专利名称：类固醇衍生物在治疗血管紧张素Ⅱ相关性疾病如心血管性和增生性疾病中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及包括曲洛司坦(trilostane)或相关化合物为活性成分的药物组合物在治疗血管紧张素II相关性疾病，尤其是血管紧张素II相关性心血管疾病中的应用。
调节血管紧张素II体内水平是预防心血管疾病和减轻其影响的重要因素。血管紧张素II在体内起到了几种作用，这些作用中的一些直接导致了心血管疾病；其他的一些导致产生各种激素，例如盐皮质激素(具体的例子如醛固酮)，这些激素又导致了疾病。本发明涉及采用调节体内血管紧张素II受体作用的曲洛司坦或相关化合物来治疗心血管疾病。
心血管功能受到由体内各器官释放到体循环中，且相互联系和相互作用的激素所构成的复杂系统所影响。肾素-血管紧张素-醛固酮(RAAS)系统是所涉及的主要激素群之一。
在该系统中，肾脏分泌蛋白水解酶肾素，该蛋白水解酶肾素作用于血管紧张素原这一血浆蛋白，分离出被称为血管紧张素I的一种含有10个氨基酸的片段。在被称为血管紧张素转化酶(ACE)，即血管分泌的一种肽酶的作用下，血管紧张素I发生分解，产生含有8个氨基酸的血管紧张素II。血管紧张素II(Ang II)具有许多作用，包括收缩小动脉血管壁；封闭毛细血管床；刺激小动脉血管壁中的平滑肌细胞生长从而收缩和刺激肾部小管以重吸收钠离子；以及刺激肾上腺皮层释放醛固酮。
醛固酮使肾脏回收更多的钠并因此也回收水，增加了心跳的力量，并且也刺激垂体释放抗利尿激素(ADH，即精氨酸抗利尿激素)。
除了系统作用之外，现在认为这些激素也会在某些器官的组织中产生，并且具有以系统水平而进行的局部作用。尽管局部的肾素-血管紧张素系统被描述为机能独特的系统，近期的研究已经表明这些局部肾素-血管紧张素系统的机能亢进和心血管机能障碍之间存在联系。例如，一些研究表明人类心脏的肾素-血管紧张素系统在心脏病的情况下可能会被激活。而且，编码肾素-血管紧张素系统的基因呈现多态性似乎与高血压和左心室肥大有关(ClinExp Hypertens 1995 Apr；17(3)441-68)。
局部心血管的肾素-血管紧张素系统(RAS)的存在经常被用于解释RAS抑制剂治疗心血管疾病的长期有益疗效。然而，可能是由于并非所有的RAS组分都能在原位合成，因此局部血管紧张素II的形成可能并不依赖于循环的RAS。局部血管紧张素在心脏和管壁上的形成确实发生了，但至少在正常情况下，这可能是依赖于从循环中吸收肾脏肾素。通过改变肾素受体和/或肾素结合蛋白的数目、ACE水平、代谢酶的数量以及血管紧张素受体密度，组织可调节其局部的血管紧张素浓度。因此，肾素与心脏血管膜的结合可以是从血浆吸收肾素的机制的一部分。
在心力衰竭中，反应性间质纤维化的形成与醛固酮有关，而反应性间质纤维化是导致左心室重塑的一种不良调节。一项近期的研究(Endocrinology2002 Dec；143(12)4828-36)描述了醛固酮对大鼠模型心肌损伤的作用。血管紧张素造成了对心脏的损伤，包括动脉纤维蛋白样坏死，血管周围炎症(主要是巨噬细胞)，以及病灶性梗阻。血管病变与炎性递质环氧合酶2(COX-2)和冠状动脉介质中的骨桥蛋白的表达有关。采用依普利酮(eplerenone)(一种新型醛固酮阻断剂)进行治疗，在很大程度上减轻了心肌损伤以及COX-2和骨桥蛋白的表达。该研究推断醛固酮在Ang II-诱导的心脏血管炎症中起到主要作用，暗示COX-2和骨桥蛋白是损伤的潜在递质。在依普利酮对患有慢性心力衰竭的疗效的研究中，揭露了有些类似的发现(Circulation 2002 Dec 3；106(23)2967-72)。该研究中，由冠状动脉内微栓塞造成狗发生心力衰竭，当左心室(LV)射血分数(EF)为30％～40％时停止冠状动脉内微栓塞。在对照组的狗中，LV舒张末期和收缩末期的容量明显增大。相反，采用依普利酮治疗3个月，舒张末期容量、收缩末期容量以及EF都保持不变。LV舒张末期的血管壁压在对照组的狗中发生明显增加，而在依普利酮治疗的狗中却发生下降。与对照组相比，依普利酮与心肌细胞截面积减小28％，反应性间质纤维化的体积分数减少37％，以及替代性纤维化的体积分数减少34％有关。该研究推断，采用依普利酮进行长期治疗防止了渐进性LV官能障碍，减轻了狗体中伴随心力衰竭的LV重塑。
