专利名称：具有多种生物活性的多肽营养剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种活性多肽的制备方法及应用，尤其涉及一种以乳蛋白为原料，制备具有多种生物活性的多肽营养剂的方法及应用。
发明技术背景牛奶中蛋白质经蛋白水解成为多肽后，这些多肽具备多种生物活性，其中与内啡肽作用相似的多肽能够产生镇静作用和抑制食欲的作用，帮助对抗压力，改善睡眠和控制体重，帮助减肥；其中具有免疫调节功能的多肽，通过刺激免疫细胞增殖和成熟，刺激免疫细胞活性而起到调节人体免疫功能的作用；具有抗微生物功能的多肽，能够有效抑制人体内微生物的繁殖；抗凝血作用的多肽，能够抑制血小板凝集，防止血栓形成，预防动脉粥样硬化；而具有降压作用的多肽，则通过抑制血管紧张素转换酶(ACE)的作用，阻止血管紧张素I转变为血管紧张素II，对抗高血压；磷酸多肽具有吸附金属离子在人体小肠下部弱碱性区域形成可溶性金属盐，促进钙、铁、锌、镁等人体微量元素的吸收，并具有防止龋齿作用。乳蛋白活性多肽的上述作用已经被多项动物实验和人体试验所证实。
现代研究证实，小分子多肽比等量游离氨基酸具有更高的生物活性和营养价值，按照多肽类的氨基酸的组成不同，其功能和生物学效应也不同，而且，多肽类可以通过肠道全部吸收利用，直接通过血液循环转运至全身不同的器官和组织，直接发挥生物活性功能，而蛋白质则不能直接吸收利用，必须通过消化才能吸收，利用率也低。
作为人体重要蛋白质来源的牛奶蛋白，尽管营养丰富，但是部份人群对牛奶过敏，尤其婴幼儿对牛奶蛋白过敏的现象普遍存在，限制了其应用，但是通过蛋白水解过程将蛋白质降解为多肽后，过敏现象明显改善，既使对牛奶过敏的人群，也能应用经乳蛋白水解后的乳蛋白多肽。
现代研究进一步证实，人体肠道内寄生的乳酸杆菌类细菌，对各种免疫球蛋白和过敏原有对抗作用，经过乳酸杆菌降解的蛋白质致敏性明显降低，并能同时诱发人体的免疫耐受现象，具有明显的抗过敏效应。
从人体肠道分离的乳酸杆菌(Lactobacillus GG，美国菌种收集中心编号ATCC53103)在实验室中已经被证实能够促进人体免疫球蛋白A对抗饮食中致敏原所致的过敏反应(Isolauri et al.1993)。
目前，乳蛋白水解主要通过蛋白分解酶水解的方法进行蛋白水解过程，中国专利(申请号00813554)公布的技术介绍了应用蛋白水解产物给对牛奶过敏的婴幼儿，美国专利(5405835)公开的技术介绍了用蛋白分解酶水解乳蛋白的方法，但是上述方法并不具有上述乳酸杆菌分解蛋白产生的抗过敏作用，而且，上述方法制备的多肽并未经过超滤过程，不能控制蛋白水解多肽产品的分子量大小。
本发明所要解决的技术问题是，通过组合多种蛋白分解方法制备具有抗过敏作用及多项生物活性的乳蛋白多肽。
发明内容
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案，其特征是，以牛奶和各种乳蛋白为原料，通过接种乳酸杆菌在乳蛋白溶液内，初步水解乳蛋白，灭菌过滤后，用蛋白水解酶进一步分解蛋白质，在水解过程中，用超滤膜分离过滤已完全水解的小分子多肽，让大分子量蛋白质持续水解，最后通过超滤膜浓缩后干燥制粉，内含抗过敏及多项生物活性的多肽。
本发明的技术特征是，采用的原料可以是新鲜牛奶、冷冻牛奶、脱脂牛奶、酪蛋白粉、干酪酸钠、干酪酸钾、工业干酪素、甜乳清粉、酸乳清粉、浓缩乳清蛋白粉，也可以是制备干酪后的副产品乳清。如果采用新鲜牛奶或冷冻牛奶作为原材料，则需要采用离心方式脱脂，并采用高温进行巴氏消毒，离心速度为4,000～6,000转/分，离心时间为20～40分钟，巴氏消毒在0.2Mpa，130℃温度，持续5～15分钟；如果是采用脱脂无糖奶粉、各种乳清蛋白粉、酪蛋白粉作为原料，则应加蒸馏水调配成浓度为10％的蛋白溶液，溶解过程中，可以加热至50℃帮助溶解过程；如果是以干酪酸钠或干酪酸钾为原料，则应用蒸馏溶解后，加酸剂调PH至4.6，加热至40～50℃凝固酪蛋白，离心后收集凝固的酪蛋白，调PH至6.5～7.5溶解酪蛋白。
