专利名称：一组长效抗逆转录病毒的多肽及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种长效的抑制逆转录病毒融合的多肽。
背景技术：
美国发明专利，专利号为464933，公开了DP178多肽的638-673共36个氨基酸的多肽，这些多肽具有抗逆转录病毒的活性，特别是对HIV。尽管该发明中公开的抗病毒融合肽显示出有效地抗逆转录病毒和/或抗融合活性，但是这些多肽存在体内血浆半衰期短的缺陷，这主要是由于血清清除快和肽酶和蛋白酶的作用。因而极大地降低了多肽的有效抗病毒活性。所以需要一种延长现有抗病毒和/或抗融合的多肽半衰期并能够使多肽在体内维持更长久的抗病毒活性。
发明内容
本发明需要解决的技术问题之一是提供一组长效的抑制逆转录病毒融合的多肽。
本发明需要解决的技术问题之二是提供该多肽的制备方法。
本发明需要解决的技术问题之三是公开所述多肽的应用。
本发明的发明构思是这样的人免疫缺陷病毒HIV-1对细胞的感染过程如下(1)病毒外壳糖蛋白gp120和细胞表面CD4的结合，CD4是细胞对HIV-1病毒的初级受体；(2)外壳糖蛋白(env)与辅助受体如CCR5和CXCR4的结合；(3)病毒外壳糖蛋白gp41构象的改变，形成一种发夹前体；(4)折叠形成一种能够介导融合的中间构象，最后使得病毒与细胞膜融合并将病毒基因组导入目标细胞中。与细胞膜吸附的过程能够被结合到病毒糖蛋白和人CD4的抑制剂所阻断。
值得一提的是，HIV-1吸附过程能够被抑制gp120与细胞CD4的结合的化合物以及其类似物所抑制。因为gp120和CD4相互作用是病毒感染的前提。而且，对这样的化合物产生抗性的能力较低。
一系列研究表明，尽管N末端螺旋区的点突变会导致病毒外壳糖蛋白介导的膜融合的降低，但是并不影响gp120与gp41复合物的形成。这些突变蛋白的膜融合活性与突变位点的侧链疏水性相关。表明gp41在膜融合过程中起决定作用。
gp41的病毒外区域是最保守的，其中包含两个4-3疏水重复序列，可能与形成螺旋有关，N-端的4-3疏水重复序列紧接融合多肽，是膜融合所必需的；C-端的4-3疏水重复序列为穿膜区段。现阶段，合成的多肽融合抑制剂大多针对这两个重复区域。一种对应N-端重复序列的合成多肽在溶液中是高度螺旋化的，破坏螺旋结构的突变丧失了抗病毒活性。N-端重复序列中单一脯氨酸置换导致外壳糖蛋白完全丧失了膜融合的能力。上述结果表明gp41中两个4-3疏水重复序列以及由其形成的螺旋化的螺旋结构是HIV-1外壳糖蛋白介导的膜融合的关键。DP178 gp41C-端的638-673序列，能够特异性的和gp41N-端重复序列相互作用，抑制HIV-11外壳糖蛋白介导的膜融合。
gp41的病毒外区域突变研究表明gp41的C-端的638-673序列(YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF)的保守性为没有改变的氨基酸位点为L(8，23)，Q(16)，N(19)，W(35)高度保守的氨基酸位点为L(24，26，32)，Q(15)，E(20)，W(29，33)高度可变的氨基酸位点为S(3，7)，L(4)，E(10)其余为中度可变的氨基酸位点。
研究表明多肽的甲基化不但可以提高多肽对蛋白酶的稳定性，还可以提高多肽在体内的半衰期，提高其穿过细胞膜的能力。Fortana Haviv等发现亮丙瑞林，那发瑞林等多肽的氨基酸的甲基化可以提高多肽对胰凝乳蛋白酶的稳定性，并且Ser(4)的甲基化还可以提高多肽在体内的半衰期，Tyr(5)的甲基化可以降低多肽在体内的清除率。David J.Gordon等研究发现Amyloid的同系物Aβ16-22经过甲基化后，提高了对蛋白酶的稳定性。
本发明在设计时充分考虑了gp41的膜外区、穿膜区的特点，与DP178结合的特点，以及gp41的638-673序列中氨基酸的保守性，蛋白酶剪切位点(K，R，W，L，S，I)、在体内容易被攻击的不稳定侧链基团的基础上设计了一系列甲基化修饰的多肽。经过多肽合成后，从中筛选到5条甲基化多肽能够在体外抑制HIV和细胞膜的融合而且活性基本保持不变，这5条甲基化多肽分别在Ile(9)，Asn(14)，Lys(18，28)，Leu(4，8，26，32)，Ser(3，7，12，30)，Trp(33，35)等位点进行了N-甲基化修饰。