ACE抑制剂，除了具有已被证明的治疗高血压的作用之外，还可用于治疗心力衰竭。临床试验已经表明这些药剂具有改善心脏功能的作用，此外还能减少心力衰竭造成的死亡。人们认为ACE抑制剂治疗心力衰竭的一种治疗机理是循环的血管紧张素II和醛固酮发生减少。然而，肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)在心力衰竭治疗期间并未受到一致的抑制。这一作用被称为“血管紧张素II的再活化”，这可能预示着临床情况恶化。在被称为CONSENSUS I试验的一种大规模临床试验中，死亡率与血管紧张素II和醛固酮之间存在关联性。而且，在血管紧张素II受到较好抑制的情况下，死亡率较低。因此，已表明(Eur J Heart Fail 1999 Dec；1(4)401-6)尽管在充分治疗的情况下，神经激素升高仍可能与不良预后有关。
在随机螺内酯评价研究(Randomized Aldactone Evaluation Study，RALES)中，安体舒通(spironolactone)，一种醛固酮受体拮抗剂，明显地降低了患有严重充血性心力衰竭(CHF)的病人的死亡率。安体舒通与ACE抑制剂共同给药，其作用是使ACE抑制剂增效(JAm Coll Cardiol 2002 Nov6；40(9)1596-601)。
曲洛司坦，(4a，5a-17β)-4，5-环氧-3，17-二羟基雄甾-2-烯-2-腈，在英国专利说明书No.1,123,770以及美国专利说明书No.3,296,295中有所描述。
GB 2,130,588涉及一种制造曲洛司坦和相关化合物的改进方法。该方法能将化合物微粉化而成为等体积球体的平均直径为5-12mm的颗粒，至少95％的颗粒的粒度小于50mm。粒度的特异性更高，则利于改进曲洛司坦的生物利用度以及控制形成的活性代谢物数量，从而改进了临床应答并降低了易变性。
本申请的发明人令人惊奇地发现了曲洛司坦和相关化合物抑制血管紧张素II对血管平滑肌细胞的增生作用，而不必降低血浆中盐皮质激素，如醛固酮的水平，从而能治疗与这些激素相关的增生性疾病。抑制血管紧张素II对血管平滑肌细胞的增生作用，而不必降低血浆中盐皮质激素如醛固酮的水平的这一作用被认为是通过降低血管紧张素II受体的敏感性而引起的。对血管紧张素II受体的敏感性降低，其原因可以例如是细胞内信号，如钙信号的产生受到削弱，以及血管紧张素II 1型(AT1)受体的表达减少了。
曲洛司坦已经被用于目标是抑制治疗肾上腺类固醇分泌的治疗中。肾上腺类固醇的例子包括皮质醇(cortisol)，醛固酮和皮质酮(corticosterone)。实践中，对于肾上腺机能正常的病人，只有在曲洛司坦的剂量水平很高，高至相当于8到10mg/kg/天的情况下，循环的肾上腺类固醇才会减少，而8到10mg/kg/天的剂量正是最常采用的疗法(Beardwell等.1985，ClinEndocrinol(Oxf)，23，413-21；Engelhardt和Weber 1994，J Steroid Biochem MolBiol，40，261-7)。这些数据在全体健康的大鼠中可以重现，其中以剂量为8mg/kg/天的曲洛司坦向大鼠给药，降低了循环血浆中醛固酮的浓度(
图1a)。这一结果可通过检测治疗前后循环的肾上腺类固醇水平并评价肾上腺类固醇水平是否降低来证明。可通过收集循环的静脉血液来检测血浆中循环的肾上腺类固醇水平。血浆是通过离心分离获得的，而血浆类固醇(如人类皮质醇和醛固酮，大鼠的皮质酮和醛固酮)的检测则是采用常规的放射性免疫测定法进行的。适宜用的皮质酮放射性免疫测定试剂盒可购自AmershamBiosciences UK Limited。适宜用的醛固酮放射性免疫测定试剂盒可购自Diagnostic Products Corporation。
本申请的发明人们已经发现较低浓度(如4mg/kg/天)不会降低循环血浆中醛固酮的浓度(图1b)。4mg/kg/天和8mg/kg/天这两个剂量都不会影响循环的皮质酮的水平，如果要影响循环的皮质酮的水平，则要求更高剂量。
因此，在一种实施方式中，本发明涉及采用使循环肾上腺类固醇浓度不受影响这一水平的有效量的曲洛司坦和相关化合物来治疗血管紧张素II相关性疾病。
这一疗法带来的一个优点是避免了过量曲洛司坦治疗造成的副作用，即低皮质醇症和低醛固酮症，也避免了采用与糖皮质激素如氢化可的松(皮质醇)、地塞米松或倍他米松的联合用药。
