用于神经营养蛋白受体介导的基因送递及作为神经营养蛋白激动剂的重组多肽的制作方法

专利名称：用于神经营养蛋白受体介导的基因送递及作为神经营养蛋白激动剂的重组多肽的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于定向基因送递、特别是神经营养蛋白受体介导的基因送递及用作神经营养蛋白激动剂的重组多肽，及其制备。
背景技术：
定向基因送递(targeted gene delivery)至所选择的细胞类型提供了一种用于高度特异性基因表达的手段。基因转移的效率提高可以通过增强基因载体进入所希望的细胞中并降低非靶细胞对所述载体的摄取而实现。对于治疗性应用，定向基因送递在保证在感兴趣的细胞中的治疗效果，同时限制由外源基因在非靶细胞中表达所致的副作用包括免疫应答、炎症应答和胞毒性应答中是关键的。
一种定向基因送递的方法是使用配体相关的送递载体。通过该配体，所述载体识别并结合靶细胞独特的细胞表面受体，并在与所述配体结合的基础上可以被胞吞。所述受体-载体复合物与周围的质膜一起可因此成为胞内运输小泡。在基因从所述小泡中脱出并易位至细胞核之后，基因产物可被表达。这种受体介导的胞内基因送递最初由Wu GY和Wu CH在1987年报道(Receptor-mediated in vitro genetransformation by a soluble DNA carrier system.J Biol Chem 1987 Apr5；2624429-32；1992年11月24日授权的美国专利No.5,166,320)，并在药物/基因送递领域倍受关注。迄今为止对于定向基因送递已经研究试验了许多配体-受体系统。测试的配体包括脱唾液酸糖蛋白(WuGY and Wu CH，J Biol Chem.，2624429-32，1987)、整联蛋白结合肽(Berkner KL，Biotechniques 6616-629，1988；Cristiano RJ et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，902122-2126，1993)、运铁蛋白(Zenke M et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，873655-3659，1990；Wanger E，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，884255-4259，1991；美国专利No 5,922,859)、半乳糖(Remy JS et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，921744，1995)、叶酸(Lee RJ and Huang L，J.Biol.Chem.，271，8481，1996)、成纤维细胞生长因子(Goldman CK etal.，Cancer Res，571447-1451，1997；HogansonDK et al.，Human Gene Therapy，92565-2575，1998)、及上皮生长因子(Schaffer and Lauffenburger，J Bio Chem，27328004-28009，1998)。这些配体已经用于主要定向于肝细胞和肿瘤细胞。基于配体的基因送递系统根据其功能通过相对充分鉴定的配体-受体结合机制包括相关的受体而阐明。然而对于通过受体-配体相互作用而将基因载体定向于一个复杂系统如神经系统中的细胞，目前还了解极少。
神经系统疾病，特别是中枢神经系统(CNS)疾病，如中风、癫痫、头部和脊髓损伤、帕金森病、亨廷顿病(Huntington′s disease)、阿尔茨海默病、肌萎缩性侧索硬化症及许多神经遗传学疾病，对个体具有破坏性作用并且由于需长期护理和丧失生产力而具有高社会成本。许多前述疾病与一或多个基因的缺乏、功能失常或失效相关并且对常规的治疗方式无很好的反应。因此已经认为将基因转移至CNS中是治疗这些疾病的潜在方法。这种方法可改变神经营养因子、抗程序性细胞死亡蛋白、抗氧化分子及其它治疗因子的表达水平以恢复、停止或预防CNS中的细胞尤其是神经元的退化。基因治疗对CNS恶性肿瘤的治疗也提供了很大希望。
CNS是机体中最复杂的器官，其独特性质对在该系统内成功进行基因治疗设置了一些障碍。这些特性包括由于颅骨和血脑屏障这些物理屏障的存在而限制接触CNS、神经元定期分化的性质及用治疗性基因有效转染它们的难度。另外，在CNS中发现的神经元类型多种多样，其中许多神经元类型对生理功能非常关键并且对任何类型的改变均非常敏感。在神经学情况中，疾病可影响神经元的一个亚类，而其它的则不受影响。这些特点强烈需要开发这样的CNS基因疗法其需要将治疗性基因的表达限制在特定类型的CNS细胞中，由此限制非靶CNS细胞中基因表达可能引起的副作用。
目前，CNS中定向基因送递仅简单地通过将裸DNA或基因转移载体直接定向注射进充分限定的解剖部位而完成，其可转导注射部位周围的各种类型的细胞。病毒或非病毒基因载体的逆行轴突运输提供了通过在CNS或周围神经系统中选择适当的注射部位而定向至不同区域中神经元的另一种方式进行。然而这种方法转导所有的投射神经元并且不区分神经元的亚类。
本领域熟知神经元在送递信号所用的化学递质及接受所述信号所用的受体方面的差异。神经系统利用9种小分子递质和50多种神经活性肽，提供了基于其神经递质表型对神经元进行分类的方式。不同神经元除了对各种神经递质的敏感性不同，它们对称为神经营养因子(neurotrophic factor)的另一类型分子的应答也可能不同。这些营养因子是内源的可溶性多肽，对神经元的发育、生长和存活起重要作用，并且据信它们对治疗神经系统疾病和CNS创伤性伤害具有巨大潜力。在20多种已知神经营养因子中，研究最充分的一组是神经营养蛋白(neurotrophins)，这是长度为大约120个氨基酸并且呈现大约50％氨基酸序列相同性的一个结构和功能相关的多肽家族。从哺乳动物中分离的4种主要神经营养蛋白是神经生长因子(NGF)(人NGF序列参见SEQ ID NO1)、脑衍生神经营养因子(BDNF)(人BDNF序列参见SEQ ID NO2)、神经营养蛋白3(NT3)(人NT3序列参见SEQ IDNO3)和神经营养蛋白4/5(NT4/5)(人NT4/5序列参见SEQ ID NO4)。所述神经营养蛋白作为非共价结合的同型二聚体从神经元靶细胞中合成并分泌，并通过与其位于神经末端的受体结合后逆行传递信号而起作用。神经营养蛋白有两类主要的受体受体蛋白酪氨酸激酶(包括TrkA、TrkB和TrkC)及75-kDa跨膜糖蛋白p75NTR。NGF选择性地与TrkA相互作用，BDNF和NT4/5主要与TrkB相互作用，NT3主要与TrkC相互作用，也与TrkA和TrkB程度略低地相互作用(MeakinSO and Shooter EM，Trends Neurosci.，15323-331，1992)。所有神经营养蛋白均与p75NTR相互作用，但相比于其与Trk的相互作用，亲和力相对较低。
免疫染色表明Trk在成人脑的神经元中中等程度表达，在星形胶质细胞中弱表达。在少突胶质细胞中未发现Trk染色。p75NTR存在于神经元中，特别是在发育期间，存在于少突胶质细胞中及以极低水平存在于许多成熟的星形胶质细胞中。Trk和p75NTR在各种类型神经元中表达的结果是，神经营养蛋白影响神经元的相互重叠的亚组和神经元的独特亚组(Thorne RG and Frey II WH，Clin Pharmacokinet，40907-946，2001)。基底部前脑胆碱能神经元对所有4种神经营养蛋白均应答。应答NGF的其它神经元包括纹状体胆碱能神经元、交感神经感觉神经元和神经嵴衍生的细纤维感觉神经元。应答BDNF的其它神经元包括中脑多巴胺能神经元、脊髓运动神经元、纹状体-GABA能和神经嵴衍生的中纤维感觉神经元和视网膜神经节细胞。应答NT3的其它神经元包括蓝斑神经元、中脑多巴胺能神经元、纹状体-GABA能神经元、交感神经感觉神经元、和神经嵴衍生的大纤维感觉神经元。应答NT4/5的神经元还包括蓝斑神经元、中脑多巴胺能神经元、纹状体-GABA能神经元、交感神经和神经嵴衍生的感觉神经元、运动神经元和视网膜神经节细胞。除了神经系统之外，在B淋巴细胞、T淋巴细胞、肥大细胞、单核细胞和巨噬细胞中也检测到NGF和TrkA表达，提示NGF在免疫和炎症功能中的作用。另外，人肿瘤组织增量调节神经营养蛋白受体并且应答NGF(Saragovi HUand Gehring K，TiPS，2193-98，2000)。
由于受体介导的配体-受体复合物的胞吞及逆向运输对于在前述细胞中神经营养蛋白信号传导是必须的(NeetKE and Campenot RB，CMLS Cell.Mol.Life Sci.，581021-1035，2001)，因此这些多肽是可用于将基因载体定向于Trk或p75NTR阳性细胞的定向配体的候选物。例如，天然神经营养蛋白多肽可以与具有结合并浓缩DNA能力的阳离子脂质或聚合物化学缀合。然而这个方法要求相对大量的纯化的多肽并也许涉及可能显著降低所述多肽生物活性的苛刻化学反应。重组DNA技术是一种常用的产生具有生物活性的全长神经营养蛋白多肽的方法，如美国专利5606031和美国专利6005081所述。在细菌表达系统中使用这些技术，由于其半胱氨酸残基错配对形成的与其真形式不同的神经营养蛋白的错折叠变体是一个主要问题。各种神经营养蛋白多肽具有含胱氨酸结节基序(cystine knot motif)的相似的结构，在高度保守的部位具有6个半胱氨酸残基。正确配对的分子内二硫键的形成是神经营养蛋白的完全生物活性所必须的。使用大肠杆菌(E.coli)表达BDNF的研究报道了具有在6个半胱氨酸残基之间不正确配对的二硫键的10个蛋白质变体，所有这些变体与天然BDNF相比生物活性均较低，并且当一起使用时可显著抑制真BDNF的生物学活性(Shimizu N et al.，Biosci.Biotech.Biochem.，60971-974，1996)。阻碍有效应用大蛋白质作为定向配体的其它潜在问题包括蛋白酶解倾向、免疫原性及药物动力学不良。
尽管所有神经营养蛋白均具有由一对双链扭型β折叠组成的几乎相同的核心结构，但在这些蛋白质中有7个独特的区域，包括N末端、环形区域I、II、III、β链区域IV、环形区域V和C末端，这些区域具有高于平均水平的序列多样性(Ibanez CF，TIBTECH，13217-227，1995)。各种方法，从定点诱变、缺失、嵌合分子构建到晶体结构分析的各种方法，均已经用于研究神经营养蛋白作用的结构决定因素。这些研究证实在NGF的中，对于结合Trk受体重要的氨基酸残基位于N末端区域(#1-8)、环形区域II(#40-49)和环形区域V(#96-97)(Ibanez CF，TIBTECH，13217-227，1995)。对与TrkA的免疫球蛋白样结构域5复合的NGF的晶体结构进行的研究(Wiesmann Cet al.，Nature，401184-188，1999)注意到两个结构区域(patch)，一个结构区域包括同型二聚体NGF分子的核心β折叠，另一个结构区域包含NGF的与TrkA特异性相互作用的N末端残基。已经有报道NGF的小肽模拟物激活TrkA相关的信号转导并促进NGF样神经营养作用(美国专利No 5,958,875；美国专利No 6,017,878；Beglove N et al.，JMed Chem.，433530-3540，2000；Maliartchouk S et al.，J.Bio.Chem.，2759946-9956，2000；Xie Y et al.，J Bio.Chem，27529868-29874，2000)。这些肽模拟物需要是环形的，不仅序列类似而且结构也要类似于NGF环，以具有生物学活性。
发明概述一方面，本发明提供了一种重组多肽，其包含一种细胞定向元件和一种核酸结合元件，其中所述细胞定向元件是选择性结合神经营养蛋白受体的发夹基序。在各种实施方案中，所述多肽均包含神经营养蛋白的发夹基序。
另一方面，本发明提供了一种编码本发明重组多肽的重组核酸分子。本发明还提供了包含核酸和本发明的重组多肽的组合物。
本发明的多肽可用于定向送递核酸，包括将DNA送递至表达神经营养蛋白受体的细胞并因此可有利地用于治疗神经元病变。本发明因此在不同的方面还提供了一种将核酸送递至表达神经营养蛋白受体的细胞的方法，所述方法包括给予本发明的组合物，还提供了一种治疗对象中神经元病变的方法，所述方法包括给予所述对象本发明的组合物。本发明在其它方面提供了所述多肽在将核酸送递至表达神经营养蛋白受体的细胞中的应用，提供了所述多肽在治疗对象的神经元病变中的应用，以及提供了所述多肽在制备治疗对象的神经元病变的药物中的应用。
本发明另一方面提供了一种神经营养蛋白激动剂，其包含选择性结合神经营养蛋白受体的发夹基序。在各种实施方案中，所述发夹基序是神经营养蛋白的发夹基序，所述激动剂可进一步有利地包含带正电的结构域，其可以增强所述激动剂的活性。本发明的激动剂可用于治疗对神经营养蛋白治疗有反应的疾病。因此本发明在其它方面提供了一种包含本发明的激动剂和药物可接受的载体或稀释剂的组合物，及提供了治疗对象中对神经营养蛋白治疗有反应的疾病的方法，所述方法包括给予所述对象有效量的所述激动剂或者包含有效量的所述激动剂的组合物。在其它方面，本发明提供了本发明的激动剂在治疗对神经营养蛋白治疗有反应的疾病中的应用或者在制备用于治疗所述疾病的药物中的应用。
附图简述

图1NL4-10K而非NL4与质粒DNA结合，并且在琼脂糖凝胶电泳中阻滞其迁移。
图2NL4-10K介导体外靶特异性基因送递。
(A)NL4-10K被用于将pCAGluc质粒DNA送递至PC12细胞。短肽NL4、10K、及NL4和10K肽的混合物(NL4&10K)用作对照。在24孔平板中将细胞在存在100μM氯喹的情况下用含有1μgpCAGluc/孔的复合物转染。在转染后24小时分析萤光素酶表达。结果以相对光单位(RLU)/mg蛋白质±SE表示。**与对照相比P＜0.01。
(B)NGF对NL4-10K介导的基因送递进PC12中的竞争性抑制。将PC12细胞在存在100μM氯喹的情况下用以肽/DNA(nmol/μg)为1.5(N/P比率为5)制备的NL4-10K/pCAGluc复合物转染，与或不与游离NGF、NL4、10K或NL4-10K共同温育。与无添加剂的转染相对比*P＜0.05和**P＜0.01。
(C)NL4-10K介导基因送递进原代神经元和神经胶质细胞中。在24孔平板中将来自大鼠皮质的原代神经元和神经胶质细胞在存在100μM氯喹的情况下用含有1μg pCAGluc/孔的复合物转染。4小时后，加入等体积的正常培养基并温育24小时，之后进行萤光素酶表达分析。**与10K对照物相比P＜0.01。
图3NL4-10K介导体内背根神经节(DRG)内基因表达。如实施例所述形成含有NL4-10K的三链体。对于所有三链体而言，肽/DNA(nmol/μg)比率均为1.5(N/P比率为5)。三链体经鞘内给予麻醉的大鼠。在注射后3天收集DRG。结果以相对光单位(RLU)/mg蛋白质±SE表示。
图4DsbC-NL4-10K介导的基因表达。
(A)和(B)DsbC-NL4-10K/DNA/鱼精蛋白三链体被用于分别转染PC12(A)和COS7(B)细胞。为形成三链体，将DsbC-NL4-10K蛋白和pCAGluc质粒(0.1μg/孔于96孔平板中)以各种比率在室温于20μlOpti-MEM中温育30分钟。加入鱼精蛋白(2μg/μgDNA)后，将所述复合物另外温育30分钟。结果以相对光单位(RLU)/mg蛋白质±SE表示。
(C)NL4-10K预处理对DsbC-NL4-10K/DNA/PEI600介导的将基因送递至PC12细胞的抑制。将PC12细胞用DsbC-NL4-10K或牛血清白蛋白预处理之后进行转染。为形成DsbC-NL4-10K/DNA/PEI600三链体，将DsbC-NL4-10K以蛋白质/DNA(nmol/μg)为0.3(N/P比率为1)的比率加入DNA中，之后将PEI600以N/P比率为20加入所述复合物中。将细胞在96孔平板中暴露于0.1μg DNA/孔。结果以相对光单位(RLU)/mg蛋白质±SE表示。
图5SPKR4NL1-2结合并浓缩质粒DNA。
(A)质粒DNA在1％琼脂糖凝胶中的电泳迁移率由于SPKR4NL1-2结合而降低。将各种量的肽与0.1μg DNA混和30分钟，体积为20μl，之后进行电泳。
