专利名称：精选氨基酸锌复合物作为抗疟疾的应用的制作方法
技术领域：
本发明提供了精选氨基酸与氯化锌、乙酸锌或其他药物上可接受的锌盐的锌复合物的应用，其中该氨基酸选自脯氨酸、赖氨酸、组氨酸、甘氨酸、精氨酸及色氨酸的D或L异构体或它们的各种羟基、氨基、烷基及羧基衍生物。该化合物的应用包括给药有效量的所述化合物用于抑制疟疾寄生虫(恶性疟原虫(Plasmodium falciparum))的生长。这些化合物在红细胞(RBC)培养中对寄生虫是致命的，但是对红细胞没有影响。该化合物对氯喹抗性株-W2Mef也表现出活性。该化合物对于3D7和W2Mef株的剂量反应曲线是完全相同的，这就有力地表明该化合物对抵抗相独立的氯喹抗性、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)领域具有相同的效果。该化合物通过杀死目标来作用于W2Mef株。
背景及现有技术疟疾是一种重要的热带寄生疾病。相对地，除了肺结核以外，它杀死了比任何其它传染病多的人。每年，约3亿～4亿人会与疟疾寄生虫相接触，而据报道，每年约有170万人死于疟疾。由于寄生虫具有包括两个宿主人及蚊子的复杂生命周期，因此疟疾代表现代医学所面临最棘手的挑战，还没有出现疟疾疫苗。在发展中国家，特别在非洲，疟疾造成大量人失去生命，并带来严重的经济及医疗费用。人类中的病原体是四种由蚊子产生的单细胞寄生虫。其中，认为寄生虫恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)是主要致命传染病。
目前全球情况如今，在人口总数为24亿(约占世界人口的40％)的90多个国家中，疟疾已成为一个严重的公共健康问题，每年，据估计，世界范围的疾病的流行，为大约3～5亿个临床病例。超过90％的疟疾病例在撒哈拉沙漠以南的非洲。据估计，每年因该病而死亡的人超过100万。这些死亡大多数发生在非洲的年轻的孩子中，特别是在僻远的、健康服务差的农村中。随着对现有多数抗疟疾药抗药性的产生与传播，需要开发新的抗疟疾药。
抗疟疾药物的现状氯喹(一种抵抗所有三日疟原虫(Plasmodium malariae)、卵形疟原虫(P.ovale)、以及恶性疟原虫(P.falciparum)的不成熟配子细胞感染的快速杀裂殖体剂，且对肝内的形式没有作用)，氨酚喹(一种退热及消炎药物，在清除血液中的寄生虫以增进临床的快速康复方面比氯喹有效)，磺胺多辛-乙胺嘧啶(抗恶性疟原虫(P.falciparum)高活性血液杀裂殖体剂，但抗其它疟原虫种(Plasmodium sp)的效果差)，氯胍(一种人工合成的嘧啶的双胍洐生物，在恶性疟原虫(P.falciparum)、间日疟原虫(P.vivax)以及卵形疟原虫(P.ovale)的初级组织阶段具有显著的效果)，甲氟喹(一种抗恶性疟原虫(P.falciparum)的有效长效杀裂殖体剂血液，且在抗间日疟原虫(P.vivax)及三日疟原虫(P.malariae)上有高效活性，它不是杀细胞的(gamatocytocidal)，并且对疟疾寄生虫的肝阶段没有活性)，奎宁(对于能抗氯喹及磺胺多辛—乙胺嘧啶组合的恶性疟原虫(P.falciparum)是一种合理的选择。它广泛用于东南亚)，卤泛曲林(一种对所有疟疾寄生虫均有效的杀裂殖体剂，特别是对氯喹及磺胺药物有抗药性的恶性疟原虫(P.falciparum)，但是由于它的高成本、变化的生物实用性以及心脏毒性，所以它在控制疟疾中没有应用空间)，青蒿素(从中国黄花蒿(Artemisia annua)中提取的，且对间日疟原虫(P.vivax)及对氯喹及磺胺药物—乙胺嘧啶有抗药性的恶性疟原虫(P.falciparum)有效。青蒿素及其洐生物蒿甲醚及青蒿琥酯(Artesunata)是最快速有效的抗疟疾药物)。
印度绿贝(贻贝(Perna virdis))是廉价的蛋白质来源，并且认为是一种美食。从绿贝中通过酶酸水解过程制备的提取物，表现出包括抗疟疾活性的各种生物活性。已经做过尝试，去纯化表现出对疟疾寄生虫(恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)及伯氏疟原虫(P.berghei))的生长有抑制作用的活性抗疟疾化合物。通过如HPLC、凝胶过滤及TLC等色谱法的结合，使该粗提取物得到提纯。继续采用活性引导分馏手段，直至活性成分提纯为均一的，并且确定出其结构。确认该提纯的化合物保持上述活性。通过NMR及LC-MS/MS技术鉴定该活性化合物。用已知的方法来合成该活性化合物，并且证实其生物活性。本专利特别描述了该化合物及其抗疟疾活性。