因此，本发明提供了通式(I)的化合物或其3-烯醇C1-4链烷酸酯在制备用于治疗人类或动物血管紧张素II相关性疾病的药物中的应用，
其中，R1，R2，R5，R6可相同也可不同，分别独立地选自氢或C1-4烷基；R3是氢，C1-4烷基，C2-4烯基或C2-4炔基；R4是羟基，C1-4烷酰氧基，式(II)或(III)的基团， 其中R7是(CH2)n，n是0-4的整数，R8是氢，C1-4烷基，羟基或NH2，而R9和R10可相同也可不同，分别独立地为氢或C1-4烷基；或者，R3和R4一起形成羰基(oxo)，乙二氧基或丙二氧基；通式(I)的化合物或其3-烯醇C1-4链烷酸酯在制造用于治疗人类和动物血管紧张素II相关性心血管疾病的药物中的应用， 其中，R1，R2，R5，R6可相同也可不同，分别独立地为氢或C1-4烷基；R3是氢，C1-4烷基，C2-4烯基或C2-4炔基；R4是羟基，C1-4烷酰氧基，式(II)或(III)的基团 其中R7为(CH2)n，n为0-4的整数，R8为氢，C1-4烷基，羟基或NH2，而R9和R10可相同也可不同，分别独立地为氢或C1-4烷基；或R3和R4一起形成羰基(oxo)，乙二氧基或丙二氧基；
如上定义的通式(I)化合物或其3-烯醇C1-4链烷酸酯在制造用于治疗人类和动物血管紧张素II相关性疾病的药物中的应用，其中，所述的治疗是与下列药物中的一种或多种的联合用药而进行的-血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂；-血管紧张素II受体阻断剂；-醛固酮抑制剂或降低醛固酮水平或阻止醛固酮作用的药剂；或-类固醇生成抑制剂；以及通式(I)化合物或其3-烯醇C1-4链烷酸酯在制造用于治疗人类和动物血管紧张素II相关性疾病的药物中的应用，其中，所述的治疗是与下列药物中的一种或多种的联合用药而进行的-血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂；-血管紧张素II受体阻断剂；或-醛固酮抑制剂或降低醛固酮水平或阻止醛固酮作用的药剂。
在一种优选方式中，本发明涉及如上定义的通式(I)化合物或其3-烯醇C1-4链烷酸酯在制造药物中的应用，其中，所述的药物的给药量为0.5-4mg/kg/天。
本发明进一步提供了一种药物，其包括(a)如上定义的通式(I)化合物或其3-烯醇C1-4链烷酸酯；以及(b)下列药物中的一种或多种-血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂；-血管紧张素II受体阻断剂；-醛固酮抑制剂或降低醛固酮水平或阻止醛固酮作用的药剂；或-类固醇生成抑制剂；一种药物，其包括(a)如上定义的通式(I)化合物或其3-烯醇C1-4链烷酸酯；以及(b)下列药物中的一种或多种-血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂；
-血管紧张素II受体阻断剂；或-醛固酮抑制剂或降低醛固酮水平或阻止醛固酮作用的药剂；一种治疗血管紧张素II相关性疾病的方法，该方法是通过给予所述疾病的患者施用治疗所述疾病的有效量的上述通式(1)化合物或其3-烯醇C1-4链烷酸酯而实现的；一种治疗血管紧张素II相关性心血管疾病的方法，该方法是通过给予所述疾病的患者施用治疗所述疾病的有效量的上述通式(1)化合物或其3-烯醇C1-4链烷酸酯而实现的；一种治疗血管紧张素II相关性疾病的方法，该方法是通过给予所述疾病的患者施用治疗所述疾病的有效量的上述通式(1)化合物或其3-烯醇C1-4链烷酸酯以及治疗所述疾病的有效量的一种或多种下列药物而实现的-血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂；-血管紧张素II受体阻断剂；-醛固酮抑制剂或降低醛固酮水平或阻止醛固酮作用的药剂；或-类固醇生成抑制剂；以及一种治疗血管紧张素II相关性心血管疾病的方法，该方法是通过给予所述疾病的患者施用治疗所述疾病的有效量的上述通式(1)化合物或其3-烯醇C1-4链烷酸酯以及治疗所述疾病的有效量的一种或多种下列药物而实现的-血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂；-血管紧张素II受体阻断剂；或-醛固酮抑制剂或降低醛固酮水平或阻止醛固酮作用的药剂。