(B)插入DNA中的溴化乙锭的荧光由于加入置换溴化乙锭的SPKR4NL1-2而降低。将指定量的肽加入与溴化乙锭预先混和的0.8μgDNA中。
(C)&(D)分别为超螺旋质粒DNA和SPKR4NL1-2/DNA/PEI600复合物的原子力显微镜图像。肽∶DNA和PEI600∶DNA的N/P比率分别为2∶1和10∶1。这两个图像均是在4μm2的视野收集，定标线条代表0.5μm。
图6SPKR4NL1-2增强PC12细胞的聚阳离子介导的基因转染。为了形成用于48孔平板每个孔中的复合物，将0.5μg pCAGluc质粒首先与各种量的肽混和并温育30分钟，之后加入聚阳离子并将所述混合物再温育30分钟。萤光素酶活性以相对光单位(RLU)/mg总蛋白质表示。(A)PEI600，N/P比率为10。(B)聚L-赖氨酸(PLL)，N/P比率为10。
图7SPKR4NL1-2介导的基因表达的特异性。NGF抑制SPKR4NL1-2介导的基因表达。将PC12细胞在48孔平板中处理。为形成用于每个孔的复合物，将0.5μg pCAGluc质粒首先与SPKR4NL1-2或(SPKR)4以N/P比率为2.5进行混和并温育30分钟，之后加入PEI600(N/P比率为10)并将所述混合物再温育30分钟。在转染期间将NGF(200ng/ml)加入一些孔中。24小时后测定萤光素酶活性并以相对光单位(RLU)/mg蛋白质表示。*与用同样的SPKR4NL1-2/DNA/PEI600复合物但无NGF处理的细胞相对比P＜0.05。
图8SPKR4NL1-2介导的基因表达的特异性。SPKR4NL1-2介导基因送递至神经元和神经胶质细胞。在48孔平板中，将原代大鼠皮质神经元或神经胶质细胞用SPKR4NL1-2/DNA/PEI600、(SPKR)4/DNA/PEI600或DNA/PEI600复合物转染。所述复合物是用0.25μgDNA与肽(如果存在的话)和PEI600以N/P比率分别为2.5和5混和而制备的。24小时后测定萤光素酶活性并以相对光单位(RLU)/mg蛋白质表示。**与用与(SPKR)4和PEI600复合的DNA处理的神经元相比P＜0.01。
图9SPKR4NL1-2介导体内基因送递至背根神经节(DRG)。将4μg pCAGluc与SPKR4NL1-2以N/P比率为2.5、及与PEI600以N/P比率为10形成的复合物经鞘内注射进大鼠腰部脊髓中。在注射后3天收集DRG和腰部脊髓。结果以相对光单位(RLU)/mg蛋白质表示。**与用与(SPKR)4/PEI600复合的DNA处理的大鼠相比P＜0.01。
图10SPKR4BL1-2结合并浓缩DNA。
(A)SPKR4BL1-2与质粒DNA结合并在电泳期间降低其迁移率。所述DNA在N/P比率为2(0.075nmol肽与0.1μgDNA)时被完全阻滞。
(B)-(D)DNA和SPKR4BL1-2的原子力显微镜图像。每一图像覆盖2μm×2μm的视野。(B)pCAGluc质粒DNA。(C)SPKR4BL1-2肽。(D)SPKR4BL1-2和质粒DNA自组装成浓缩的颗粒。
图11SPKR4BL1-2介导基因在大鼠神经元和星形胶质细胞的原代培养物中表达。
(A)在48孔平板中，将皮质神经元用pCAGluc(0.25μg/孔)、PEI600和SPKR4BL1-2的三重复合物转染。24小时后测定萤光素酶活性并以用总蛋白质含量标准化的相对光单位(RLU)表示，误差条表示SD。
(B)在48孔平板中，将原代星形胶质细胞用pCAGluc/SPKR4BL1-2或pCAGluc/PEI600复合物转染。每个孔使用0.25μg pCAGluc。24小时后转基因表达以RLU/mg蛋白质±SD表示。
图12NL4-10K激活TrkA、Erk和Akt。
(A)TrkA及其相关信号传导途径的激活。将PC12细胞在含有0.5％FBS和0.25％马血清的RPMI-1640培养基中温育，并用10ng/mlNGF、5μM NL4、5μM NL4-10K、NL4-10K/DNA复合物(N/P比率为5)或者无添加剂的无血清RPMI-1640处理15分钟。收集细胞裂解物，使用针对Phospho-TrkA、Phospho-p44/p42MAPK或Phospho-Akt的抗体进行Western印迹。
(B)TrkA抑制剂阻断NL4-10K诱导的Erk激活。将PC12细胞与或不与100nM K-252a或10μM AG879预温育10分钟，然后如(A)所述处理。收集细胞裂解物，使用针对Phospho-p44/p42 MAPK的抗体进行Western印迹分析。
图13NL4-10K在无血清培养基中促进神经元分化的PC12细胞存活。将血清和NGF从分化的PC12细胞被剥夺血清和NGF中4天。在撤除血清和NGF时加入NL4和NL4-10K，并且以10ng/ml NGF作为阳性对照。细胞存活率使用MTT分析评估。多肽介导的细胞存活率以NGF促进的最大存活率百分比表示。
图14SPKR4NL1-2激活TrkA和Erk。将在含有0.5％FBS和0.25％马血清的RPMI-1640培养基中预温育2天的PC12细胞用在无血清RPMI-1640中稀释的NGF或肽处理20分钟。细胞裂解物通过免疫印迹分析，所述分析使用特异于Phospho-TrkA或磷酸化Erk 1和2的初级抗体进行。
(A)Phospho-TrkA Western印迹。将细胞用NGF(20ng/ml)、SPKR4NL1-2(8μM)、SPKR4NL1-2/DNA复合物(8μM，N/P比率为5)、或者(SPKR)4(8μM)处理。
(B)Phospho-Erk Western印迹。将细胞用NGF(20ng/ml)、从1至8μM各种浓度的SPKR4NL1-2、或者8μM(SPKR)4处理。
(C)TrkA抑制剂阻断SPKR4NL1-2诱导的Erk激活。将PC12细胞与0、10、20、50和100nM K-252a(TrkA酪氨酸激酶抑制剂)预温育10分钟，之后用NGF(20ng/ml)或SPKR4NL1-2(8μM)处理。蛋白质标准分子量在左侧示出。
图15SPKR4NL1-2具有NGF样生物活性。
(A)&(B)SPKR4NL1-2促进神经突生长(outgrowth)。将PC12细胞用8μM(SPKR)4(A)或者SPKR4NL1-2(B)处理3天。
(C)SPKR4NL1-2促进剥夺血清3天的PC12细胞存活。在撤除血清时加入0-16μM不同浓度的SPKR4NL1-2，10ng/ml NGF用作阳性对照。细胞存活率通过MTT分析评估并以NGF促进的最大细胞存活率的百分比表示。
优选的实施方案详述本文所用术语“多肽”与“蛋白质”在指氨基酸的任何聚合物或链时是同义的。多肽可以是线性或环形的。术语“多肽”和“肽”仅基于聚合物中残基的数目而区别。一般而言，术语“肽”是指含有大约30个或更少残基、优选20个或更少、最优选大约10个或更少残基的氨基酸聚合物。如本文所用，术语“氨基酸”是指遗传编码的L-氨基酸的标准系列(丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、色氨酸和酪氨酸)，及其衍生物。对于通过半合成或化学方法产生的多肽或肽而言，术语“氨基酸”还指所有非天然的氨基酸，以及遗传编码的氨基酸的D-异构体。
本发明部分得自申请人令人惊奇地发现神经营养蛋白的分离的发夹基序片段可以选择性结合神经营养蛋白受体并保留全长神经营养蛋白的功能。这些片段当与核酸结合元件组合时提供一种将核酸选择性送递至表达神经营养蛋白受体的细胞的方式。因此本发明一方面提供了一种包含核酸结合元件和细胞定向元件的重组多肽，所述细胞定向元件是选择性结合神经营养蛋白受体的发夹基序。本发明另一方面提供了一种神经营养蛋白激动剂，其包含选择性结合神经营养蛋白受体的发夹基序。
术语发夹基序描述了通过一个环形区域连接的两个相邻的通过氢键键合的β链，该术语在此还描述了串联的两或多个这种结构。β链的长度可以变化但优选是足以形成稳定的β折叠的长度，意味着β链在例如生理溶液中保持氢键。因此，该术语例如描述了形成本文所述发夹基序的神经营养蛋白的片段，但不包括全长的神经营养蛋白。术语“发夹基序”也包括下述所有功能等价物。术语“选择性结合神经营养蛋白受体”或其它相似术语是描述与神经营养蛋白受体结合，而与其它类型受体基本上不结合。细胞定向元件如果不影响受体的生理功能则其基本上不结合该受体。
根据其在本领域中的通常定义，术语神经营养蛋白在本领域中用于描述一个结构和功能相关的神经营养因子家族。神经营养蛋白的代表性实例包括但非限于神经生长因子(NGF)、脑衍生神经营养因子(BDNF)、神经营养蛋白-3(NT3)和神经营养蛋白4/5(NT4/5)。如本文所用，术语神经营养蛋白一般是指人神经营养蛋白，但也包括任何物种包括鼠、牛、羊、猪、马和禽物种的神经营养蛋白。提及的神经营养蛋白受体包括p75NTR和神经营养蛋白酪氨酸激酶受体TrkA、TrkB和TrkC，及神经营养蛋白的所有其它关连受体。
在不同的实施方案中，细胞定向元件是神经营养蛋白的发夹基序或其功能等价物。神经营养蛋白的发夹基序是由一个环形序列和该环形序列的紧邻上游和紧邻下游的β链序列形成。术语“功能等价物”用于描述与亲代氨基酸结构和功能相关的氨基酸序列，其与亲代氨基酸由于一或多个缺失、取代、修饰或添加而有所不同，但不影响选择性结合神经营养蛋白受体。例如，在β链的每一端均可加入氨基酸而不影响所述发夹基序的形成及与神经营养蛋白受体的选择性结合。在一个实施方案中，功能等价物是基本同源的，这是指所述等价物的氨基酸序列与亲代氨基酸序列之间基本相应。在特定的实施方案中，所述功能等价物是至少大约50％、75％、90％和95％同源的。
同源性是使用序列分析软件如the Genetics Computer Group，University of Wisconsin Biotechnology Center，1710 University Avenue，Madison，WI 53705的Sequence Analysis Software Package测定的。将氨基酸序列排列对比以取得最大相同性。可以将缺口人工导入序列中以获得适当的排列对比。一旦建立最佳的排列对比，则同源程度通过记录两个序列的氨基酸相同的所有位置相对于位置总数而确定。
在一个实施方案中，所述功能等价物由于一或多个保守氨基酸取代而与神经营养蛋白的发夹基序序列不同。保守氨基酸取代是同类氨基酸之间的取代。这些类别包括例如具有无电荷极性侧链的氨基酸，如天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸；具有碱性侧链的氨基酸如赖氨酸、精氨酸和组氨酸；具有酸性侧链的氨基酸如天冬氨酸和谷氨酸；及具有非极性侧链的氨基酸如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸和半胱氨酸。
通常地，所述功能等价物包括在非保守序列中的一或多个缺失、取代、修饰或添加，通常对于结合神经营养蛋白受体重要的氨基酸不被改变。各种神经营养蛋白的氨基酸序列及其二级结构元件已经加以研究，对于神经营养蛋白受体结合重要的氨基酸已经被鉴别，例如Wiesmann et al.(Nature，1999，401184-188)对于NGF进行的描述。可以分析不同物种的序列之间的同源性以确定保守的序列，使用例如Altschul et al.，Nucleic Acids Res.；253389-3402(1997)的BLAST同源检索算法进行。
在特定的实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO1的第26-38位、第41-49位、第17-57位、第69-79位或第81-107位氨基酸；SEQ ID NO2的第33-45位、第48-56位、第22-64位、第76-86位或第88-115位氨基酸；SEQ ID NO3的第25-37位、第40-48位、第16-56位、第68-78位或第80-107位氨基酸；SEQID NO4的第28-40位、第43-52位、第19-60位或第79-89位或第91-118位氨基酸，或者其功能等价物。
在一个实施方案中，所述多肽包含人NGF的第17-67位氨基酸SVSVWVGDKTTATDIKGKEVMVLGEVNINNSVFKQYFFETKCRDPNPVDSG(SEQ ID NO1的第17-67位氨基酸)。
在这个实施方案中，所述细胞定向元件由NGF的第17-57位氨基酸形成的发夹基序及额外的10个氨基酸组成，所述额外的氨基酸不影响发夹基序的形成或者与神经营养蛋白受体的选择性结合。所述额外的10个氨基酸被包括进来是为了促进重组多肽的表达。
在一个实施方案中，所述多肽包含人NGF的第80-108位氨基酸CTTTHTFVKALTMDGKQAAWRFIRIDTAC(SEQ ID NO1的第80-108位氨基酸)。
在这个实施方案中，细胞定向元件由NGF的第81-107位氨基酸形成的发夹基序及在每个末端的一个半胱氨酸组成。
在一个实施方案中，所述多肽包含人BDNF的第22-74位氨基酸并具有如下序列SISEWVTAADKKTAVDMSGGTCTVLEKVOVSKGQLKQYFYETKCNPMGYTKEG(SEQ ID NO2的第22-74位氨基酸)。
在这个实施方案中，所述细胞定向元件由BDNF的第22-64位氨基酸形成的发夹基序和增强所述多肽稳定表达的额外10个氨基酸组成。
其它合适的细胞定向元件可以通过本领域技术人员已知的方法鉴别，例如通过测试与神经营养蛋白受体的选择性结合而鉴别。神经营养蛋白受体结合可以例如使用表达关连受体的细胞通过置换/竞争结合分析而测定(见Ilag et al J.Biol.Chem.26919941-19946及其参考文献；Ruden et al J.Biol.Chem 2175623-5627)。如本文所用，术语“关连受体”是指能选择性结合特异的神经营养蛋白的细胞表面受体。例如，TrkA是NGF的关连受体，TrkB是BDNF的关连受体。p75NTR受体是NGF、BDNF、NT-3和NT4/5的低亲和性关连受体。在置换/竞争分析中，细胞定向元件结合神经营养蛋白受体的能力通过标记的全长神经营养蛋白与其关连受体的结合降低而表明。进行竞争/置换分析的方法为本领域技术人员所已知。例如，大鼠嗜铬细胞瘤细胞系PC12表达TrkA和p75NTR受体，并可以与标记的NGF和包含推定的受体结合元件的多肽用于竞争分析中。
或者，在细胞定向元件是神经营养蛋白激动剂的情况中，可以围绕Trk受体的内源酪氨酸激酶活性而设计结合分析。当表达Trk受体的细胞与细胞定向元件在存在32P磷酸盐来源的情况下温育时，配体结合可以通过放射标记的Phospho-Trk受体的量而测定。或者，所述神经营养蛋白激动剂结合可以通过Trk信号传导途径中任一种下游激酶底物例如Erk1、Erk2或Akt确定。本领域技术人员已知怎样检测放射标记的磷蛋白，例如通过免疫印迹技术检测。
或者，可以筛选表现为神经营养蛋白激动剂的推定的细胞定向元件的促进神经细胞存活的能力。例如暴露于无血清培养基的接种的PC12细胞的存活率降低，但是可通过在培养基中加入NGF而增加存活率。可以筛选推定的激动剂性细胞定向元件促进无血清培养基中细胞存活的能力。
神经营养蛋白具有被氧化形成半胱氨酸结基序的6个半胱氨酸残基。其它生长因子包括血小板衍生生长因子(PDGF)(Oefner et alEMBO J 113921-26，1994)、转化生长因子-B(TGF-B)(Schlunegger etal Nature 358430-434，1992)、及绒毛膜促性腺激素(Lapthorn et alNature 369455-61，1994)也具有半胱氨酸结基序。人NGF具有三个二硫键，位于半胱氨酸15-80、58-108和68-110之间。BDNF在大肠杆菌中的异源表达产生具有不适当的二硫键配对的10种形式，导致生物活性降低(Shimizu et al，Biosci.Bitech.Bichem.60；971-974，1996)。由于本发明的重组多肽仅包括神经营养蛋白序列的一部分，因此不参与受体结合的残基，包括任何半胱氨酸残基可以被缺失，从而避免了与全长神经营养蛋白中二硫键杂乱(disulfidescrambling)相关的问题。另外，较小的神经营养蛋白结合元件的免疫原性可以低于全长神经营养蛋白的免疫原性。