锌离子是一种从人体内的每个细胞中均可以找到的基本元素。它们在生物系统的调节和催化活性中起关键作用。它是200多种酶中的必需组分，并且高度集中在红、白血细胞中。它调节各种激素的活性，如生长激素和性激素。
氯喹抗药性1989年在巴布亚岛、新几内亚岛，首次记载了间日疟原虫(P.vivax)对氯喹的抗药性，且如今在印度尼西亚和缅甸被确认。在恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)对氯喹的抗药性广泛同时发生的领域，才会报道这样的发生。氯喹抗药性的恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)株是1957年在泰国首次被怀疑的，而于1960年的泰国和哥伦比亚的患者中被发现。在东南亚、南亚、大洋洲亚马逊河流域及部分南美洲的沿海地区，均报道了高氯喹抗药性的恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)株。1979年，在非洲的坦桑尼亚，首次描述了氯喹抗药性，而在最近的20年中它被传播和强化。在东非及埃塞俄比亚经历了对氯喹的高抗药性，但在中部及南部非洲只记录了中等水平的抗药性。多种药物抗药性的寄生虫株的出现使情况恶化。疟疾如今又在以前已得到控制或根除的地方再次出现，如塔吉克斯坦及阿塞拜疆中亚共和国和韩国。
成本效率指数根据1997年的预测，在撒哈拉沙漠以南的非洲的疟疾的直接或间接费用超过二十亿美元。根据联合国儿童基金会(UNICEF)，每个非洲国家在用于疟疾控制过程中的平均费用估计至少为每年$300,000。这个数字对于五百万人口的国家来讲，每个人约6美分($0.06)。
新引导分子的特点粗提取物是从发现于印度果阿海水中的、属于贻贝科(Mytilidae)的贝类中，采用酶-酸水解过程提取的。该贝类属于包含棕贝、绿贝及其它相关贝类的科。从属于该科的贝类的提取物，至少在对人类红细胞中的恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)的体外培养检测中，最初表现出潜在的抗疟疾活性。这就引导向分离、并鉴定有抗疟疾活性的分子实体进行努力。在本研究中，接下来采用活性引导的分馏法策略，其中采用了各种色谱步骤。这包含使用一定范围的色谱柱(疏水的、选择性吸收、离子交换等)的高效液相色谱(HPLC)，预备的薄膜色谱法，选择性衍生作用及凝胶过滤色谱法。在应用恶性疟原虫培养的体外研究中，每一步都要对活性的选择性浓缩进行监控。经过这样的努力，其结果是最终确定了可独立表现出抗疟疾活性的活性化合物。接下来是对化合物的化学结构进行结构说明。所说明的结构也是独立有效且有力的。该化合物标被记为PIZ2。
发明目的本发明的主要目的是研究有抗疟疾活性的氨基酸与氯化锌、乙酸锌或其他药物上可接受的锌盐的锌复合物的应用，其中该氨基酸选自脯氨酸、赖氨酸、组氨酸、甘氨酸、精氨酸及色氨酸的D或L异构体或它们的各种羟基、氨基、烷基、及羧基衍生物。
本发明的另一目的，是提供一种精选氨基酸锌复合物的可选择的抗疟疾药物，特别用于抵抗选自间日疟原虫(P.vivax)、卵形疟原虫(P.ovale)、三日疟原虫(Plasmodium malariae)、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、P.bergei及其他已知疟原虫的组中的疟原虫种(Plasmodium species)。
本发明的另一目的，是提供可选择抗疟疾药物的用途，其用于选自包含间日疟原虫、卵形疟原虫(P.ovale)、三日疟原虫(Plasmodium malariae)、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、P.bergei及其他已知疟原虫的组的抗药疟原虫寄生虫。
本发明的另一目的，是提供了一种通过对哺乳动物，优选人类给药精选氨基酸和氯化锌、乙酸锌或其他药物上可接受的锌盐的锌复合物，以治疗和预防疟疾的方法，其中该氨基酸选自脯氨酸、赖氨酸、组氨酸、甘氨酸、精氨酸及色氨酸的D或L异构体或它们的各种羟基、氨基、烷基、及羧基衍生物。