典型地，本发明中治疗上述血管紧张素II相关性疾病的方法包括采用通式(I)化合物或其3-烯醇C1-4链烷酸酯以无毒且有效治疗所述疾病的给药量向所述疾病患者给药。
如本文所采用的，C1-4烷基基团或部分是指含有1-4个碳原子的直链或支链烷基，如甲基，乙基，正丙基，异丙基，正丁基和叔丁基。典型地，所述的烷基是非取代的。通常，C1-4烷基基团或部分是直链烷基，如甲基，乙基，正丙基和正丁基。优选地，C1-4烷基基团或部分是甲基。
C2-4烯基是含有2-4个碳原子的烯烃基团。C2-4烯基的例子有乙烯基，正丙烯基，异丙烯基，正丁烯基，异丁烯基，仲丁烯基以及叔丁烯基。典型地，烯基基团仅含有一个双键。所述的烯基基团通常是非取代的。
C2-4炔基是含有2-4个碳原子的直链或支链炔烃基团。C2-4炔基的例子有乙炔基，正丙炔基或正丁炔基。典型地，炔基只含有一个叁键。所述的炔基通常是非取代的。
C1-4烷酰氧基典型地是式RaC(O)O-表示的基团，其中Ra是氢或C1-3烷基，如甲基，乙基，正丙基或异丙基。典型地，所述C1-3烷基是非取代的。优选的C1-3烷基是直链烷基，如甲基，乙基或正丙基。
通式(I)化合物的3-烯醇C1-4链烷酸酯具有通式(Ia)所示的结构 其中，R1-R6的定义如上，而Rb则是氢或C1-3烷基，如甲基，乙基，正丙基或异丙基。典型地，所述的C1-3烷基是非取代的。优选地，C1-3烷基是直链烷基，如甲基，乙基或正丙基。
通式(I)定义的曲洛司坦和相关化合物或其3-烯醇C1-4链烷酸酯都可用于本发明。
通式(I)的优选化合物是其中R1为氢或甲基，R2是氢或甲基，以及R5和R6为甲基的那些化合物。更优选R4为羟基或R3和R4一起形成羰基的化合物。这类优选化合物的例子有曲洛司坦(R1，R2和R3为氢，R4为羟基，以及R5和R6为甲基)，酮曲洛司坦(ketotrilostane)(R1和R2为氢，R3和R4一起形成羰基，而R5和R6为甲基)以及环氧司坦(epostane)(R1，R3，R5和R6为甲基，R2为氢，而R4为羟基)。
本发明的化合物可用于制造治疗人类和动物血管紧张素II相关性疾病的药物。典型地，本发明的化合物可用于制造治疗人类和动物血管紧张素II相关性心血管疾病的药物。可被治疗的疾病包括但不限于与增生性和纤维化性改变有关的心力衰竭，如充血性心力衰竭，心肌梗塞后(post myocardialinfarction)，心肌症，糖尿病，肾衰竭，代谢综合症(X综合症)以及高醛固酮症(如原发性，继发性和第三期高醛固酮症)以及身体组织或血液中的血管紧张素II水平发生增长的其它疾病或病状。可被治疗的血管紧张素II相关性心血管疾病的另一个例子是心律不齐。心律不齐以及采用卡托普利(Captopril)和洛沙坦(Losartan)对心律不齐进行的治疗在Ozer等，2002 Pharmacol Res 45257-63中有所讨论。典型地，血管紧张素II相关性心血管疾病是充血性心力衰竭，心肌梗塞后，心肌症，糖尿病，肾衰竭或代谢综合症(X综合症)。更典型地，血管紧张素II相关性心血管疾病是心肌梗塞后。
优选地，被治疗的血管紧张素II相关性疾病是增生性疾病。典型地，增生性疾病是表现出平滑肌细胞增生的疾病。典型的增生性疾病是心血管增生性疾病。更典型地，增生性疾病是血管紧张素II调节的平滑肌细胞增生和/或平滑肌细胞迁移的心血管增生性疾病。被治疗的增生性疾病的优选例子包括外周动脉疾病，脑血管疾病，心脏纤维化，心肌病，糖尿病性视网膜病，糖尿病性坏疽，糖尿病性肾病，硬皮病，哮喘，动脉瘤以及动脉粥样化，尤其是除了动脉粥样化之外的疾病。
更优选地，被治疗的增生性疾病是心脏纤维化。进一步优选的是梗塞形成之后发生的心脏纤维化。在梗塞形成之后发生的心脏纤维化中，梗塞的大小以及嗜中性粒细胞入侵依赖于血管紧张素II。梗塞形成之后发生的心脏纤维化在Sun等，1994 Cardiovasc Res 281423-32和Waltman等，1995，J CardFail 1293-302(梗塞的大小和嗜中性粒细胞入侵)，以及Wang等，CardiovascRes 5525-37和Martinez等2003 Arch Med Res 34357-61(卡托普利和洛沙坦在梗塞形成之后发生的心脏纤维化中的应用)中有所讨论。