如果发夹基序含有半胱氨酸残基，则该序列可以通过常规技术被修饰以缺失或取代半胱氨酸，由此在所述发夹基序中仅存在两个半胱氨酸残基。发夹基序中的一或多个半胱氨酸残基也可以被除去，或者加入半胱氨酸残基由此半胱氨酸残基存在于发夹基序的氨基和羧基末端以形成分子内二硫键。在各种实施方案中，两个半胱氨酸残基的巯基可以被氧化形成分子内二硫键。二硫键的形成可以通过蛋白质化学领域技术人员已知的常规方式实现，例如通过空气氧化进行。不受限于任何特定理论，据信分子内二硫键的形成将稳定发夹基序，并且可以增加所述基序与关连受体的亲和性。错配的二硫键或二硫键杂乱的问题可以通过在序列中仅包括两个半胱氨酸残基而避免。在一个实施方案中，所述二硫键是在β发夹基序的开放端。
核酸结合元件可以是以序列特异性或序列非依赖性方式结合核酸的任何氨基酸序列。在一个实施方案中，所述核酸结合元件是DNA结合元件。DNA结合元件为本领域所已知，包括例如转录因子的DNA结合结构域。一般而言，转录因子通常以序列特异性方式结合DNA。“序列特异性”是指受体选择性识别特异DNA序列，或者少数高度相关的序列。在一些实施方案中，所述DNA结合元件可以衍生自其DNA结合结构域含有如下任一结构基序的转录因子螺旋-转角-螺旋蛋白质(λCro、λcI、大肠杆菌CAP蛋白质、Lac阻抑物、Trp阻抑物(Steisz et al PNAS 793097-3100，1982；Ohlendorf et al J.Mol Bio169757-769，1983；Kaptein et al J.Mol Biol.182179-182，1985；Sheritzet al Nature 317782-786))、同源域(Antennapaedia和MATα2(Qian etall，Cell 59573-580；Wolberger et al Cell 59573-580))、锌指蛋白(TFIIA、Sp-1、Zif268，见Krizek et al JACS 1134518-4523，1991)、类固醇受体、亮氨酸拉链蛋白(C/EBP、c-fos、c-jun、GCN4、CREB(见O′Shea et al Science 24539-544))、螺旋-环-螺旋蛋白(MyoD和c-myc(Weinrib et al Science 251761-766，1991))及β-折叠(Met J、Arc和Mnt阻抑物(Phillips，Current Opinion in Struc Biol 189-98，1991；Berg et alNature 346586-589，1990))。或者，其它DNA结合元件包括GAL4阻抑物的DNA结合结构域及HIV的RRE(rev应答元件)。
许多转录因子已被克隆，其序列在公共数据库上可获得。或者，序列特异性DNA结合结构域可以衍生自非转录因子的蛋白质，例如限制性内切酶等等。在各种实施方案中，本发明涵盖了全长DNA结合结构域以及保留结合DNA能力的任何DNA结合结构域的片段的应用。
在各种其它实施方案中，DNA结合元件以序列非依赖性方式结合DNA。“序列非依赖性”是指蛋白质对特定的DNA序列几乎没有任何特异性地结合DNA。合适的序列非依赖性结合元件可以衍生自高度碱性蛋白质如组蛋白或鱼精蛋白的DNA结合结构域的氨基酸序列。在一个特定的实施方案中，DNA结合元件是首次由Fortunati et al(Gene Therapy 2000；71505-15)使用的组蛋白H1的DNA结合结构域，具有如下序列SPKRSPKRSPKRSPKR(SEQID NO11)。
在一个实施方案中，所述DNA结合元件可以是带正电的结构域，例如阳离子多肽如聚赖氨酸、聚精氨酸、或者具有碱性侧链的氨基酸的任何其它聚合物。据信阳离子聚合物以序列非依赖性方式通过阳离子聚合物与阴离子核酸磷酸酯主链之间的静电相互作用而结合DNA。本领域技术人员理解阳离子聚合物与DNA之间相互作用的强度将反映所述聚合物中阳离子单体的数目，更特别地反映所述阳离子聚合物的总体净电荷，以及反映其它事情。在本发明的一个特定的实施方案中，DNA-结合元件是十赖氨酸(即KKKKKKKKKK，SEQ IDNO10)。如下文所论述，这种带正电的结构域也结合细胞表面，从而增强发夹基序与神经营养蛋白受体的结合。
本领域技术人员可易于鉴别其它合适的DNA结合元件。例如，序列特异性DNA结合可以应用含有一或多个DNA识别序列的核酸通过常规凝胶阻滞分析而测定。或者，在DNA结合元件是阳离子性的并且以序列非依赖性方式结合的情况中，DNA结合可以通过在有或无推定的DNA结合元件的情况下测定靶DNA的电泳迁移率而检测。阳离子聚合物对DNA的结合减少DNA结合元件复合物上的净电荷，并且相对于未结合的DNA阻滞复合物的电泳迁移。所述复合物的电泳迁移率可以通过常规琼脂糖凝胶电泳确定，通过溴化乙锭染色使DNA显色。
在一个实施方案中，所述DNA结合元件和所述细胞定向元件可以是相邻的，例如核酸结合元件的羧基末端残基可以与细胞定向元件的氨基末端残基共价连接。
在不同的实施方案中，多肽可进一步在DNA结合元件与细胞定向元件之间包含一个接头序列，从而通过提供足够的构象柔性而增强DNA结合和/或神经营养蛋白受体结合，使得被连接的元件基本上彼此独立地发挥功能。
在一个实施方案中，所述接头序列是遗传编码的氨基酸序列。优选地，所述接头序列不包括半胱氨酸。
合适的接头/间隔元件为本领域技术人员所已知，包括少于大约20个氨基酸的多肽序列，其含有高百分比小的不带电荷的氨基酸(即甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺)。在这些氨基酸中，特别优选具有高百分比丝氨酸和甘氨酸残基的接头。
或者，合适的接头/间隔元件可含有已知形成特定二级结构的序列。在一些实施方案中，所述接头序列形成α螺旋结构。α螺旋接头序列可防止连续的功能元件相互作用和/或聚集。在一个特定的实施方案中，所述接头序列是H1α螺旋，并且具有如下氨基酸序列TYLSEDELKAAEAAFKRHNPT(SEQ ID NO30)。
在另一个实施方案中，多肽进一步包含二硫键异构酶。非限于任何特定理论，据信二硫键异构酶活性将增强所述多肽的溶解度、稳定性和折叠。例如，二硫键异构酶可通过还原所有分子间二硫键而防止多肽聚集。二硫键异构酶也可以促进二硫键交换从而有利于最稳定的二硫键。在各种实施方案中，所述多肽可包含催化蛋白质折叠、稳定性和溶解度的其它元件，包括但非限于脯氨酸肽异构酶。
在另一个实施方案中，多肽包含一个标记或标签如促进所述多肽制备、分离或纯化的组氨酸标签。组氨酸标签是已被示出对二价金属离子如铜、更优选镍或钴具有亲和性的聚组氨酸序列。本领域技术人员已知这些组氨酸标签可以用于进行固定化金属亲和层析(IMAC)蛋白质纯化步骤。通常地，将加上组氨酸标签的蛋白质在溶液中与固定的金属离子一起温育。加上组氨酸标签的蛋白质与所述固定的金属结合，而不含有组氨酸标签的蛋白质被洗掉。在洗涤步骤后，加上组氨酸标签的蛋白质通过加入金属螯合剂如EDTA或者通过高浓度咪唑而从固定的金属支持物中洗脱。组氨酸标签的长度优选为6个残基(His6)，更优选8或10个残基(His8或His10)。在一个特定的实施方案中，多肽包含10个残基的组氨酸标签(His10)。组氨酸标签也可以促进基因送递，因为组氨酸中的咪唑杂环结构具有大约为6的pKa，因此在内溶酶体pH范围具有缓冲能力。这种性质可促进DNA通过“质子海绵(proton sponge)”机制而从小泡中逃脱。
多肽可包含被可操纵地定位的一或多个细胞定向元件，从而每个细胞定向元件均可结合神经营养蛋白受体。相似地，多肽可含有多个DNA结合元件。例如，包含一个以上细胞定向元件的多肽可以是特别优选的，其中全长配体通常结合受体二聚体，从而其可以更强地结合和/或更特异于这种受体(例如Trk家族同源二聚体或p75NTR-Trk异源二聚体)。期望这种增强的结合可通过受体介导的胞吞而增加融合蛋白的内在化效率。
在一个实施方案中，多肽包含如下序列CTTTHTFVKA LTMDGKQAAW RFIRIDTACK KKKKKKKKK(SEQ ID NO5)。
这个29个氨基酸的序列是通过将人NGF的第80-108位氨基酸与可结合DNA并将DNA浓缩为紧凑结构的10-赖氨酸序列组合而产生。发夹基序由NGF的L4环的4个氨基酸残基和NGF的Cβ链和Dβ链的部分组成，从而通过两个β链之间形成氢键而稳定所述环的天然构象。这个三维结构通过氧化后在C80和C108之间形成二硫键而进一步稳定。
在另一个实施方案中，将DsbC蛋白(一种大肠杆菌二硫键异构酶)加入发夹基序的氨基末端，这个实施方案中的多肽包含如下序列MKKGFMLFTL LAAFSGFAQA DDAAIQQTLA KMGIKSSDIQPAPVAGMKTV LTNSGVLYIT DDGKHIIQGP MYDVSGTAPVNVTNKMLLKQ LNALEKEMIV YKAPQEKHVI VFTDITCGYCHKLHEQMAD YNALGITVRY LAFPRQGLDS DAEKEMKAIWCAKDKNKAFD DVMAGKSVAP ASCDVDIADH YALGVQLGVSGTPAVVLSNG TLVPGYQPPK EMKEFLDEHQ KMTSGKGSTSGSGHHHHHHS AGLVPRGSCT TTHTFVKALT MDGKQAAWRFIRIDTACKKK KKKKKKK(SEQ ID NO6)
在另一个实施方案中，多肽包含如下序列MGHHHHHHHH HHSSGHIEGR HMSPKRSPKR SPKRSPKRGGTYLSEDELKA AEAAFKRHNP TGSCSVSVWV GDKTTATDIKGKEVMVLGEV NINNSVFKQY FFETKCRDPN PVDSG(SEQ ID NO7)在这个实施方案中，发夹基序是由NGF的L1和L2环与衍生自人NGF的第17-67位残基的Aβ链和Bβ链一起产生的。得自基于结合小沟而可以浓缩DNA的组蛋白H1的(SPKR)4用作非特异性核酸结合成分(Khadake JR and Rao MR，Biochemistry 361041-1051，1997)。这两个元件由侧翼为柔性甘氨酸序列的α螺旋接头序列隔断，从而增强细胞定向元件和核酸结合元件的独立作用，特别是增强环结构与神经营养蛋白受体的柔性相互作用。His10标签用于肽纯化并可以在胞吞的多肽/DNA复合物的逃脱中起作用。为稳定多肽构象，将一个半胱氨酸残基加入到紧邻人NGF的第17-67位氨基酸残基前面，以促进与NGF的第58位半胱氨酸形成二硫键。
在另一个实施方案中，多肽包含BDNF的L1和L2环的发夹基序(第22-74位氨基酸)、(SPKR)4及一个α螺旋接头，并包含如下氨基酸序列MGHHHHHHHH HHSSGHIEGR HMSPKRSPKR SPKRSPKRGGTYLSEDELKA AEAAFKRHNP TGSCSISEWV TAADKKTAVDMSGGTVLEKVPVSKGQLK QUFYETKCNP MGYTKEG(SEQ ID NO8)本发明的多肽可以通过本领域已知的方法制备，所述方法包括常规的化学手段，例如应用t-Boc或Fmoc氨基酸衍生物的固相合成方法。或者，多肽可以使用重组DNA技术和适当的表达系统表达。特别优选细胞表达系统，其中编码本发明多肽的基因被转录和翻译。合适的表达系统包括但非限于在培养的大肠杆菌(E.coli)、酿酒酵母(S.cerevisiae)、甲醇酵母(Pichia pastoris)、杆状病毒/昆虫细胞表达系统和真核细胞中表达。在任何这些系统中的表达可以由组成型或可诱导的启动子驱动。
表达的多肽可以通过常规技术包括层析、免疫沉淀等技术从其它生物或化学组分中纯化和分离。纯化的蛋白质的纯度可以通过电泳或层析技术评定。纯化的多肽的同一性也可以通过质谱技术证实，而且如果需要的话通过MS/MS测序证实。
在各个方面，本发明提供了一种重组核酸分子，由其可表达本发明的多肽。本发明因此提供了一种编码本发明多肽的重组核酸分子。所述核酸可以是RNA或DNA。所述DNA可以是单链的，优选是双链的，最优选是环状双链的。编码本发明多肽的DNA可以使用本领域已知的方法从已知多肽序列中确定。已知神经营养蛋白的DNA序列并且可以在公共数据库如genbank中获得。根据对神经营养蛋白序列的了解，本领域技术人员可易于设计寡核苷酸引物，从而编码神经营养蛋白序列的片段的DNA分子可以通过聚合酶链反应从神经营养蛋白cDNA或mRNA中扩增。相似地，接头序列、组氨酸标签和核酸结合元件的核苷酸序列可以使用合适的遗传密码生成。优选地，包含具有高度密码子偏倚性的密码子的核酸序列用于防止在任何特定表达宿主中错误掺入及用于高水平的蛋白质表达(见Calderone et al.JMol Biol 1996，262(4)407-412)。在各种实施方案中，所述核酸分子包含SEQ ID NO14、SEQ ID NO26、SEQ ID NO29和SEQ ID NO31所示序列。
本发明的重组核酸分子可以通过本领域技术人员已知的标准技术构建，例如Sambrook et al.在Molecular CloningA LaboratoryManual，3rd Edition，Cold Spring Harbour，Laboratory Press及其它实验室手册中所述。核酸分子可以使用如Itakura等的美国专利No.4,598,049；Caruthers等的美国专利No.4,458,066；及Itakura等的美国专利No.4,401,796和4,373,071所述技术化学合成。
核酸分子也可以分离及组合。分离是指被分离的物质基本上与其例如在体内关联的其它成分如生物成分分离或从中纯化，从而分离的物质可自身被操纵或处理。术语分离的因此包括通过标准纯化方法纯化的物质，以及通过在宿主中重组表达纯化的物质，以及化学合成的物质。可利用各种策略以组合并连接各个核酸分子并且依赖于要连接的核酸的性质或末端，本领域技术人员将易于明白合适的策略。分子生物学领域技术人员显而易见DNA片段必须在适当的框内连接，以保证所得基因编码所希望的氨基酸序列。
本发明的另一方面提供了包含本发明的重组核酸分子的表达载体。所述载体可以是质粒或病毒或病毒衍生的载体。本领域技术人员也熟知通过标准技术构建这种载体。本发明的载体也可以含有其它序列元件以促进载体在宿主细胞中增殖和选择，所述其它序列元件例如是本领域技术人员已知的选择标记的编码序列及报道基因。另外，本发明的载体可包含一或多个限制性核酸内切酶识别位点的核苷酸序列。
本发明的表达载体可以导入宿主细胞中，所述宿主细胞可包括能表达所述表达载体编码的蛋白质的细胞。因此，本发明还提供了含有本发明的表达载体的宿主细胞。术语“宿主细胞”不仅是指特定的对象细胞，而且还是指这种细胞的子代或潜在子代。因为某些修饰由于细胞分化、突变或环境影响而可以在以后的世代中发生，因此这种子代可能事实上与前代细胞不同，但仍包括在本发明所用术语的范围内。
载体DNA可以通过常规转化或转染技术导入细胞中。术语“转化”和“转染”是指将外源核酸导入宿主细胞中的技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂转染、电穿孔、微注射和病毒介导的转染。合适的转化或转染宿主细胞的方法为本领域所熟知，并可例如见Sambrook et al.(Molecular CloningA LaboratoryManual，3rd Edition，Cold Spring Harbor Laboratory press(2001))及其它实验室手册。
其中已经导入外源核酸的细胞、组织、器官或生物体被认为是“转化的”、“转染的”或“转基因的”。转基因的或转化的细胞或生物体也包括所述细胞或生物体的子代及应用转基因生物体作为亲代经繁殖程序产生的子代，所述子代呈现由于存在重组核酸构建体而产生的表型改变。转基因生物体因此是已经用异源核酸转化的生物体，或者包括所述转基因的这种生物体的子代。本发明在各个方面提供了包含本发明各个实施例的重组核酸分子的转基因细胞和非人动物。
为了稳定转染哺乳动物细胞，基于使用的表达载体和转染技术，已知仅有少部分细胞可以将外源基因整合进其基因组中。为了鉴别并选择这些整合体，可以将编码选择标记(例如抗生素抗性)的基因与感兴趣的基因一起导入宿主细胞中。优选的选择标记包括授予药物如G418、潮霉素和氨甲喋呤抗性的那些标记。编码选择标记的核酸可以在编码肽化合物的同一载体上导入宿主细胞，或者可以在分开的载体上导入。用导入的核酸稳定转染的细胞可以通过药物选择鉴别。