本发明的另一目的涉及用于预防或治疗疟疾的药物组合物，其通过给药有效量的精选氨基酸和氯化锌、乙酸锌或其他药物上可接受的锌盐的锌复合物，其中，该氨基酸选自脯氨酸、赖氨酸、组氨酸、甘氨酸、精氨酸及色氨酸的D或L异构体或它们的各种羟基、氨基、烷基、及羧基衍生物。
发明内容
本发明涉及精选氨基酸和氯化锌、乙酸锌或其他药物上可接受的锌盐的锌复合物的抗疟疾活性，其中，该氨基酸选自脯氨酸、赖氨酸、组氨酸、甘氨酸、精氨酸及色氨酸的D或L异构体或它们的各种羟基、氨基、烷基、及羧基衍生物。该化合物在体外红细胞(RBC)培养中表现出对人类疟疾寄生虫恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)生长的显著抑制作用。该化合物对寄生虫是致命的，但对红细胞(RBCs)及小鼠没有影响。该化合物对氯喹抗性株-W2Mef也表现出活性。该化合物对于3D7和W2Mef株的剂量反应曲线是完全相同的，这就有力地表明该化合物对抵抗相独立的氯喹抗药、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)领域具有相同的效果。该化合物通过杀死目标来作用于W2Mef株。
在本研究中，该化合物表面出抗疟疾寄生虫的生物活性(小鼠及人的测试)。该化合物在对体外培养检验中，表现出抗恶性疟原虫(Plasmodiumfalciparum)的活性。重要的是，该化合物通过直接杀死寄生虫来发挥作用，而不是仅在它们的生长中起抑制作用。在我们的任何实验中，没有发现该化合物对宿主细胞有影响。这证明该化合物是无毒的。
进而，来自药物处理的小鼠的血液涂片也支持了该化合物是通过杀死体内的寄生虫来发挥作用。重要的是，当该化合物通过口服给药时，还保持其生物活性，这暗示其作为高期望的药物。
总之，本化合物代表疟疾的有希望的侯选药物。PIZ2在这方面是突出的，因为它对氯喹—敏感及氯喹—抗性株之间是没有区别的。体内实验结果以及包括口服治疗的体内实验结果进一步确认了这些发现。
图1不同浓度的脯氨酸锌复合物对疟疾寄生虫(恶性疟原虫(Plasmodiumfalciparum))生长的抑制图2各种氨基酸，以其如下所述的锌复合物的形式进行筛选图3化合物对恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)的3D7株的效果图4PIZ2对被感染小鼠的寄生虫水平的效果图5口服PIZ2对体内研究的存活的效果图6氯喹—敏感的3D7与恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)的W2Mef株的对比图7PIZ2对CQ-敏感(3D7)及CQ-抗性(W2Mef)的恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)的抑制作用图8PIZ2对氯喹抗药株-W2Mef的效果发明的详细描述本发明涉及精选氨基酸和氯化锌、乙酸锌或其他药物上可接受的锌盐的锌复合物的应用，其中，该氨基酸选自脯氨酸、赖氨酸、组氨酸、甘氨酸、精氨酸及色氨酸的D或L异构体或它们的各种羟基、氨基、烷基、及羧基衍生物。该化合物的应用包括，给药有效量的所述化合物，用以抑制疟疾寄生虫恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)的生长。这些化合物在红细胞培养中对寄生虫是致命的，但是对红细胞没有影响。该化合物对抵抗氯喹抗药株-W2Mef也表现出活性。对于3D7和W2Mef株的剂量反应曲线是完全相同的，这就有力地表明该化合物对抵抗相独立的氯喹抗药、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)领域具有相同的效果。该化合物通过杀死目标来作用于W2Mef株。
因此，本发明的主要实施方式涉及治疗和/或预防疟疾方法，所述方法包括对哺乳动物，优选人类给药有效量的精选氨基酸和氯化锌、乙酸锌或其他药物上可接受的锌盐的锌复合物，其中该氨基酸选自脯氨酸、赖氨酸、组氨酸、甘氨酸、精氨酸及色氨酸的D或L异构体或它们的各种羟基、氨基、烷基、及羧基衍生物。可选择的，还有可接受的添加剂、载体、稀释剂、溶剂、过滤剂、润滑剂、赋形剂、粘合剂或稳定剂。