典型地，被治疗的患者患有与肾上腺类固醇的水平增加无关的血管紧张素II相关性疾病，或不能通过抑制肾上腺类固醇的分泌而治疗的血管紧张素II相关性疾病。
此类化合物优选以颗粒形式使用。尤其是，理想的化合物由等体积球体的平均直径为12μm或更小的颗粒组成，且其中至少80，85，90，95％或更多，优选98％或更多，99％或更多，或99.5％或更多的颗粒的颗粒直径小于50μm，优选小于40μm，小于30μm或小于20μm，例如为0.1μm到10，20，30，40或50μm，从1μm到10，20，30，40或50μm，或者从10μm到20，30，40或50μm。这些颗粒优选的等体积球体的平均直径为5-12μm，或者至多为5μm，例如为0.1-5μm，或为1-5μm。进一步优选，通式(I)化合物的特大粒径的累积百分比对粒径所做的特征曲线的标准偏差是1.5-2.5μm，优选为1.75-2.25μm，更优选为约2μm，如为1.9-2.1μm。
治疗是以药物形式进行，该药物优选包括单位剂量的25mg-1000mg，例如为25-50mg，50-100mg，100-200mg，200-300mg，300-400mg，400-500mg，500-600mg，600-700mg，700-800mg，800-900mg或900-1000mg的本发明化合物。典型单位剂量的另一些例子包括0.25mg-1000mg，如0.5-25mg，1-5mg，5-10mg，10-15mg，15-20mg，或20-25mg。
上述单位剂量可以以规则的间隔时间进行给药，例如，单位剂量给药可以每月一次，每周一次，每天一次或每天几次地进行。这种治疗总共延续的时间可以为1天到几周、几个月或几年，例如为患者的整个生命期间。
进一步优选上述的曲洛司坦或相关化合物的给药量为0.5-4mg/kg/天。最优选地，曲洛司坦或相关化合物的给药量为1-3mg/kg/天，例如为1-1.5mg/kg/天，1.5-2mg/kg/天，2-2.5mg/kg/天或2.5-3mg/kg/天。
通式(I)的化合物或其3-烯醇C1-4链烷酸酯可以药学上可接受的盐的形式存在。如本文中所采用的，药学上可接受的盐是与药学上可接受的酸或碱反应制得的盐。药学上可接受的酸包括无机酸，如盐酸，硫酸，磷酸，焦磷酸，氢溴酸或硝酸，也包括有机酸，如柠檬酸，富马酸，马来酸，苹果酸，抗坏血酸，琥珀酸，酒石酸，苯甲酸，乙酸，甲磺酸，乙磺酸，苯磺酸或对甲苯磺酸。药学上可接受的碱包括碱金属(如钠或钾)和碱土金属(如钙或镁)的氢氧化物，还包括有机碱如烷基胺，芳烷基胺或杂环胺。
该药物可通过静脉内，肌内或皮下途径给药，或者作为软膏、霜剂或洗液进行外用。优选的给药途径是口服，例如作为片剂，胶囊剂或液体分散剂口服。
在曲洛司坦和其它通式(I)的化合物和其酯以单纯形式进行给药时，它们通常与一种或多种药学上可接受的载体或稀释剂相配制。例如，固态的口服剂型可以含有伴随活性化合物的稀释剂，如乳糖，葡萄糖，蔗糖，纤维素，玉米淀粉或马铃薯淀粉；润滑剂，如二氧化硅，滑石粉，硬脂酸，硬脂酸镁或钙，和/或聚乙二醇；粘结剂，如淀粉，阿拉伯胶，白明胶，甲基纤维素，羧甲基纤维素或聚乙烯吡咯烷酮；崩解剂，如淀粉，褐藻酸，藻酸盐或羧甲淀粉钠；发泡混合物；染料；甜味剂；润湿剂，如卵磷脂，聚山梨醇酯，十二烷基磺酸盐；以及药物制剂中采用的通常为无毒的药理学惰性物质。这类药物制剂可以公知的方式制造，如采用混合，制粒，压片，包糖衣，或包膜的方法制造。
用于口服给药的液体分散剂可以是糖浆，乳液和悬浮液。糖浆中可含有的载体例如为蔗糖，或蔗糖和甘油和/或甘露醇和/或山梨糖醇。悬浮液和乳液中可含有的载体例如为天然树胶，琼脂，藻酸钠，果胶，甲基纤维素，羧甲基纤维素，或聚乙烯醇。
用于肌肉注射的悬浮液或溶液可含有伴随活性化合物的药学上可接受的载体，如无菌水，橄榄油，油酸乙酯，二元醇(如丙二醇)，如果需要，还可含有适量的利多卡因盐酸盐。用于注射或输注的溶液可含有的载体例如为无菌水，或优选被制为无菌的含水等渗溶液。
治疗可单独进行，也可与一种或多种下列化合物的进一步治疗相结合血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂；血管紧张素II受体阻断剂；或者醛固酮抑制剂或降低醛固酮水平或阻止醛固酮作用的药剂。醛固酮抑制剂或降低醛固酮水平的药剂可以是，也可以不是ACE抑制剂。联合治疗中采用的合适ACE抑制剂的例子包括但不限于卡托普利，依那普利(Enalopril)和赖诺普利(Lisinopril)。合适的醛固酮抑制剂或降低醛固酮水平的药剂包括但不限于安体舒通，洛沙坦和依普利酮。其中，安体舒通和依普利酮是醛固酮抑制剂，并且充当醛固酮受体拮抗剂。洛沙坦充当作用于1型(AT1)受体的血管紧张素II受体阻断剂，并且对降低醛固酮浓度也有部分生理学作用。