在一个实施方案中，DNA表达载体包含如下序列ATGAAGAAAG GTTTTATGTT GTTTACTTTG TTAGCGGCGT TTTCAGGCTT 50TGCTCAGGCT GATGACGCGG CAATTCAACA AACGTTAGCC AAAATGGGCA 100TCAAAAGCAG CGATATTCAG CCCGCGCCTG TAGCTGGCAT GAAGACAGTT 150CTGACTAACA GCGGCGTGTT GTACATCACC GATGATGGTA AACATATCAT 200TCAGGGGCCA ATGTATGACG TTAGTGGCAC GGCTCCGGTC AATGTCACCA 250ATAAGATGCT GTTAAAGCAG TTGAATGCGC TTGAAAAAGA GATGATCGTT 300TATAAAGCGC CGCAGGAAAA ACACGTCATC ACCGTGTTTA CTGATATTAC 350CTGTGGTTAC TGCCACAAAC TGCATGAGCA AATGGCAGAC TACAACGCGC 400TGGGGATCAC CGTGCGTTAT CTTGCTTTCC CGCGCCAGGG GCTGGACAGC 450GATGCAGAGA AAGAAATGAA AGCTATCTGG TGTGCGAAAG ATAAAAACAA 500AGCGTTTGAT GATGTGATGG CAGGTAAAAG CGTCGCACCA GCCAGTTGCG 550
ACGTGGATAT TGCCGACCAT TACGCACTTG GCGTCCAGCT TGGCGTTAGC 600GGTACTCCGG CAGTTGTGCT GAGCAATGGC ACACTTGTTC CGGGTTACCA 650GCCGCCGAAA GAGATGAAAG AATTTCTCGA CGAACACCAA AAAATGACCA 700GCGGTAAAGG ATCAACTAGT GGTTCTGGTC ATCACCATCA CCATCACTCC 750GCGGGTCTGG TGCCACGCGG TAGTTGTACC ACGACTCACA CCTTTGTCAA 800GGCGCTGACC ATGGATGGCA AGCAGGCTGC CTGGCGGTTT ATCCGGATAG 850ATACGGCCTG TAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA ATGA(SEQ ID NO14)在另一个实施方案中，DNA表达载体包含如下序列ATGGGCCATC ATCATCATCA TCATCATCAT CATCACAGCA GCGGCCATAT 50CGAAGGTCGT CATATGAGTC CGAAACGCAG CCCGAAACGT AGCCCAAAGC 100GTAGCCCGAA GCGTGGCGGT ACCTACCTGT CTGAAGATGA GCTGAAAGCG 150GCGGAGGCGG CATTCAAACG TCACAACCCG ACTGGATCCT GCAGTGTCAG 200CGTGTGGGTT GGGGATAAGA CCACCGCCAC AGACATCAAG GGCAAGGAGG 250TGATGGTGTT GGGAGAGGTG AACATTAACA ACAGTGTATT CAAACAGTAC 300TTTTTTGAGA CCAAGTGCCG GGACCCAAAT CCCGTTGACA GCGGGTGA(SEQ ID NO26)在另一个实施方案中，DNA表达载体包含如下序列ATGGGCCATC ATCATCATCA TCATCATCAT CATCACAGCA GCGGCCATAT 50CGAAGGTCGT CATATGAGTC CGAAACGCAG CCCGAAACGT AGCCCAAAGC 100GTAGCCCGAA GCGTGGCGGT ACCTACCTGT CTGAAGATGA GCTGAAAGCG 150GCGGAGGCGG CATTCAAACG TCACAACCCG ACTGGATCCT GCAGTATTAG 200TGAGTGGGTA ACGGCGGCAG ACAAAAAGAC TGCAGTGGAC ATGTCGGGCG 250GGACGGTCAC AGTCCTTGAA AAGGTCCCTG TATCAAAAGG CCAACTGAAG 300CAATACTTCT ACGAGACCAA GTGCAATCCC ATGGGTTACA CAAAAGAAGG 350CTGA(SEQ ID NO29)本发明的多肽可用于实现神经营养蛋白受体介导的核酸送递，所述核酸如与多肽的核酸结合元件结合的DNA。所述核酸也可以是RNA，包括有义RNA、反义RNA或核酶。因此本发明一方面提供了一种包含本发明的多肽和一种核酸的组合物。所述多肽和核酸可形成非共价复合物。术语“非共价”是指所有不是共价键(即电子在两个原子之间共用)的原子或分子间的相互作用。如本文所用，“非共价”包括但非限于如下相互作用静电或离子键、氢键、偶极相互作用、疏水相互作用、van der Walls接触及芳族堆积(aromatic stacking)相互作用。一般而言，非共价键的稳定性远远低于共价键，通常可以可逆形成和破坏。在不同的实施方案中，非共价复合物可以由于核酸的负电荷磷酸主链与非特异性DNA结合元件的正电荷侧链之间的相互作用而形成。
在一个实施方案中，所述核酸包含一个编码基因序列。在本发明的一个实施方案中，所述编码序列是治疗性基因序列。治疗性基因序列包括但非限于编码蛋白质、有义RNA、反义RNA或核酶的基因，包括具有神经营养性、抗程序性细胞死亡或抗氧化剂活性的分子。或者，治疗性基因序列可通过代替或补充内源缺陷的基因或者通过编码内源或外源基因产物而用于实现基因治疗。
在另一个实施方案中，所述编码基因序列可编码一种标记基因产物。术语“标记基因产物”与“报道基因产物”当指其存在可易于鉴别(通常通过肉眼观察或通过授予细胞对其它胞毒剂或细胞抑制剂抗性而鉴别)的基因产物时可互换使用。本领域技术人员已知许多标记基因产物，包括但非限于萤光素酶、绿色荧光蛋白、β-半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶(GUS)和氯霉素乙酰转移酶(CAT)。
在各种实施方案中，有利的是本发明的组合物在生理溶液中是稳定的。所述稳定性可以通过增加所述多肽与核酸之间形成的复合物的稳定性而增加，例如通过增加所述多肽的DNA结合结构域及关连结合结构域识别的DNA序列的价态而进行。所述组合物可以通过在合适的缓冲液中混和所述多肽与所述核酸而形成。所述合适的缓冲液的成分依赖于所述核酸和多肽元件的性质。本领域技术人员已知使用合适的溶液条件以促进所述组合物中复合物的稳定性。例如，如果所述组合物中多肽与核酸之间的结合主要是通过静电作用介导的，则本领域技术人员已知使用相对低盐浓度的溶液以防止离子屏蔽。稳定的非共价复合物的形成可以通过许多基于所述非共价复合物的大小和/或电荷的实验方法确定。例如，所述复合物可以通过质谱、凝胶渗透/大小排阻层析、琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶阻滞分析、插入DNA中的溴化乙锭的荧光猝灭、原子力显微镜分析、ζ电位分析及动态光散射分析确定。
在本发明的另一个实施方案中，所述组合物还包含阳离子聚合物。据信所述阳离子聚合物与核酸的带负电主链相互作用，导致非共价的核酸/多肽复合物浓缩为较小的携带较少负电荷的微粒。这些较小的携带较少负电荷的阴离子非共价复合物可以通过受体介导的胞吞更有效地内在化(Schaffer et al J.Biol.Hem.27328004-28009，1998)。合适的阳离子聚合物包括鱼精蛋白、聚赖氨酸、聚精氨酸、聚鸟氨酸、聚乙烯亚胺或衍生自碱性蛋白如组蛋白的碱性肽序列。优选所述聚乙烯亚胺是低分子量聚合物，优选平均分子量(重量)为600(PEI600)。PEI600与高分子量PEI不同，如与显示高度毒性及基因转染效率的PE125K不同(BoussifO，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 927297-7302，1995；Abdallah B，et al.，Hum Gene Ther，71947-1954，1996；Goula D，Gene Therapy，5712-7171998)。PEI600显示低得多的胞毒性但是几乎无转染效率。由于PEI600含有1°、2°和3°胺，在掺入复合物并胞吞进细胞中后均具有质子化潜力，因此该聚合物破坏内体(endosome)膜并促进多肽复合物的逃脱或释放。
本发明还提供了将核酸定向送递至细胞的方法，包括将本发明各实施方案的组合物给予表达神经营养蛋白受体的细胞。非限于任何特定理论，据信多肽-核酸复合物选择性结合细胞表面神经营养蛋白受体，然后所述复合物由受体介导的胞吞而内在化。
表达至少一种神经营养蛋白受体的任何细胞均可以被定向，包括表达Trk如Trk A、TrK B和Trk C或p75NTR的细胞。在各种神经元中，这些细胞包括基底部前脑-胆碱能神经元、纹状体-胆碱能神经元、蓝斑神经元、脊髓运动神经元、交感神经感觉神经元、神经嵴衍生的小、中和大纤维感觉神经元、视网膜神经节细胞等等。神经系统中的其它细胞包括星形胶质细胞、少突胶质细胞、神经膜细胞(Schwanncells)、小胶质细胞和神经外胚层衍生的细胞。神经系统外的细胞包括B淋巴细胞、T淋巴细胞、肥大细胞，单核细胞、巨噬细胞及许多肿瘤细胞。
所述组合物可包含其它非病毒基因载体，包括阳离子聚合物或脂质，如Davis ME(Non-viral gene delivery system；Current opinion inbiotechnology 2002，13128-131)、Niidome T and Huang L(Gene therapyprogress and prospectsnonviral vectors.Gene Therapy，2002，91647-1652)及Li S and Huang L(nonviral gene therapypromises andchallenges.Gene Therapy，2000，731-34)所述。多肽在化学缀合或置换内源病毒配体后也可以用于病毒载体中。用作基因治疗的逆转录病毒介导的基因送递已经充分鉴定，产生重组逆转录病毒及用这种病毒在体外或体内感染细胞的方案可见于Current Protocols in MolecularBiology，Ausubel，F.M.et al.(eds.)Greene Publishing Associates，(1989)及其它标准实验室手册。进行基因治疗的其它已知病毒载体包括腺病毒、腺伴随病毒和杆状病毒产生的载体(Sarkis C et al，Proc Natl AcadSci U.S.A.9714638-43，2000)，包括如美国专利6,180,613所述的将DNA送递至神经系统细胞的载体。
通过基因治疗方法有效治疗许多神经疾病需要高水平的及细胞特异性的基因表达。本发明的多肽因此可有利地用于基因治疗中以治疗神经元疾病，包括中风、缺血、癫痫、头部和脊髓创伤、帕金森病、亨廷顿病、阿尔茨海默病、肌萎缩性侧索硬化症、及神经遗传疾病。例如，在帕金森病中，黑质中多巴胺能神经元的进行性丧失最终导致多巴胺不足及相关的运动损伤。定向在这组神经元的膜表面上表达的Trk B受体的基因送递系统应可用于推进帕金森病的基因治疗方法。同样在阿尔茨海默病中，具有最主要病变的神经元组是应答所有神经营养蛋白的基底部前脑胆碱能神经元。定向神经营养蛋白受体的基因送递系统可有助于将治疗性基因转移进该神经元以增加胆碱能功能。可使用的治疗性基因包括生长因子基因(包括编码神经营养蛋白、成纤维细胞生长因子家族蛋白质、胰岛素样生长因子家族蛋白质的基因)，及抗程序性细胞死亡的基因(包括bcl-2基因家族的基因)。
本发明另一方面因此还提供了一种治疗对象中神经元疾病的方法，包括将本发明各种实施方案的组合物给予所述对象。所述对象可以是任何哺乳动物，在一个实施方案中所述对象是人。在各种实施方案中，所述神经元疾病是中风、缺血、癫痫、头部和脊髓创伤、帕金森病、亨廷顿病、阿尔茨海默病、或者肌萎缩性侧索硬化症、或者神经疾病。技术人员显而易见，所述组合物可以用药物可接受的载体或稀释剂适当制备而用于体内给药。
本领域已知将DNA在体内导入哺乳动物细胞的方法，并可以用于将与本发明的多肽复合的DNA给予对象以进行基因治疗。在一个实施方案中，靶细胞是神经元细胞，所述组合物是通过鞘内注射进脑脊液(CSF)中给予的。为将所述组合物特异性送递至中枢神经系统的特定区域中的神经元，如本领域所已知的可通过定向微注射(stereotactic microinjection)进特定的解剖部位而给予。对于人患者，将定向框架基础固定在头骨内并使用高分辨率MRI对脑部成像。使用合适的定向软件，将图像转化为适于DNA定向注射的三维坐标。将与本发明多肽复合的DNA定向注射进特定的解剖部位也有助于通过逆行轴突转运而定向在不易到达处的特定的神经元亚类。还可以在周围注射所述组合物后利用逆行轴突转运定向至CNS中的神经元。一个实例是经肌肉注射定向至脊髓内的运动神经元。这个方案避开血脑屏障，并且提供了对CNS组织无侵害性的一种实际的治疗策略。
已经在表达Trk A和p75NTR的PC12细胞以及表达Trk A和Trk B的大鼠原代皮质神经元中测试了本发明的多肽和组合物的神经营养蛋白样活性和定向基因送递。所述多肽使得转染的基因表达增加了几百至几千倍。所述组合物对定向于神经营养蛋白受体的特异性在使用神经营养蛋白或相关对照肽作为竞争抑制剂的抑制实验中已经证实。另外，使用本发明的多肽改良的基因送递在腰椎注射后已经在神经系统中证实。在表达神经营养蛋白受体的背根神经节中观测到显著增加的基因表达。特别地，与包含(SPKR)4和His10标签的多肽复合的DNA可以在体外和体内有效地转移细胞而无需使用帮助内体逃脱的试剂，如氯喹和PEI。
所述多肽还激活神经营养蛋白受体相关的信号转导并发挥神经营养蛋白样生物作用，促进神经突生长和神经元存活。发夹基序因此是一种神经营养蛋白激动剂，意味着其能促进与神经营养蛋白相关的至少一种生物学作用，如神经突生长、神经元存活及神经营养蛋白受体相关的信号转导。因此在一方面，本发明提供了包含选择性结合神经营养蛋白受体的发夹基序的神经营养蛋白激动剂。所述发夹基序可以是神经营养蛋白的发夹基序或者如上述的其功能等价物。在一个实施方案中，所述激动剂进一步包含一个带正电的结构域，在各种其它实施方案中所述激动剂包含其它元件，包括上述那些元件，例如发夹基序与带正电结构域之间的合适接头/间隔或者增强所述激动剂的稳定性、溶解度或折叠的其它元件。
不限于任何特定理论，据信带正电的结构域通过结合带负电的细胞膜而促进所述激动剂的受体结合。所述带正电的结构域可以是如上述氨基酸的任何带正电荷的聚合物，包括聚赖氨酸和SPKR4结构域。在各种实施方案中，所述激动剂包含SEQ ID NO5，SEQ ID NO6，SEQ ID NO7和SEQ ID NO8所示序列。
本发明各种实施方案的神经营养蛋白激动剂具有许多用途，这些用途为本领域技术人员所显而易见，包括研究神经营养蛋白受体功能。其也可以用于治疗对神经营养蛋白治疗有反应的疾病，例如肿瘤或神经元疾病包括上述疾病。本发明因此还提供了治疗对象中对神经营养蛋白有反应的疾病的方法，包括给予所述对象有效量的本发明的神经营养蛋白激动剂或者包含有效量的本发明的神经营养蛋白激动剂的组合物。所述对象可以是任何哺乳动物，包括人。
本发明另一方面提供了包含神经营养蛋白激动剂和药物可接受的稀释剂或载体的组合物。所述组合物可以以常规方式生产。通常地，稀释剂或载体基于给药模式和途径及标准药物实践而选择。合适的药物载体或稀释剂以及它们在药物配制品中的应用所需的药物必需品如本领域的标准参考文献Remington′s Pharmaceutical Sciences和USP/NF中所述。配制品可以制备为含有有效量(是指足以实现治疗疾病或其症状的量)，例如合适的日剂量。所述有效量及合适的日剂量根据治疗的对象和疾病及疾病程度而变化，可以由本领域技术人员常规确定。所述有效量与合适的配制品可以与神经营养蛋白治疗中使用的剂量和配制品相似，例如RT Thorne and WH Frey″Delivery ofneurotrophin factor to the central nervous systemPharmacokineticconsiderations″，Clin.Pharmacokinet，40(12)907-946，2001所述。在一个实施方案中，如果是通过注射给予对象，则所述有效量是大约0.03-1μg所述激动剂/kg对象体重。
