治疗线粒体性疾病的组合物和方法

文档序号:1186309
专利名称:治疗线粒体性疾病的组合物和方法
技术领域
本发明总的来讲涉及治疗和预防与线粒体功能障碍相关的疾病、发育延缓和症状的化合物和方法。将嘧啶核苷酸前体给予哺乳动物包括人以代偿线粒体功能障碍并改善线粒体的功能。
背景技术
线粒体是存在于大多数真核细胞中的细胞器。它们的主要功能之一是氧化磷酸化,即通过将得自燃料像葡萄糖或脂肪酸的新陈代谢的能量转化为ATP的过程,然后ATP用来驱动各种需要能量的生物合成反应和其它代谢活动。线粒体具有独立于细胞核DNA的其自身的基因组,在人细胞中包含具有约16,000个碱基对的DNA环。每个线粒体可以具有其基因组的多个拷贝并且单个细胞可以具有数以百计的线粒体。
线粒体功能障碍引起各种疾病状态。某些线粒体性疾病是由于线粒体基因组中的突变或缺失引起的。线粒体分裂和增殖的周转率比它们的宿主细胞快,而它们的复制却是在核基因组的控制之下。如果细胞中一定阈值比例的线粒体缺损,并且如果这种组织内一定阈值比例的这种细胞含有缺损的线粒体,则组织或器官功能障碍的症状可能产生。实际上,可以影响到任何组织,并且可以出现大量不同的症状,取决于涉及不同组织的程度。
一个受精卵可能既含有正常的线粒体也含有遗传上缺损的线粒体。在该卵的分裂期间缺损线粒体分离到不同的组织中是一种随机过程,在特定的组织或细胞内缺损线粒体与正常线粒体的比率也是不确定的(尽管线粒体在细胞内的周转期间可以对缺损线粒体基因组进行正选择或负选择)。因此,由于线粒体DNA中特定点突变,可以出现各种不同的病理表型。相反地,根据线粒体DNA内影响不同基因的突变或缺失,可以出现相似表型。先天性线粒体性疾病中的临床症状通常表现在有丝分裂期后具有高能量需要的组织中,像脑、肌肉、视神经和心肌,但也涉及包括内分泌腺、肝脏、胃肠道、肾脏和造血组织的其它组织,也部分取决于在发育期间线粒体的分离,以及取决于自始至终线粒体周转的动力学。
除涉及遗传的缺损线粒体先天性疾病外,后天线粒体功能障碍还引起一些疾病,特别是与衰老相关的神经变性性疾病,像帕金森病、早老性痴呆、亨廷顿舞蹈病。线粒体DNA中体细胞突变的发生率随着年龄的增加而指数上升;在老年人中普遍发现呼吸链活性降低。线粒体功能障碍也牵涉兴奋毒性神经元损伤,例如与癫痫发作或局部缺血相关的神经元损伤。
迄今为止,治疗与线粒体功能障碍有关的疾病包括给予由线粒体呼吸链特定组分所用的维生素和辅因子。辅酶Q(泛醌)、烟酰胺、核黄素、肉碱、生物素和硫辛酸都用于患线粒体性疾病的患者中,具有偶然的益处,特别是用于直接由这些辅因子之一的原发性缺乏引起的疾病中。然而,虽然在独立的病例中有用,但没有一种这样的代谢辅因子或维生素已经显示出在治疗线粒体性疾病方面的临床实践中具有普遍的效用。同样地,已经将二氯乙酸(DCA)用来治疗线粒体细胞病,例如MELAS;DCA抑制乳酸形成并主要用于由过多的乳酸自身累积引起症状的线粒体性疾病的情况。然而,DCA对本质上与线粒体机能不全有关的症状无效,并且对某些患者可能是有毒的,这取决于作为基础的分子缺损。
线粒体性疾病包括由种类繁多的分子损害或缺损引起的疾病,缺损线粒体在不同组织中的随机分配进一步使疾病的表型表达复杂化。
共同拥有的美国专利5,583,117公开了胞苷和尿苷的酰化衍生物。共同拥有的申请PCT/US96/10067公开了使用酰化嘧啶核苷降低化学治疗和抗病毒嘧啶核苷类似物的毒性。

发明内容
本发明的目的本发明的一个目的是提供治疗哺乳动物包括人中的与线粒体功能障碍或线粒体呼吸链功能障碍相关的疾病或病理生理后果的组合物和方法。
本发明的一个目的是提供改善对机体内线粒体功能障碍的组织抗性的化合物和组合物。
本发明的一个目的是提供治疗线粒体性疾病的组合物和方法。
本发明的一个目的是提供广泛地代偿涉及各种各样分子病理学的线粒体缺陷的药物,因为,在许多情况下,精确地诊断线粒体性疾病中的分子损害(lesions)是困难的。
本发明的一个目的是提供对线粒体疾病的一种实用疗法,所述疗法在与所述特定分子缺陷无关的线粒体电子传递链缺陷的情况下是有益的。
本发明的一个目的是不仅提供用于与线粒体DNA缺陷有关的相对罕有的先天性疾病,而且还提供用于儿童中出现的显著性神经肌病和神经发育性疾病以及提供用于普通的与年龄有关的神经变性性疾病像早老性痴呆或帕金森病。
本发明的一个目的是提供治疗和预防神经变性性疾病和神经肌病的组合物和方法。
本发明的一个目的是提供治疗和预防对神经组织兴奋毒性损伤的组合物和方法。
本发明的一个目的是提供治疗和预防癫痫的组合物和方法。
本发明的一个目的是提供治疗和预防偏头痛的组合物和方法。
本发明的一个目的是提供防止哺乳动物包括人中的有丝分裂期后细胞死亡或功能障碍的组合物和方法。
本发明的一个目的是提供治疗神经发育延缓性疾病的组合物和方法。
本发明的另一个目的是提供治疗和预防由于低氧或局部缺血引起的组织损害的组合物。
本发明的再一个目的是提供治疗和预防卵巢功能障碍、绝经、或绝经继发性并发症的组合物和方法。
本发明的再一个目的是提供降低由于化学疗法诱导的线粒体损伤引起的癌症化学疗法副作用的组合物和方法。
本发明的再一个目的是提供诊断线粒体性疾病和功能障碍的方法。
发明慨述本发明提供治疗哺乳动物中线粒体呼吸链缺陷的病理生理后果的方法,所述方法包括给予需要这种治疗的哺乳动物减少所述病理生理后果有效量的一种嘧啶核苷酸前体。另一方面,本发明提供预防线粒体呼吸链缺陷的病理生理后果的方法,所述方法包括给予哺乳动物预防所述病理生理后果有效量的一种嘧啶核苷酸前体。
在线粒体性疾病中,本发明的化合物和组合物可用来减弱由呼吸链缺陷引起的临床后遗症。构成线粒体性疾病基础的呼吸链缺陷由各种因素引起,所述因素包括线粒体DNA中先天的或遗传的突变和缺失、影响呼吸链活性的细胞核编码的蛋白中的缺陷、以及体细胞突变、细胞内钙的升高、兴奋毒性、一氧化氮、低氧和轴突运输缺陷。
本发明提供预防或减少具有线粒体呼吸链缺陷的有丝分裂期后细胞的死亡和功能障碍的化合物、组合物和方法。
此外,本发明还提供治疗语言、运动、执行功能、认知和神经心理学社会性技能方面的神经发育延缓的化合物、组合物和方法。
本发明也涉及本文公开为线粒体缺损引起的并因此用本发明的化合物和组合物治疗的疾病和病症的疗法。这些包括癌症化学疗法的副作用像外周神经病、肾病、疲劳症和早期绝经、以及排卵异常和正常绝经本身。
本发明还涉及通过用嘧啶核苷酸前体治疗患者而诊断线粒体性疾病,然后以选择的征和症状评价临床效果的方法。
当参阅以下实施例中所讨论的实验结果时,根据以下详细的描述将更加清楚、全面地理解本发明、以及本发明的其它目的、特点和优点。
具体实施例方式
本发明涉及治疗或预防各种各样的线粒体功能障碍、特别是线粒体呼吸链组分活性缺乏继发的临床疾病的化合物、组合物和方法。这些疾病包括先天性线粒体细胞细胞病、神经发育延缓、与年龄有关的神经变性性疾病,以及影响心脏、外周神经和自主神经、骨骼肌、胰腺和其它组织和器官的特殊的疾病。
A.定义“线粒体性疾病”是指哺乳动物的病理生理发展过程中线粒体呼吸链活性缺乏引起的疾病。这类疾病包括1)线粒体呼吸链的一种或多种组分活性的先天性遗传缺乏;2)线粒体呼吸链的一种或多种组分活性的获得性(后天)缺乏;其中这种缺乏特别是由以下引起a)在衰老期间的氧化性损伤;b)细胞内钙的上升;c)受影响的细胞暴露于一氧化氮;d)低氧或局部缺血;e)线粒体轴突运输中的微管相关缺陷或f)线粒体解偶联蛋白的表达。
线粒体呼吸链(也称为电子传递链)包括5种主要的复合体复合体I NADH:泛醌还原酶复合体II 琥珀酸:泛醌还原酶复合体III 泛醌醇:细胞色素-c还原酶复合体IV 细胞色素-c氧化酶复合体V ATP合酶复合体I和II实现将来自代谢燃料像糖酵解产物和脂肪酸的电子传递到泛醌(辅酶Q),将其转化为泛醌醇。在复合体III中通过将电子传递到细胞色素c而将泛醌醇再转化为泛醌。在复合体IV上通过将电子传递到分子氧产生水而将细胞色素c再氧化。复合体V利用得自通过这些电子传递跨越线粒体膜产生的质子梯度的势能,将ADP转化为ATP,然后ATP为细胞中的代谢反应提供能量。
二氢乳清酸脱氢酶(DHODH)是参与尿苷酸从头合成的一种酶。通过将来自二氢乳清酸的电子传递到泛醌,而将DHODH活性偶联到呼吸链上;然后这些电子分别通过复合体III和IV传递到细胞色素c和氧。只有复合体III和IV直接参与嘧啶生物合成。通过DHODH作用产生的乳清酸经磷酸核糖基化和脱羧作用转化为尿苷一磷酸。
在本发明正文中的“嘧啶核苷酸前体”或者为嘧啶核苷酸合成的从头合成途径中的中间体或者为所述合成补救途径中的中间体,所述中间体或者在DHODH(例如乳清酸)远侧进入嘧啶合成或者不需要DHODH活性来转化为嘧啶核苷酸(例如胞苷、尿苷或胞苷或尿苷的酰基衍生物)。在本发明的范围内还包括嘧啶核苷磷酸酯(例如核苷酸、胞苷二磷酸胆碱、尿苷二磷酸葡糖);这些化合物在进入细胞和合成代谢之前,被降解成尿苷或胞苷水平。胞苷和尿苷的酰基衍生物的口服生物利用率比母体核苷或核苷酸更好。将乳清酸和它的酯转化成尿苷酸并且也可用来达到本发明的目的。
B.本发明的化合物本发明的主要特征为这样的意外发现,即在治疗与线粒体功能障碍有关的各种各样症状和疾病状态中给予嘧啶核苷酸前体是有效的。