本发明公开的序号为1-5的多肽序列如下(序列中甲基化用(Me)表示，标在被甲基化的氨基酸之前)1、CH3CO-Tyr Thr(Me)Ser(Me)Leu Ile His(Me)Ser(Me)Leu Ile Glu Glu(Me)Ser GlnAsn Gln Gln Glu(Me)Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu Glu(Me)Leu Asp(Me)Lys(Me)TrpAla(Me)Ser Leu(Me)Trp Asn(Me)Trp Phe-NH22、CH3CO-Tyr Thr(Me)Ser Leu Ile His(Me)Ser(Me)Leu Ile Glu Glu(Me)Ser Gln AsnGln Gln Glu(Me)Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu Glu(Me)Leu Asp Lys(Me)Trp Ala(Me)Ser Leu(Me)Trp Asn(Me)Trp Phe-NH23、CH3CO-Tyr Thr(Me)Ser(Me)Leu Ile His(Me)Ser Leu Ile Glu Glu(Me)Ser Gln AsnGln Gln Glu Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu Glu Leu Asp(Me)Lys Trp Ala(Me)SerLeu(Me)Trp Asn Trp Phe-NH24、CH3CO-Tyr Thr(Me)Ser Leu Ile His(Me)Ser Leu(Me)Ile Glu Glu(Me)Ser Gln AsnGln Gln Glu Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu Glu Leu Asp(Me)Lys Trp Ala(Me)SerLeu Trp Asn Trp Phe-NH25、CH3CO-Tyr Thr Ser Leu Ile His(Me)Ser(Me)Leu Ile Glu Glu(Me)Ser Gln Asn GlnGln Glu Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu Glu Leu Asp(Me)Lys Trp Ala(Me)Ser Leu(Me)Trp Asn Trp Phe-NH2观察体外细胞间的融合来检测多肽的融合抑制活性。在没有加多肽融合抑制剂时，表达HXB2外壳蛋白，tat和rev的中国仓鼠卵巢细胞和表达CD4和长末端重复序列的HeLa细胞(Hela-CD4-LTR-Beta-gal)可以融合。加入融合抑制剂后，抑制剂会阻断上述两种细胞的融合，试验结果表明，本发明的融合抑制活性与DPA178接近。
比较本发明的公开的多肽和DP178对胰凝乳蛋白酶(t1/2)和胰蛋白酶(t1/2)的稳定性。检测甲基化修饰后的多肽对胰凝乳蛋白酶(t1/2)和胰蛋白酶(t1/2)的稳定性。发现DP178对胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶都非常敏感，半衰期不到1分钟。而经过甲基化修饰的多肽其半衰期有显著提高，最长超过60分钟。具体结果见下表DP178及本发明的的多肽用生物素标记后，每种成分经过静脉注射到家兔体内2mg/kg，每隔六小时抽血检测一次，用EDTA作为抗凝剂。血液经过离心分离后，通过ELISA检测其在血清中的含量。实验结果表明，经过甲基化修饰的多肽其体内半衰期比未修饰的DP178延长了20多倍。
本发明提供一组多肽。可方便地采用固相化学法制备或将编码抗菌肽的基因克隆到载体上，然后进入宿主细胞中表达后获得。
本发明公开的多肽在制备抗逆转录病毒融合的抑制剂中的应用，其中尤其是逆转录病毒HIV。该多肽在制备抗HIV的药物中的应用，其特征在于所述的药物包括权利要求1的多肽中的一种或一种以上，并混合有一种或一种以上医药上可接受的载体和添加剂。有希望成为新的长效抗HIV药物。
图1为表示病毒外壳糖蛋白gp41C-端的638-673序列的保守性。
图2为1号多肽的质谱图。
具体实施例方式
实施例1 多肽的固相化学合成制备及分离纯化制备本发明公开的多肽序列1号-5号，同时制备DP178。
本实施例采用固相化学法合成，所用仪器为美国应用生物系统公司生产的Pioneer多肽合成仪。合成的多肽经过高浓度的TFA剪切后，用反向柱纯化，纯化后的多肽通过质谱鉴定。具体试验步骤如下1、多肽的制备(以制备0.1mmol量的为例)以下所有制备多肽的试剂均购于美国应用生物系统公司。
