专利名称：大肠杆菌菌株dsm 6601的无质粒的克隆的制作方法
技术领域：
本发明涉及大肠杆菌(E.coli)菌株DSM 6601的无质粒的克隆，其制备方法以及如此获得的细菌作为克隆载体的用途。
大肠杆菌是在自然中特别是在人和动物的肠中存在的细菌，长期以来其就已经是深入的微生物学和基因技术研究的对象，并在基因技术中特别地用于克隆和/或表达某种的基因或者蛋白质。
大多数埃希氏菌属(Escgerichia)的菌株在肠腔外是致病的，并通常在侵袭部位导致感染。大肠杆菌的一个非致病菌株是在德国微生物保藏所中保存的菌株DSM 6601，其在一些基因特征上与所有常见的大肠杆菌菌株不同。然而，已经表明这种菌株只是在复杂的情况下并且部分地是完全不可进行基因操作的，因此其不能用作简单的克隆试剂。
大肠杆菌DSM 6601天然地含有两种质粒，它们被称为pMut1或pMut2，和分别具有3177kb和5552kb的大小。例如在US-6,391,631中描述了这些质粒和其DNA序列。
大肠杆菌的致病性或非致病性明显部分地受到其质粒的控制，从这一考虑出发，和部分出现的大肠杆菌菌株的“基因抗性”也可能与其隐蔽的质粒有关这另一考虑出发，本发明的任务是开发出无质粒的大肠杆菌，除此之外其与原始菌株就其基因组DNA方面在基因上完全相同。
前述的任务通过提供大肠杆菌菌株DSM 6601的无质粒的克隆以及通过制备这样的克隆的方法来解决。
在附图中
图1以示意图的形式显示了制备菌株DSM 6601的无质粒的克隆的方法路线。
图2显示了质粒pMut1-Tc的物理图谱。
图3显示了质粒pMut2-Kn的物理图谱。
在导致本发明的漫长的研究中，已经表明用通常的基因技术方法根本不能或者只在巨大的困难下能够制备菌株DSM 6601的无质粒的克隆，因此必须采取特殊的方法来形成这样的克隆。因为该菌株的野生型除了其基因组DNA之外还具有两种不同大小的质粒，因此这些质粒的去除必须在多个、部分平行施行的步骤中进行。
为了制备本发明的克隆，根据本发明的方法，在第一步骤中用抗生素抗性分别标记在大肠杆菌菌株DSM 6601中天然存在的质粒pMut1和pMut2。为此根据常规方法分离质粒，并在希望的位点上引入抗性基因。根据一个优选的实施方案，将抗性基因与表达盒一起引入各个质粒中，该表达盒含有构建的或还是可诱导的启动子。
然后，根据常规方法如CaCl2方法或电穿孔将如此获得的质粒引入合适的宿主中，并在那里进行克隆，其中引入各个质粒中的抗性基因使得能够容易地选择带有该质粒的宿主细胞。适合于克隆带有该抗性基因的质粒的宿主例如为大肠杆菌菌株DH5α或大肠杆菌HB101。
分离带有该抗性基因的质粒，随后将sacB基因引入质粒中，以提供进一步的标记。
然后，将如此获得的或者说经标记的质粒引入大肠杆菌菌株DSM6601中。
在转化之后，将大肠杆菌DSM 6601在含有抗生素的培养基上进行培养，对于该抗生素在先前的步骤中引入质粒的抗性基因能够表现出抗性。
通过在这样的培养基上进行培养，只有对于营养培养基中含有的抗生素具有抗性的克隆能够生长。此外，因为这些细菌的生长不再需要原来的质粒pMut1和pMut2，所以这些细菌丢失多余的基因物质，以致于这些细菌最后只是仍然含有经修饰的质粒pMut1和pMut2(其含有抗性基因和sacB基因)。
在进一步的步骤中，将如此培养的细菌转移至抑制含有sacB的细菌生长的营养培养基中，其中产生基本上只允许已经丢失sacB基因的细菌生长的选择压力。这可以通过在10％蔗糖的存在下于30℃培养菌株来进行，因为在这样的条件下只有这种已经丢失了带有sacB基因的质粒的克隆能够进行复制。
结果获得菌株DSM 6601的无质粒的衍生物。
现在发现，具有质粒丧失的本发明的克隆丝毫没有发生基因组DNA的改变，并能够令人惊奇地很好地用作克隆载体。
因此，它们能够在实验室中无风险地用作宿主细胞用于克隆或表达许多基因或蛋白质。使用本发明的菌株DSM 6601 ΔpMut1/2的试验表明，当将外源DNA整合入该菌株的特有的、以分离的形式存在的质粒中，即该特有的质粒由此用作外源DNA的克隆载体时，该菌株是对于外源DNA的特别优异的受体。此外，因为这些细菌来自非致病性菌株，因此它们能够用于在动物和人中治疗胃肠道紊乱。为此，如果需要，它们可以用促进细菌粘附在粘膜上的外源基因进行转化，例如粘附素，其视需要宿主动物特异性地促使细菌粘附在例如牛和/或猪的粘膜上，因此阻碍或防止其他病原微生物的生长。
现在，用参考实施例来进一步解释本发明。