本文引用的所有文献均以全文并入参考。
尽管本文揭示了本发明的各种实施方案，但在本发明范围内根据本领域技术人员的共识可以对本发明进行一些改变和修改。这些修改包括用等价物取代本发明任一方面以便以基本相同的方式达到相同的结果。除非特别说明，本文所用所有技术和学术术语具有本领域技术人员共识的含义。
单词“包含”作为开放式术语使用，基本上与短语“包括但非限于”的含义相同。短语“根据本发明”或“根据本发明的各种实施方案”是指包括本发明范围内的所有实施方案。如下实施例例证了本发明的各个方面，无限制本发明的范围之意。
实施例材料和方法多肽生产细胞系PC12(大鼠嗜铬细胞瘤)细胞系得自ATCC(美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，Manassas，VA，USA))，在补加10％胎牛血清(FBS)和5％马血清的RPMI-1640培养基中培养。已知PC12细胞表达TrkA和p75NTR受体。COS7(非洲绿猴肾成纤维细胞)细胞系得自ATCC，在补加10％胎牛血清、50U/ml青霉素和50μg/ml链霉素的Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM)中培养。将细胞保持在37℃、5％CO2、增湿的温育器中。
原代细胞培养物神经元的原代培养物从妊娠20天的Wistar大鼠胚胎的皮质中确立。切开被剥离脑膜的皮质并将单个细胞通过将组织糜在补加2％FBS的3ml DMEM培养基中研磨而机械分散。将悬浮液置入离心管中。通过离心收集上清中的细胞并轻轻再悬浮于具有10％FBS的DMEM中。评价细胞的存活性之后使用台盼蓝铺板。将细胞铺板于用聚L赖氨酸/层粘连蛋白预先包被的微量培养板上，密度为7.5×105个活细胞/cm2。在温育2小时使得神经元附着后，除去培养基和未附着的细胞并更换为具有1％N2补充物(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)的无血清DMEM/F12培养基。然后将细胞在37℃在5％CO2中在增湿的温育器中温育。培养2-5天后，所述神经元细胞用于转染实验。
神经胶质细胞的原代培养物从20天龄的Wistar大鼠胚胎的皮质中确立。如上述收集单个细胞。将所述细胞以4×105个存活细胞/cm2密度铺板于聚L赖氨酸/层粘连蛋白包被的平皿上，并在补加10％FCS的DMEM/F12培养基中生长7天至铺满。在转染前一天，分离所述细胞并铺板进包被的微量滴定板中，密度为2.5×104个细胞/孔。
N/P比率氮/磷(N/P)比率通常用于测定聚阳离子-核酸或多肽-核酸复合物中的电荷平衡。对于阳离子聚合物，这是指聚阳离子中氮原子与核酸中磷酸根的比率。对于计算本发明的多肽的N/P比率，我们采用DNA结合结构域中碱性氨基酸残基的数目为每个多肽分子的“N”成分的数目。
DNA阻滞分析这种分析定性地评价了多肽或聚阳离子结合DNA并因此阻滞其在电泳条件下通过琼脂糖凝胶迁移(通过降低其电荷/质量比)的能力。对于N/P比率的范围，将多肽加入0.1μg质粒DNA中并用HEPES缓冲盐水(HBS，150mM NaCl，29mM HEPES，pH 7.3)或5％葡萄糖溶液定容至20μl。将该混合物进行涡旋(vortex)并在室温温育30分钟，之后在用溴化乙锭染色的0.8-1.0％Tris-硼酸盐-EDTA琼脂糖凝胶中进行电泳，在紫外光下显色。
溴化乙锭置换分析在这种分析中，掺入DNA中的溴化乙锭的荧光猝灭用于测定结合和浓缩DNA的能力。将溴化乙锭(153μl的0.01％溶液)加入96μg质粒DNA中并用水稀释至终体积为6ml。在96孔微量培养板的孔中，将各种量的多肽置于50μlDNA-溴化乙锭溶液中。混和后5分钟加入100μl水。使用485nm激发波长和593nm发射波长在SPECTRAFluorPlus微量培养板阅读仪(TECAN，Maennedorf，Switzerland)上读出荧光。
原子力显微镜分析制备DNA样品、多肽-DNA复合物、及多肽-聚阳离子-DNA复合物，其中DNA浓度为0.02mg/ml。将样品在HPLC级的水中稀释10倍，并将每种样品20μl沉积在云母片上。1分钟后，将所述云母片用HPLC级的水洗涤并在过滤的气流中干燥。在Nanoscope IIIa原子力显微镜(Digital Instruments，Santa Barbara，CA，USA)上获得图像，显微镜使用Nanoprobe Silicon针尖(Digital Instruments)在空气中以轻敲模式(tapping mode)操作。
报道基因质粒为确定本发明核酸送递系统的转染效率，应用在合成的启动子CAG控制下的编码萤火虫萤光素酶的报道质粒pCAGluc(YoshiharuMatsuura，National Institute of Infectious Diseases，Tokyo，Japan惠赠)。CAG包含鸡β-肌动蛋白启动子和巨细胞病毒立即早期增强子。
体外基因送递在PC12(TrkA和p75NTR阳性)细胞和COS7(神经营养蛋白受体阴性)细胞中体外测试TrkA定向基因送递复合物的转染效率。将所述细胞在微量培养板(24、48或96孔板)的孔中生长至50-70％铺满。所述基因送递复合物根据每个实施例的说明所述而制备。转染通过用一半体积的减少血清的培养基置换富含血清的培养基而实现，所述减少血清的培养基为含有所述基因送递复合物的Opti-MEM(Invitrogen)。特别提及的是，也要加入100μM氯喹以帮助复合物从内体中逃脱。温育4小时后，将细胞恢复至正常培养基体积和血清浓度中，通过用含有两倍血清浓度的培养基(对于PC12为具有20％FBS和10％马血清的RPMI-1640)加满或者通过完全更换培养基而恢复。
以相似方式在皮质神经元和神经胶质细胞的原代培养物上测试基因送递复合物。然而，由于培养神经元的DMEM-F12/N2培养基不含有血清，因此将所述复合物简单地直接加入到体积为通常体积一半的DMEM-F12/N2中。4小时后，加入等体积的DMEM-F12/N2。
转染后1-2天，除去细胞培养基并将细胞在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中漂洗。向每个孔中加入足以覆盖底部表面的报道基因裂解缓冲液(Reporter Lysis Buffer)(Promega，Wisconsin，MD，USA)(50μl/孔，48孔平板)。在一次冷冻-解冻循环后，使用萤光素酶分析系统(Luciferase Assay System)(Promega)和单管光度计(Berthold Lumat LB9507，Bad Wildbad，Germany)测试所述裂解物的萤光素酶活性。每种裂解物的总蛋白质浓度使用DC Protein分析(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)确定。结果以相对光单位(RLU)/mg总蛋白质表示。
体内基因送递体内基因送递通过鞘内注射成年Wistar大鼠(8周龄，180-200g)进行研究。将所述大鼠经腹膜内注射戊巴比妥钠麻醉。在暴露L4-L5周围的皮肤后，用注射器将基因送递复合物缓慢注射进蛛网膜下隙中。伴随注射针的正确放置有轻微的尾部摆动。注射后，将注射器原位留置5分钟以限制由于逆流压力所致的扩散。有时需要多次注射以送递全部体积的所述复合物。注射后，将皮肤用手术夹子封闭并将动物保持温暖直至它们苏醒。
2天后，将所述大鼠麻醉并穿心灌注PBS。切离脊髓的腰部节段和腰部背根神经节。将所述组织根据大小在100-400μl报道基因裂解缓冲液(Promega)中匀浆，并进行三次冷冻-解冻循环。将裂解物在4℃在14000g离心5分钟。使用萤光素酶分析系统(Promega)在单管光度计(Berthold Lumat LB 9507)中测试上清的萤光素酶活性。将读数用通过DC Protein分析(Bio-Rad)测定的裂解物的总蛋白质含量标准化。
TrkA和信号转导途径激活的检测进行免疫印迹实验测试嵌合多肽是否如NGF一样可诱导TrkA自身磷酸化及其信号转导途径的激活。将PC12细胞以2×106个细胞/孔的密度接种在6孔平板中，并在含有0.5％FBS和0.25％马血清的RPMI 1640中培养2天。低浓度的血清对于降低磷酸化的基本水平是必需的。将培养基在开始处理之前2小时更换。将细胞与所述多肽或NGF在无血清培养基中温育15-20分钟。然后将细胞在PBS中洗涤、裂解并超声处理。细胞裂解物通过SDS-PAGE解离并移至硝化纤维素膜进行免疫印迹。所用的初级抗体包括Phospho-TrkA(Tyr490)抗体、Phospho-p44/p42 MAPK(Thr202/Tyr204)单克隆抗体、及Phospho-Akt(Ser473)单克隆抗体，所有抗体均得自Cell SignalingTechnology(Beverly，MA，USA)。在使用辣根过氧化物酶缀合的二级抗体后通过标准技术进行比色检测。在一些实验中，使用TrkA酪氨酸激酶抑制剂K-252a或AG879(均得自Calbiochem，La Jolla，CA，USA)。在这些情况中，将PC12细胞与100nM K-252a或10μMAG879温育，之后加入多肽或NGF。
PC12细胞存活分析将接种在胶原包被的96孔平板上的未分化或分化的(用10ng/mlNGF处理6天)PC12细胞接触含有NGF或各种浓度的嵌合多肽的无血清RPMI-1640培养基。温育3-4天后，细胞存活性通过标准MTT分析测定。细胞存活率以与NGF处理的对照组存活力的百分比表示。
PC12神经突生长分析测试嵌合多肽在PC12细胞中诱导神经突生长的能力。将不同浓度的多肽加入到在富含血清的RPMI-1640培养基中培养的PC12细胞中。将细胞温育3天，每24小时照像一次。
实施例1NL4-10K的设计NL4-10K包含NGF的第4环及侧翼的β折叠序列(NL4，第80-108位氨基酸)，所述NL4连接至由10个连续赖氨酸残基组成的一个C末端核酸结合结构域(10K)。NL4的第一个和最后一个氨基酸残基是半胱氨酸残基，其形成分子内二硫键以稳定TrkA-结合区域的环形结构。NL4-10K、NL4和10K的氨基酸序列分别如SEQ ID NO5、9和10所示。
肽合成NL4-10K、NL4和10K是通过常规的肽合成技术化学合成的。NL4-10K和NL4由Cambridge Research Biochemicals(Cleveland，UK)合成、环化及纯化。10K得自Bio-Synthesis(Lewisville，Texas，USA)。NL4-10K结合DNANL4-10K肽结合DNA的能力通过在电泳期间DNA阻滞而监测。NL4-10K与质粒DNA的结合降低了DNA的电荷-质量比。图1示出质粒DNA的迁移率随着肽浓度增加而降低。在N/P比率为1-5之间复合物变得不能移动，表明所述DNA完全的电荷中和。相反，不含有DNA结合结构域的NL4不阻滞DNA迁移。
NL4-10K介导基因送递至PC12细胞为检测NL4-10K作为基因送递载体的效力，使用以不同比率的肽和报道质粒pCAGluc自身装配形成的复合物转染PC12细胞。所述复合物是将肽滴加至涡旋中的(vortexing)DNA，使得这两种成分均溶解在Opti-MEM培养基中而形成。转染之前在室温使得复合物形成进行30分钟。向24孔平板的每个孔中加入含有1μg质粒DNA的50μl复合物。由于NL4-10K缺少内体破坏结构域，因此在转染期间使用氯喹(100μM)。
图2A示出由0.3nmol的NL4-10K与1μg的pCAGluc(N/P比率为1)形成的复合物产生中度基因送递，但是转染效率随着NL4-10K量增加而显著增加。NL4(仅有定向结构域)或10K(仅有DNA结合结构域)或者二者的混合物均不呈现这种剂量响应趋势。使用1.5nmol的NL4-10K/μg DNA(N/P比率为5)与使用NL4和10K肽的混合物相比达到的转染效率高110倍。
NL4-10K介导的基因送递至PC12细胞是特异性的为进一步证明NL4-10K介导的基因送递特异性定向于NGF受体，使用过量的NGF、NL4和NL4-10K与NL4-10K/pCAGluc复合物竞争接触TrkA而进行竞争性分析。在转染期间这些分子每一种的存在均使得基因送递降低74-90％(图2B)。然而，过量的10K肽的存在不具有显著作用。这些结果提示NL4-10K介导的基因送递至PC12细胞是NGF受体特异性的。
NL4-10K介导基因送递至神经元和神经胶质细胞的原代培养物皮质神经元中TrkA表达已经充分确定，而在神经胶质细胞中TrkA的存在仍有争论(Sofroniew et al.，Annu.Rev.Neurosci.2001；241217-281)。如果确实存在，则TrkA在少量的神经胶质细胞中低水平表达。我们检测了NL4-10K将送递pCAGluc质粒送递至分离自20天龄大鼠胚胎的神经元和神经胶质细胞的原代培养物的能力。
使用通过肽/DNA(nmol/μg)比率为0.75(N/P比率为2.5)的NL4-10K和报道质粒pCAGLuc经自身装配形成的复合物转染原代神经元和神经胶质细胞。图2C示出在存在氯喹的情况下，NL4-10K肽/pCAGLuci复合物与非定向的对照组相比将基因转移至原代神经元中的效力高22倍。然而，在原代神经胶质细胞中，NL4-10K和10K的转染效率之间的差异不显著。
NL4-10K介导基因送递至背根神经节已知背根神经节(DRG)的神经元表达TrkA。对大鼠进行基因送递复合物的腰椎内注射，以评价NL4-10K在体内的效力。在体外使用氯喹以帮助NL4-10K/DNA复合物从内体中逃脱，但在体内则不用，因为所需要的浓度是毒性的。因此，向肽-DNA复合物中加入聚阳离子低分子量聚乙烯亚胺(MW 600Da，PEI600)，其具有内体破坏能力并且是低毒性的。在形成这些三重复合物的过程中，首先将PEI600与DNA混和30分钟，之后加入肽并将混合物在室温再温育30分钟。每只大鼠均注射60μl复合物，所述复合物含有溶解于5％葡萄糖中的3μg的pCAGluc、N/P比率为5的PEI600、及N/P比率为5的肽(NL4-10K或10K对照)。3天后收集脊髓腰段和DRG，分析萤光素酶活性。在接近腰部注射部位的脊髓中，NL4-10K介导的转染相对于10K对照组降低。相反，得自PEI600/pCAGluc/NL4-10K介导的DRG中萤光素酶基因表达与PEI600/pCAGluc/10K介导的相比高至2倍(图3)。这些结果表明体内NL4-10K增强基因送递的特殊性质。
实施例22.1DsbC-NL4-10K重组蛋白的设计与重组产生的蛋白质相比，通过化学方法进行肽合成是昂贵的并面临链长度限制。我们希望显示出当掺入至重组蛋白质时，NL4-10K的氨基酸序列仍保留介导TrkA定向基因送递的能力。嵌合蛋白DsbC-NL4-10K(SEQ ID NO6)由附着于DsbC的C末端的NL4-10K组成，DsbC是大肠杆菌二硫键异构酶，其应增强蛋白质稳定性、溶解度和折叠。
质粒构建使用引物D1-a(SEQ ID NO12)和D1-b(SEQ ID NO13)，将编码NL4的DNA序列从含有NGF基因的pcDNA3.1/GS质粒(InvitrogenH-X52599M)中经PCR扩增。下游引物D1-b包括所述10K尾部的符合读框的密码子。这个序列符合读框地插入pET-40b(+)(Invitrogen)的ScaI和HindIII位点之间，这是在DsbC和His6标签的编码序列下游。所述构建体的序列(D1-cSEQ ID NO14)通过常规DNA测序技术证实。
蛋白质表达和纯化将pET-40b(+)-NL4-10K转化进大肠杆菌表达宿主菌株BL21(DE3)中。将新鲜转化的细菌的一个集落悬浮于200μl水中，再次铺板并温育过夜。收集所得菌落并用于接种含有30μg/ml卡那霉素的400ml Luria-Bertani(LB)培养基。在30℃快速摇动5小时后，收获细胞并在冰上在含有1mg/ml鸡卵溶菌酶的20mM Na2HPO4、0.5MNaCl、10mM咪唑、pH 7.9中裂解30分钟。在超声和离心后，将上清通过镍螯合亲和层析在KTAexplorer FPLC(AmershamBiosciences，Buckinghamshire，UK)上纯化。使用1ml HisTrap柱(Amersham Biosciences)，通过增加咪唑浓度进行洗涤和洗脱。收集含有纯化的蛋白质的级分，在4℃用HBS透析。
