤膜浓缩水份，浓缩物冷冻干燥制粉，该制剂内含丰富的生长因子群，为了进一步增加收获率，将超滤分离的残留物，用酸制剂调PH至强酸性，促进生长因子及其结合旦白之间的连接中断，使生长因子游离出来，然后再次用低分子量超滤膜分离过滤，收集上清液后用碱液调节PH至弱酸性或中性，浓缩水份后冷冻干燥制备干粉。
本发明的技术特征是，从牛初乳中提取生长因子群也可以采用另一种方法，脱脂牛初乳直接用酸液调节PH至强酸性，使生长因子从结合旦白中游离出来，用低分子量的超微滤膜直接分离过滤，收集上清液，用碱性剂调PH至弱酸性或中性，经浓缩去除水份后冷冻干燥制备干粉，这种制剂内含纯度较高的生长因子群，尤其IGF含量高。
本发明的技术特征是，采用酸制剂调整脱脂初乳的PH值至强酸性，采用的酸制剂可以是HCL或其他酸制剂，调整PH值至2.2～3.5，优选2.8～2.9，调整PH值至规定的区间后，用分子量为8,000～20,000的超滤膜，采用常规超滤设备，最理想的是采用切面交错流体超滤设备进行分离，收集过滤液，用碱性制剂调整过滤液的PH值至5.5～7.5，优选5.8～6.2，调整PH值后的过滤液采用分子量为3,000～6,000的超滤膜，优选为分子量4,000～5,000超滤膜，采用常规超滤设备浓缩至起始容量10％～60％，优选20％～30％后，送至冷冻干燥设备，制备冷冻干燥粉，内含丰富的类胰岛素生长因子。在调整PH值后，也可以在过滤液中加入相当于过滤液1倍～5倍，优选2倍～3倍的无菌蒸镏水稀释过滤液后进行浓缩，尤其采用切面交错流体超滤装置时更应采用后一步骤。
本发明的技术特征是，也可以采用另一途径和方法制备牛初乳中生长因子群，其方法是脱脂牛初乳用分子量8,000～15,000的超微滤膜分离过滤，收集上清液，用分子量为4000～6000的超微滤膜浓缩水份至原体积10％～20％，送入冷冻干燥装置制备干粉，超滤分离的残余物用2N HCL调节PH值至2.7～2.9，促使与结合旦白结合状态的生长因子游离，用分子量为10,000～20,000的超微滤膜分离过滤，收集上清液，用2N NaOH调节PH值至5.8～7.0后，用分子量为4000～6000的超微滤膜浓缩水份至原体积20％～30％，冷冻干燥制备干粉，制剂内富含多种生长因子。
本发明的技术特征是，通过将有效量的本发明方法制备的制剂施加于伤口上，治愈患者的外部伤口，这些外部伤口包括但不限于褥疮、裂伤、烧伤、手术刀口、皮肤溃疡、糖尿病人久治不愈的伤口等，上述制剂通过促进上皮和结缔组织的生长及促进旦白质和胶原的合成，帮助愈合或者至少部份愈合伤口，本发明方法制备的制剂治疗伤口比不进行处理(即没有施加外源剂)，能达到更好的效果。
本发明的技术特征是，通过对病人施加本发明制备的制剂，最好是向受伤的区域或缺骨的区域施加有效量的上述制剂，促进患者骨质的再生，上述制剂通过促进结缔组织、骨质和牙骨质的生长及刺激旦白质和胶原的合成，帮助骨质再生，或至少部份再生，采用本发明的制剂促进骨质再生比不进行处理(即不用外源剂处理)，达到更好的效果。
本发明的技术特征是，在本发明上述制剂内加入某些基因重组的生长因子，包括但不限于血小板衍生因子(PDGG)和类胰岛素生长因子(GIF)，能增强本发明制剂促进皮肤、结缔组织、骨生长的效果，用于治疗患者外伤能取得更好的疗效。可以在本发明制剂内单独加入血小板衍生因子(PDGF)，也可以在本发明制剂内单独加入类胰岛素生长因子(GIF)，上述组份的单独加入能提高本发明制剂的治疗效果，但PDGF和GIF同时加入本发明制剂内能达到更好的治疗效果，PDGF和GIF加入的比例为1∶5到10∶1的范围内，最佳结果是两者之比为1∶1～2∶1之间。
