专利名称：用于治疗癌症的msp36的慢病毒载体传递的制作方法
技术领域：
本发明涉及通过给予患者包含乳腺分泌蛋白(msp36)基因的慢病毒(lentiviral)载体，以治疗癌症或恶性肿瘤的组合物和方法，该给予方式使该基因在靶组织中表达而产生分泌的生物活性msp36蛋白。
背景技术：
在身体里正常细胞的分裂和迁移是被高度调节的。该调节系统称为“细胞内环境稳定”，其利用若干机制以维持细胞的校验。调节细胞生长的主要机制包括通过可溶性介质(例如生长因子)的外部信号传导、通过细胞接触抑制的细胞生长阻滞、通过特定的细胞表面受体-配体相互作用的细胞粘附和细胞分化。
Knudson首先论述癌症的发展是一个多级过程[(1971)Proc.Nat.Acad.Sci.68，820-3]。正常细胞在其DNA内累积遗传突变，包括核苷酸的置换、缺失和重排。在关键调节基因中某些这种突变的积累通常由于接触抑制的丧失、细胞粘附的丧失、细胞分化的丧失和不能完成它们的预定功能，而经常导致细胞内环境稳定的丧失。此外，还可改变细胞存活和程序性死亡(凋亡)之间的平衡。由于这些遗传突变，癌症细胞丧失了维持细胞分裂在可控状态下的调控元件，并且获得超过组织和器官中正常细胞的增殖优势，以及作为转移迁移到远处组织和器官的能力。
生长因子和它们的特殊细胞表面或细胞内结合蛋白形成了联系外部环境和细胞的关键管道。生长因子结合蛋白的实例包括表皮生长因子(Taylor等(1970)Proc.Nat.Acad.Sci.67，164-71；Taylor等(1974)J.Biol.Chem.249，3198-203)、神经生长因子(Kanzake等(1990)Cell 61，1051-61；Dennis等(1989)J.Biol.Chem.264，7210-6)、胰岛素样生长因子(Zapf等(1975)Arch.Biochem.Biophys.168，638-45；Cohen andNissley(1976)Acta Endocrinol.83，243-58；Moses等(1976)Nature 263，137-40；Hintz and Liu(1977)J.Clin.Endocrinol.&Metab.45，988-95)，胰岛素(Hoffinan等(1973)Exp.Cell Res.80，275-80)、血小板衍生生长因子(Huang等(1989)Proc.Nat.Acad.Sci.81，342-6)和转化生长因子-β(O’Connor-McCourt and Wakefield(1987)J.Biol.Chem.262，14090-9；Huang等(1988)J.Biol.Chem.263，1535-41；Kanzake等(1990)Cell 61，1051-61)。肝素结合生长因子家族包括酸性和碱性FGF、K-FGF、Int-2、FGF-5、KGF和FGF-7(Burgess and Maciag(1989)Ann.Rev.Biochem.58，575-606；Finch等(1989)Science 245，752-5；Gospodarowicz等(1986)Mol.Cell.Endocrinol.46，187-204)。这些生长因子涉及生物过程例如生长刺激、血管生成、创口愈合和组织再生(Burgess and Maciag；Gospodarowicz等；Kan等(1989)Proc.Nat.Acad.Sci.86，7432-6)。
Wu等(1991)J.Biol.Chem.266，16778-85，Lametsch等(2000)J.Biol.Chem.275，19469-74和Kurtz等(1997)Oncogene 14，2671-81分别从人表皮样癌细胞、牛prepartum乳腺分泌物和小鼠SW13细胞中分离并鉴定了肝素结合生长因子的17KD结合蛋白。该蛋白与碱性或酸性FGF非共价结合，并且抑制了碱性FGF的功能(Wu，Lametsch和Kurtz)。