DsbC-NL4-10K增强鱼精蛋白介导的基因送递至PC12细胞而非COS7细胞DsbC-NL4-10K由于大体积的DsbC结构域而能结合DNA但不能使其完全浓缩。然而，与富含精氨酸的碱性蛋白质鱼精蛋白组合，则DsbC-NL4-10K能定向将基因送递定向至TrkA受体。将在96孔平板中生长的PC12和COS7细胞用三重复合物转染，所述复合物含有0.1μg/孔pCAGluc、0.2μg/孔鱼精蛋白、及各种量的DsbC-NL4-10K。为形成这些三重复合物，首先将鱼精蛋白与DNA混和30分钟，之后加入DsbC-NL4-10K并将混合物在室温再温育30分钟。
在表达TrkA的PC12细胞中，随着DsbC-NL4-10K量增加而表现剂量响应趋势，最大转染效率在蛋白质/DNA(nmol/g)比率为0.3(＝N/P为1)时出现(图4A)。在更高的蛋白质/DNA比率，过量的未结合的DsbC-NL4-10K可引起竞争性抑制或毒性作用。然而，在COS7细胞中，DsbC-NL4-10K不改善基因送递(图4B)，提示在PC12细胞中的增强作用是NGF受体特异性的。
DsbC-NL4-10K预处理抑制DsbC-NL4-10K/DNA/PEI600转染为获得DsbC-NL4-10K介导的基因送递的特殊性质的进一步证据，将PC12细胞与游离DsbC-NL4-10K在转染之前温育30分钟。与用牛血清白蛋白预处理的细胞相比，这种预处理明显降低DsbC-NL4-10K/DNA/PEI600复合物的转染效率(图4C)。相反，用DsbC-NL4-10K或牛血清白蛋白预处理，当使用PEI600/DNA复合物时产生相似的转基因表达。这提示DsbC-NL4-10K介导的基因送递通过受体结合而发生，因为用游离DsbC-NL4-10K预处理使得受体饱和。
实施例3SPKR4NL1-2的设计SPKR4NL1-2(SEQ ID NO7)是一种嵌合蛋白，含有一个在N末端附近的DNA结合结构域SPKRSPKRSPKRSPKR(SEQ ID NO11)，其通过α螺旋接头TYLSEDELKAAEAAFKRHNPT(SEQ ID NO30)与包括NGF的环1和环2的定向结构域连接。组蛋白H1-衍生的DNA结合结构域和所述接头的序列首先由Fortunati等应用(Gene Therapy2000；71505-15)。所述接头侧翼是柔性甘氨酸残基，其使得DNA结合和定向结构域独立起作用。所述定向结构域包含一个Cys残基，后接人NGF的第17-67位氨基酸，从而与相应于NGF中C58的Cys残基可以形成二硫键。基于NGF的晶体结构(Wiesmann et al.，Nature1999；401184-8)，我们判断这种二硫键帮助定向结构域呈现环1和2的天然构象。
质粒构建在先前的研究中(未公布)，我们已经通过PCR介导的基因装配方法(Jayaraman & Puccini，BioTechniques 1992；12(3)392-8)构建了编码(SPKR)4和与第三个结构域连接的α螺旋接头的DNA片段。简要而言，将组成编码链的三个长寡核苷酸(D2-a，D2-b，D2-c，分别为SEQID NO15、16、17)、互补于连接处(junction)的两个短寡核苷酸(D2-d，D2-e分别为SEQ ID NO18、19)及两个末端引物(D2-f，D2-g分别为SEQ ID NO20、21)在一个PCR反应中混和。使用该产物作为模板，将相应于DNA结合结构域和所述接头的序列使用引物D2-h和D2-i(SEQ ID NO22和23)通过PCR扩增。将该PCR产物用NdeI和BamHI消化并连接进被类似消化的pET-16b表达载体(Novagen)中位于His10标签下游，产生pET16-SPKR4linker。将编码全长NGF的DNA序列首先通过PCR扩增人脑cDNA(得自Clontech，Palo Alto，CA，USA)而克隆进TA载体中。将相应于NGF的第17-67位氨基酸的DNA序列使用引物D2-j和D2-k(SEQ ID NO24和25)扩增。这些引物在两端导入BamHI限制位点，使得消化的片段与所述α螺旋接头序列符合读框地连接。另外，正向引物导入上述额外的Cys密码子。检测所述构建体正确的插入方向并通过常规方法测序。编码序列如SEQ IDNO26所述。
蛋白质表达和纯化将用pET16-SPKR4NL1-2转化的大肠杆菌菌株BL21(DE3)pLysS在37℃在LB培养基(含有50μg/ml氨苄青霉素和34μg/ml氯霉素)中强力摇动直至光密度达到0.7。然后在30℃通过加入1mM异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(IPTG，Bio-Rad)诱导重组蛋白表达。随后通过离心90分钟收获细菌并冷冻。将细胞沉淀再悬浮于补加了无EDTA的蛋白酶抑制剂(Calbiochem，San Diego，CA，USA)的裂解缓冲液(20mM Tris-HCl pH 7.9、0.5M NaCl、20mM咪唑)中。将细胞裂解物超声处理直至不再粘性并通过离心澄清。将上清通过镍螯合亲和层析在KTAexplorer FPLC(Amersham Biosciences)上纯化。使用裂解缓冲液平衡的1ml HisTrap柱(Amersham Biosciences)从1.6L培养物中纯化裂解物，通过增加咪唑浓度进行洗涤和洗脱。收集含有纯化的蛋白质的级分并在4℃用蒸馏水透析。
SPKR4NL1-2结合质粒DNASPKR4NL1-2的DNA结合活性在DNA阻滞分析中评价。当与质粒DNA混和时，SPKR4NL1-2降低DNA在电泳条件下通过琼脂糖凝胶的迁移率，表明所述肽已经结合DNA并降低其电荷/质量比(图5A)。
SPKR4NL1-2结合并浓缩DNA的能力也通过测定当插入的溴化乙锭被取代时荧光的猝灭而鉴定。在N/P比率为大约10时荧光急剧下降表明DNA浓缩需要的SPKR4NL1-2量(图5B)。溴化乙锭取代分析与DNA阻滞分析的结果相似。
然而，原子力显微镜分析表明所述肽仅部分浓缩质粒DNA(结果未示出)。当加入PEI600(N/P比率为5)时，形成紧密的纳米颗粒(图5D)。
SPKR4NL1-2增强聚阳离子介导的基因送递至PC12细胞只是由SPKR4NL1-2和DNA组成的复合物具有相对弱的转染效率，但是加入聚阳离子聚合物充分浓缩DNA产生了有效的基因送递系统。根据其DNA浓缩能力和低背景转染效率，选择PEI600和低分子量聚L赖氨酸(PLL，MW 1000)。在48孔平板中，将PC12细胞用含有0.25μg pCAGluc报道质粒、PEI600或PLL(N/P为5)及各种量的SPKR4NL1-2的三重复合物转染。将所述蛋白质加入于Opti-MEM培养基中的DNA中，在室温温育30分钟，之后加入聚阳离子并将混合物进一步温育30分钟。含有PLL的复合物还使用氯喹。
图6A示出PEI600介导的基因转移通过增加SPKR4NL1-2的量而显著增强。使用最高量SPKR4NL1-2的转基因表达比单独使用PEI600的转基因表达高5000倍。相似地，对于PLL介导的基因送递，使用最佳量的SPKR4NL1-2的转染效率比无SPKR4NL1-2的转染效率高1000倍(图6B)。
SPKR4NL1-2介导的基因送递是NGF受体特异性的为确定SPKR4NL1-2介导的基因送递是否是TrkA特异性的，我们研究了在用SPKR4NL1-2/DNA/PEI600复合物转染期间加入NGF(200ng/ml)的作用。从图7可见加入NGF明显降低SPKR4NL1-2/DNA/PEI600的转染效率。然而，当用对照的合成肽(SPKR)4代替SPKR4NL1-2时，NGF预处理无显著作用。由于NGF是SPKR4NL1-2-介导的基因送递的竞争性抑制剂，因此可推断SPKR4NL1-2的作用是定向及受体特异性的。同样，(SPKR)4与SPKR4NL1-2组之间的差异表明使用含有NGF的环L1和L2的多肽导致基因表达增加1400倍。
SPKR4NL1-2特异性介导基因送递至原代神经元培养物对于分离自20天龄大鼠胚胎的表达TrkA的皮质神经元和TrkA缺乏的神经胶质细胞的原代培养物也测试了SPKR4NL1-2对PEI600介导的基因送递的作用。将48孔平板中皮质神经元和神经胶质细胞用含有0.25μg/孔pCAGluc和肽(N/P比率为5)的SPKR4NL1-2/PEI600/DNA或(SPKR)4/PEI600/DNA复合物转染。所述复合物是在Opti-MEM培养基中通过向DNA中加入SPKR4NL1-2、等待30分钟、加入PEI600、在室温再温育30分钟而形成的。
图8示出单独通过PEI600的基因送递在神经元和神经胶质细胞中可忽略不计。当将对照肽(SPKR)4加入所述复合物中时，额外的DNA浓缩能力在这两种类型细胞中均增强转基因表达，但在神经胶质细胞中影响高于在神经元中。然而，含有SPKR4NL1-2的三重复合物在神经元中效力比(SPKR)4三重复合物高9倍，而在神经胶质细胞中SPKR4NL1-2与(SPKR)4之间基本无差异。
SPKR4NL1-2介导基因送递至背根神经节为评价在体内SPKR4NL1-2介导的转染效率，将基因送递复合物经鞘内注射进Wistar大鼠的腰部。所述复合物是在5％葡萄糖中以上述顺序形成的，用20μl体积的4μg pCAGluc、PEI600(N/P比率为5)及32nmol肽注射每只大鼠。3天后解剖含有表达TrkA的神经元的腰部DRG，分析萤光素酶活性。SPKR4NL1-2/PEI600/pCAGluc复合物所致转基因表达是PEI600/pCAGluc对照组的9倍(图9)。
实施例4SPKR4BL1-2的设计嵌合蛋白SPKR4BL1-2(SEQ ID NO8)的设计与SPKR4NL1-2相似，其中定向结构域通过掺入BDNF而不是NGF的环1和环2被改变，从而结合TrkB。这个定向结构域由一个Cys残基后接人BDNF的第22-74位氨基酸组成，由此与BDNF的C65形成分子内二硫键。所述二硫键和环-侧翼β折叠用于稳定受体结合环的构象。在C末端的定向结构域与N末端附近的(SPKR)4DNA结合结构域被一个α-螺旋接头TYLSEDELKAAEAAFKRHNPT间隔。
质粒构建在构建编码SPKR4NL1-2的质粒期间，产生含有DNA结合结构域和α-螺旋接头的编码序列的中间质粒pET16-SPKR4linker。恰位于接头序列3’端的独特的BamHI限制位点使得定向结构域插入。使用引物D3-a和D3-b(SEQ ID NO27和28)，从携带克隆自人脑cDNA文库(Clontech)的BDNF基因的质粒中扩增编码BDNF的环1和2的序列。这个引物对在每一端均导入BamHI位点以符合读框地连接进pET16-SPKR4linker。检测所得构建体的正确插入方向并送出进行序列确认。pET16-SPKR4BL1-2的编码序列如SEQ ID NO29所示。
蛋白质表达和纯化将携带pET16-SPKR4BL1-2质粒的大肠杆菌菌株BL21(DE3)pLysS在37℃在摇瓶中的LB培养基(含有50μg/ml氨苄青霉素和34μg/ml氯霉素)中培养直至光密度达到0.7。在等待15分钟使培养瓶冷却后将培养瓶移至室温摇床并用1mM IPTG诱导。随后细菌通过离心90分钟沉淀并冷冻。将细胞解冻并在1/10培养体积的具有无EDTA的蛋白酶抑制剂(Roche Applied Science，Penzberg，Germany)的50mM Na2HPO4、1M NaCl、10mM咪唑、0.1％TritonX-100、pH 8.0中裂解。将裂解物超声处理直至不再粘性并通过离心澄清。SPKR4BL1-2通过在KTAexplorer FPLC(AmershamBiosciences)上经镍螯合亲和层析从上清中纯化。对于1.6L培养物，将4ml Ni-NTA Superflow(Qiagen，Hilden，Germany)树脂在50mMNa2HPO4、0.3M NaCl、10mM咪唑、pH 8.0中平衡，通过增加咪唑浓度进行洗涤和洗脱。收集含有纯化的蛋白质的级分，在4℃用蒸馏水透析并浓缩。
SPKR4BL1-2结合并浓缩DNASPKR4BL1-2结合DNA的能力通过DNA阻滞分析检测。图10A示出在N/P比率为2(等于0.8nmol/μg DNA)时，SPKR4BL1-2能完全阻止DNA电泳迁移。原子力显微镜分析(图10B-10D)也表明N/P比率为10时，SPKR4BL1-2能将质粒DNA浓缩为直径200nm以下的粒子。
SPKR4BL1-2介导基因送递至皮质神经元和神经胶质细胞由于没有可商购的表达TrkB的细胞系，因此在体外测试SPKR4BL1-2对得自20天龄大鼠胚胎皮质神经元和神经胶质细胞原代培养物的转染能力。熟知皮质神经元表达全长TrkB受体。长期以来认为星形胶质细胞仅表达TrkB的截短异构体，但Climent et al.(Neurosci.Letters 2000；28853-56)示出其也表达一些全长TrkB。
将48孔平板中的皮质神经元用SPKR4BL1-2/PEI600/DNA复合物转染，所述复合物含有每孔0.25μgpCAGluc。所述复合物是在5％葡萄糖中通过向DNA中加入SPKR4BL1-2、等待30分钟、加入PEI600、并在室温再温育30分钟而产生的。对于N/P比率固定为10的PEI600，增加SPKR4BL1-2的量显著增加转基因表达，在所用最高比率可达到500倍(图11A)。也表明PEI600对于有效转染不是必需的。
在对神经胶质细胞的实验中，不使用三重复合物。将0.25μg/孔pCAGluc与SPKR4BL1-2或PEI600复合(不是与这两者同时复合)。当使用更多的SPKR4BL1-2时，基因送递愈加有效，转基因表达达到裸DNA的180倍，及达到PEI600/DNA的50倍(图11B)。
实施例55.1NL4-10K激活TrkA及其信号传导途径NGF结合并诱导TrkA的磷酸化，其反过来激发信号传导级联(signal cascades)产生NGF的生物活性。所包含的蛋白质包括Erk1和Erk2、部分Ras-MAP激酶途径、及Akt，Akt在细胞存活中起重要作用(Sofroniew et al.，Annu.Rev.Neurosci.2001；241217-281)。在用5μM NL4-10K或NL4处理20分钟的PC12细胞中TrkA、Erk1、Erk2和Akt的激活通过使用特异性识别磷酸化异构体的抗体进行免疫印迹而检测。如图12A所示，NL4和NL4-10K处理诱导TrkA、Erk1和Erk2、及Akt激活。另外，当与DNA复合时，NL4-10K保留其活性。
为进一步评价NL4(加入或不加入10K)通过TrkA起作用的假说，使用两种抑制剂K-252a和AG879阻断TrkA蛋白质酪氨酸激酶活性。正如所期望的，用这些抑制剂预处理显著降低NL4-和NL4-10K诱导的Erk1和Erk2的磷酸化程度(图12B)。这些生物化学分析表明NL4(有或无10K结构域)可通过TrkA起作用以激活与NGF激活的相同的一些信号转导途径。
5.2NL4-10K促进撤除血清的PC12细胞存活NGF的促进存活的生物活性的一个表现是其促进在无血清培养基中生长的PC12细胞的存活，否则此生长条件导致细胞生存能力丧失。将分化的PC12细胞在含有各种浓度NL4或NL4-10K的无血清培养基中生长。将通过MTT分析测定的细胞存活率与NGF(10ng/ml，最佳浓度)促进的存活率相对比。在0.125-2.5μM浓度范围内，增加的NL4浓度导致细胞存活率增加至最佳NGF促进的存活率的68-109％(图13)。对于NL4-10K在0.125-5μM之间观测到相似的剂量响应。
5.3SPKR4NL1-2激活TrkA及其信号传导途径将6孔平板中的PC12细胞用浓度为1-8μM的SPKR4NL1-2处理15分钟。在所有这些浓度，SPKR4NL1-2诱导比8μM的(SPKR)4对照肽诱导的更高水平的Erk1和Erk2激活(图14B)。为示出Erk激活是通过TrkA磷酸化特异性发生的，将细胞用K-252a TrkA酪氨酸激酶抑制剂预处理以观测Erk磷酸化是否降低。图14C示出由8μMSPKR4NL1-2诱导的Erk磷酸化降低，并且最终随着K-252a浓度增加而消除。