本发明的另一实施方式涉及治疗和/或预防在哺乳动物，优选人类中的疟疾的药用组合物，所述组合物包含对哺乳动物，优选人类给药有效量的精选氨基酸和氯化锌、乙酸锌或其他药物上可接受的锌盐的锌复合物，其中该氨基酸选自脯氨酸、赖氨酸、组氨酸、甘氨酸、精氨酸及色氨酸的D或L异构体或它们的各种羟基、氨基、烷基、及羧基衍生物。可选择的，还有可接受的添加剂、载体、稀释剂、溶剂、过滤剂、润滑剂、赋形剂、粘合剂或稳定剂。
本发明的另一实施方式涉及精选氨基酸锌复合物的应用，其中，所述精选氨基酸锌复合物对选自包括间日疟原虫、卵形疟原虫(P.ovale)、三日疟原虫(Plasmodium malariae)、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、P.bergei及其他已知疟原虫的组的疟疾疟原虫是致命的。
本发明的另一实施方式涉及精选氨基酸锌复合物的应用，其中，所述精选氨基酸锌复合物可以与磷酰基衍生物一起用药，该磷酰基衍生物选自包含脂肪族单及双羧酸的、具有结构式R-COOH的组，其中R是PO3H2或CR1R2-PO3H2，其中，R1/R2是H、OH、COOH或烷基(如在美国临时专利申请60/512,906中所记载的，申请日为2003年10月20日)。
本发明的另一实施方式涉及精选氨基酸锌复合物的应用，其中，所述精选氨基酸锌复合物可以与其他抗疟疾药物一起用药。
本发明的另一实施方式涉及其他抗疟疾药物的，其中，其他抗疟疾药物可以选自由氯喹及其衍生物、阿莫待喹、磺胺多辛、乙胺嘧啶及其衍生物、氯胍、甲氟喹、奎宁、卤泛曲林、青蒿素、蒿甲醚、及青蒿琥酯以及它们的衍生物所组成的组。
本发明的另一实施方式涉及精选氨基酸锌复合物，其中，精选氨基酸锌复合物是从发现于印度果阿海水中属于贻贝科(Mytilidae)的贝类的提取物中分离出来的。
本发明的另一实施方式涉及于贻贝科(Mytilidae)的贝类，其中该属于贻贝科(Mytilidae)的贝类选自由棕贝、绿贝及其它相关贝类组成的组。
本发明的另一实施方式涉及精选氨基酸锌复合物，其中，精选氨基酸锌复合物以血管注射剂、药片、胶囊、糖浆的形式给药，用于疟疾的治疗。
本发明的另一实施方式涉及可接受的添加剂、载体、稀释剂、溶剂、过滤剂、润滑剂、赋形剂、粘合剂或稳定剂，其中，添加剂、载体、稀释剂、溶剂、过滤剂、润滑剂、赋形剂、粘合剂或稳定剂可以选自由下列物质组成的组乳糖、甘露醇、山梨糖醇、微晶纤维素、蔗糖、柠檬酸钠、磷酸二钙、硬脂酸镁、硬脂酸钙或硬脂酸(steorotes)、滑石、固体聚乙二醇、月桂基硫酸钠、十六烷醇、甘油基单硬脂酸盐，或单独地、或以其适当组合的近似性能的其他任何可接受的添加剂、载体、稀释剂、溶剂、过滤剂、润滑剂、赋形剂、粘合剂或稳定剂。
本发明的另一实施方式涉及精选氨基酸锌复合物，其中，精选氨基酸锌复合物对寄生虫是致命的，但对红细胞没有影响。
本发明的另一实施方式涉及精选氨基酸锌复合物，其中，精选氨基酸锌复合物在红细胞培养中抑制疟疾寄生虫(恶性疟原虫(Plasmodiumfalciparum))的生长。
本发明的另一实施方式涉及精选氨基酸锌复合物，其中，精选氨基酸锌复合物通过分裂滋养体来杀死寄生虫。
本发明的另一实施方式涉及精选氨基酸锌复合物，其中，约5μM到10μM的精选氨基酸锌复合物抑制疟疾寄生虫的生长。
本发明的另一实施方式涉及精选氨基酸锌复合物，其中，约5μM到10μM的氨基酸脯氨酸锌复合物抑制恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)约100％的生长。
本发明的另一实施方式涉及精选氨基酸锌复合物，其中，约1mg到50mg/Kg的氨基酸脯氨酸锌复合物，抑制伯氏疟原虫(P.berghei)约80％的生长。
本发明的另一实施方式涉及精选氨基酸锌复合物，其中，约1mg到50mg/Kg的氨基酸脯氨酸锌复合物，抑制P.yeoeli约90％的生长。
本发明的另一实施方式涉及精选氨基酸锌复合物，其中，约1μM到50μM的精选氨基酸锌复合物，抑制恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)W2Mef约100％的生长，其对氯喹没有抗药性。
以下的实施例是以描述本发明的方式提出的，因此，不应解释为对本发明范围的限定。