给予几种前体中的任一种均可增加组织嘧啶核苷酸水平。经5’位置的磷酸化作用,尿苷和胞苷被掺入到细胞核苷酸库中;通过酶促氨基化反应和脱氨基反应,胞苷酸和尿苷酸可相互转换。在嘧啶核苷酸的从头生物合成中,乳清酸是一种关键性中间物。将乳清酸掺入到核苷酸库中需要细胞磷酸核糖焦磷酸(PRPP)。另一方面(或除了提供外源核苷酸前体之外),经给予抑制尿苷磷酸化酶(尿苷降解途径中的第一种酶)的化合物,组织中尿嘧啶的可利用性增加。可用于治疗线粒体性疾病和相关病症的本发明化合物包括尿苷、胞苷、乳清酸、口服生物可利用的这些嘧啶核苷酸前体的酰基衍生物或酯以及尿苷磷酸化酶的抑制剂。
关于胞苷和尿苷的酰基衍生物,涉及以下定义如本文所用的,术语“酰基衍生物”是指嘧啶核苷的衍生物,其中衍生自羧酸的基本上无毒的有机酰基取代基以酯键连接于氧化嘌呤核苷的核糖部分的一个或多个游离羟基和/或其中这种取代基以酰胺键连接于胞苷的嘌呤环上的氨基取代基。这种酰基取代基衍生自羧酸,所述羧酸包括但不限于,选自脂肪酸、氨基酸、烟酸、二羧酸、乳酸、对氨基苯甲酸和乳清酸的化合物。优选的酰基取代基是正常存在于体内的化合物,或者作为食物成分或者作为中间代谢物。
如本文所用的,术语“药学上可接受的盐”是指具有所述衍生物的药学上可接受的酸加成盐或碱加成盐的盐,包括但不限于,硫酸、盐酸或磷酸,或者在乳清酸的情况下是氢氧化钠或氢氧化钙和阳离子氨基酸,特别是赖氨酸。
如本文所用的,术语“氨基酸”包括但不限于甘氨酸、L型的-丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、蛋氨酸、色氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、赖氨酸、组氨酸、鸟氨酸、羟赖氨酸、肉碱和其它天然存在的氨基酸。
如本文所用的,术语“脂肪酸”是指具有2-22个碳原子的脂族羧酸。这种脂肪酸可以是饱和的、部分饱和的或多不饱和的脂肪酸。
如本文所用的,术语“二羧酸”是指具有第二羧酸取代基的脂肪酸。
本发明的化合物具有以下结构
在所有的情况下(除非另外指定),本发明化合物的化学结构中的字母和具有用符号表示可变取代基下标的字母只适用于紧接在所述符号之前的结构。
(1)具有下式的尿苷的酰基衍生物 其中R1、R2、R3和R4相同或不同,并且每个为氢或代谢物的酰基,前提是至少其中一个所述R取代基不为氢或为其一种药学上可接受的盐。
(2)具有下式的胞苷的酰基衍生物 其中R1、R2、R3和R4相同或不同,并且每个为氢或代谢物的酰基,前提是至少其中一个所述R取代基不为氢或为其一种药学上可接受的盐。
可用于治疗线粒体性疾病的本发明化合物包括(3)具有下式的尿苷的酰基衍生物
其中R1、R2和R3相同或不同,并且每个为氢或以下的酰基a.具有2-22个碳原子的直链脂肪酸,b.氨基酸,选自甘氨酸、L型的-丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、胱氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、赖氨酸、组氨酸、肉碱和鸟氨酸,c.具有3-22个碳原子的二羧酸,d.选自羟基乙酸、丙酮酸、乳酸、烯醇丙酮酸、硫辛酸、泛酸、乙酰乙酸、对氨基苯甲酸、β-羟丁酸、乳清酸和肌酸的一个或多个的羧酸。
(4)具有下式的胞苷的酰基衍生物 其中R1、R2、R3和R4相同或不同,并且每个为氢或以下的酰基a.具有2-22个碳原子的直链脂肪酸,b.氨基酸,选自甘氨酸、L型的-苯丙氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、胱氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、赖氨酸、组氨酸、肉碱和鸟氨酸,c.具有3-22个碳原子的二羧酸,d.选自羟基乙酸、丙酮酸、乳酸、烯醇丙酮酸、硫辛酸、泛酸、乙酰乙酸、对氨基苯甲酸、β-羟丁酸、乳清酸和肌酸的一个或多个的羧酸。
(5)具有下式的尿苷的酰基衍生物 其中R1、R2或R3中的至少一个为含2-26个碳原子的烃基氧羰基部分,而其余的R取代基独立地为烃基氧羰基或烃基羰基部分或氢或磷酸酯。
(6)具有下式的胞苷的酰基衍生物 其中R1、R2、R3或R4中的至少一个为含2-26个碳原子的烃基氧羰基部分,而其余的R取代基独立地为烃基氧羰基或烃基羰基部分或氢或磷酸酯。
(7)乳清酸或及盐 乳清酸的药学上可接受的盐包括那些其中所述盐的阳离子组分为钠、钾、碱性氨基酸诸如精氨酸或赖氨酸、甲基葡糖胺、胆碱或任何其它分子量低于1000道尔顿的基本上无毒的水溶性阳离子的盐。
(8)醇取代的乳清酸衍生物 其中R1为通过酯键连接于乳清酸的含1-20个碳原子的醇基团。
本发明还包括上述化合物的药学上可接受的盐。
本发明优选的化合物为尿苷或胞苷的短链(2-6个碳原子)脂肪酸酯。特别优选的化合物是三乙酰尿苷或三乙酰胞苷。这些化合物的口服生物可利用性比母体核苷更好,并且在口服给予吸收后快速地脱乙酰。
丙酮酸可用来治疗具有线粒体功能缺陷的细胞。线粒体氧化磷酸化能力降低的细胞必须依赖于糖酵解产生ATP。糖酵解通过细胞的氧化还原状态调节。具体地讲,对最适葡萄糖通量而言需要NAD+,在所述过程中产生NADH。为了从糖酵解中最大限度地产生能量,NADH必须再被氧化成NAD+。部分可以通过质膜酶-NADH氧化酶,将外源丙酮酸再氧化成NADH。
尿苷三丙酮酸(2’,3’,5’-三-O-丙酮酰尿苷)提供既有利于嘧啶又有利于丙酮酸的益处,这两种均以单个化学实体传递并避免在丙酮酸的相应盐中加载钠、钙或其它阳离子。
尿苷磷酸化酶抑制剂用于治疗线粒体性疾病的替代策略或补充策略包括用尿苷磷酸化酶的抑制剂抑制尿苷分解代谢。
可用来治疗线粒体性疾病的尿苷磷酸化酶抑制剂的实例包括但不限于包括5-苄基巴比妥酸盐或含5-苄基巴比妥酸盐的5-亚苄基巴比妥酸盐衍生物、5-苄氧基苄基巴比妥酸盐、5-苄氧基苄基--1-[(1-羟基-2--乙氧基)甲基]巴比妥酸盐、5-苄氧基苄基乙酰基--1-[(1-羟基-2-乙氧基)甲基]巴比妥酸盐和5-甲氧基苄基乙酰基-无环巴比妥酸盐、2,2’-脱水-5-乙基尿苷、5-乙基-2-脱氧尿苷和无环尿苷化合物,特别是5-苄基取代的无环尿苷同类物,包括但不限于苄基无环尿苷、苄氧基-苄基-无环-尿苷、氨甲基-苄基-无环尿苷、氨甲基-苄氧基-苄基无环尿苷、羟甲基-苄基无环尿苷和羟甲基-苄氧基-苄基-无环尿苷。也参见WO89/09603和WO 91/16315,其通过引用结合到本文中。
C.本发明的组合物在本发明的一个实施方案中,新的药用组合物包含作为活性剂的一种或多种嘧啶核苷酸前体,所述嘧啶核苷酸前体选自尿苷、胞苷、乳清酸或其盐或酯和这些嘧啶核苷酸前体的酰基衍生物,以及药学上或接受的载体。
根据预期的用途和给予的途径,以液体、悬浮剂、sprinkles、微胶囊、片剂、胶囊、锭剂、注射溶液或栓剂(参见以下制剂的讨论)的形式制备所述组合物。
在本发明的另一个实施方案中,所述组合物包含至少一种嘧啶核苷酸前体和一种抑制尿嘧啶降解的药物,例如尿苷磷酸化酶的抑制剂。尿苷磷酸化酶抑制剂的实例包括但不限于包括5-苄基巴比妥酸盐或含5-苄基巴比妥酸盐的5-亚苄基巴比妥酸盐衍生物、5-苄氧基苄基巴比妥酸盐、5-苄氧基苄基-1-[(1-羟基-2-乙氧基)甲基]巴比妥酸盐、5-苄氧基苄基乙酰基-1-[(1-羟基-2-乙氧基)甲基]巴比妥酸盐和5-甲氧基苄基乙酰基-无环巴比妥酸盐、2,2’-脱水-5-乙基尿苷和无环尿苷化合物,特别是5-苄基取代的无环尿苷同类物,包括但不限于苄基无环尿苷、苄氧基-苄基-无环-尿苷、氨甲基-苄基-无环尿苷、氨甲基-苄氧基-苄基无环尿苷、羟甲基-苄基无环尿苷和羟甲基-苄氧基-苄基-无环尿苷。此外,在本发明的范围内还有仅利用尿苷磷酸化酶的抑制剂,但不同时给予嘧啶核苷酸前体,以治疗线粒体性疾病或与线粒体呼吸链功能障碍相关的病理生理。
本发明的其它实施方案包括与一种或多种与线粒体结构和功能有关的保护性活性或支持性活性的其它药物组合的嘧啶核苷酸前体。与在线粒体性疾病中推荐的日剂量一起介绍的这些药物包括但不限于,丙酮酸(1-10g/天)、辅酶Q(1-4mg/kg/天)、丙氨酸(1-10g/天)、硫辛酸(1-10mg/kg/天)、肉碱(10-100mg/kg/天)、核黄素(20-100mg/天)、生物素(1-10mg/天)、烟酰胺(20-100mg/天)、烟酸(20-100mg/天)、维生素C(100-1000mg/天)、维生素E(200-400mg/天)和二氯乙酸或其盐。就丙酮酸盐或酯而论,可以作为丙酮酸、其药学上可接受的盐或具有含2-10个碳原子的醇部分的丙酮酸酯,给予这种活性剂。
D.本发明化合物和组合物的治疗用途与线粒体呼吸链功能障碍相关的疾病基于线粒体缺陷的起源可以将其分为几种类型。
先天性线粒体性疾病是与线粒体DNA中或调节线粒体DNA完整性的核基因中或编码对线粒体呼吸链功能关键的蛋白的核基因中的遗传突变、缺失或其它缺陷的相关疾病。
后天性线粒体缺陷主要包括1)由于氧化过程或衰老引起的对线粒体DNA的损伤;2)由于过多的细胞内和线粒体内钙累积引起的线粒体功能障碍;3)用内源或外源呼吸链抑制剂抑制呼吸链复合体;4)急性或慢性氧缺乏和5)损伤的细胞核-线粒体相互作用,例如由于微管缺陷(defects)引起的长轴突中的线粒体的损伤的穿梭作用和6)对脂质、氧化性损伤或炎症应答的线粒体解偶联蛋白的表达。