本发明的技术特征是，在本发明上述制剂单独应用或与其他生长因子制剂联合应用时，组合物是通过在一种药物学上可接受的载体物质，例如在医药公司或医药商店可购买到的惰性凝胶或液体(例如，加有清旦白或甲基纤维素的盐水)，将本发明的制剂和/或组合的其他生长因子制剂(例如基因重组生长因子制剂)相结合来制取的。
上述惰性的凝胶或液体，以及基因重组的生长因子，都可以在生物公司、医药公司、制药厂购买到商品化产品。
本发明的技术特征是，本发明的上述制剂可以单独应用，也可以加入其他形式的生长因子制剂(例如基因重组生长因子制剂)联合应用，这些生长因子包括但不限于类胰岛素生长因子、表皮生长因子、血小板衍生因子等。上述组合物可以添加到化妆品中，能刺激正常皮肤的生长和细胞的修复，对皮肤的保护和保养有很重要作用。上述组合物对皮肤的保护和保养比未加入上述组合物的化妆品有明显的效果。
本发明的有益效果是，本发明的上述制剂和/或联合应用的上述组合物为治疗患者的外部伤口和骨质生长不佳提供了一个安全、快速、有效的方法，本组合物与自然治疗(即不加外源剂)相比增强了皮肤、结缔组织、骨质的形成。促进新的结缔组织形成比不加外源剂治疗大约增加20％，促进上皮组织生长比不加外源剂治疗增加80％，得到的上皮组织层更厚，并且还包含更多的与新的结缔组织相连接的上皮突起。因此，它结合得更牢固，更有保护性，此外，疤痕形成被减至最小。上述组合物还为有牙周疾病史的患者的结缔组织和骨质再生提供了一种快速有效的方法，同自然治疗相比，组合物增强了结缔组织和骨质的形成。此外，上述组合物为皮肤的保护和保养提供了一个有效的方法，可以明显改善皮肤的营养，促进皮肤表皮细胞代谢，增强皮下结缔组织增生，增加皮肤弹性，减少皱纹产生。
具体实施例方式
下面通过实施例对本发明作进一步说明实施例1从牛初乳中制备生长因子群收集牛初乳，用3000转/分速度离心脱脂，用2倍量蒸镏水稀释脱脂牛初乳，采用分子量为12000的超微滤膜用板框式超滤器过滤分离，收集上清液，采用分子量为5000的超微滤膜浓缩至原体积20％，浓缩物送入冷冻干燥装置，冷冻干燥制备成白色粉末，制剂内含有多种生长因子群。
实施例2从牛初乳中制备生长因子群脱脂牛初乳用2N HCL调PH至2.8，用分子量为15000的超微滤膜，采用美国Pall公司生产的交错切面流体超滤装置(TFF)分离过滤，收集上清液，用2N NaOH调PH至6.2，用同样装置，但采用分子量为4000的超微滤膜浓缩至原体积30％，浓缩物送入冷冻干燥机制备干粉，制剂内富含各种生长因子，尤其类胰岛素生长因子(GIF)含量最高，经类胰岛素生长因子放射免疫药盒测定，每克干粉中含0.5微克类胰岛素生长因子。
实施例3制备促进伤口愈合的凝胶取实施例1制备的干粉3克加入甲基纤维素凝胶内，用磁力搅拌器搅拌混匀。
实施例4制备促进伤口愈合的生长因子组合物取实施例2制备的干粉2克，取重组基因血小板衍生因子提纯制剂(PDGF)10微克，(从Amgen公司Thousand oaks，CA，USA购买)，取重组基因类胰岛素生长因子提纯制剂10微克(从上述同一公司购买)，将上述组合悬浮于生物相容凝胶内(含清旦白的盐水)，用磁力搅拌器搅拌均匀10分钟备用。
实施例5