实施例实施例1从贝类提取物中提取氨基酸锌复合物冻干贝类的水解产物，以得到粗制的固体，通过加入150ml甲醇并在室温下搅拌90分钟，从中得到甲醇提取物。用过滤纸过滤。滤出液标记为AcM。将AcM部分在使用0-60％B乙腈线性梯度的RP-C18柱上进行HPLC，超过40分钟。收集并冻干在空隙体积(10分钟)的峰流出。将粗制的固体溶解于60mlmilliQ水中，并且在交联葡聚糖凝胶-G15柱中分馏，并用水洗脱。收集馏分6-11并冻干，标记为P2N。利用prep-TLC以BAW＝4∶1.5∶1的硅胶作为流动相进一步纯化P2N。经用0.01N的HCl萃取硅胶后，获得标记为K-1-1及K-1-2的两个馏分。冻干以获得固体，并且，将在K-1-1和K-1-2中发现的活性物，在HSF5 RP中用水作为流动相进行进一步细分馏份，在同样的条件下得到K-1-2/1和K-1-2/2，且这两份均有抗疟疾活性。发现馏分K-1-2/1是氨基酸锌复合物，而K-1-2/2是膦酰基衍生物。而这两个馏分即K-1-2/1和K-1-2/2均表现出抗疟疾活性。进而用质谱分析来确定K-1-2/1，确认它是氨基酸锌复合物(锌—脯氨酸复合物)。最终，从贝类提取物中分离的化合物的活性成份，通过商业可获得的合成L-脯氨酸来再生产，为了确认人工合成的商业可获得的氨基酸与分离的氨基酸锌复合物具有相似的抗疟疾活性，采用了如下方法由商业可获得的L-脯氨酸及氯化锌制成锌—脯氨酸复合物混合物将10ml水中有3.6克的乙酸锌溶液(或2.65克的氯化锌)(0.02mol)滴加到装有10ml水中有1.15克的L-脯氨酸溶液(0.01mol)的锥形烧瓶中，在室温下搅拌混合物10分钟，然后在超过20分钟的时间内逐渐加热到100度。将反应混合物在100度下保持10分钟，然后使其冷却到室温。将该溶液进行等分以进行生物鉴定。从贝类提取物中分离的氨基酸锌复合物与商业可获得的氨基酸锌复合物之间的质谱相比非常匹配，这样就证明了来自贝类提取物的发现。换名话说，在它们的质谱分析中，贝类提取物馏分K-1-2/1与商业的是氨基酸锌复合物相似的。
实施例2将L-脯氨酸锌复合物溶解于生理盐水中，并过滤消毒。将在1-10μM范围的不同浓度的该化合物，加入到寄生虫培养中。在指定的剂量下，用如下所述的实验方案，对化合物进行测试对恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)药物作用的体外研究测试方案首先用山梨糖醇处理，使恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)同步化。将不同浓度的化合物加入到200μl的同步化的恶性疟原虫(Plasmodiumfalciparum)培养中(1％寄生虫虫体密度)。在37℃经48小时培育，用制作Giemsa染色涂片的方式来检测寄生虫虫体密度。以与剂量相关的方式抑制了恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)的生长，其中，10μM浓度达到＞80％的抑制率(图1)。得到的剂量相关的响应结果示于盘1中。条状物代表抑制率百分数，而兰曲线表示寄生虫虫体密度的百分数。从该图中，可以计算出达到半量(LD50)抑制率的浓度是约7.0μM。
实施例3将L-组氨酸、L-赖氨酸及L-蛋氨酸溶解于生理盐水中，并过滤除菌。该化合物以与剂量相关的方式进行抑制，其中，10μM浓度达到～85％的抑制率(图2)。
实施例4在本实验中，用Giemsa染色制作载波片，在光显微镜下进行检测，代表图示于图3中。在用化合物PIZ2处理过的培养基上，可以明显地看出寄生虫的分裂。这就确认该化合物的作用是对寄生虫的直接杀死。
实施例5PIZ2对感染小鼠寄生虫虫体密度等级的影响用105伯氏疟原虫(P.berghei)寄生虫/小鼠感染BALB/c小鼠(4-6周大)，将PIZ2溶解于盐水中，并过滤除菌。经四天的感染，以10mg/kg体重(组2)和20mg/kg体重(组3)的剂量给小鼠注射不同浓度的化合物。对照组(组1)指感染寄生虫但没有用任何药(即只用赋形剂)的小鼠组。组4指按指定的治疗方式，用乙胺嘧啶(以20mg/kg体重)治疗感染小鼠的组。每组有10只小鼠，从血涂片所得到的寄生虫虫体密度的等级，作为在未治疗的小鼠中寄生虫虫体密度的百分比来给出(图4)。