与后天性线粒体缺陷有关并且构成各种形式的器官和组织功能障碍的发病机制的最基本的机制,包括钙累积细胞损伤的、特别是在可兴奋组织内细胞损伤的一个基本机制,涉及过多的钙进入细胞中,导致通过质膜的渗漏或细胞内钙处置机制的缺损。线粒体是集钙作用的主要位点,并且优先利用来自呼吸链的能量以摄取钙而不是用于ATP合成,这导致盘旋下降的线粒体衰竭,因为将钙摄入线粒体导致减弱能量转移的能力。
兴奋毒性用兴奋性氨基酸过度刺激神经元是中枢神经系统中的细胞死亡或损伤的常见机制。谷氨酸受体,特别是命名为NMDA受体亚型的活化,部分通过在兴奋毒性刺激期间细胞内钙的升高,导致线粒体功能障碍。相反地,线粒体呼吸链和氧化磷酸化中的缺缺陷使细胞对兴奋毒性刺激物过敏,导致在暴露于对正常细胞可能是无害的兴奋毒性神经递质或毒素期间细胞死亡或损伤。
一氧化氮暴露一氧化氮(NO)(约1μM)抑制细胞色素氧化酶(复合体IV),并因此抑制线粒体的呼吸(Brown GC,Mol.Cell.Biochem.174189-192,1997);况且,延长暴露于NO不可逆地降低复合体I活性。因此NO的生理或病理生理浓度抑制嘧啶生物合成。一氧化氮与包括中枢神经系统的炎症和自身免疫病的各种各样神经变性性疾病有关,并且涉及对神经元兴奋毒性损伤和对神经元缺氧后损伤的介导。
缺氧氧是所述呼吸链中的末端电子受体。氧缺乏降低电子传递链活性,导致通过氧化磷酸化减少嘧啶合成以及减少ATP合成。在真正的无氧条件下,如果提供尿苷和丙酮酸(或一种氧化NADH以优化糖酵解ATP生成的类似的有效药物),人细胞增殖并保持生存能力。
细胞核-线粒体相互作用编码呼吸链组分的线粒体DNA的转录需要细胞核转录因子。在神经元轴突中,线粒体必须来回穿梭于细胞核以保持呼吸链活性。如果轴突运输由于缺氧或由于药物像影响微管稳定性的紫杉酚而受损,则远离细胞核的线粒体的细胞色素氧化酶活性受到损失。
线粒体解偶联蛋白因为游离自由基和活性氧物质从线粒体呼吸链溢出,特别是当在一种或多种呼吸链组分的缺陷降低电子从代谢中间物有序地传递到分子氧时,线粒体是游离自由基和活性氧物质的主要的来源。为了减少氧化性损伤,细胞可以通过表达线粒体解偶联蛋白(UCP)而代偿,已经鉴定出其中的几种蛋白。在应答氧化性损伤、炎性细胞因子或过多脂质负载例如脂肪肝和脂肪肝炎时转录UCP-2。经释放跨越线粒体内膜的质子梯度,UCP减少从线粒体溢出活性氧物质,实际上消耗由新陈代谢生成的能量并作为一种减少氧化性损伤的交换而使得细胞对能量胁迫变得易受伤。
特别是在神经系统中,线粒体呼吸链缺陷产生两种普遍性结果1)神经系统内的神经元回路的延缓或异常发育;2)神经元和神经回路或者急性地或者在数年的时间内加速变性,这取决于线粒体缺乏和其它沉淀因子的严重程度。发育受损和加速变性的类似模式也涉及非神经组织以及系统。
线粒体功能障碍和嘧啶生物合成如果提供代偿关键性的线粒体功能的两种药物尿苷和丙酮酸,则含有严重损伤的线粒体(包括线粒体DNA的完全缺失,必然导致呼吸链活性的关闭)的细胞可以在培养物中存活。在体外需要尿苷,因为通过泛醌作为近侧的电子受体、细胞色素c作为中间体和氧作为末端电子受体,将尿苷酸从头合成的限制酶-二氢乳清酸脱氢酶(DHODH)偶联到线粒体呼吸链上(Loffler等,Mol.Cell.Biochem.174125-129,1997)。合成乳清酸需要DHODH,然后将乳清酸磷酸核糖基化和脱羧基以生成尿苷一磷酸(UMP)。细胞中的所有其它嘧啶均衍生自UMP。来自患有因线粒体DNA缺陷引起的线粒体性疾病的患者的细胞,,需要外源尿苷以在体外环境存活,其中得自其它细胞或饮食,并通过所述循环运输的嘧啶,是确实足以支持其生存能力(Bourgeron等,Neuromusc.Disord.3605-608,1993)。有重要意义地是,与在临床线粒体性疾病中主要涉及有丝分裂期后组织像神经系统和肌肉相反,用药物像Brequinar或Leflunomide有意抑制DHODH导致对造血系统和胃肠粘膜的剂量限制性细胞毒性损伤。
呼吸链功能障碍的病理生理后果线粒体对于几乎所有类型的真核细胞的存活功能和固有功能是关键性的。实际上在任何细胞类型中的线粒体都可能具有影响其功能的先天性缺陷或后天缺陷。因此,影响呼吸链功能的线粒体缺陷的临床上重要的病征和症状是异种性和可变的,取决于缺陷线粒体在细胞中的分布和其缺陷的严重程度,还取决于对受影响细胞的生理需求的。具有高能需要的不分裂组织,例如神经组织、骨骼肌和心肌对线粒体呼吸链功能障碍是特别敏感的,但任何器官和系统都可受影响。
以下列出的疾病和症状包括已知的线粒体呼吸链功能障碍的病理生理后果,并因此为本发明的化合物和组合物在其中具有治疗效果的疾病。
线粒体功能障碍继发性疾病症状一般归因于1)自由基从呼吸链漏失;2)ATP合成中的缺陷导致细胞能量衰竭,或3)由释放线粒体信号像引发或介导编程性细胞死亡级联的细胞色素c触发的编程性细胞死亡。如所述实施例中所示的,本发明的一个意外特征是观察到本发明的嘧啶核苷酸前体具有针对患有线粒体性疾病的患者中各种各样症状的治疗活性。在了解涉及线粒体功能障碍的疾病的发病机制方面和在了解了如何治疗这些疾病方面,这就构成了重要的paradigm shift。
先天性线粒体细胞病的治疗线粒体DNA缺陷许多临床综合征与线粒体DNA中的突变或缺失有关。线粒体DNA为母性遗传,实际上机体内的所有线粒体均得自由卵母细胞所提供的那些线粒体。如果一个卵母细胞中有缺陷的线粒体和正常线粒体的混合物,则线粒体的分布和分离为一随机过程。因此,线粒体性疾病通常为多系统疾病,例如,在线粒体DNA中的特定点突变,在不同患者中可以导致不同类型的病征和症状。相反地,线粒体DNA中的两个不同基因的突变却可导致相似的症状综合征。
然而,某些一致的症状模式已经与已鉴定的线粒体DNA缺陷一起出现,并且这些包括所述典型的“线粒体性疾病”,其中某些紧接着列于下文中。尽管如此,本发明的一个重要方面是认识到线粒体性性疾病的概念和用本发明的化合物和组合物的治疗延伸至本文也公开的许多其它疾病。
与线粒体DNA突变或缺失有关的主要线粒体性疾病的某些典型的表型包括MELAS线粒体性脑脊髓病(encephalomyopathy),乳酸血症和中风样发作。
MERRF伴有“不规则红色”(肌肉)纤维的肌阵挛性癫痫MNGIE线粒体性胃肠神经性脑脊髓病NARP神经原性肌无力、共济失调和色素性视网膜炎LHONLeber遗传性视神经病利氏综合征(亚急性坏死性脑脊髓病)PEO进行性外眼肌麻痹克-塞综合征(Kearns-Sayres Syndrome)(PEO、色素性视网膜病、共济失调和心传导阻滞)可以单独存在或与这些综合征同时存在的线粒体性疾病的其它普通症状包括心肌病、肌无力和萎缩、发育延缓(包含运动原、语言、认知或执行功能)、共济失调、癫痫、肾小管性酸中毒、外周神经病、视神经病变、自主神经病、神经原性肠功能障碍、感觉神经性聋、神经原性膀胱功能障碍、扩张性心肌病、偏头痛、肝衰竭、乳酸血症和糖尿病。
此外,线粒体DNA编码一些基因产物和tRNA,线粒体呼吸作用和氧化磷酸化所涉及的许多蛋白或影响线粒体呼吸作用和氧化磷酸化的许多蛋白质均由细胞核DNA编码。事实上,约3000种蛋白质或由细胞核基因组编码的所有蛋白质的20%实际上是被物理掺入线粒体和线粒体功能或与生物发生中,或与这些相关,尽管作为呼吸链的结构组分直接涉及的只有约100种蛋白质。因此,线粒体性疾病不仅涉及线粒体DNA的基因产物,而且涉及影响呼吸链功能和线粒体结构的细胞核编码的蛋白质。
代谢应激子像感染可以暴露在正常条件下不一定产生症状的线粒体缺陷。在感染期间的神经肌肉障碍或神经障碍是线粒体性疾病的一种标志。相比之下,线粒体呼吸链功能障碍可以使细胞对在其它情况下可能是无害的应激子是易受损的。
由于症状的异种性,甚至在受相同分子缺陷影响的患者之间,诊断出先天性线粒体性疾病是一种挑战。在由于线粒体功能障碍引起的细胞和组织功能缺陷可能与不是直接涉及线粒体缺陷的问题引起的组织功能障碍非常相似。本领域中已知几种临床上诊断线粒体性疾病的有用且实用的方案;这些方案通常涉及几个主要标准(例如典型临床表型,像MELAS、NARP或利氏综合征,新鲜组织样品中的呼吸链复合体活性的极度(>80%)压抑)和许多次要标准(呼吸链缺陷特征性的适度的生化异常、不完全表现以上所列的其中一种典型表型的线粒体性疾病特征性的症状),主要标准在确立在疾病发病机制方面呼吸链功能障碍的作用中具有良好程度的必然性,次要标准单独地是比单个主要标准难以使人信服,但它们累积起来为诊断出呼吸链缺陷引起特定患者临床表现提供了强有力的证据,正如Walker等(Eur Neurol.,36260-7,1996)中所描述的,该文献通过引用结合到本文中。