制备从C端到N端逐个进行，由合成仪自动控制。首先称量0.1mmol的结合了第一个氨基酸即Phe的树脂(购于美国应用生物系统公司)，装柱，再用20％哌啶二甲基甲酰胺溶液脱保护，二甲基甲酰胺清洗，9-笏甲氧羰基(Fmoc)保护的游离氨基酸溶解于碳二亚胺(DCC)，羟基苯并三唑(HOBt)/二异丙基乙基胺(DIPEA)，溶解后的溶液在柱上循环偶合反应30分钟，二甲基甲酰胺清洗重复以上脱保护到偶合反应步骤直到制备结束(具体操作步骤见pioneer多肽合成仪操作指南)。
制备后的多肽经如下步骤剪切取下反应后的树脂，加入B型剪切液(88％三氟乙酸，5％苯酚，5％水，2％三异丙基硅烷)，室温反应2小时，过滤，滤出液中加入10倍体积的预冷无水乙醚，4000转/分钟离心10分钟，收集沉淀并室温干燥。
2、多肽纯化称量一定量干燥后的多肽，溶于0.1％三氟乙酸，样品处理后经反向柱分离(洗脱液为含80％乙氰的0.1％三氟乙酸)，收集洗脱峰。
实施例2 多肽的鉴定如图2所示，制备的多肽1号经过质谱分析，在质谱图中显示的分子量为4660。由多肽序列计算出的理论值为4660。以下为计算结果931.9×5＝4660。证明合成的修饰多肽为设计的1号多肽。鉴定合格的多肽产物备用。
实施例3本发明公开的多肽与DP178抑制融合活性的比较本方法是通过观察体外细胞间的融合来检测多肽的融合抑制活性。在没有加多肽融合抑制剂时，表达HXB2外壳蛋白，tat和rev的中国仓鼠卵巢细胞和表达CD4和长末端重复序列的HeLa细胞(Hela-CD4-LTR-Beta-gal)可以融合。加入融合抑制剂后，抑制剂会阻断上述两种细胞的融合。
具体试验过程如下将表达HXB2外壳蛋白，tat和rev的中国仓鼠卵巢细胞以3×104CFU的接种量和表达CD4和Hela-CD4-LTR-Beta-gal细胞5×104CFU的接种量共培养，然后加入不同浓度的多肽抑制剂。多肽溶解于DMSO中，培养基中的DMSO的终浓度为1％，多肽浓度通过6M GuHCl中280nm的吸收值来定量。加入多肽抑制剂后培养20小时后，加入X-Gal染色。IC50通过以下公式计算y＝k/(1+[peptide]/IC50)，其中y有融合的数目，k为计数值。
表1本发明公开的多肽与DP178融合抑制活性(IC50)的比较
其中1-5分别表示本发明的序号为1-5条甲基化序列实施例四 对蛋白酶的稳定性比较本方法比较了本发明的公开的多肽和DP178对胰凝乳蛋白酶(t1/2)和胰蛋白酶(t1/2)的稳定性。检测甲基化修饰后的多肽对胰凝乳蛋白酶(t1/2)和胰蛋白酶(t1/2)的稳定性。发现DP178对胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶都非常敏感，半衰期不到1分钟。而经过甲基化修饰的多肽其半衰期有显著提高，最长超过60分钟。
具体结果见下表表2本发明公开的多肽与DP178对蛋白酶的稳定性的比较
其中1-5分别表示本发明序号为1-5的多肽。
Ct1/2(min)为胰凝乳蛋白酶作用后的半衰期，It1/2(min)为胰蛋白酶作用后的半衰期实施例五 体内半衰期的比较DP178及本发明的的多肽用生物素标记后，每种成分经过静脉注射到家兔体内2mg/kg，每隔六小时抽血检测一次，用EDTA作为抗凝剂。血液经过离心分离后，通过ELISA检测其在血清中的含量。首先将mAb 2F5以20ng/孔的量加到96孔板中包被，然后将离心后的血清经过一定比例稀释后，室温孵育过夜，后加入标记辣根过氧化物酶的亲和素，最后经过染色检测血清中含有的多肽的量。实验结果表明，经过甲基化修饰的多肽其体内半衰期比未修饰的DP178延长了20多倍。检测结果如下表3表3本发明公开的多肽和DP178家兔体内半衰期的比较
其中1-5分别表示本发明序号为1-5的多肽t1/2为药物体内半衰期。