另一个血管紧张素II 1型受体阻断剂是坎地沙坦(Candasartan)。可与如上定义的曲洛司坦或相关化合物联合使用的化合物的另一个例子是类固醇生成抑制剂，例如氨鲁米特(aminoglutethimide)和美替拉酮(metyrapone)。
优选地，治疗可单独进行，或与一种或多种选自下列药物的进一步治疗相结合卡托普利，依那普利，赖诺普利，安体舒通，依普利酮，洛沙坦，坎地沙坦，氨鲁米特和美替拉酮。更优选地，治疗单独进行，或与洛沙坦的进一步治疗相结合。
该治疗和进一步的治疗可同时、分开或相继进行，且在分开或相继进行的情况下采用任意治疗顺序。该治疗和进一步的治疗可以以单一的联合药物形式进行，该药物优选包括单位剂量的所述进一步的化合物(其含量为本领域公知的治疗心血管疾病的有效量)，以及单位剂量的通式(I)化合物或其3-烯醇C1-4链烷酸酯(其含量如上所述)。该药物的给药可以按照上述的一种给药方式进行。或者，这两种治疗可以分开进行或相继进行，如作为两种不同的药物，采用相同的或不同的给药方式向同一部位或不同部位给药。
实施例采用介质组织培养分离块方法从大鼠胸部和腹部动脉(RASMC)以及牛的大动脉(BASMC)分离出大动脉平滑肌细胞(ASMCs)，并进行几代培养。
小心解剖杀死的大鼠，从大鼠体获得胸部和腹部的大动脉段。在麻醉的条件下从小牛体获得大动脉段。将大动脉段放置到装有组织培养介质的凹载玻片中，然后在解剖显微镜下去除各动脉段的动脉外膜和外层部分。将剩余的组织内层部分和内膜转移到单独的解剖盘中，用新鲜的培养介质清洗几次。然后，将各动脉段切成约1mm2，放置于25cm2的组织培养瓶中。松散地盖上组织培养瓶，将其置于潮湿的CO2培育箱中。2小时以后，将补充了100单位/ml青霉素、100mg/ml链霉素、4pmol/l L-谷氨酰胺和20％ PBS的4mlRPMI-1640培养介质小心地加入到组织培养瓶中而不移动组织。1周后，用新鲜介质填充样品。在大约2周的期间内，来自分离块的细胞发生了一定的融合。然后用PBS冲洗细胞，随后用含有0.125％胰岛素和0.02％ EDTA的PBS溶液在37℃下处理1-2分钟，从而进行胰蛋白酶化。用移液管将得到的悬浮液移到装有10ml培养介质的75cm2组织培养瓶中，按照上述方法进行温育。
采用3到5代的细胞进行试验。
实施例1吸收到大鼠大动脉平滑肌细胞(RASMC)中的3H-甲基胸腺嘧啶用不含血清(SFM)而含有Ang II(10-7M)，还含有或不含各种浓度的曲洛司坦的介质对静止的RASMC(0.3×105/ml/孔)进行48小时温育。结果示于表1中。在Ang II处理组中，促进了3H-甲基胸腺嘧啶被吸收到RASMC中。由Ang II引起的氚吸收受到浓度为10-6和10-5的曲洛司坦的抑制，但不受浓度为10-9，10-8以及10-7M的曲洛司坦的抑制。
表1
数值是平均值±S.E.M；N＝3/组；ANNOVAP＜0.001；研究者的t-检验-对照和血管紧张素刺激的样品的比较，P＜0.01，血管紧张素刺激的样品与添加了浓度为10-6或10-5M的曲洛司坦的样品的比较，P＜0.05。
(dpm每分钟的衰减)实施例2对大鼠大动脉平滑肌细胞(RASMC)计数用含有Ang II(10-7M)并含有或不含各种浓度的曲洛司坦的20％ FBSRPMI-1640介质温育RASMC(0.5×105/ml/孔)48小时。结果示于表2中。与对照组相比，用Ang II 10-7M处理的组中，RASMC的数量发生明显增加。Ang II刺激细胞数目增长这一作用受到浓度为10-6和10-5的曲洛司坦的抑制，但不受浓度为10-9，10-8以及10-7M的曲洛司坦的抑制。
表2
数值是平均值±S.E.M；N＝3/组；ANNOVAP＜0.001；研究者的t-检验-对照和血管紧张素刺激的样品的比较，P＜0.01，血管紧张素刺激的样品与添加了浓度为10-6或10-5M的曲洛司坦的样品的比较，P＜0.05。