正如所述实例中所证实的,本发明的化合物和组合物可用来治疗具有不同的作为基础的分子病理学的线粒体性疾病中的非常广谱的病征和症状。在这些患者和另外的患者中所观察到的改善包括但不限于癫痫发作、偏头痛和中风样发作的频率和严重程度的降低,在患有“不能健康生长”的儿童中体重增加的改善,同时减少补充重碳酸盐需求的肾小管性酸中毒的改善,肌肉强度的改善、言语获得的改善,共济失调的改善,鼻窦感染和耳部感染的频率和严重程度的降低,记忆的改善,自主神经病和外周神经病症状的改善。在各种各样的基本上对其它形式的代谢支持例如对固有线粒体功能必需的已知维生素和辅因子(因为当嘧啶支持停止时,症状再次复发,这反对将益处归因于安慰剂效应)没有反应的症状中,所察到到的所述改善,证实了本发明的一种主要意外的见识功能性或条件性的嘧啶缺乏在患有线粒体性疾病的患者中构成各种各样的显性症状的基础,并且在这样的患者中嘧啶补充物足以改善或减轻各种各样的症状。迄今为止,线粒体性疾病的症状被认为是ATP缺乏、由缺损的呼吸链产生活性氧物质或线粒体编程性细胞死亡级联组分触发的细胞死亡引起的。从头嘧啶合成的抑制剂的剂量限性制毒性通常由于对快速分裂细胞类型像骨髓和胃肠粘膜干细胞的增生的抑制引起。意想不到的是,在患者和实验动物中,在包含不分裂的有丝分裂期后细胞的组织例如中枢和外周神经元以及骨骼肌和心肌中,已经证实了本发明的化合物和方法的治疗效果。
本发明的一个重要的特征是这样一种意想不到的结果由各种构成基础的分子缺损引起的患线粒体性疾病患者的治疗导致患者(实施例1-4)体内不同类型症状方面的临床改善。重要的并更意相不到的是,甚至在直接参与特别是需要嘧啶生物合成的电子传递的两种呼吸链复合体(III和IV)的活性正常的患者中也观察到临床益处。
因此,本发明一个意想不到的和重要的方面是,在患有线粒体细胞病的患者中的最佳治疗效果比患有实际上完全阻断从头嘧啶合成(例如I型乳清酸尿的纯合子)的患者的适当治疗通常需要更高的剂量本发明嘧啶核苷酸前体。用于治疗儿童中的先天性线粒体性疾病的本发明化合物例如三乙酰尿苷(口服给予后有效地吸收)的最佳剂量范围为1-6g/m2机体表面积(50-300mg/kg,最好为100-300mg/kg),而成人中嘧啶从头合成的总目剂量约为1g/天(约0.5g/m2)。
本发明方法的广泛应用性是意想不到的,并且使本发明的化合物和组合物区别于已经进行的线粒体性疾病的其它疗法,例如辅酶Q、维生素B、肉碱和硫辛酸之外,所述疗法通常与线粒体功能有关的满足了非常特异性的反应并因此只可用于单一性的情况下。然而,用呼吸链复合体的抗氧化剂和辅因子的这样的代谢干预适合于同时用本发明化合物和组合物治疗,并且事实上可用它们的最佳优点同本发明的化合物和组合物相组合。
神经肌肉变性性疾病的治疗弗里德赖希共济失调(Friedreich’s Ataxia)最近已经鉴定出构成弗里德赖希共济失调(FA)-最常见的遗传性共济失调的一种基因缺损,并命名为“frataxin”。在FA中,经过一段正常发育期后,协调作用中的缺陷通常在年龄为30-40岁之间产生,这发展成瘫痪并死亡。受影响最严重的组织为脊髓、外周神经、心肌和胰腺。患者通常丧失运动控制,然后被迫坐轮椅,并且通常患心力衰竭和糖尿病。
FA的遗传基础涉及在编码frataxin基因的内含子区中的GAA三核苷酸重复序列。这些重复序列的存在导致减少所述基因的转录和表达。Frataxin与调节线粒体离子含量有关。如果细胞frataxin含量低于正常水平,则过多的离子累积在线粒体中,促进氧化性损伤,然后随之发生线粒体变性和功能障碍。
如果中等数量的GAA重复序列存在于frataxin基因内含子中,则可以不发生共济失调严重的临床表型。然而,在患非胰岛素依赖型糖尿病的25-30%患者中发现了这些中等长度三核苷酸的延伸,与之相比非糖尿病人群约为5%。
本发明的化合物和组合物可用来治疗患与frataxin中的缺乏或缺陷有关疾病(包括弗里德赖希共济失调、心肌功能障碍、糖尿病以及糖尿病的并发症像外周神经病)的患者。相比之下,推测frataxin缺陷的诊断性试验包括GAA内含子重复序列的PCR试验可用来鉴定从用本发明化合物和组合物治疗中受益的患者。
肌营养不良症肌营养不良症是指一类涉及神经肌肉结构和功能退化、通常导致骨骼肌萎缩和心肌功能障碍的疾病。在杜-兰肌营养不良(Duchennemuscular dystrophy)的情况下,特定蛋白-肌营养不良蛋白中的突变或缺陷与其病因学相关。肌营养不良蛋白基因失活的小鼠表现出某些肌营养不良的特征,并具有线粒体呼吸链活性约50%缺乏。在大多数情况下,神经肌肉变性的最终共同途径是钙介导的线粒体功能的受伤。本发明的化合物和组合物可用来减慢肌肉功能能力减退的速率,并可用来改善患有肌营养不良的患者中的肌肉功能状态。
多发性硬化多发性硬化(MS)是特征为大脑白质局灶性炎性变性和自身免疫变性的神经肌病。周期性的加重或发作明显地与上呼吸道感染和其它感染(细菌和病毒)有关,表明线粒体功能障碍在MS中起作用。暗示由一氧化氮(由与炎症有关的星形胶质细胞和其它细胞产生)引起的神经元线粒体呼吸链活性的阻抑是导致MS的分子机制。
既可预防性地又可在疾病加重的发作期间,用本发明的化合物和组合物来治疗患多发性硬化的患者。
神经元不稳定性疾病的治疗癫痫发作疾病的治疗癫痫是通常发生于患线粒体细胞病的患者中,包含各种各样的癫痫发作的严重程度和频率,例如分开发作或一天多次发生的癫痫性失神、癫痫性强直、癫痫性失张力、癫痫性肌阵挛和癫痫持续状态。
在患线粒体功能障碍继发性癫痫发作的患者中,本发明的化合物和方法可用来降低癫痫发作活动的频率和严重程度。
偏头痛的治疗和预防对患有复发性偏头痛患者的代谢研究表明,线粒体活性的缺陷通常与该病症相关,表现为降低的氧化磷酸化和过量乳酸生成。这样的缺陷不一定由线粒体DNA中的遗传缺陷引起。偏头痛患者对一氧化氮(细胞色素c氧化酶的一种内源抑制剂)过敏。此外,患线粒体细胞病的患者,例如MELAS,通常患有复发性偏头痛。
在患有复发性偏头痛的患者中,本发明的化合物、组合物和方法可用来预防和治疗,特别是在麦角化合物或5-羟色胺受体拮抗物难控制头痛的情况下。
如实施例1中所证实的,本发明的化合物和方法可用来治疗与线粒体功能障碍相关的偏头痛。
发育延缓的治疗在患线粒体性疾病的儿童中通常发现神经发育或神经心理发育中的延缓。神经连接的发育和重建需要增强的生物合成活性,特别是与神经元膜和髓磷脂合成有关的活性,这两种合成都需要嘧啶核苷酸作为辅因子。尿苷酸与失活和糖转化为糖脂和糖蛋白有关。胞苷酸衍生自尿苷酸,并对主要的膜磷脂组分像磷脂酰胆碱的合成是决定性的,磷脂酰胆碱的胆碱部分来自胞苷二磷酸胆碱的胆碱部分。在线粒体功能障碍(由于或者线粒体DNA缺陷或者任何获得性或条件性缺陷像上述的兴奋毒性或一氧化氮介导的线粒体功能障碍引起的)或导致减少嘧啶合成的其它疾病的情况下,在神经元相互连接和神经元回路的发育中的决定性阶段,减少了细胞增殖和轴突延伸,导致神经心理功能发育的延缓或停滞,所述功能像语言功能、运动功能、社会性功能、执行功能和认知技能。例如在孤独症中,大脑磷酸酯化合物的磁共振波谱学测量表明,存在与膜合成有关的尿苷二磷酸糖和胞苷酸衍生物的降低水平所显示的膜和膜前体的总体合成不足(Minshew等,Biological Psychiatry 33762-773,1993)。
特征为发育延缓的疾病包括雷特综合征(Rett’s Syndrome)、普遍性发育延缓(或PDD-NOS“pervasive developmental delay-不是指其它病症”将其区别于特定亚类像孤独症)、孤独症、阿斯珀格综合征(Asperger’s Syndrome)和注意涣散/多动症(ADHD),注意涣散/多动症现在认为是基础制执行功能的神经回路发育中的延缓或延迟。
本发明的化合物和方法可用来治疗患神经发育延缓的患者,所述神经发育延缓包含运动功能、语言功能、执行功能和认知技能。目前对这样的疾病例如ADHD的治疗包括增强某些受影响的发育不全的回路中的神经传递的苯丙胺样兴奋剂,但这样的药可以改善破坏性行为的控制,但不改善认知功能,因为它们不能解决于构成受影响神经回路的所述结构和相互连接中作为基础的缺陷。
本发明的化合物和组合物也可用于神经系统中的神经发育和神经心理发育以及非神经组织像肌肉和内分泌腺中的躯体发育的其它延缓或停滞的情况。
神经变性性疾病的治疗两种最显著的、与衰老相关的、严重的神经变性性疾病,早老性痴呆(AD)和帕金森病(PD),在它们的发病机制中都与线粒体功能障碍有关。具体地讲,不仅在帕金森病中变性的黑质纹状体神经元中,而且在帕金森病患者的外周组织和细胞像肌肉和血小板中经常发现复合体I缺陷。
在早老性痴呆中,线粒体呼吸链活性通常被阻抑,特别是复合体IV(细胞色素c氧化酶)。此外,衰老的结果是线粒体呼吸链功能一起被抑制,进一步扩大了影响线粒体呼吸链功能的其它分子损害的有害后遗症。
除原发性线粒体功能障碍以外的其它因素也引起AD、PD和相关疾病中的神经变性。兴奋毒性刺激和一氧化氮与所述两种疾病有关,这两种因子均加重线粒体呼吸链缺陷以及它们的有害作用在呼吸链功能障碍的背景上扩大化。
亨廷顿舞蹈病在受影响的大脑区中也涉及线粒体功能障碍,兴奋毒性刺激和线粒体功能障碍的协同相互作用引起神经元变性。在实施例8中,在亨廷顿舞蹈病的小鼠模型中,本发明的化合物三乙酰尿苷防止神经元细胞死亡。
本发明的化合物和组合物可用来治疗和减慢年龄相关神经变性性疾病包括AD和PD的进程。