序列表<110>上海高科联合生物技术研发有限公司<120>一组长效抗逆转录病毒的多肽及其制备方法和应用<130>SPI048590<160>5<170>Patent In Version 2.1<210>1<211>36<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>CHAIN<400>1Tyr Thr MeSer MeLeu Ile His MeSer MeLeu Ile Glu Glu MeSer Gln Asn Gln5 1015Gln Glu MeLys Asn Glu Gln Glu Leu Leu Glu MeLeu Asp MeLys MeTrp Ala20 2530MeSer Leu MeTrp Asn MeTrp Phe35<210>2<211>36<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>CHAIN<400>2Tyr Thr MeSer Leu Ile His MeSer MeLeu Ile Glu Glu MeSer Gln Asn Gln5 1015Gln Glu MeLys Asn Glu Gln Glu Leu Leu Glu MeLeu Asp Lys MeTrp Ala20 25 30MeSer Leu MeTrp Asn MeTrp Phe35<210>3<211>36<212>PRT<213>人工序列
<220>
<221>CHAIN<400>3Tvr Thr MeSer MeLeu Ile His MeSer Leu Ile Glu Glu MeSer Gln Asn Gln51015Gln Glu Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu Glu Leu Asp MeLys Trp Ala20 2530MeSer Leu MeTrp Asn Trp Phe35<210>4<211>36<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>CHAIN<400>4Tvr Thr MeSer Leu Ile His MeSer Leu MeIle Glu Glu MeSer Gln Asn Gln5 1015Gln Glu Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu Glu Leu Asp MeLys Trp Ala20 2530MeSer Leu Trp Asn Trp Phe35<210>5<211>36<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>CHAIN<400>5Tvr Thr Ser Leu Ile His MeSer MeLeu Ile Glu Glu MeSer Gln Asn Gln5 1015Gln Glu Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu Glu Leu Asp MeLys Trp Ala20 2530MeSer Leu MeTrp Asn Trp Phe3权利要求
1.一组多肽，其特征在于所述多肽具有序列表中所列的氨基酸序列。
2.一种如权利要求1或2所述多肽的制备方法，其特征在于，所述的制备方法为固相化学法合成。
3.一种如权利要求1或2所述多肽的制备方法，其特征在于，所述的制备方法为将编码所述多肽的基因克隆到载体上，然后进入宿主细胞中表达后获得所述多肽。
4.根据权利要求3所述多肽的制备方法，其特征在于，所述及的载体是质粒或病毒中的一种。
5.根据权利要求3所述多肽的制备方法，其特征在于，所述及的宿主细胞是原核细胞。
6.根据权利要求5所述多肽的制备方法，其特征在于，所述及的原核细胞包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌。
7.根据权利要求3所述多肽的制备方法，其特征在于所述及的宿主细胞是真核细胞。
8.一种如权利要求1所述多肽在制备抗逆转录病毒融合的抑制剂中的应用。
9.根据权利要求8所述的多肽，其特征在于，所述及的逆转录病毒为HIV。
10.多肽在制备抗HIV的药物中的应用，其特征在于所述的药物包括权利要求1的多肽中的一种或一种以上，并混合有一种或一种以上医药上可接受的载体和添加剂。
全文摘要
本发明公开了一组经过修饰的多肽，是一种长效的抗逆转录病毒融合的抑制剂。本发明还公开了该组多肽的制备方法，可以用固相化学法合成，也可以通过基因工程方法表达获得。本发明公开的多肽对蛋白酶的稳定性提高了近60倍，在动物体内的半衰期延长了近30倍，而其融合抑制活性没有显著降低，可以用于制备新的长效抗逆转录病毒尤其是HIV的药物。
文档编号A61P31/00GK1781940SQ200410084728
公开日2006年6月7日 申请日期2004年12月1日 优先权日2004年12月1日
发明者黄青山, 李国栋 申请人:上海高科联合生物技术研发有限公司