本发明的技术特征是，采用乳酸杆菌进行初步蛋白水解过程，以降低过敏性，提高抗过敏作用，选择的乳酸杆菌是正常寄生于人体胃肠道的乳酸杆菌，这些乳酸杆菌可以通过分泌蛋白分解酶而发挥水解蛋白的作用，选择的乳酸杆菌在美国菌种收集中心编号为ATCC53103(Strain Lactobacillus GG)，也可以选择短乳酸杆菌作为蛋白分解的乳酸杆菌菌种。
本发明的技术特征是，在35℃±1℃温度下接种培养成熟的乳酸杆菌液体菌种，加入量为10±2％(体积/体积百分比)，培养时间为72～96小时，在培养前期3～5小时应在有微量通风且有搅拌的条件下进行，在培养结束后，高温灭菌，温度为120～135℃，持续时间为10～20分钟，灭菌后用分子量为0.1mu.m的微滤膜分离过滤细菌，收集水解的蛋白溶液上清液。
本发明的技术特征是，在被乳酸杆菌蛋白水解的蛋白水解上清液内加入胰蛋白酶，加酶量为0.02～0.6％，调PH值为3～6，在30℃～50℃温度下酶解2～8小时，水解蛋白质，在酶解过程结束后，迅速升温至90℃保温5分钟，灭活胰蛋白酶，用分子量为8,000～12,000的超滤膜分离过滤蛋白水解溶液，去除未完全水解的大分子蛋白，收集过滤上清液，喷雾干燥或真空干燥成粉。
本发明的技术特征是，为了保证蛋白水解过程更彻底，一种改良的方法可能会产生更好的效果，这种方法的程序是，在用蛋白分解酶进行蛋白水解1小时后，采用交错切面流体超滤装置并采用分子量为10,000D的超滤膜，持续对已部份水解的蛋白水解液分离，分子量小于10,000的小分子多肽被收集，而大分子量的未水解蛋白再循环到酶解反应锅内继续水解，反复循环，直至水解过程结束。
本发明的技术特征是，本发明方法制备的具有多种生物活性的多肽，具有抗过敏，抗高血压，促进钙、磷、铁、锌等微量元素吸收，降低胆固醇，改善脂质代谢，抗血栓，防止动脉粥样硬化，促进大脑及神经发育，提高记忆力，防止微生物繁殖，调节免疫功能，对抗压力，改善睡眠，抑制食欲，控制体重等多种作用。
本发明的技术特征是，本发明方法制备的活性多肽中，含有VAF、LLF、SPYL、Ala-Arg-Ala-Lys，Leu-Pro-Leu-Arg-Phe等多肽，通过抑制血管紧张素转换酶(ACE)，产生对抗高血压和延缓动脉硬化的作用，含有的VEPIPY多肽能够和免疫球蛋白结合，形成MAbIC3，这种抗体能够增强人体免疫功能；其中X-酪蛋白、P-酪蛋白和K-酪蛋白水解后产生的YPFPGPI肽，YPFP-NH2肽，RYLGYLE肽，SRYPSY-OME肽具有内啡肽样作用，除具有镇静、镇痛作用外，还能帮助对抗压力，改善睡眠，并具有抑制食欲，减少胃肠蠕动而发挥控制体重作用；其中磷酸多肽促进人体吸收钙、铁、锌、镁等微量元素；其中的AVPYP肽、GLY-His-Lys肽，Lys-His-Gly-NH2肽具有催乳功能；此外，活性多肽还具有促进大脑及神经发育，提高记忆力，抗毒解毒，促进细胞繁殖，增强吞噬细胞功能，激活β淋巴细胞，保护皮肤，防止黑色素沉淀，促进松果体再生等多种作用。
本发明的技术特征是，本发明方法制备的活性多肽中基本不含致敏的蛋白质，并具有抗过敏及诱发免疫耐受作用，而且其中含有多种人类必需氨基酸和非必需氨基酸，适合用于对牛奶过敏的婴幼儿及其他人群作为营养补充剂。
本发明的技术特征是，本发明方法制备的活性多肽，可以作为食品添加剂或营养强化剂制备活性肽婴幼儿奶粉、活性肽儿童保健食品、活性肽中老年保健食品、保健饮料、运动员专用增强体能饮料、活性肽康复食品等多种强化功能食品或保健食品，也可以作为生物活性组份，制备具有治疗作用的特殊保健食品，包括但不限于降压保健食品，防治冠心病保健食品，改善睡眠保健食品，减肥保健食品，增强免疫功能的保健食品，防治骨质疏松的保健食品等。