实施例1pMut1的改变野生型DSM 6601的两种天然存在的质粒pMut1和pMut2根据QIAGEN的质粒中等规模制备方案(Plasmid-Midiprep-Protokoll)(QIAGEN Plasmid Purification Handbook 12/2002，第16-20页)来进行分离。
为了标记质粒pMut1，选择源自载体pBR322的四环素抗性盒。将附属的启动子从质粒pASK75中取出。将由这样的克隆过程得到的质粒称为pKS-tetAtetp/o。用限制性内切酶XbaI和HindIII切割出插入片段tetAtetp/o(插入片段大小为1.5kb)。将该XbaI/HindIII片段通过NbeI限制性酶切位点引入质粒pMut1中。
为此，在用相应的酶对质粒进行限制性内切酶酶切消化之后，将限制性内切酶酶切产物通过柱(Quiagen，PCR纯化试剂盒)进行纯化，并进行Klenow处理以形成“平头末端”。为了防止质粒pMut1的重新连接，将用限制性内切酶NdeI线性化并用Klenow酶处理的质粒进行去磷酸化。随后将载体pMut1与插入片段tetAtetp/o连接，并用其转化大肠杆菌K-12菌株DH5α。
为了制备感受态细胞，将150ml LB培养基(Lurea-Bertani培养基)用1.5mlN培养物接种，并于37℃摇动，直至OD600＝0.5。然后将细菌培养物于冰上培养20分钟，并于4℃以4000Upm离心10分钟。将细菌粒状沉淀在无菌的、冰冷的10％甘油中洗涤3次，第一次用100％的初始体积，然后用50％的初始体积，和最后一次用10％的初始体积。最后，将经洗涤的沉淀物重新悬浮在300μl 10％甘油中，等分成几份(40μl)，并于-80℃储存。为了转化细菌细胞，将1-2μl质粒DNA(1-100ng)与40μl在冰上融解的感受态细胞混合，并在冰上培养5分钟。然后，用移液器将这一所得物无气泡地转移至无菌且预冷的2mm电穿孔杯(Küvette)的两个电极之间。将该杯充分晾干，并在电极夹中使用。于2.5kV、200Ω和25μF实施了电脉冲之后，用1ml LB培养基将细菌悬浮液从电穿孔杯中冲洗出来，并在摇床中于37℃培养1-2小时。随后离心出细菌，并取出直至100μl的上清液。将沉淀在剩余的100μl中重新悬浮，在含有Tc的选择平板上涂板，并将N于37℃进行培养。
克隆的结果通过微量制备单个细菌克隆的各个质粒来检查。将用四环素盒标记的质粒pMut1称为pMut1-Tc。在图2中描绘了质粒pMut1-Tc的物理图谱。给出了对于介导四环素抗性的DNA片段的插入位点(初始时为单NdeI位点)。所述DNA片段还含有适合于克隆的单EcoRI序列。此外，给出了对于引物Muta5和Muta6的结合位点，这些引物适合于通过PCR来特异性地检测这些质粒。
实施例2pMut2的改变为了标记质粒pMut2，选择源自载体pACYC177的卡那霉素抗性盒。为此，用限制性内切酶StuI从该质粒中切割出抗性盒(大小为1.34kb)，并通过BglII限制性酶切位点引入质粒pMut2中。在用相应的酶对质粒进行限制性内切酶酶切消化之后，将限制性内切酶酶切产物通过柱(Quiagen，PCR分级试剂盒)进行纯化，并进行Klenow处理所述质粒pMut2以形成用于克隆的”平头末端”。为了防止质粒pMut2的重新连接，将用限制性内切酶BglII线性化并用Klenow酶处理的质粒进行去磷酸化。随后连接载体pMut2和卡那霉素盒，并用此如实施例1中所述转化大肠杆菌K-12菌株DH5α。将所述转化物在含有Kn的LB琼脂平板上进行涂板。克隆的结果通过微量制备单个细菌克隆的质粒DNA来检查。将用卡那霉素盒标记的质粒pMut2称为pMut2-Kn。
在图3中描绘了质粒pMut2-Kn的物理图谱。图中画出了对于卡那霉素抗性盒的插入位点(初始时为单BglII位点)，以及适合作为克隆位点的单EcoRI序列。用Muta7至Muta10标明与引物序列互补的那些区域，这些区域适合于通过PCR来特异性地检测这些质粒。
实施例3sacB基因的引入为了将sacB基因(编码果聚糖蔗糖酶)引入用抗性盒标记的质粒pMut1-Tc和pMut2-Kn中，各在这两个质粒中选择出单EcoRI限制性酶切位点。用限制性内切酶PstI从质粒pCVD442中分离出sacB基因(大小为2.6kb)。为了准备载体pMut1-Tc和pMut2-Kn，将这些质粒用EcoRI进行线性化，随后施行Klenow处理以形成“平头末端”以及去磷酸化。将插入片段sacB在用PstI进行限制性内切酶消化之后进行纯化，并用Klenow酶处理。连接线性化的载体和插入片段，并用此转化如实施例1中所述制成感受态的大肠杆菌K-12菌株DH5α。克隆的结果通过微量制备单个细菌克隆的质粒DNA和随后的限制性内切酶酶切分析来检查。将用sacB基因标记的质粒pMut1-Tc和pMut2-Kn称为pMut1-TcSac和pMut2-KnSac。