肌萎缩性侧索硬化症在患有肌萎缩性侧索硬化症(ALS;Lou Gehrig病;运动神经元进行性变性、骨骼肌营养不良,不可避免地导致瘫痪和死亡)的患者中其中一个主要遗传缺陷为铜-锌超氧化物歧化酶(SOD1)(一种抗氧化酶)中的突变或缺陷。线粒体既产生活性氧物质又是活性氧物质的主要靶。在哺乳动物系统中,线粒体中的电子到氧的传递无效是自由基最重要的生理来源。抗氧化剂或抗氧化酶中的缺乏可以导致或加速线粒体变性。突变的SOD1的转基因小鼠产生的症状和病理学类似于人ALS中的那些症状和病理学。这些动物中所述疾病的发展已经显示涉及线粒体的氧化性破坏,接下来是运动神经元的功能降低和临床症状的发作(Kong和Xu,J.Neurosci.183241-3250,1998)。来自ALS患者的骨骼肌具有低线粒体复合体I活性(Wiedemann等,J.Neurol.Sci 15665-72,1998)。
本发明的化合物、组合物和方法可用来治疗ALS,以逆转或减慢临床症状的进程。
抵抗局部缺血和缺氧的保护氧缺乏既导致通过使细胞在复合体IV处丧失细胞色素c再氧化的末端电子受体而直接抑制线粒体呼吸链活性,又导致通过无氧后继发性兴奋毒性和一氧化氮形成而间接地抑制呼吸链活性,特别是在神经系统中。
在疾病像大脑缺氧、心绞痛或镰刀形红细胞贫血危象中,组织为相对低氧。在这样的情况下,本发明的化合物为受影响组织提供抵抗低氧的有害效应的保护,减弱继发性延迟细胞死亡并加速从低氧组织胁迫和损伤中的恢复。
本发明的化合物和组合物可用来防止在对大脑局部缺血损伤或低氧损伤后的延迟的细胞死亡(发生在大脑局部缺血发作后约2-5天在像海马或皮质的区域中的编程性细胞死亡)。
肾小管性酸中毒无论基础的呼吸链功能障碍是先天性的还是通过局部缺血或细胞毒性剂像顺铂诱导的,在患线粒体性疾病的患者中经常观察到由于肾功能障碍引起的酸中毒。肾小管性酸中毒通常需要给予外源碳酸氢钠以维持血液和组织的pH。
在实施例3中,给予本发明的化合物引起患有严重复合体I缺陷的一名患者中的肾小管性酸中毒的立即逆转。本发明的化合物和组合物可用来治疗肾小管性酸中毒和由线粒体呼吸链缺陷引起的其它形式的肾功能障碍。
年龄相关的神经变性和认知减退在正常衰老期间,在线粒体呼吸链功能有进行性减退。开始于约40岁,人类中的线粒体DNA缺陷的累积是指数上升,并在线粒体呼吸活性的核调节的组分中同时发生减退。
de Grey(Bioessays,19161-167,1998)讨论了构成以下观察的基础的机制许多线粒体DNA损伤在线粒体周转期间、特别是在有丝分裂期后细胞中具有选择优势(selection advantage)的。所提出的机制为,具有缺陷呼吸链的线粒体比具有完整功能呼吸链的线粒体对它们自身产生较少的氧化性损伤(线粒体呼吸是机体内自由基的主要来源)。因此,正常功能的线粒体对膜脂的氧化性损伤累积比缺陷线粒体更快,而因此为通过溶酶体降解的“标记”。因为在细胞内的线粒体的半寿期约为10天,选择优势可以导致快速用降低的呼吸活性的那些线粒体更替功能线粒体,特别是在缓慢分裂的细胞中。净结果是,一旦在降低对线粒体的氧化性损伤的线粒体蛋白的基因中发生一个突变,则这样的缺陷线粒体将在所述细胞快速增加,减少或消除其呼吸能力。这样的细胞的累积导致在有机体水平中的衰老或变性性疾病。这与肌肉中具有缺陷电子转递活性细胞的进行性镶嵌外观一致,与在具有正常活性的细胞中随机分布的几乎没有细胞色素c氧化酶(COX)活性的细胞以及来自老年患者的活检中的COX-负细胞的发生率较高一致。在衰老期间或各种各样的线粒体性疾病中,生物因此面对一种情况,其中不能恢复的有丝分裂期后细胞(例如神经元、骨骼肌和心肌)必须保留并在有意义的程度上保持它们的功能,以抵抗线粒体呼吸链功能中的不可抗拒的进行性衰退。具有功能障碍线粒体的神经元变成对损伤像兴奋毒性损伤更加敏感。线粒体衰竭引起伴随衰老的最严重的变性性疾病(特别是神经变性)。
先天性线粒体性疾病通常涉及在基本机制方面类似于天生具有正常线粒体的人的衰老期间发生的早期发生的神经变性。本发明的化合物和组合物可用于治疗先天性或早期发生的线粒体性疾病的所述实施例中公开的证据,对本发明的化合物和组合物用于治疗年龄相关组织变性的实用性提供了直接的支持。
本发明的化合物和组合物可用来治疗或减弱衰老的先天性减退和衰老的其它变性性结果。
线粒体和癌症化学疗法线粒体DNA通常比核DNA更容易损伤有以下几个原因1.线粒体DNA比核DNA具有复杂性较低的修复系统。
2.实际上所有线粒体DNA链均编码重要的蛋白质,所以任何缺陷都将有可能影响线粒体功能。核DNA含有不编码蛋白质的长区域,其中有些突变或损伤基本上是无关紧要的。
3.在增殖和周转期间,缺陷线粒体通常比正常、活性线粒体具有选择优势。
4.线粒体DNA不受组蛋白保护。
在实验基础上,在经受氧化胁迫或癌症化疗剂像顺铂的细胞中,线粒体DNA损伤比核DNA损伤更广泛并且持续时间更长,因为线粒体DNA更加容易损伤并且修复效率低。尽管线粒体DNA比核DNA可能对损伤更敏感,但它在某些情况下对由化学致癌剂引起的诱变具有相对抗性。这是因为线粒体对某些类型的线粒体DNA损伤的反应是通过破坏它们有缺陷的基因组而不是企图修复它们。这导致细胞毒性化学疗法后一段时期的总体线粒体功能障碍。化疗剂像顺铂、丝裂霉素和环磷酰胺的临床应用通常伴随使人衰弱的“化学疗法疲劳”、延长时期的无力和运动不耐受性,这可以甚至在从这些药物的血液学和胃肠毒性恢复后仍持续。
本发明的化合物、组合物和方法可用来治疗和预防与线粒体功能障碍有关的癌症化学疗法的副作用。这种使用嘧啶核苷酸前体减弱癌症化学疗法副作用在机制上和生物化学上与嘧啶核苷酸前体的对细胞毒性抗癌嘧啶类似物的毒性降低不同,后者是在核苷酸抗代谢物水平上通过生化竞争所介导的。
实施例5说明了口服三乙酰尿苷在抵抗紫杉酚诱导的神经病的保护方面的保护性效应。
此外,肝线粒体氧还状态是一种对食欲调节的因素(contributor)。癌症患者通常出现引起厌食、体重减轻和恶病质的“早期厌腻”。在癌症患者中,能量新陈代谢通常受到严重地破坏,功能亢进肿瘤糖酵解的能量消耗无效循环产生循环乳酸,所述乳酸通过肝脏转化成葡萄糖。化学疗法诱导的线粒体损伤进一步引起代谢破坏。
如实施例2中所表明的,用本发明的化合物的疗法导致在患线粒体性疾病的患者中改善食欲。
线粒体和卵巢功能卵巢的重要功能是维持卵母细胞中线粒体基因组的完整性,因为传到胎儿的线粒体全部得自在妊娠时存在于卵母细胞中的线粒体。线粒体DNA中的缺陷在绝经年龄前后可检测到,并且也与异常月经周期相关。由于细胞不能对线粒体DNA中的缺陷直接地检测和反应,而只能检测影响细胞质的继发性效应,像降低的呼吸、氧化还原状态或嘧啶合成中的缺陷,线粒体功能的这样的产物作为卵母细胞选择和卵泡闭锁的信号参与,当线粒体基因组保真度和功能活性的保持不再受到保证时最终触发绝经。这类似于具有DNA损伤的细胞中的编程性细胞死亡,如果基因组保真度不再通过修复过程达到,则所述细胞经历细胞自杀的活性过程。患有影响性腺的线粒体细胞病的妇女通常经历过早绝经或出现原发性周期异常。细胞毒性癌症化学疗法通常诱导过早绝经,结果是增加骨质疏松症的危险性。化学疗法诱导的闭经一般是由于原发性卵巢衰竭引起的。在接受化学疗法的绝经前期妇女中,化学疗法诱导的闭经的发病率随年龄而增加,指出涉及线粒体。线粒体呼吸或蛋白合成的抑制剂抑制激素诱导的排卵,还抑制对垂体促性腺激素反应的卵巢类固醇激毒的产生。患有唐氏综合征(Downs syndrome)的妇女通常经历过早地绝经,并还引起早期发生的阿尔茨默样疾呆(Alzheimer-like dementia)。在唐氏综合征患者的组织中和迟发生的阿尔茨默样痴呆病中总是发现低活性的细胞色素氧化酶。
因此,线粒体功能合适的支持或代偿线粒体功能障碍可用来保护以抵抗年龄相关的或化学疗法诱导的绝经或月经周期的不规则或排卵的不规则。也包括抗氧化剂和线粒体辅因子的本发明的化合物和组合物,可用来治疗和预防闭经、不规则排卵、绝经或继发性绝经并发症。
在实施例1中,用本发明化合物的疗法导致缩短月经周期。因为所述患者中是处在持久性的黄体期,她的反应表明所给予的嘧啶核苷酸前体逆转对垂体促性腺激素的低反应性,推测所述反应性升高以代偿线粒体源的卵巢低反应性。
线粒体性疾病的诊断患线粒体性疾病的患者对给予本发明化合物惊人的反应表明,按照本发明的方法所给予的嘧啶核苷酸前体的临床反应对检测可能的线粒体性疾病具有诊断效用。构成线粒体功能障碍的分子损害的分子诊断是困难的并费用昂贵,特别是如果所述缺陷不是线粒体DNA更常见的突变或缺失的一种时。定性诊断线粒性疾病通常需要肌肉活组织检查,但甚至这种侵入性测量仅仅在线粒体损缺陷存在于肌肉时有效。当按照本发明的方法给予时,由于本发明的的化合物和组合物是安全的,则用嘧啶核苷酸前体的治疗攻击是对怀疑的线粒体性疾病一种重要的诊断探针,特别是当与用于线粒体功能障碍的种种其它方面的试验结合使用时。