5.4SPKR4NL1-2促进PC12细胞中神经突生长应答NGF，PC12细胞停止增殖并分化为交感神经元样细胞。在NGF处理的2-3天内，可以见到细胞形态改变和神经突从细胞突出。我们测试了SPKR4NL1-2以观察其是否也促进PC12细胞中神经突生长。将所述细胞用8μM(SPKR)4或SPKRR4NL1-2处理3天。对比(SPKR)4处理的细胞(图15A)与SPKR4NL1-2处理的细胞(图15B)的照片，可以看出SPKR4NL 1-2具有NGF样生物活性并促进神经突生长。
5.5SPKR4NL1-2促进撤除血清的PC12细胞存活我们还评价了SPKR4NL1-2促进撤除了血清和NGF3天的PC12细胞的存活能力。向无血清培养基中加入SPKR4NL1-2(8μM)使PC12存活率保持在由20ng/ml NGF促进的最大存活率的80％(图15C)。所述存活促进作用在2-8μM SPKR4NL1-2范围内呈现剂量响应趋势。
序列表<110>新加坡科技研究局<120>用于神经营养蛋白受体介导的基因送递及作为神经营养蛋白激动剂的重组多肽<130>93231-8<160>31<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>119<212>PRT<213>Nerve growth factor(NGF)from human<400>1Ser Ser Ser His Pro Ile Phe His Arg Gly Glu Phe Ser Val Cys Asp1 5 10 15Ser Val Ser Val Trp Val Gly Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys20 25 30Gly Lys Glu Val Met Val Leu Gly Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser Val35 40 45Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu Thr Lys Cys Arg Asp Pro Asn Pro Val50 55 60Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile Asp Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys65 70 75 80Thr Thr Thr His Thr Phe Val Lys Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys Gln85 90 95Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Leu100 105 110Ser Arg Lys Ala Val Arg Arg115<210>2<211>126<212>PRT<213>Brain-derived neurotrophic factor(BDNF)from human
<400>2His Ser Asp Pro Ala Arg Arg His Ser Asp Pro Ala Arg Arg Gly Glu1 5 10 15Leu Ser Val Cys Asp Ser Ile Ser Glu Trp Val Thr Ala Ala Asp Lys20 25 30Lys Thr Ala Val Asp Met Ser Gly Gly Thr Val Thr Val Leu Glu Lys35 40 45Val Pro Val Ser Lys Gly Gln Leu Lys Gln Tyr Phe Tyr Glu Thr Lys50 55 60Cys Asn Pro Met Gly Tyr Thr Lys Glu Gly Cys Arg Gly Ile Asp Lys65 70 75 80Arg His Trp Asn Ser Gln Cys Arg Thr Thr Gln Ser Tyr Val Arg Ala85 90 95Leu Thr Met Asp Ser Lys Lys Arg Ile Gly Trp Arg Phe Ile Arg Ile100 105 110Asp Thr Ser Cys Val Cys Thr Leu Thr Ile Lys Arg Gly Arg115 120 125<210>3<211>119<212>PRT<213>Neurotrophin 3(NT3)from human<400>3Tyr Ala Glu His Lys Ser His Arg Gly Glu Tyr Ser Val Cys Asp Ser1 5 10 15Glu Ser Leu Trp Val Thr Asp Lys Ser Ser Ala Ile Asp Ile Arg Gly20 25 30His Gln Val Thr Val Leu Gly Glu Ile Lys Thr Gly Asn Ser Pro Val35 40 45Lys Gln Tyr Phe Tyr Glu Thr Arg Cys Lys Glu Ala Arg Pro Val Lys50 55 60
Asn Gly Cys Arg Gly Ile Asp Asp Lys His Trp Asn Ser Gln Cys Lys65 70 75 80Thr Ser Gln Thr Tyr Val Arg Ala Leu Thr Ser Glu Asn Asn Lys Leu85 90 95Val Gly Trp Arg Trp Ile Arg Ile Asp Thr Ser Cys Val Cys Ala Leu100 105 110Ser Arg Lys Ile Gly Arg Thr115<210>4<211>130<212>PRT<213>Neurotrophin 4/5(NT4/5)from human<400>4Gly Val Ser Glu Thr Ala Pro Ala Ser Arg Arg Gly Glu Leu Ala Val1 5 10 15Cys Asp Ala Val Ser Gly Trp Val Thr Asp Arg Arg Thr Ala Val Asp20 25 30Leu Arg Gly Arg Glu Val Glu Val Leu Gly Glu Val Pro Ala Ala Gly35 40 45Gly Ser Pro Leu Arg Gln Tyr Phe Phe Glu Thr Arg Cys Lys Ala Asp50 55 60Asn Ala Glu Glu Gly Gly Pro Gly Ala Gly Gly Gly Gly Cys Arg Gly65 70 75 80Val Asp Arg Arg His Trp Val Ser Glu Cys Lys Ala Lys Gln Ser Tyr85 90 95Val Arg Ala Leu Thr Ala Asp Ala Gln Gly Arg Val Gly Trp Arg Trp100 105 110Ile Arg Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Thr Leu Leu Ser Arg Thr Gly115 120 125Arg Ala130
<210>5<211>39<212>PRT<213>artificial<220>
<223>NL4-10K<220>
<223>residues 1-29 correspond to residues 80-108 of nerve growth factor(NGF)and include loop 4 a known receptor binding region<220>
<223>C1 and C29 form a disulfide bridge<220>
<223>residues 30-39 form a nucleic acid binding domain<400>5Cys Thr Thr Thr His Thr Phe Val Lys Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys1 5 10 15Gln Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ala Cys Lys Lys Lys20 25 30Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys35<210>6<211>297<212>PRT<213>artificial<220>
<223>DsbC-NL4-10K<220>
<223>residues 1-236DsbC<220>
<223>residues 244-249His6 tag<220>
<223>residues 259-297NL4-10K<400>6Met Lys Lys Gly Phe Met Leu Phe Thr Leu Leu Ala Ala Phe Ser Gly1 5 10 15
Phe Ala Gln Ala Asp Asp Ala Ala Ile Gln Gln Thr Leu Ala Lys Met20 25 30Gly Ile Lys Ser Ser Asp Ile Gln Pro Ala Pro Val Ala Gly Met Lys35 40 45Thr Val Leu Thr Asn Ser Gly Val Leu Tyr Ile Thr Asp Asp Gly Lys50 55 60His Ile Ile Gln Gly Pro Met Tyr Asp Val Ser Gly Thr Ala Pro Val65 70 75 80Asn Val Thr Asn Lys Met Leu Leu Lys Gln Leu Asn Ala Leu Glu Lys85 90 95Glu Met Ile Val Tyr Lys Ala Pro Gln Glu Lys His Val Ile Thr Val100 105 110Phe Thr Asp Ile Thr Cys Gly Tyr Cys His Lys Leu His Glu Gln Met115 120 125Ala Asp Tyr Asn Ala Leu Gly Ile Thr Val Arg Tyr Leu Ala Phe Pro130 135 140Arg Gln Gly Leu Asp Ser Asp Ala Glu Lys Glu Met Lys Ala Ile Trp145 150 l55 160Cys Ala Lys Asp Lys Asn Lys Ala Phe Asp Asp Val Met Ala Gly Lys165 170 175Ser Val Ala Pro Ala Ser Cys Asp Val Asp Ile Ala Asp His Tyr Ala180 185 190Leu Gly Val Gln Leu Gly Val Ser Gly Thr Pro Ala Val Val Leu Ser195 200 205Asn Gly Thr Leu Val Pro Gly Tyr Gln Pro Pro Lys Glu Met Lys Glu210 215 220Phe Leu Asp Glu His Gln Lys Met Thr Ser Gly Lys Gly Ser Thr Ser225 230 235 240Gly Ser Gly His His His His His His Ser Ala Gly Leu Val Pro Arg
245 250 255Gly Ser Cys Thr Thr Thr His Thr Phe Val Lys Ala Leu Thr Met Asp260 265 270Gly Lys Gln Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ala Cys Lys275 280 285Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys290 295<210>7<211>115<212>PRT<213>artificial<220>
<223>SPKR4NL1-2<220>
<223>residues 3-12His10 tag<220>
<223>residues 23-38(SPKR)4 DNA-binding domain<220>
<223>residues 41-61alpha-helical linker<220>
<223>residues 65-115 correspond to aa 17-67 of human NGF，includingloops 1 and 2 and the flanking beta-sheet sequences<220>
<223>C64 and C106 form a disulfide bridge<400>7Met Gly His His His His His His His His His His Ser Ser Gly His1 5 10 15Ile Glu Gly Arg His Met Ser Pro Lys Arg Ser Pro Lys Arg Ser Pro20 25 30Lys Arg Ser Pro Lys Arg Gly Gly Thr Tyr Leu Ser Glu Asp Glu Leu35 40 45Lys Ala Ala Glu Ala Ala Phe Lys Arg His Asn Pro Thr Gly Ser Cys50 55 60
Ser Val Ser Val Trp Val Gly Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys65 70 75 80Gly Lys Glu Val Met Val Leu Gly Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser Val85 90 95Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu Thr Lys Cys Arg Asp Pro Asn Pro Val100 105 110Asp Ser Gly115<210>8<211>117<212>PRT<213>artificial<220>
<223>SPKR4BL1-2<220>
<223>residues 3-12His10 tag<220>
<223>residues 23-38(SPKR)4 DNA-binding domain<220>
<223>residues 41-61alpha-helical linker<220>
<223>residues 65-117 correspond to aa 22-74 of human BDNF，includingloops 1 and 2 and the flanking beta-sheet sequences<220>
<223>C64 and C108 form a disulfide bridge<400>8Met Gly His His His His His His His His His His Ser Ser Gly His15 10 15Ile Glu Gly Arg His Met Ser Pro Lys Arg Ser Pro Lys Arg Ser Pro20 25 30Lys Arg Ser Pro Lys Arg Gly Gly Thr Tyr Leu Ser Glu Asp Glu Leu35 40 45Lys Ala Ala Glu Ala Ala Phe Lys Arg His Asn Pro Thr Gly Ser Cys50 55 60