实施例4大肠杆菌菌株DSM 6601的无质粒的克隆的制备首先，将质粒pMut1-TcSac如实施例1所述通过电穿孔转化入这一菌株中。在用于将质粒pMut1-TcSac转移入菌株DSM 6601中的电穿孔之后，将所得物在含有Tc(50μg/ml)的LB平板上进行涂板。将获得的四环素抗性细菌克隆就质粒pMut1-TcSac的拥有和与此相关的天然存在的质粒pMut1的丧失方面进行检查。质粒pMut1的丧失通过如下方法进行检测，即在制备质粒DNA和用酶EcoRI进行限制性内切酶酶切消化之后，并在电泳分离线性化的质粒之后，通过代表pMut1的DNA条带的丧失来检测。
随后将这些克隆之一在含有10％蔗糖的LB培养基中于30℃培养过夜，然后在含有10％蔗糖的LB平板上进行涂板(LB培养基的组成为在1L蒸馏水中含有10g来自酪蛋白的蛋白胨、5g酵母提取物和5g氯化钠)。在冷却至45℃之后通过向经高压灭菌的培养基中添加一定比例的过滤除菌的50％(重量/体积)蔗糖原液直至10％的终浓度，来制备含有蔗糖的LB培养基。将平板于30℃进行培养。在这些条件下，只有那些不再表达sacB即已经丢失了带有sacB基因的质粒的克隆能够进行复制。对由此得到的菌株DSM 6601 ΔpMut1就质粒pMut1-TcSac的丧失进行检查。
然后，通过电穿孔将质粒pMut2-KnSac引入菌株DSM 6601 ΔpMut1中。
在用于将质粒pMut2-KnSac转移入菌株DSM 6601 ΔpMut1中的电泳之后，将所得物在含有Kn(50μg/ml)的LB平板上进行涂板。将所获得的卡那霉素抗性细菌克隆就质粒pMut2-KnSac的拥有和与此相关的天然存在的质粒pMut2的丧失方面进行检查。随后将这些克隆之一在含有10％蔗糖的LB培养基中于30℃培养过夜，然后在含有10％蔗糖的LB平板上进行涂板。将平板于30℃进行培养。对由此得到的菌株DSM 6601 ΔpMut1/2就质粒pMut2-KnSac的丧失进行检查。
此外，对于无质粒的菌株DSM 6601 ΔpMut1/2施行脉冲场电泳，以排除可能的菌株的染色体改变。已确定不能检测到变化，且进一步的试验证明无质粒的克隆丝毫没有显示出形态学的、生物化学的或发酵的变化。
权利要求
1.大肠杆菌菌株DSM 6601的无质粒的克隆。
2.用于制备根据权利要求1的无质粒的克隆的方法，其特征在于下列步骤a)将抗性基因引入质粒pMut1和pMut2中，b)将sacB基因引入步骤a)中获得的质粒中，c)将步骤b)中获得的质粒引入大肠杆菌菌株DSM 6601中，并在这样的条件下培养该菌株，即在该条件下天然存在的质粒pMut1和pMut2受到步骤b)中获得的质粒的排挤；和d)将步骤c)中获得的克隆在这样的条件下进行培养，即该条件使得基本上只有丧失sacB基因的细菌能够生长。
3.根据权利要求2的方法，其特征在于，抗性基因存在于表达盒中。
4.根据权利要求2或3的方法，其特征在于，抗性基因选择四环素抗性或卡那霉素抗性。
5.根据权利要求2-4中任一项的方法，其特征在于，质粒pMut1用四环素抗性盒和sacB基因进行标记，和原来的质粒pMut2用卡那霉素抗性盒和sacB基因进行标记。
6.根据权利要求2-5中任一项的方法，其中将用标记有四环素抗性盒和sacB基因的质粒pMut1转化的细菌在含有四环素的平板上进行培养，随后在含有蔗糖的平板上进行培养，并在首先去除质粒pMut1之后，通过在卡那霉素平板上进行培养和在蔗糖平板上继续进行培养来去除质粒pMut2。
7.根据权利要求1的无质粒的克隆用作克隆菌株的用途。
8.根据权利要求1的无质粒的克隆用于制备药剂的用途，该药剂用于在动物中治疗胃肠的紊乱。
全文摘要
本发明涉及大肠杆菌(Escherichia coli)菌株DSM6601的无质粒的克隆，其制备方法以及其作为克隆载体的用途。
文档编号A61K35/74GK1700925SQ200480000915
公开日2005年11月23日 申请日期2004年6月25日 优先权日2003年6月26日
发明者J·哈克尔, T·欧尔施拉格尔, S·奥斯瓦尔德, U·索南波恩, H·普罗泊特 申请人:制药中心有限公司