本发明的技术特征是，本发明方法制备的活性多肽，也可以与药物辅料制备成各种药剂形式，包括但不限于口服液、片剂、冲剂、颗粒剂、胶囊剂、丸剂、水剂、散剂、软胶囊剂、膜剂等多种剂型，以口服方式施用。
本发明的有益效果是，通过乳酸杆菌和蛋白水解酶的双重蛋白水解作用，以及超滤分离，获得的多肽分子量得到很好控制，从而消除过敏性，增加多种活性多肽数量，发挥更强的生物活性。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明实施例1以牛奶为原料制备活性多肽收集新鲜牛奶100升，以离心方式脱脂，离心速度6000转/分，离心时间20分钟，脱脂牛奶以130℃高温持续10分钟进行巴氏消毒，采用已培养成熟的短乳酸杆菌液体菌种，投料量为10％，投料后充分搅拌并保持微量通风3～5小时，培养时间90小时，以120℃高温持续15分钟杀灭乳酸杆菌，以孔径为0.1mu.m的微滤膜滤除乳酸杆菌，收集过滤上清液，加入0.4％的胰蛋白酶，调节PH值至5.5在50℃温度下酶解6小时，酶解完成后升温至90℃维持10分钟灭活胰蛋白酶，用分子量为10,000D的超滤膜，采用交错切面流体超滤装置(美国Pall公司生产的TFF装置)过滤分离，去除末完全水解的大分子蛋白，收集超滤上清液直接喷雾干燥成粉，内含多种生物活性多肽。
实施例2测试蛋白水解液各项指标采集实施例1制备的干粉进行测试，水解度91％，氨基氮260/ml，TCA可溶性氮350mg/ml，MM＞500＝18.5％，1000＞MM＞500＝16.8％，2000＞MM＞1000＝28.2％，3000＞MM＞2000＝13.8％，5000＞MM＞3000＝17.5％，MM＞5000＝5.2％。
权利要求
1.本发明涉及一种活性多肽的制备方法及应用，尤其涉及一种以乳蛋白为原料，制备具有多种生物活性的多肽营养剂的方法及应用，其特征是，以牛奶和各种乳蛋白为原料，通过接种乳酸杆菌在乳蛋白溶液内，初步水解乳蛋白，灭菌过滤后，用蛋白水解酶进一步分解蛋白质，在水解过程中，用超滤膜分离过滤已完全水解的小分子多肽，让大分子量蛋白质持续水解，最后通过超滤膜浓缩后干燥制粉，内含抗过敏及多项生物活性的多肽。
2.按照权利要求1所述的方法，本发明的技术特征是，采用的原料可以是新鲜牛奶、冷冻牛奶、脱脂牛奶、酪蛋白粉、干酪酸钠、干酪酸钾、工业干酪素、甜乳清粉、酸乳清粉、浓缩乳清蛋白粉，也可以是制备干酪后的副产品乳清，如果采用新鲜牛奶或冷冻牛奶作为原材料，则需要采用离心方式脱脂，并采用高温进行巴氏消毒，离心速度为4,000～6,000转/分，离心时间为20～40分钟，巴氏消毒在0.2Mpa，130℃温度，持续5～15分钟；如果是采用脱脂无糖奶粉、各种乳清蛋白粉、酪蛋白粉作为原料，则应加蒸馏水调配成浓度为10％的蛋白溶液，溶解过程中，可以加热至50℃帮助溶解过程；如果是以干酪酸钠或干酪酸钾为原料，则应用蒸馏溶解后，加酸剂调PH至4.6，加热至40～50℃凝固酪蛋白，离心后收集凝固的酪蛋白，调PH至6.5～7.5溶解酪蛋白。
3.按照权利要求1所述的方法，本发明的技术特征是，采用乳酸杆菌进行初步蛋白水解过程，以降低过敏性，提高抗过敏作用，选择的乳酸杆菌是正常寄生于人体胃肠道的乳酸杆菌，这些乳酸杆菌可以通过分泌蛋白分解酶而发挥水解蛋白的作用，选择的乳酸杆菌在美国菌种收集中心编号为ATCC53103(Strain Lactobacillus GG)，也可以选择短乳酸杆菌作为蛋白分解的乳酸杆菌菌种。
4.按照权利要求1所述的方法，本发明的技术特征是，在35℃±1℃温度下接种培养成熟的乳酸杆菌液体菌种，加入量为10±2％(体积/体积百分比)，培养时间为72～96小时，在培养前期3～5小时应在有微量通风且有搅拌的条件下进行，在培养结束后，高温灭菌，温度为120～135℃，持续时间为10～20分钟，灭菌后用分子量为0.1mu.m的微滤膜分离过滤细菌，收集水解的蛋白溶液上清液。