将10～15公斤的约克夏小白猪麻醉，胸背部剃毛，局部用70％酒精消毒，用电刀开出1.5cm×2.5cm深度为0.5mm切口，并使上皮和埋在下面的真皮旦白质去除，在相隔4cm处做同一切口，作为对照组，取实施例4制备的制剂施用于伤口，第三天～第十天采集活检样品，在显微镜下进行观察，发现施用本发明制剂组的伤口具有较厚的结缔组织和上皮层，并有更广泛的上皮突起同上皮层相连。
实施例6选择数只有自然发生牙周病的小猎犬，用超声波仪器探测到有50％-70％骨缺损的牙齿，进行根整平术，用实施例4制作的制剂施放在病牙上，对牙周组织和骨头观察显示，齿根表面存在着新骨形成的明显区域，并在与新骨邻接的齿根表面有一层类似牙骨质的沉积物。
权利要求
1.本发明涉及一种促进皮肤、结缔组织、骨生长的组合物及其制备方法，特别涉及一种促进皮肤、结缔组织、骨生长的生长因子类多肽组合物的制备方法和应用，其特征是，应用超滤技术从牛初乳中提取生长因子群，经超滤浓缩后冷冻干燥制备粉状物。应用牛初乳中制备的生长因子制剂，或联合应用基因重组生长因子，促进皮肤、结缔组织、骨生长，促进伤口愈合，并设计具体应用方案将这些组合物应用于治疗伤口、促进骨生长或牙齿生长，并应用于化妆品中。
2.按照权利要求1所述的方法，本发明的技术特征是，从牛初乳中提取生长因子群的方法是，收集新鲜或冷冻保存的牛初乳，采用离心方式去除脂肪，去脂牛初乳用无菌蒸镏水稀释后，用低分子量超微滤膜分离过滤，收集上清液后用超滤膜浓缩水份，浓缩物冷冻干燥制粉，该制剂内含丰富的生长因子群，为了进一步增加收获率，将超滤分离的残留物，用酸制剂调PH至强酸性，促进生长因子及其结合旦白之间的连接中断，使生长因子游离出来，然后再次用低分子量超滤膜分离过滤，收集上清液后用碱液调节PH至弱酸性或中性，浓缩水份后冷冻干燥制备干粉。
3.按照权利要求1所述的方法中，本发明的技术特征是，从牛初乳中提取生长因子群也可以采用另一种方法，脱脂牛初乳直接用酸液调节PH至强酸性，使生长因子从结合旦白中游离出来，用低分子量的超微滤膜直接分离过滤，收集上清液，用碱性剂调PH至弱酸性或中性，经浓缩去除水份后冷冻干燥制备干粉，这种制剂内含纯度较高的生长因子群，尤其IGF含量高。
4.按照权利要求1所述的方法中，本发明的技术特征是，采用酸制剂调整脱脂初乳的PH值至强酸性，采用的酸制剂可以是HCL或其他酸制剂，调整PH值至2.2～3.5，优选2.8～2.9，调整PH值至规定的区间后，用分子量为8,000～20,000的超滤膜，采用常规超滤设备，最理想的是采用切面交错流体超滤设备进行分离，收集过滤液，用碱性制剂调整过滤液的PH值至5.5～7.5，优选5.8～6.2，调整PH值后的过滤液采用分子量为3,000～6,000的超滤膜，优选为分子量4,000～5,000超滤膜，采用常规超滤设备浓缩至起始容量10％～60％，优选20％～30％后，送至冷冻干燥设备，制备冷冻干燥粉，内含丰富的类胰岛素生长因子。在调整PH值后，也可以在过滤液中加入相当于过滤液1倍～5倍，优选2倍～3倍的无菌蒸镏水稀释过滤液后进行浓缩，尤其采用切面交错流体超滤装置时更应采用后一步骤。