关于诊断先天性线粒体细胞病,将日剂量50-300mg/kg的本发明的一种嘧啶核苷酸前体给予患者1-12周,并监测临床病症和症状的改变。在所述实施例中所述的患者和其它的患者中所观察到的改善包括但不限于癫痫发作、偏头痛和中风样发作的频率和严重程度的降低,在患有“不能健康成长”的儿童中体重增加的改善,同时减少补充重碳酸盐需求的肾小管性酸中毒的改善,肌肉强度的改善,言语获得的改善,共济失调的改善,张力减退的改善,鼻窦感染和耳部感染的频率和严重程度的降低,记忆的改善和自主神经病和外周神经病症状的改善。在本发明的一个实施方案中,线粒体功能的其它试验也用来提供诊断线粒体性疾病的证据。正如Walker等(Eur Neurol.,36260-7,1996)中所描述的,诊断通常需要综合考虑具有不同程度的可靠度的大量确证性试验。对本发明嘧啶核苷酸前体的治疗反应性主要可用作在该诊断方案中的另一次要标准,因为可能治疗效果可以发生在不仅仅通过代偿呼吸链缺陷介导的嘧啶核苷酸前体的给予之后发生。由于线粒体性疾病症状的性质和严重程度在患者之间是异质性的和可变的,通常通过在患者中选择显性症状来评价外源嘧啶核苷酸前体的功效,并在治疗的疗程期间用可行的定量标度监测严重程度。如果怀疑一种可能的对照剂效果,则对所述患者进行从药物到合适的对照剂的盲法改变可任选地用于个别患者。鉴于该类疾病的严重性,则评价临床效果可能需要相当的技能和丰富的经验,但这样的技能是在本领域的医师治疗患有多系统代谢疾病患者的范围内,并且因此不会构成了过度的试验。在个别患者中,用三乙酰尿苷(本发明的一种化合物)临床治疗患有线粒体性疾病的以下所述的实例,例证了测定临床效果的可行性。
E.本发明化合物的组合物的给予和配制在线粒体性疾病的嘧啶核苷酸前体疗法的所有特异性治疗靶的情况下,通常将本发明的化合物每天3次给予患者。口服给予尿苷酰基衍生物和胞苷酰基衍生物的剂量为10-500mg/kg体重/天,根据最佳临床效果所需的量,可在该范围内改变。一般来讲,最佳剂量是在50-300mg/kg/天之间(优选为100-300mg/kg/天),分成每次间隔6-12小时服用2次或3次分开剂量。尿苷和胞苷比这两种核苷的酰基衍生物吸收效果差,所以为了达到酰基衍生物同样的治疗效果则需要比酰基衍生物的剂量高。渗透性腹泻限制可以给予患者的尿苷或胞苷(或其它衍生物像胞苷二磷酸胆碱)的量,所以在大多数情况下胞苷和尿苷的酰基衍生物比所述母体化合物更有效,并且副作用更小。用来达到本发明目的的胞苷和尿苷的剂量范围为50-1000mg/kg/天,优选为100-1000mg/kg/天,取决于治疗功效和耐受度之间的平衡。在涉及线粒体呼吸链功能障碍的特定疾病状态下,口服给予乳清酸和乳清酸的醇酯的剂量范围为20-200mg/kg/天,再次取决于达到最佳效果所需的量。用于特定疾病或患者所需的本发明嘧啶核苷酸前体的剂量也部分取决于所述疾病的严重程度。
在任何患有线粒体功能障碍特征的疾病或由线粒体功能障碍所引起的疾病的个别患者中,通常根据经验确定本发明嘧啶核苷酸前体的有效剂量。在先天性线粒体性疾病中,也称为线粒体细胞病或线粒体脑脊髓病,在患者之间临床呈现的病症和症状一般为异质性和可变的。通过超过规定时间例如数月的间隔,监测一组症状并评价它们的严重程度,确定给予本发明化合物后的临床效果。为了该目的选择3-5个显性症状,判断构成临床效果改善的程度通常作为临床判断的依据。在患复杂代谢紊乱的患者的疗法方面,这样的评价不构成过重的实验负担,特别是已知的线粒体细胞病严重程度(经常有生命危险)和它们护理费用昂贵的性质的情况下。青春期后大脑和机体的发育达到停止之后,尽可能早的在所述患者生命中代偿线粒体缺陷或其它代谢缺陷可以与干预比较出现一种非常大的差异。因此,在诊断和治疗复杂代谢疾病方面,特别是对在正在发育的儿童,所花费的一切努力是值得的。将本发明的一种化合物给予患有线粒体性疾病的患者之后的临床改善的以下所述的实例证实了,这样的治疗和评价的可行性和重要性。
在大多数临床表现方面比线粒体性疾病的异质性较少的疾病的情况下,本领域存在对测定药物治疗效果的合适有效的评价标度。在进行临床研究以确定用于治疗本说明书中所公开的疾病的本发明嘧啶核苷酸前体的剂量之前,按照定量疾病评价标度,通过评价临床反应(包括大脑MRI影像和其它指数,例如生化测量,所述测量可能不需要仅通过观察患者的症状而在临床上是明显)确定个别患者的合适的剂量。在所有情况下,在规定时间以外监测特殊疾病的显性症状,以确定是否发生病征和症状的改善或减弱临床减退,这是医学领域常用的。在盲法临床研究中的剂量确定之前,进行几个星期的疗程,简单地通过从药物到对照剂的盲法转换,从可能的安慰剂效应中而鉴别特定患者对本发明嘧啶核苷酸前体的反应。
在患者不能接受口服药物的情况下,必要时,可以通过延长的静脉内注射给予本发明的化合物,尤其是尿苷、胞苷和乳清酸酯,传递的日剂量为10-500mg/kg/天。
所述药理学上活性化合物任选地与包括有利于加工处理所述活性化合物的赋形剂和辅助剂合适的药学上可接受的载体混合。作为片剂、悬浮剂、溶液、锭剂或栓剂给予这些化合物。例如口服、直肠、阴道给予所述组合物,或通过口的口腔含化囊(buccal pouch)释放所述组合物,并以溶液形式经注射、口服或经局部给药来应用所述组合物。所述组合物与所述赋形剂一起可以含有约为0.1-99%,优选为50-90%的所述活性化合物。
为了经注射或静脉内注射胃肠外给药,将所述活性化合物悬浮于或溶于水性介质中例如无菌水或盐水溶液。可注射的溶液或悬浮液任选地含有表面活性剂例如聚氧乙烯山梨醇酯、山梨醇酐酯、聚氧乙烯酯或增溶剂像丙二醇或乙醇。所述溶液通常含有0.01-5%的所述活性化合物。
合适的赋形剂包括填充剂诸如糖例如乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨糖醇,纤维素制剂和/或磷酸钙例如磷酸三钙或磷酸氢钙;以及粘合剂诸如淀粉糊剂,例如采用玉米淀粉、小麦淀粉、水稻淀粉或马铃薯淀粉,明胶、西黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧基甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮。
辅助剂包括流动调节剂和润滑剂,例如二氧化硅、滑石粉、硬脂酸或其盐诸如硬脂酸镁或硬脂酸钙和/或聚乙二醇。为锭剂核心提供合适的包衣,所述包衣,必要时,可抗胃液。为了该目的,使用浓缩的糖溶液,所述溶液任选地包含阿拉伯树胶、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇和/或二氧化钛、漆用溶液和合适的有机溶剂或溶剂混合物。为了生产抵抗胃液的包衣,使用合适纤维素制剂的溶液诸如醋酸纤维素邻苯二甲酸酯或羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯。将染料(dyestuffs)或色素(pigments)任选地加入到所述片剂或锭剂包衣,例如以鉴定或为了区别不同的化合物剂量。
将本发明的药用制剂以其已知的方式制备,例如通过常规混合、制粒、制锭、溶解或冻干过程的方式。因此,用于口服用途的药用制剂通过将所述活性化合物与固体赋形剂一起混合,任选地研磨(option-ally grinding)所产生混合物并加工所述粒状混合物,在加入合适的辅助剂后(如果需要或必要时),以获得片剂或锭剂核心。
可用于口服传递的其它药用制剂包括由明胶制成的push-fit胶囊以及由明胶和例如甘油或山梨糖醇的增塑剂制成的软密封胶囊。push-fit胶囊含有所述所述活性化合物,所述化合物的形式为任选地与填充剂诸如乳糖、粘合剂诸如淀粉和/或润滑剂诸如滑石粉或硬脂酸镁,和任选地稳定剂混合的颗粒。在软胶囊中,所述活性化合物优选溶于或悬浮于合适的液体诸如脂肪油、液体石蜡或聚乙二醇中。此外,任选地加入稳定剂。
直肠使用的药用制剂包括例如栓剂,所述栓剂含有活性化合物与栓剂基质的组合。合适的栓剂基质为,例如天然或合成的甘油三酯、链烷烃、聚乙二醇或高级链烷醇。此外,含有所述活性化合物与基质组合的明胶直肠胶囊是有作用的。基质物质包括,例如液体甘油三酯、聚乙二醇或链烷烃。在本发明的另一个实施方案中,使用灌肠制剂,所述制剂任选地含有增粘赋形剂像甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素、carbopol、甘油聚丙烯酸酯或其它水凝胶。
胃肠外给药的合适的制剂包括水溶性形式的所述活性化合物的水溶液,例如水溶性盐。
此外,以合适的油性注射悬浮剂给予所述活性化合物的悬浮剂。合适的亲油溶剂或载体包括脂肪油例如芝麻油或合成的脂肪酸酯例如油酸乙酯或甘油三酯。注射水悬浮剂任选地包括增加所述悬浮剂粘度的物质,所述物质包括例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇和/或葡聚糖。所述悬浮剂任选地含有稳定剂。
F.本发明化合物的合成通常经包括酰基氯或酸酐与胞苷或尿苷反应的酰化方法合成胞苷和尿苷的酰基衍生物。
2’,3’,5’-三-O-丙酮酰尿苷的合成示于实施例6中。
* * *以下实施例为说明性的,但不限制本发明的所述方法和组合物。对本领域技术人员显而易见的临床治疗中遇到的各种条件和参数的其它合适的修改和改变是在本发明的精神和范围内。
实施例实施例1用三乙酰尿苷治疗多系统线粒体性疾病一名患有部分复合体I缺陷的29岁妇女和被诊断患有导致中风样发作、共济失调和脑病的线粒体性疾病的她的儿子,表现为多系统线粒体性疾病。病征和症状包括偏瘫性/失语性偏头痛、癫痫大发作、神经原性肠和膀胱功能障碍、每天需要约4次导管插入、吞咽困难、产生疼痛性感觉异常的自主和外周多神经病、心动过速/心动过缓综合征和很低的肺功能容量以致如果不停下来休息则没有能力爬一段楼梯以及减退的认知能力、持续数小时至数天神志不清和很差的记忆的发作。