实施例6口服给药NIO-2对体内研究的寄生虫生长的影响对于这些实验，使用小鼠疟疾寄生虫Plasmodium yeoeli，因为其被认为是与人类疟疾寄生虫恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)相近似的株。每组8只小鼠，用106寄生虫/小鼠通过内腹膜注射染病。四天后，在这些小鼠中，寄生虫虫体密度的达到0.8～1％。此时，小鼠组2口服给药剂量为20mg/kg体重的PIZ2(溶于水)。每天给药一次，共6天一个完整周期。然后，另外三天，将小鼠单独分开，之后数其存活数(即在感染后12天)。此处结果示于图5中。组1表示没有感染、没有用药的小鼠的对照组，组3表示已感染、也没有用药(即只是赋形剂)的小鼠组，很明显，组2(给药PIZ2)中的感染小鼠的存活率有实质性的增长。组4表示感染的小鼠组，该组用25毫克乙胺嘧啶和500毫克磺胺胍(每只小鼠)相结合，用与PIZ2同样的方式进行治疗。与没有给药化合物的组3(成活％∶25％)相比，组3的成活的百分数是88％(图5)。
实施例7口服给药PIZ2对感染小鼠寄生虫虫体密度等级的影响(表1)方案1)第0天用105/小鼠感染两组8BALB/c小鼠。
2)第4天小鼠呈阳性(约0.5％寄生虫虫体密度)。
一组以20mg/kg体重口服给药PIZ2(试验组)。
另一组只给赋形剂(对照组)3)从每组每只小鼠身上制血涂片，确定寄生虫虫体密度的百分数表1
实施例8还将PIZ2的活性与抗氯喹抗药恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)株进行了比较。在这些实验中，使用了W2Mef株。首先，可以确定，该株确实对有比氯喹更强的抗药性，然后，在我们的实验中，将3D7作为对氯喹敏感的原形。如图6所示，与3D7株相比，W2Mef株在对氯喹的IC50值方面表现出有近7倍的提高，以下是本实验的方案在本研究中，使用氯喹敏感(3D7)株和氯喹抗性(W2Mef)株。在体外进行培养，所使用的培养基由用10％热灭活的人O+血清补充的标准RPMI-1640、血球密度为4％的3.6％NaHCO3组成。所有检验均在96孔平底微量滴定板中进行，使用5％的山梨糖醇，以使培养同步。寄生虫的生长用与次黄嘌呤的结合来检测。最初在每个孔中加入200μl体积的培养寄生虫。将不同的抗疟疾化合物以不同的浓度加入到孔中。对所有的化合物均在氯喹敏感和氯喹抗性株上这种进行测试。然后将板放入密封室中，用混合气体(5％CO2，5％O2和90％N2)冲洗。最后，将板放置在温度为37℃的恒温箱中24小时。
在孵育过程的最后，在每个孔中加入5μl的终浓度为1μCi的稀释的3H-次黄嘌呤，然后将板再放回到密封室中，然后用上述混合气冲洗，并再孵育24小时。然后，盘子在-70℃下存放，直到需要检测所结合放射性。必要时，将盘子解冻，将孔内物收集到过滤垫上。然后，干燥并密封这些过滤垫。接着，用BetaPlate Scint对过滤垫进行显影，并在BetaPlate Scintillation计数器来测定所结合的放射性(图6)。
实施例9化合物PIZ2对恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)的氯喹抗性株具有相同的活性初步的实验表明PIZ2确实对抗氯喹抗性株-W2Mef有活性。随后的剂量响应分析确认为这个事实，并且还表明无论目标是氯喹敏感的或是氯喹抗药的恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)株，该化合物的效力是相同的。从三个相独立的实验之一得出的代表性结果示于图7中。
实施例10
本实验表明，与PIZ2作用于3D7一样，它也通过直接杀死的相似方式来作用于W2Mef(图8)本发明的优点1)用于疟疾的本活性化合物是相对便宜，且容易批量生产。
2)它加入现有的抗疟疾化合物，可以与其他传统药物如氯喹、甲氟喹等联合使用。
3)它还可以用于抵抗有抗药性的疟疾寄生虫。
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权利要求
1.一种精选氨基酸和氯化锌、乙酸锌或其他药物上可接受的锌盐的锌复合物在治疗和/或预防哺乳动物，优选人类疟疾中的应用，其中，该氨基酸选自脯氨酸、赖氨酸、组氨酸、甘氨酸、精氨酸及色氨酸的D或L异构体或它们的各种羟基、氨基、烷基、及羧基衍生物，可选择地，除此以外，还有可接受的添加剂、载体、稀释剂、溶剂、过滤剂、润滑剂、赋形剂、粘合剂或稳定剂。