5.按照权利要求1所述的方法中，本发明的技术特征是，也可以采用另一途径和方法制备牛初乳中生长因子群，其方法是脱脂牛初乳用分子量8,000～15,000的超微滤膜分离过滤，收集上清液，用分子量为4000～6000的超微滤膜浓缩水份至原体积10％～20％，送入冷冻干燥装置制备干粉，超滤分离的残余物用2N HCL调节PH值至2.7～2.9，促使与结合旦白结合状态的生长因子游离，用分子量为10,000～20,000的超微滤膜分离过滤，收集上清液，用2N NaOH调节PH值至5.8～7.0后，用分子量为4000～6000的超微滤膜浓缩水份至原体积20％～30％，冷冻干燥制备干粉，制剂内富含多种生长因子。
6.按照权利要求1所述的方法中，本发明的技术特征是，通过将有效量的本发明方法制备的制剂施加于伤口上，治愈患者的外部伤口，这些外部伤口包括但不限于褥疮、裂伤、烧伤、手术刀口、皮肤溃疡、糖尿病人久治不愈的伤口等，上述制剂通过促进上皮和结缔组织的生长及促进旦白质和胶原的合成，帮助愈合或者至少部份愈合伤口，本发明方法制备的制剂治疗伤口比不进行处理(即没有施加外源剂)，能达到更好的效果。
7.按照权利要求1所述的方法中，本发明的技术特征是，通过对病人施加本发明制备的制剂，最好是向受伤的区域或缺骨的区域施加有效量的上述制剂，促进患者骨质的再生，上述制剂通过促进结缔组织、骨质和牙骨质的生长及刺激旦白质和胶原的合成，帮助骨质再生，或至少部份再生，采用本发明的制剂促进骨质再生比不进行处理(即不用外源剂处理)，达到更好的效果。
8.按照权利要求1所述的方法中，本发明的技术特征是，在本发明上述制剂内加入某些基因重组的生长因子，包括但不限于血小板衍生因子(PDGG)和类胰岛素生长因子(GIF)，能增强本发明制剂促进皮肤、结缔组织、骨生长的效果，用于治疗患者外伤能取得更好的疗效。可以在本发明制剂内单独加入血小板衍生因子(PDGF)，也可以在本发明制剂内单独加入类胰岛素生长因子(GIF)，上述组份的单独加入能提高本发明制剂的治疗效果，但PDGF和GIF同时加入本发明制剂内能达到更好的治疗效果，PDGF和GIF加入的比例为1∶5到10∶1的范围内，最佳结果是两者之比为1∶1～2∶1之间。
9.本发明的技术特征是，在本发明上述制剂单独应用或与其他生长因子制剂联合应用时，组合物是通过在一种药物学上可接受的载体物质，例如在医药公司或医药商店可购买到的惰性凝胶或液体(例如，加有清旦白或甲基纤维素的盐水)，将本发明的制剂和/或组合的其他生长因子制剂(例如基因重组生长因子制剂)相结合来制取的。
10.本发明的技术特征是，本发明的上述制剂可以单独应用，也可以加入其他形式的生长因子制剂(例如基因重组生长因子制剂)联合应用，这些生长因子包括但不限于类胰岛素生长因子、表皮生长因子、血小板衍生因子等。上述组合物可以添加到化妆品中，能刺激正常皮肤的生长和细胞的修复，对皮肤的保护和保养有很重要作用。上述组合物对皮肤的保护和保养比未加入上述组合物的化妆品有明显的效果。
全文摘要
本发明涉及一种促进皮肤、结缔组织、骨生长的组合物及其制备方法，特别涉及一种促进皮肤、结缔组织、骨生长的生长因子类多肽组合物的制备方法和应用，其特征是，应用超滤技术从牛初乳中提取生长因子群，经超滤浓缩后冷冻干燥制备粉状物，应用牛初乳中制备的生长因子制剂或联合应用基因重组生长因子，促进皮肤、结缔组织、骨生长，促进伤口愈合，并设计具体应用方案将这些组合物应用于治疗伤口、促进骨生长或牙齿生长，并应用于化妆品中。
文档编号A61P19/00GK1557478SQ20041001585
公开日2004年12月29日 申请日期2004年1月15日 优先权日2004年1月15日
发明者高春平 申请人:高春平