实施例3采用与实施例1中相同的氚化胸腺嘧啶吸收方法，在存在或缺乏曲洛司坦的情况下检测洛沙坦对受血管紧张素II-刺激的细胞增生的作用。洛沙坦明显消除了血管紧张素II的刺激作用，且仅存在洛沙坦的组与对照组并无区别。另外添加的曲洛司坦进一步将细胞增生减少至低于对照组的值(*P＜0.05，**P＜0.01)。结果示于图2中。
实施例4用存在于棉籽油中的1ml乙醇和曲洛司坦(4mg/kg/天)处理雄性Wistar大鼠(～500g)，共5天。对照组的动物仅接受溶煤处理。然后用0.1ml(500u)肝素以IP方式处理动物，然后通过打晕方式杀死动物，使其颈部脱位。从颈部血管收集血液并进行离心分离，将获得的血浆储藏在-20℃下，直到要求进行类固醇分析。采用商购的试剂盒(Diagnostic Systems Laboratories Inc.，Webster，Texas，USA)分析皮质酮和醛固酮的浓度。结果示于图3中。图中示出了对照组动物和接受曲洛司坦处理的动物的皮质酮(图3(a))和醛固酮(图3(b))的循环浓度。对照组和曲洛司坦组的数值之间的区别并不明显。
采用已制定的方法建立来自曲洛司坦处理组和对照组动物的RASMC的原代培养物。为进行[Ca2+]i测定，用1μM fura-2于37℃下，在改进的Krebs-Ringer碳酸氢盐溶液(3.6mM K+，1.2mM Ca2+，0.5mM Mg2+，5mMHepes和20mM HCO-)这一介质中填充细胞达30分钟。为了同时测定fura-2的荧光，将覆盖在盖玻片上的细胞固定在置于改性Krebs-Ringer碳酸氢盐溶液中的倒置显微镜(Zeiss)的镜台上。激发波长为340和380nm，在51nm下检测发射。由激发波长340和380nm下的荧光强度比计算[Ca2+]i。检测对照组和曲洛司坦处理组动物的细胞区域，～10个细胞/区域。结果示于表3和图3(c)和(d)，图中的箭头表示施用血管紧张素II的时间。采用10nmol/L血管紧张素II刺激对照组动物(图3(c))和曲洛司坦处理组动物(图3(d))的血管平滑肌细胞，获得特征钙信号。
表3曲洛司坦处理的平滑肌细胞(TTSMC)和对照组细胞(NSMC)中响应血管紧张素II(1nmol/L)产生钙信号的阈值浓度
+＝钙响应，-＝无响应实施例5.
在存在或缺乏醛固酮10-8mol/L的情况下温育48小时而得到的RASMC中，采用RT-PCR和实时定量的RT-PCR检测AT1受体mRNA的表达。采用Brilliant SYBR Green QRT-PCR Master Mix Kit，即基于累积荧光的实时检测的一步法试剂盒(Mx300P，Stratagene，Amsterdam)进行实时RT-PCR。结果是平均值，SEM太小而不能被示出。**＝P＜0.01。结果示于图4中。血管紧张素II本身减少了编码血管紧张素II 1型受体(AT1)的基因的mRNA转录，添加曲洛司坦，则更进一步地减少了编码血管紧张素II 1型受体(AT1)的基因的mRNA转录。
权利要求
1.通式(I)的化合物或其3-烯醇C1-4链烷酸酯在制备用于治疗人类或动物血管紧张素II相关性疾病的药物中的应用 其中，R1，R2，R5，R6可相同也可不同，分别独立地选自氢或C1-4烷基；R3是氢，C1-4烷基，C2-4烯基或C2-4炔基；R4是羟基，C1-4烷酰氧基，式(II)或(III)的基团， 其中R7是(CH2)n，n是0-4的整数，R8是氢，C1-4烷基，羟基或NH2，而R9和R10可相同也可不同，分别独立地为氢或C1-4烷基；或者，R3和R4一起形成羰基(oxo)，乙二氧基或丙二氧基。
2.根据权利要求1的应用，其中，通式(I)中的R1为氢或甲基，和/或R2为氢或甲基，和/或R4为羟基或R3和R4一起形成羰基(oxo)，和/或R5和R6为甲基。
3.根据权利要求1的应用，其中，通式(I)的化合物是曲洛司坦，酮曲洛司坦或环氧司坦。
4.根据权利要求1至3任意一项的应用，其中，所述血管紧张素II相关性疾病是心血管疾病。
5.根据权利要求4的应用，其中，所述心血管疾病是充血性心力衰竭，心肌梗塞后，心肌症，糖尿病，肾衰竭，代谢综合症(X综合症)或心律不齐。
6.根据权利要求4的应用，其中，所述心血管疾病是心肌梗塞后。
7.根据前述任意一项权利要求的应用，其中，所述药物的给药量为0.5-4mg/kg/天。
8.根据权利要求1-3中任意一项的应用，其中，所述血管紧张素II相关性疾病是增生性疾病。