2.根据权利要求1所述的应用，其中，所述精选氨基酸锌复合物对选自包括间日疟原虫、卵形疟原虫(P.ovale)、三日疟原虫(Plasmodium malariae)、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、P.bergei及其他已知疟原虫的组的疟疾疟原虫是致命的。
3.根据权利要求1所述的应用，其中，所述精选氨基酸锌复合物可以与磷酰基衍生物一起用药，该磷酰基衍生物选自包含脂肪族单及双羧酸的、具有结构式R-COOH的组，其中R是PO3H2或CR1R2-PO3H2，其中，R1/R2是H、OH、COOH或烷基(如在美国临时专利申请60/512,906中所记载的，申请日为2003年10月20日)。
4.根据权利要求1所述的应用，其中，所述精选氨基酸锌复合物可以与其他抗疟疾药物一起用药。
5.根据权利要求4所述的应用，其中，其他抗疟疾药物可以选自由氯喹及其衍生物、阿莫待喹、磺胺多辛、乙胺嘧啶及其衍生物、氯胍、甲氟喹、奎宁、卤泛曲林、青蒿素、蒿甲醚、及青蒿琥酯以及它们的衍生物所组成的组。
6.根据权利要求1所述的应用，其中，精选氨基酸锌复合物是从发现于印度果阿海水中的、属于贻贝科(Mytilidae)的贝类的提取物中分离出来的。
7.根据权利要求6所述的应用，其中，该属于贻贝科(Mytilidae)的贝类选自由棕贝、绿贝及其它相关贝类组成的组。
8.根据权利要求1所述的应用，其中，精选氨基酸锌复合物以血管注射剂、药片、胶囊、糖浆的形式给药，用于疟疾的治疗。
9.根据权利要求1所述的应用，其中，添加剂、载体、稀释剂、溶剂、过滤剂、润滑剂、赋形剂、粘合剂或稳定剂可以选自由下列物质组成的组乳糖、甘露醇、山梨糖醇、微晶纤维素、蔗糖、柠檬酸钠、磷酸二钙、硬脂酸镁、硬脂酸钙或硬脂酸(steorotes)、滑石、固体聚乙二醇、月桂基硫酸钠、十六烷醇、甘油基单硬脂酸盐，或单独地、或以其适当组合的近似种类的其他任何可接受的添加剂、载体、稀释剂、溶剂、过滤剂、润滑剂、赋形剂、粘合剂或稳定剂。
10.根据权利要求1所述的应用，其中，精选氨基酸锌复合物对寄生虫是致命的，但对红细胞没有影响。
11.根据权利要求1所述的应用，其中，精选氨基酸锌复合物在红细胞培养中抑制疟疾寄生虫(恶性疟原虫(Plasmodium falciparum))的生长。
12.根据权利要求1所述的应用，其中，精选氨基酸锌复合物通过分裂滋养体来杀死寄生虫。
13.根据权利要求1所述的应用，其中，约5μM到10μM的精选氨基酸锌复合物抑制疟疾寄生虫的生长。
14.根据权利要求1所述的应用，其中，约5μM到10μM的氨基酸脯氨酸锌复合物抑制恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)约100％的生长。
15.根据权利要求1所述的应用，其中，约1mg到50mg/Kg的氨基酸脯氨酸锌复合物抑制伯氏疟原虫(P.berghei)约80％的生长。
16.根据权利要求1所述的应用，其中，约1mg到50mg/Kg的氨基酸脯氨酸锌复合物抑制P.yeoel约90％的生长。
17.根据权利要求1所述的应用，其中，约1μM到50μM的精选氨基酸锌复合物，抑制恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)W2Mef约100％的生长，其对氯喹没有抗药性。
18.一种预防或治疗在哺乳动物，优选人类中的疟疾的药用组合物，所述组合物包含对哺乳动物，优选人类给药有效量的精选氨基酸，和氯化锌、乙酸锌或其他药物上可接受的锌盐的锌复合物，其中该氨基酸选自脯氨酸、赖氨酸、组氨酸、甘氨酸、精氨酸及色氨酸的D或L异构体或它们的各种羟基、氨基、烷基、及羧基衍生物，可选择地，除此以外，还有可接受的添加剂、载体、稀释剂、溶剂、过滤剂、润滑剂、赋形剂、粘合剂或稳定剂。
19.根据权利要求18所述的组合物，其中，所述精选氨基酸锌复合物对选自包括间日疟原虫、卵形疟原虫(P.ovale)、三日疟原虫(Plasmodiummalariae)、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、P.bergei及其他已知疟原虫的组的疟疾疟原虫是致命的。