在开始用0.05mg/kg/天口服三乙酰尿苷治疗后,且治疗的持续时间至少6个月,该患者一直没有癫痫发作或偏头痛;与外周神经病有关的她的感觉异常已经消除。在大多数的天数她能够自发地排泄,仅每周一次或两次需要导管插入。用三乙酰尿苷治疗6周后,该患者能够走整整一英里,因为她功能不足的肺功能容量,她已经在过去的两年不能走这么远的路了。她在睡眠期间心动过缓和在劳累期间心动过速的发作在频率方面已经降低;治疗之前,在简单站起来就发生心率超过140bpm的心动过速,而用三乙酰尿苷治疗6周后,仅在爬山和爬楼梯时发生心动过速。她的神志一直清楚并且记忆缺陷已经显著地改善。
在治疗期间,该患者的月经周期从4周缩短到2周,并且通过雌二醇、黄体酮、FSH和LH测量评价,她表现出持久性的黄体期。几个月后,她的周期才恢复到4周正常水平。
该患者证实了本发明重要的特性,因为1),本发明的化合物引起与在多种组线粒体功能障碍相关的复杂多系统疾病实际上所有特性的改善,和2)本发明的化合物意外地可用来治疗与部分复合体I缺陷有关的疾病状态,所述缺陷影响直接与从头嘧啶生物合成的电子传递顺序之外的一部分线粒体呼吸链。
短暂的缩短该患者的月经周期解释为由三乙酰尿苷引起的卵巢功能的改善,尽管神经内分泌系统企图通过过多的激素刺激代偿卵巢功能障碍。卵巢和下丘脑之间的反馈导致周期时间的逐渐正常化。
实施例2顽固性癫痫的治疗一个11岁男孩从4.5岁起一直患有顽固性癫痫,这是明显地由多线粒体DNA缺陷引起的综合征。于1997年12月,他的病开始恶化,包括两次入院监护护理以治疗逐渐恶化的癫痫。甚至用标准抗惊厥药的激进的方案治疗,该患者每晚有8-10次癫痫大发作,使他不能正常上学或参加体育活动。他还发展为上唇自动症。
在开始用口服三乙酰尿苷(开始剂量为0.05g/kg/天,然后在几周内增加到0.1和0.24g/kg/天)治疗后的前三天,没有癫痫发作,并且不随意的嘴唇运动停止。尽管比用三乙酰尿苷治疗之前发作的频率低得到,但随后有几次癫痫发作复发特别是在感染期间发作。该患者已经能重返学校并重新开始积极参加运动。他的食欲、认知功能和灵巧运动协调能力在治疗期间已经改善,导致学习成绩提高并在体育活动像蓝球方面有杰出的表现。
实施例3肾小管性酸中毒的治疗一个2岁女孩,患有与严重复合体缺陷相关的利氏综合征(亚急性坏死性脑脊髓病),表现为肾小管性酸中毒,需要每天静脉内给予25mEq碳酸氢钠。在开始用0.1g/mg/天三乙酰尿苷胃内治疗后几小时内,她的肾小管性酸中毒消除并不再需要补充碳酸氢钠以中和血液pH。三乙酰尿苷也导致升高的循环氨基酸浓度快速正常化,并在停止二氯乙酸酯治疗后维持低水平乳酸,所述治疗先前用来防止乳酸性酸中毒。
实施例4发育延缓的治疗一个患有癫痫、共剂失调、语音障碍和脂肪不耐受性以及二羧酸尿症的4.5岁女孩,用日剂量0.1-0.3g/kg/天的三乙酰尿苷治疗。这样的治疗导致癫痫发作频率减少50%,改善共济失调和运动协调性,恢复饮食脂肪耐受性并非常快地加速发育语言表达能力。
实施例5紫杉酚诱导的神经病的预防外周神经病是一种常见病,而通常有重要抗癌剂像顺铂和紫杉酚的剂量限制、副作用。在紫杉酚的情况下,感觉神经病在给药后几天内发生。紫杉酚的作用机制包含稳定微管,它可用来治疗癌症,但对外周神经元有害。微管稳定损害了细胞组分的轴突运输。线粒体穿梭在胞体和神经元末端之间,以便线粒体呼吸链组分的表达可以由核转录因子调节。在线粒体穿梭受抑制期间,由于对mtDNA转录因子的暴露不足,远离核的线粒体在由线粒体基因组编码的呼吸链亚单位的表达方面下降,不合适,导致区域性神经元能量衰竭并导致线粒体功能障碍的其它结果。
将两组小鼠,每组10只小鼠,经腹膜内注射,用紫杉酚21.6mg/gk/天连续处理6天。10只小鼠的另一组只接受载体注射。其中一组紫杉酚处理的小鼠给予口服三乙酰尿苷,4000mg/kg b.i.d。开始紫杉酚处理后的9天,将尾尖暴露于用红外线加热灯聚焦的热辐射后,通过测定甩尾潜伏期来测试伤害感受性感觉缺陷。在该系统中,对辐射热的甩尾反应的延迟与感觉神经缺陷有关。
组别 甩尾潜伏期对照(不含紫杉酚) 10.8±0.5秒紫杉酚 16.0±3.1秒紫杉酚+三乙酰尿苷11.9±0.7秒紫杉酚处理减少作为一种中毒性感觉神经病的指示的对疼痛刺激的反应。口服三乙酰尿苷处理显著性减少甩尾潜伏期中紫杉酚诱导的改变。
实施例6尿苷丙酮酸的合成A.采用Ottenheum和Man(Synthesis,1975,第163页)的方法,通过α,α-二氯甲基甲基醚与丙酮酸的反应完成丙酮酰氯的制备。
B.尿苷(3.0g,12mmol)在真空下经甲苯共沸干燥(3x),然后溶于DMF(20mL)和吡啶(20mL)中。将所产生的溶液冷却至-10℃,并滴加6.0mL丙酮酰氯(上述步骤A中所生产的)。将所述反应混合物于室温、氩气下搅拌24小时。通过TLC(5%MeOH/CH2Cl2)分析显示尿苷消耗。将所述反应混合物蒸发至干,然后分配在CH2Cl2和碳酸氢钠水溶液之间。所述有机层用水、HCl水溶液(pH3.0)和水洗涤;经硫酸钠干燥;浓缩;然后采用快速层析法(硅胶,5%MeOH/CH2Cl2)纯化,得到1.4g尿苷丙酮酸或2’,3’,5’-三-O-丙酮酰尿苷。
实施例7在帕金森病(PD)和线粒体功能障碍的MPTP模型中口服三乙酰尿苷的治疗效应神经毒素1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)是用来诱导多巴胺能细胞丧失的复合体I(NADH脱氢酶)线粒体呼吸链抑制剂(Varastet等,Neuroscience,6347-56,1994)。目前该毒素广泛用作PD的动物模型(Bezard等,Exp Neurol,148288-92,1997)。
来自Taconic Farms体重30-40g 6-9月龄雄性C57/BL6小鼠用于MPTP研究(n=7/组)。将MPTP(30mg/kg i.p.)b.i.d.给予1.5天。在给予毒素前2小时,在0.75%羟丙基甲基纤维素载体中以200mg TAU/mL溶液b.i.d.4g/kg p.o.给予TAU,直到处死所述小鼠的前一天为止。
在停止注射MPTP后8天,以CO2处死所述小鼠,然后在冷表面上解剖来自双侧的纹状体。将所述纹状体在干冰上冷冻。根据纹状体的多巴胺(DA)含量评价所述多巴胺能神经元存活情况。在GLP条件下通过放射酶学方法测定所述多巴胺含量,但也可以如先前所描述的采用高压液相层析法与电化学检测法一起测量DA(Friedemann和Gerhardt,Neurobiol Aging,13325-32,1992)。在MPTP处理的小鼠中由于TAU处理引起的死亡率增加。在对照+MPTP小鼠中的死亡率为71.4%,而TAU+MPTP处理组中的死亡率为28.6%。PN401处理对由于MPTP引起的DA含量增加也存在神经保护性效应。
TAU对MPTP诱导的纹状体DA含量减少的效应治疗纹状体DA*对照+对照 147±13.0TAU+对照 93.8±10.7对照+MPTP 9.2±2.2TAU+MPTP 37.9±7.4*数据以ng DA/mg蛋白(平均值±SEM)表示。
采用MPTP(25mg/kg i.p.b.i.d.连续2天)进行第二项研究。来自Taconic Farms体重30-40g 6-9月龄雄性C57/BL6小鼠用于该MPTP研究(n=6/组)。将MPTP(30mg/kg i.p.)b.i.d.给予2天。在毒素给予前2小时,在0.75%羟丙基甲基纤维素载体中以200mg TAU/mL溶液b.i.d.4g/kg bw p.o.给予TAU,直到处死所述小鼠的前一天为止。在MPTP给予前一天开始口服给予TAU或载体(TAU剂量=4g/kg bw b.i.d.),然后在第8天结束。在第9天处死小鼠。该研究也证实,通过由MPTP引起的纹状体DA损失增加的减弱所示,TAU显示出对多巴胺能神经元的保护性效应。
TAU对MPTP诱导的纹状体DA含量减少的效应治疗纹状体DA*对照+对照71.0±10.6TAU+对照 52.0±3.0对照+MPTP15.9±2.2TAU+MPTP 26.7±0.9*数据以ng DA/mg蛋白(平均值±SEM)表示。
实施例8在亨廷顿舞蹈病(HD)的3-硝基丙酸(3NP)模型中TAU的治疗效应HD的特征为进行性神经元的丧失,特别是在纹状体中。患有HD的患者的琥珀酸脱氢酶(复合体II)-泛醌醇氧化还原酶(复合体III)活性的活性降低。Browne,Mitochondria & Free Radicals in NeurodegenerativeDiseases,361-380(1997)。HD的一种广泛使用的模型采用琥珀酸脱氢酶的一种抑制剂,3-硝基丙酸(3NP)。(Ferrante等,Mitochondria & FreeRadicals in Neurodegenerative Diseases,229-244,1997)。具体地讲,3NP诱导对所述纹状体的损害。(Brouillet等,J Neurochem,60356-9,1993)。
6-8月龄瑞士雄性小鼠(National Cancer Institute;NCI,Frederick,MD)每天用3NP(65mg/kg i.p.)处理连续4天以诱导死亡、神经元细胞丧失和行为障碍(n=8/组)。在0.75%羟丙基甲基纤维素载体中以200mgTAU/mL b.i.d.4g/kg bw p.o.给予TAU,在前一天给予所述小鼠ATU,并且每天给予ATU,直至第8天。在第9天,所述小鼠用10%缓冲的福尔马林灌注固定,然后进行银染色以检测神经元的损害。如下所示,与对照组相比,用TAU处理的小鼠中存在由于3NP引起的死亡率的降低。在3NP+TAU组中没有死亡,但在载体+3NP组中8只小鼠中有3只死亡。