9.根据权利要求8的应用，其中，所述增生性疾病是外周动脉疾病，脑血管疾病，动脉粥样化，心脏纤维化，心肌病，糖尿病性视网膜病，糖尿病性坏疽，糖尿病性肾病，硬皮病，动脉瘤，哮喘或动脉粥样化。
10.根据权利要求8或9的应用，其中，所述增生性疾病是心脏纤维化。
11.根据权利要求8-10中任意一项的应用，其中，所述增生性疾病是梗塞形成之后发生的心脏纤维化。
12.根据前述任意一项权利要求的应用，其中，所述药物的给药量为0.5-4mg/kg/天。
13.根据前述任意一项权利要求的应用，其中，所述药物包括颗粒形式的权利要求1-3所述的通式(I)化合物或其3-烯醇C1-4链烷酸酯。
14.根据权利要求13的应用，其中，所述颗粒形式化合物的颗粒的等体积球体的平均直径为至多12μm，且95％或更多的颗粒的粒度为至多50μm。
15.根据权利要求13或14的应用，其中，所述颗粒的等体积球体的平均直径为5-12μm。
16.根据权利要求13-15中任意一项的应用，其中，所述颗粒的等体积球体的平均直径为至多5μm。
17.根据权利要求13-16中任意一项的应用，其中，所述颗粒形式的化合物的比表面面积为大于等于2m2g-1或大于等于5m2g-1。
18.根据前述任意一项权利要求的应用，其中，所述药物作为片剂，胶囊剂或液体分散剂而进行口服给药。
19.根据前述任意一项权利要求的应用，其中，所述药物包括单位剂量为0.25mg-1000mg的权利要求1-3所述的通式(I)化合物或其3-烯醇C1-4链烷酸酯。
20.根据权利要求19的应用，其中，所述单位剂量为0.5mg-25mg。
21.根据权利要求19的应用，其中，所述单位剂量为25-1000mg。
22.根据前述任意一项权利要求的应用，其中，所述采用通式(I)化合物或其3-烯醇C1-4链烷酸酯对血管紧张素II相关性心血管疾病的治疗与一种或多种下列药物的进一步治疗相结合-血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂；-血管紧张素II受体阻断剂；-醛固酮抑制剂或降低醛固酮水平或阻止醛固酮作用的药剂；或-类固醇生成抑制剂。
23.根据权利要求22的应用，其中，所述醛固酮抑制剂或降低醛固酮水平的药剂是ACE抑制剂。
24.根据权利要求22或23的应用，其中，所述ACE抑制剂是卡托普利，依那普利或赖诺普利。
25.根据权利要求22的应用，其中，所述醛固酮抑制剂或阻止醛固酮作用的药剂是安体舒通或依普利酮。
26.根据权利要求22的应用，其中，所述血管紧张素II受体阻断剂是洛沙坦或坎地沙坦。
27.根据权利要求22的应用，其中，所述类固醇生成抑制剂是氨鲁米特或美替拉酮。
28.一种药物，其包括(a)权利要求1-3和13-17所述的通式(I)化合物或其3-烯醇C1-4链烷酸酯；以及(b)权利要求22-27中任意之一所述的一种或多种下列药物-ACE抑制剂；-血管紧张素II受体阻断剂；-醛固酮抑制剂或降低醛固酮水平或阻止醛固酮作用的药剂；或-类固醇生成抑制剂，(a)和(b)在治疗权利要求4-6或8-11中任意一项所述的血管紧张素II相关性疾病的过程中同时、分开或相继使用。
29.一种治疗血管紧张素II相关性疾病的方法，该方法为给予患有所述疾病的患者施用治疗所述疾病有效量的权利要求1-3或13-17任意一项所述的通式(I)化合物或其3-烯醇C1-4链烷酸酯。
30.一种治疗血管紧张素II相关性疾病的方法，该方法为给予患有所述疾病的患者施用治疗所述疾病有效量的权利要求1-3或13-17任意一项所述的通式(I)化合物或其3-烯醇C1-4链烷酸酯，以及治疗所述疾病有效量的一种或多种下列药物-血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂；-血管紧张素II受体阻断剂；-醛固酮抑制剂或降低醛固酮水平或阻止醛固酮作用的药剂；或-类固醇生成抑制剂。
31.根据权利要求29或30的方法，其中，所述血管紧张素II相关性疾病是权利要求4-6或8-11所述的疾病。
全文摘要
通式(I)的化合物或其3－烯醇C
文档编号A61P35/00GK1791414SQ200480009923
公开日2006年6月21日 申请日期2004年4月16日 优先权日2003年4月16日
发明者乔治·马吉茨, 加文·保罗·文森 申请人:乔治·马吉茨, 加文·保罗·文森