Ser Ile Ser Glu Trp Val Thr Ala Ala Asp Lys Lys Thr Ala Val Asp65 70 75 80Met Ser Gly Gly Thr Val Thr Val Leu Glu Lys Val Pro Val Ser Lys85 90 95Gly Gln Leu Lys Gln Tyr Phe Tyr Glu Thr Lys Cys Asn Pro Met Gly100 105 110Tyr Thr Lys Glu Gly115<210>9<211>29<212>PRT<213>Nerve growth factor(NGF)from human<400>9Cys Thr Thr Thr His Thr Phe Val Lys Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys1 5 10 15Gln Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ala Cys20 25<210>10<211>10<212>PRT<213>artificial<220>
<223>artificial sequencelysine 10<400>10Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys1 5 10<210>11<211>16<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>artificial sequenceSPKR4<400>11Ser Pro Lys Arg Ser Pro Lys Arg Ser Pro Lys Arg Ser Pro Lys Arg
1 5 10 15<210>12<211>18<212>DNA<213>artificial<220>
<223>forward primer for NL4-10K<400>12tgtaccacga ctcacacc 18<210>13<211>59<212>DNA<213>artificial<220>
<223>reverse primer for NL4-10K<400>13gcaagctttc attttttttt tttttttttt tttttttttt tacaggccgt atctatccg 59<210>14<211>894<212>DNA<213>artificial<220>
<223>Coding sequence for DsbC-NL4-10K<400>14atgaagaaag gttttatgtt gtttactttg ttagcggcgt tttcaggctt tgctcaggct 60gatgacgcgg caattcaaca aacgttagcc aaaatgggca tcaaaagcag cgatattcag120cccgcgcctg tagctggcat gaagacagtt ctgactaaca gcggcgtgtt gtacatcacc180gatgatggta aacatatcat tcaggggcca atgtatgacg ttagtggcac ggctccggtc240aatgtcacca ataagatgct gttaaagcag ttgaatgcgc ttgaaaaaga gatgatcgtt300tataaagcgc cgcaggaaaa acacgtcatc accgtgttta ctgatattac ctgtggttac360tgccacaaac tgcatgagca aatggcagac tacaacgcgc tggggatcac cgtgcgttat420cttgctttcc cgcgccaggg gctggacagc gatgcagaga aagaaatgaa agctatctgg480tgtgcgaaag ataaaaacaa agcgtttgat gatgtgatgg caggtaaaag cgtcgcacca540gccagttgcg acgtggatat tgccgaccat tacgcacttg gcgtccagct tggcgttagc600ggtactccgg cagttgtgct gagcaatggc acacttgttc cgggttacca gccgccgaaa660
gagatgaaag aatttctcga cgaacaccaa aaaatgacca gcggtaaagg atcaactagt720ggttctggtc atcaccatca ccatcactcc gcgggtctgg tgccacgcgg tagttgtacc780acgactcaca cctttgtcaa ggcgctgacc atggatggca agcaggctgc ctggcggttt840atccggatag atacggcctg taaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa atga 894<210>15<211>59<212>DNA<213>artificial<220>
<223>First of three long oligonucleotides used in assembly of asequence encoding(SPKR)4 and an a-helix linker<400>15cgcagtacta gtccgaaacg cagcccgaaa cgtagcccaa agcgtagccc gaagcgtgg59<210>16<211>59<212>DNA<213>artificial<220>
<223>Second of three long oligonucleotides used in assembly of asequence encoding(SPKR)4 and an a-helix linker<400>16cggtacctac ctgtctgaag atgagctgaa agcggcggag gcggcattca aacgtcaca59<210>17<211>57<212>DNA<213>artificial<220>
<223>Third of three long oligonucleotides used in assembly of asequence encoding(SPKR)4 and an a-helix linker<400>17acccgactgg atccggttgt gtgcctgtgt ctaaaggtca actgtgctaa gcttggc57<210>18<211>20<212>DNA<213>artificial<220>
<223>First bridging oligonucleotide used in assembly of a sequenceencoding(SPKR)4 and an a-helix linker
<400>18gtaggtaccg ccacgcttcg20<210>19<211>20<212>DNA<213>artificial<220>
<223>Second bridging oligonucleotide used in assembly of a sequenceencoding(SPKR)4 and an a-helix linker<400>19ccagtcgggt tgtgacgttt20<210>20<211>20<212>DNA<213>artificial<220>
<223>artificial primer<400>20cgcagtacta gcccgaaacg20<210>21<211>20<212>DNA<213>artificial<220>
<223>artificial primer<400>21gccaagctta gcacagttga20<210>22<211>25<212>DNA<213>artificial<220>
<223>artificial primer<400>22ccagacatat gagtccgaaa cgcag 25<210>23<211>20<212>DNA
<213>artificial<220>
<223>artificial primer<400>23ccggatccag tcgggttgtg20<210>24<211>26<212>DNA<213>artificial<220>
<223>artificial primer<400>24ctggatcctg cagtgtcagc gtgtgg 26<210>25<211>24<212>DNA<213>artificial<220>
<223>artificial primer<400>25atggatcctc acccgctgtc aacg 24<210>26<211>348<212>DNA<213>artificial<220>
<223>Coding sequence of SPKR4NL1-2<400>26atgggccatc atcatcatca tcatcatcat catcacagca gcggccatat cgaaggtcgt60catatgagtc cgaaacgcag cccgaaacgt agcccaaagc gtagcccgaa gcgtggcggt 120acctacctgt ctgaagatga gctgaaagcg gcggaggcgg cattcaaacg tcacaacccg 180actggatcct gcagtgtcag cgtgtgggtt ggggataaga ccaccgccac agacatcaag 240ggcaaggagg tgatggtgtt gggagaggtg aacattaaca acagtgtatt caaacagtac 300ttttttgaga ccaagtgccg ggacccaaat cccgttgaca gcgggtga348<210>27<211>31
<212>DNA<213>artificial<220>
<223>artificial primer<400>27ctggatcctg cagtattagt gagtgggtaa c 31<210>28<211>29<212>DNA<213>artificial<220>
<223>artificial primer<400>28atggatcctc agccttcttt tgtgtaacc 29<210>29<211>354<212>DNA<213>artificial<220>
<223>Coding sequence for SPKR4BL1-2<400>29atgggccatc atcatcatca tcatcatcat catcacagca gcggccatat cgaaggtcgt 60catatgagtc cgaaacgcag cccgaaacgt agcccaaagc gtagcccgaa gcgtggcggt120acctacctgt ctgaagatga gctgaaagcg gcggaggcgg cattcaaacg tcacaacccg180actggatcct gcagtattag tgagtgggta acggcggcag acaaaaagac tgcagtggac240atgtcgggcg ggacggtcac agtccttgaa aaggtccctg tatcaaaagg ccaactgaag300caatacttct acgagaccaa gtgcaatccc atgggttaca caaaagaagg ctga 354<210>30<211>21<212>PRT<213>artificial<220>
<223>H1 alpha helix<400>30Thr Tyr Leu Ser Glu Asp Glu Leu Lys Ala Ala Glu Ala Ala Phe Lys1 5 10 15
Arg His Asn Pro Thr20<210>31<211>120<212>DNA<213>artificial<220>
<223>NL4-10K coding sequence<400>31tgtaccacga ctcacacctt tgtcaaggcg ctgaccatgg atggcaagca ggctgcctgg 60cggtttatcc ggatagatac ggcctgtaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaatga120
权利要求
1.一种重组多肽，其包含一种细胞定向元件和一种核酸结合元件，其中所述细胞定向元件是选择性结合神经营养蛋白受体的发夹基序。
2.权利要求1的多肽，其中所述细胞定向元件是神经营养蛋白的发夹基序或其功能等价物。
3.权利要求2的多肽，其中所述神经营养蛋白是神经生长因子(NGF)、脑衍生神经营养因子(BDNF)、神经营养蛋白3(NT3)或神经营养蛋白4/5(NT4/5)。
4.权利要求1-3任一项的多肽，其包含a)人NGF(SEQ ID NO1)的第26-38位、第41-49位、第17-57位、第69-79位或第81-107位氨基酸；b)人BDNF(SEQ ID NO2)的第33-45位、第48-56位、第22-64位、第76-86位或第88-115位氨基酸；c)人NT3(SEQ ID NO3)的第25-37位、第40-48位、第16-56位、第68-78位或第80-107位氨基酸；d)人NT4/5(SEQ ID NO4)的第28-40位、第43-52位、第19-60位、第79-89位或第91-118位氨基酸；或者其功能等价物。
5.权利要求1-4任一项的多肽，其中所述神经营养蛋白受体是TrkA、TrkB、TrkC或P75NTR。
6.权利要求5的多肽，其中所述受体是TrkA。
7.权利要求1-6任一项的多肽，其包含人NGF(SEQ ID NO1)的第17-67位氨基酸、人NGF(SEQ ID NO1)的第80-108位氨基酸、或者人BDNF(SEQ ID NO2)的第22-64位氨基酸。
8.权利要求1-7任一项的多肽，其中所述核酸结合元件是DNA结合元件。
9.权利要求8的多肽，其中所述DNA结合元件是非特异性DNA结合元件。
10.权利要求8或9的多肽，其中所述DNA结合元件是带正电荷的。
11.权利要求10的多肽，其中所述非特异性DNA结合元件是(SPKR)4结构域或者聚L-赖氨酸。
12.权利要求11的多肽，其中所述聚L-赖氨酸是十-L-赖氨酸。
13.权利要求1-12任一项的多肽，其进一步包含在所述发夹基序的氨基和羧基末端的半胱氨酸。
14.权利要求1-13任一项的多肽，其包含在所述核酸结合元件与所述细胞定向元件之间的一个接头序列。
15.权利要求1-14任一项的多肽，其包含SEQ ID NO5、SEQ IDNO6、SEQ ID NO7或SEQ ID NO8所示序列。
16.权利要求7-14任一项的多肽，其是神经营养蛋白激动剂。
17.权利要求16的多肽，其包含SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO7或SEQ ID NO8所示序列。
18.编码权利要求1-17任一项的重组多肽的重组核酸分子。
19.权利要求18的重组核酸分子，其中所述核酸是DNA。
20.权利要求19的重组核酸，其包含SEQ ID NO14、SEQ IDNO26、SEQ ID NO29或SEQ ID NO31所示序列。
21.权利要求18-20任一项的重组核酸分子，其是一种表达载体。
22.一种包含核酸和权利要求1-17任一项的重组多肽的组合物。
23.权利要求22的组合物，其中所述核酸是DNA。
24.权利要求23的组合物，其中所述DNA包含一种编码基因序列。
25.权利要求24的组合物，其中所述编码基因序列是一种治疗性基因序列。
26.权利要求22-25任一项的组合物，其进一步包含一种阳离子聚合物。
27.权利要求26的组合物，其中所述阳离子聚合物是聚赖氨酸、聚乙烯亚胺或鱼精蛋白。
全文摘要
本发明提供了一种新的重组多肽，其包含一种核酸结合元件及与一种神经营养蛋白受体结合的发夹基序。所述重组多肽可用于与其结合的核酸，包括治疗性DNA的神经营养蛋白受体介导的送递。在一个实施方案中，所述发夹基序是神经营养蛋白如神经生长因子、脑衍生神经营养因子、神经营养蛋白3和神经营养蛋白4/5的发夹基序。所述发夹基序也是一种神经营养蛋白激动剂，因此可用于治疗对神经营养蛋白治疗有反应的任何疾病，如神经系统疾病和肿瘤。在一个实施方案中，所述激动剂包含一种选择性结合神经营养蛋白受体的发夹基序及一种据信通过与带负电的细胞膜结合而增强受体结合的带正电的结合结构域。
文档编号A61K38/12GK1852980SQ200480024797
公开日2006年10月25日 申请日期2004年8月25日 优先权日2003年8月28日
发明者王朔, 吴珊珊, 曾洁铭, 马楠 申请人:新加坡科技研究局