对3NP处理的小鼠进行行为记录,以测定在所述研究期间在任何时间是否存在任何运动原损害。根据总体观察表明,88%的对照+3NP处理的小鼠出现行为障碍。在TAU+3NP处理的小鼠中,发现障碍的发病率减少,只有50%。
通过对组织样品身份的盲法病理学分析银染色。在TAU+3NP处理的小鼠中,没有检测到明显的神经元损害的病征。然而,在对照+3NP处理的小鼠中,在纹状体区(尾状核区/豆状核区)和塞梅林神经节的突触末端的银染色是明显的。在80%的TAU+3NP处理的小鼠中,也发现丘脑、中脑深层和/或网状结构(髓)中的轴突和/或突触末端的浸银。塞梅林神经节投射到所述纹状体,3NP特别容易损伤这些区域。TAU防止对塞梅林神经节和纹状体的损伤。
实施例9癫痫的3-硝基丙酸(3NP)模型中的TAU的治疗效应3-硝基丙酸(3NP)是通过抑制呼吸链的复合体II起作用的一种线粒体毒素;它可用来诱导类似于亨廷顿舞蹈病的那些特征的大脑损伤。癫痫发作也可以通过使用3NP来诱导,作为癫痫和线粒体功能障碍的一种模型。Urbanska等,Eur J Phamacol,35955-8(1998)。在整个研究中都使用体重在26-40g之间的雄性CD-1小鼠(National CancerInstitute,NCI,Frederick.MD)。将小鼠分为5组,并从不同的笼中随机挑选每个组的动物以避免年龄的可能的影响。所述鼠保持12小时光照/12小时黑暗周期,并可自由得到水和食物。所有试验均在9:00-16:00之间的光照期间进行。将小鼠(n=17-20)给予160mg/kg 3NP后癫痫发作。在无菌水(pH7.4)中以16mg或18mg/ml制备3NP。以i.p.0.1ml/10g体重(体积)给予3NP。在3NP给予前2小时,在0.75%羟丙基甲基纤维素载体中以4g/kg p.o.给予TAU。类似于先前所描述(Roberts和Keith,J Pharmacol Exp Ther,270505-11,1994;Urbanska等,Eur JPharmacol,35955-8,1998)的方法评价癫痫发作。
在应用3-NP后的120分种内进行行为观察。已经观察并记录下癫痫发作反应的三种主要类型1.阵挛性运动伴随过面部颤搐的前肢运动;2.突发阵挛性运动所有四肢的运动,包含跑、跳和蹦;3.强直性反应包括所有四肢的强直性曲和强直性伸。
3NP注射后的120分种时评价死亡率。
3NP主要是诱导阵挛性癫痫发作,并且某些小鼠继续发展为一般导致死亡的跑和跳的行为。TAU减少由于3NP引起的阵挛性癫痫发作、跑发作和死亡的百分发病率。主要最终影响是阵挛性癫痫发作的潜伏期。TAU将阵挛性癫痫发作的潜伏期从25.0分钟增加到40.8分钟。数据以平均值±SEM表示。
终点对照+3NPTAU+3NP%阵挛性癫痫发作 90.070.6%跑发作 42.95.9%死亡35 11.8阵挛性癫痫发作的潜伏期23.8±0.7 40.8±4.9
实施例10在兴奋毒性喹啉酸(QA)模型中的TAU的治疗效应喹啉酸是在亨廷顿舞蹈病和兴奋毒性损伤的模型中已经使用的NMDA受体兴奋剂(Beal等,J Neurosci,111649-59,1991;Beal等,JNeurosci,11147-58,1991;Ferrante等,Exp Neurol,11946-71,1993)。当将它直接给予纹状体中时可以诱导对CNS的严重损伤。由于纹状体内QA引起的损伤和/或死亡类似于由于CNS病原学引起损伤和/或死亡。
将雄性6-8月龄瑞士小鼠(National Cancer Institute;NCI,Frederick,MD)用QA处理(在两个纹状体中的双侧给予50或100nmole,n=8/组)。在前一天然后每天直到第6天为止,在0.75%羟丙基甲基纤维素载体中以200mg TAU/mL b.i.d.4g/kg bw p.o.给予TAU。于第7天处死小鼠。如先前所描述的(Tatter等,Neuroreport,61125-9,1995),以2μl体积给予QA。
在TAU处理的小鼠中,由于QA引起的死亡率降低。用50nmoleQA处理7天存活的小鼠百分比在对照TQA中为64%,而在TAU+QA中为73%,用100nmol QA处理的小鼠在对照+QA组中只有4%存活,而在TAU+QA组中有19%存活。TAU证实了对由于QA引起的兴奋毒性的神经保护性效应。
* * *尽管已经通过优选实施方案描述了本发明,但不用说本领域中的技术人员可以进行各种变化和修改。因此,所附的权利要求书中包括属于要求保护的本发明的范围内的所有这种等同变化和修改。
权利要求
1.嘧啶核苷酸在制备用于治疗或预防哺乳动物中的线粒体呼吸链功能障碍的病理生理后果的药物中的用途。
2.如权利要求1中的用途,其中所述呼吸链功能障碍是由线粒体DNA的突变、缺失或重排引起的。
3.如权利要求1中的用途,其中所述呼吸链功能障碍是由线粒体呼吸链的缺陷的核编码的蛋白组分引起的。
4.如权利要求1中的用途,其中所述呼吸链功能障碍是由衰老引起的。
5.如权利要求1中的用途,其中所述呼吸链功能障碍是由将细胞毒性癌症化疗剂给予所述哺乳动物引起的。
6.如权利要求1中的用途,其中所述呼吸链功能障碍是线粒体复合体I活性的缺陷。
7.如权利要求1中的用途,其中所述呼吸链功能障碍是线粒体复合体II活性的缺陷。
8.如权利要求1中的用途,其中所述呼吸链功能障碍是线粒体复合体III活性的缺陷。
9.如权利要求1中的用途,其中所述呼吸链功能障碍是线粒体复合体IV活性的缺陷。
10.如权利要求1中的用途,其中所述呼吸链功能障碍是线粒体复合体V活性的缺陷。
11.如权利要求1中的用途,其中所述嘧啶核苷酸选自尿苷、胞苷、尿苷的酰基衍生物、胞苷的酰基衍生物、乳清酸、乳清酸的醇酯或其药学上可接受的盐的嘧啶核苷酸前体。
12.如权利要求11中的用途,其中所述嘧啶核苷酸前体是胞苷的酰基衍生物。
13.如权利要求11中的用途,其中所述嘧啶核苷酸前体是尿苷的酰基衍生物。
14.如权利要求11中的用途,其中所述尿苷的酰基衍生物是2’,3’,5’-三-O-乙酰尿苷。
15.如权利要求1 1中的用途,其中所述尿苷的酰基衍生物是2’,3’,5’-三-O-丙酮酰尿苷。
16.如权利要求11中的用途,其中所述乳清酸的醇酯其醇取代基是乙醇。
17.如权利要求11中的用途,其中所述嘧啶核苷酸前体是胞苷二磷酸胆碱。
18.如权利要求11中的用途,其中所述药物是口服的嘧啶核苷酸前体。
19.如权利要求11中的用途,其中所述药物是剂量为10-1000mg/kg体重/天的嘧啶核苷酸前体。
20.如权利要求11的用途,其中所述药物是剂量为50-300mg/kg体重/天的嘧啶核苷酸前体。
21.如权利要求11中的用途,其中所述药物是剂量为100-300mg/kg体重/天的嘧啶核苷酸前体。
22.如权利要求1中的用途,其中所述线粒体呼吸链功能障碍的病理生理后果是先天性线粒体性疾病。
23.如权利要求22中的用途,其中所述先天性线粒体性疾病选自MELAS、LHON、MERRF、MNGIE、NARP、PEO、利氏病和Kearns-Sayres综合征。
24.如权利要求1中的用途,其中所述线粒体呼吸链功能障碍的病理生理后果是神经变性性疾病。
25.如权利要求24中的用途,其中所述神经变性性疾病是早老性痴呆。
26.如权利要求24中的用途,其中所述神经变性性疾病是帕金森病。
27.如权利要求24中的用途,其中所述神经变性性疾病是亨廷顿舞蹈病。
28.如权利要求24中的用途,其中所述神经变性性疾病是在认知功能方面的年龄相关减退。
29.如权利要求1中的用途,其中所述线粒体呼吸链功能障碍的病理生理后果是神经肌肉变性性疾病。
30.如权利要求29中的用途,其中所述神经肌肉变性性疾病选自肌营养不良、强直性肌营养不良、慢性疲劳综合征和弗里德赖希共济失调。
31.如权利要求1中的用途,其中所述线粒体呼吸链功能障碍的病理生理后果是在认知、运动、语言、执行功能(executive function)或社会性技能方面的发育延缓。
32.如权利要求1中的用途,其中所述线粒体呼吸链功能障碍的病理生理后果选自癫痫、外周神经病、视神经病、自主神经病、神经原性肠功能障碍、感觉神经性聋、神经原性膀胱功能障碍、偏头痛和共济失调。
33.如权利要求1中的用途,其中所述线粒体呼吸链功能障碍的病理生理后果选自肾小管性酸中毒、扩张性心肌病、脂肪性肝炎、肝衰竭和乳酸血症。
全文摘要
本发明提供治疗与线粒体功能障碍相关疾病的化合物、组合物和方法。所述方法包括给予哺乳动物含有嘧啶核苷酸前体的组合物,所述嘧啶核苷酸前体的量以足够治疗由线粒体呼吸链缺陷导致的症状。
文档编号A61P21/00GK1636572SQ20041009057
公开日2005年7月13日 申请日期1999年8月31日 优先权日1998年8月31日
发明者R·W·冯波尔斯特 申请人:普罗神经细胞有限公司
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