20.根据权利要求18所述的组合物，其中，所述精选氨基酸锌复合物可以与磷酰基衍生物一起用药，该磷酰基衍生物选自包含脂肪族单及双羧酸的、具有结构式R-COOH的组，其中R是PO3H2或CR1R2-PO3H2，其中，R1/R2是H、OH、COOH或烷基(如在美国临时专利申请60/512,906中所记载的，申请日为2003年10月20日)。
21.根据权利要求18所述的组合物，其中，所述精选氨基酸锌复合物可以与其他抗疟疾药物一起用药。
22.根据权利要求18所述的组合物，其中，其他抗疟疾药物可以选自由氯喹及其衍生物、阿莫待喹、磺胺多辛、乙胺嘧啶及其衍生物、氯胍、甲氟喹、奎宁、卤泛曲林、青蒿素、蒿甲醚、及青蒿琥酯以及它们的衍生物所组成的组。
23.根据权利要求18所述的组合物，其中，精选氨基酸锌复合物是从发现于印度果阿海水中的、属于贻贝科(Mytilidae)的贝类的提取物中分离出来的。
24.根据权利要求23所述的组合物，其中，该属于贻贝科(Mytilidae)的贝类选自由棕贝、绿贝及其它相关贝类组成的组。
25.根据权利要求18所述的组合物，其中，精选氨基酸锌复合物以血管注射剂、药片、胶囊、糖浆的形式给药，用于疟疾的治疗。
26.根据权利要求18所述的组合物，其中，添加剂、载体、稀释剂、溶剂、过滤剂、润滑剂、赋形剂、粘合剂或稳定剂可以选自由下列物质组成的组乳糖、甘露醇、山梨糖醇、微晶、纤维素、蔗糖、柠檬酸钠、磷酸二钙、硬脂酸镁、硬脂酸钙或硬脂酸(steorotes)、滑石、固体聚乙二醇、月桂基硫酸钠、十六烷醇、甘油基单硬脂酸盐，或单独地、或以其适当组合的近似种类的其他任何可接受的添加剂、载体、稀释剂、溶剂、过滤剂、润滑剂、赋形剂、粘合剂或稳定剂。
27.根据权利要求18所述的组合物，其中，精选氨基酸锌复合物对寄生虫是致命的，但对红细胞没有影响。
28.根据权利要求18所述的组合物，其中，精选氨基酸锌复合物在红细胞培养中抑制疟疾寄生虫(恶性疟原虫(Plasmodium falciparum))的生长。
29.根据权利要求18所述的组合物，其中，精选氨基酸锌复合物通过分裂滋养体来杀死寄生虫。
30.根据权利要求18所述的组合物，其中，约5μM到10μM的精选氨基酸锌复合物抑制疟疾寄生虫的生长。
31.根据权利要求18所述的组合物，其中，约5μM到10μM的氨基酸脯氨酸锌复合物抑制恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)约100％的生长。
32.根据权利要求18所述的组合物，其中，约1mg到50mg/Kg的氨基酸脯氨酸锌复合物抑制伯氏疟原虫(P.berghei)约90％的生长。
33.根据权利要求18所述的组合物，其中，约1mg到50mg/Kg的氨基酸脯氨酸锌复合物抑制P.yeoeli约90％的生长。
34.根据权利要求21所述的组合物，其中，约1μM到50μM的精选氨基酸锌复合物，抑制恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)W2Mef约100％的生长，其对氯喹没有抗药性。
全文摘要
本发明提供了精选氨基酸，与氯化锌、乙酸锌或其他药物上可接受的锌盐的锌复合物的应用，其中，该氨基酸选自脯氨酸、赖氨酸、组氨酸、甘氨酸、精氨酸及色氨酸的D或L异构体或它们的各种羟基、氨基、烷基、及羧基衍生物。该化合物的应用包括，给药有效量的所述化合物，用以抑制疟疾寄生虫恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)的生长。该化合物在红细胞培养中对寄生虫是致命的，但是对红细胞没有影响。该化合物对抵抗氯喹抗药株－W2Mef也表现出活性。该化合物对于3D7和W2Mef株的剂量反应曲线是完全相同的，这就有力地表明该化合物对抵抗相独立的氯喹抗药、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)领域具有相同的效果。该化合物通过杀死目标来作用于W2Mef株。
文档编号A61K45/06GK1901896SQ200480034426
公开日2007年1月24日 申请日期2004年7月19日 优先权日2003年10月22日
发明者帕万·马尔霍特拉, 文卡塔·那加·达萨拉西·帕拉科德提, 阿西弗·莫哈米德, 贾马尔·霍塞恩·曼沙, 苏尼尔·穆克赫吉, 文卡塔萨米·马尼维尔, 卡努里·文卡塔·苏巴·劳, 吉扬·钱德拉·米什拉, 苏布拉扬·佩鲁尼那库拉斯·帕梅斯瓦兰, 阿尼尔·查特吉 申请人:印度科学工业研究所