5.按照权利要求1所述的方法，本发明的技术特征是，在被乳酸杆菌蛋白水解的蛋白水解上清液内加入胰蛋白酶，加酶量为0.02～0.6％，调PH值为3～6，在30℃～50℃温度下酶解2～8小时，水解蛋白质，在酶解过程结束后，迅速升温至90℃保温5分钟，灭活胰蛋白酶，用分子量为8,000～12,000的超滤膜分离过滤蛋白水解溶液，去除未完全水解的大分子蛋白，收集过滤上清液，喷雾干燥或真空干燥成粉。
6.按照权利要求1所述的方法，本发明的技术特征是，为了保证蛋白水解过程更彻底，一种改良的方法可能会产生更好的效果，这种方法的程序是，在用蛋白分解酶进行蛋白水解1小时后，采用交错切面流体超滤装置并采用分子量为10,000D的超滤膜，持续对已部份水解的蛋白水解液分离，分子量小于10,000的小分子多肽被收集，而大分子量的未水解蛋白再循环到酶解反应锅内继续水解，反复循环，直至水解过程结束。
7.按照权利要求1所述的方法，本发明的技术特征是，本发明方法制备的具有多种生物活性的多肽，具有抗过敏，抗高血压，促进钙、磷、铁、锌等微量元素吸收，降低胆固醇，改善脂质代谢，抗血栓，防止动脉粥样硬化，促进大脑及神经发育，提高记忆力，防止微生物繁殖，调节免疫功能，对抗压力，改善睡眠，抑制食欲，控制体重等多种作用。
8.按照权利要求1所述的方法，本发明的技术特征是，本发明方法制备的活性多肽中，含有VAF、LLF、SPYL、Ala-Arg-Ala-Lys，Leu-Pro-Leu-Arg-Phe等多肽，通过抑制血管紧张素转换酶(ACE)，产生对抗高血压和延缓动脉硬化的作用，含有的VEPIPY多肽能够和免疫球蛋白结合，形成MAbIC3，这种抗体能够增强人体免疫功能；其中X-酪蛋白、P-酪蛋白和K-酪蛋白水解后产生的YPFPGPI肽，YPFP-NH2肽，RYLGYLE肽，SRYPSY-OME肽具有内啡肽样作用，除具有镇静、镇痛作用外，还能帮助对抗压力，改善睡眠，并具有抑制食欲，减少胃肠蠕动而发挥控制体重作用；其中磷酸多肽促进人体吸收钙、铁、锌、镁等微量元素；其中的AVPYP肽、GLY-His-Lys肽，Lys-His-Gly-NH2肽具有催乳功能；此外，活性多肽还具有促进大脑及神经发育，提高记忆力，抗毒解毒，促进细胞繁殖，增强吞噬细胞功能，激活β淋巴细胞，保护皮肤，防止黑色素沉淀，促进松果体再生等多种作用。
9.按照权利要求1所述的方法，本发明的技术特征是，本发明方法制备的活性多肽，可以作为食品添加剂或营养强化剂制备活性肽婴幼儿奶粉、活性肽儿童保健食品、活性肽中老年保健食品、保健饮料、运动员专用增强体能饮料、活性肽康复食品等多种强化功能食品或保健食品，也可以作为生物活性组份，制备具有治疗作用的特殊保健食品，包括但不限于降压保健食品，防治冠心病保健食品，改善睡眠保健食品，减肥保健食品，增强免疫功能的保健食品，防治骨质疏松的保健食品等。
10.按照权利要求1所述的方法，本发明的技术特征是，本发明方法制备的活性多肽，也可以与药物辅料制备成各种药剂形式，包括但不限于口服液、片剂、冲剂、颗粒剂、胶囊剂、丸剂、水剂、散剂、软胶囊剂、膜剂等多种剂型，以口服方式施用。
全文摘要
本发明涉及一种活性多肽的制备方法及应用，尤其涉及一种以乳蛋白为原料，制备具有多种生物活性的多肽营养剂的方法及应用，其特征是，以牛奶和各种乳蛋白为原料，通过接种乳酸杆菌在乳蛋白溶液内，初步水解乳蛋白，灭菌过滤后，用蛋白水解酶进一步分解蛋白质，在水解过程中，用超滤膜分离过滤已完全水解的小分子多肽，让大分子量蛋白质持续水解，最后通过超滤膜浓缩后干燥制粉，内含抗过敏及多项生物活性的多肽。
文档编号A61K35/20GK1557476SQ20041001611
公开日2004年12月29日 申请日期2004年2月4日 优先权日2004年2月4日
发明者高春平 申请人:高春平