Lee(WO 02/34282)描述了基于TGF-β序列通过示差筛选含引物的人cDNA序列而分离的msp36。Lee显示，与正常组织相比，msp36RNA和蛋白在乳腺癌和前列腺癌细胞株及患者肿瘤组织中被下调。在裸鼠中使用人肿瘤细胞的Matrigel移植试验中，msp36转染或腺病毒感染进入肿瘤细胞的进一步工作导致肿瘤生长迟缓、侵袭潜力降低、肿瘤细胞的基质金属蛋白酶-9(MMP-9)产生减少和肿瘤血管生成的抑制。Lee也证明了p21的诱导，该蛋白在引发细胞分化中扮演重要的角色(Liu等(2003)Drug Resist，Update 6，183-95)。这些实验显示，msp36可调节乳腺肿瘤细胞的表型行为，将msp36植入msp36缺乏的肿瘤细胞显示出它可用于治疗人患者中的癌症。
Lee所述的实验(WO 02/34282)利用DNA转染或腺病毒感染以体外传递msp36到靶细胞，利用腺病毒感染体内传递msp36到靶细胞。这两种系统已用于传递各种基因以改善细胞中的基因缺陷。两种系统也已用于修正动物和人中的遗传缺陷，其直接给予到患者中或通过体外处理细胞随后将这些细胞重新引入动物或患者中。然而，利用裸DNA或腺病毒作为传递载体表达的基因导致下述的治疗性蛋白短暂表达。因此，通过裸DNA或腺病毒传递的msp36基因需要重复给予患者以进行长期治疗。
至于其他蛋白质，msp36蛋白的癌症治疗用途的一个问题是msp36浓度在肿瘤部位的波动性。Msp36蛋白作为浓注(bolus)传递到肿瘤部位或通过静脉注射而全身性传递，这导致形成蛋白浓度峰，紧接着通过清除和降解在肿瘤部位产生潜在的治疗下浓度。例如，Intron-A(α-干扰素，Kenilworth，NJ)和Proleukin(白介素-2，Chiron，Emeryville，CA)分别具有约2小时和1.5小时的消除半寿期(参见各自产品的包装说明书)。蛋白质的聚乙二醇化经常延长了治疗性蛋白的半寿期(Harris and Chess(2003)Nat.Rev.Drug Discov.2，214-21)，但患者仍然需要重复治疗以提高蛋白质浓度到治疗水平。对于长期的患者治疗，需要重复给予msp36蛋白以抑制乳腺肿瘤的生长。对于半寿期较短的治疗性蛋白，例如白介素2和α-干扰素，患者的治疗可频繁至每天1-3次。确实需要的是在较长时期内传递给患者改善肿瘤或恶性肿瘤必要的恒定治疗剂量。
另一种传递治疗水平的msp36的方法包括传递有效连接启动子的msp36基因到细胞中，msp36基因随后在细胞中合成并分泌生物活性msp36蛋白。转染裸DNA和脂质体包被的DNA是两种已确定的传递基因进入细胞的非病毒方法。然而，这些方法导致治疗性蛋白的短暂表达(Romano等(2000)Stem Cells 18，19-39)，不适于长期传递最佳治疗所需的恒定水平。非病毒传递系统的另一个缺陷是，因为细胞防御系统的缘故，需要大量的裸DNA以达到治疗效果(Crystal(1995)Nat.Med.1，15-7)。
Romano等和Mah等(2002)Clin.Pharmcokin.41，901-11描述了病毒基因传递系统。常用病毒系统包括腺病毒、腺伴随病毒(AAV)和逆转录病毒。这些系统已用于传递各种基因以改善细胞中的基因缺陷。它们也已用于修正动物和人中的遗传缺陷，其直接给予至患者中或体外处理细胞随后将这些细胞重新引入动物或患者中。然而，腺病毒和AAV载体不整合到宿主细胞中并且短暂地表达蛋白，对于长期治疗也需要反复给予患者。逆转录病毒序列整合到宿主细胞中，但经常在几周后由于它们的启动子区被宿主细胞甲基化而被灭活(Duch等(1994)J.Virol.68，5596-601；Chang and He(2001)Curr.Opin.Mol.Therap.3，468-75)。
慢病毒载体具有某些超出其它基因传递系统的优势；它高效率地将外源基因转导入哺乳动物细胞，它可转导不分裂的细胞，它可指导治疗性蛋白的长期表达，并且可在体内或者体外有效地传递(Naldini(1998)Curr.Opin.Biotechnol.8，457-63)。
已开发了慢病毒载体并用于治疗各种遗传性疾病和获得性疾病(Galimi and Verma(2001)Curr.Topics Micro.Immunol.261，245-54；Klimatcheva等(1999)Front.Biosci.4，D481-96)。慢病毒载体用于人类疾病治疗的主要焦点是将基因转入神经元以治疗CNS疾病(例如治疗溶酶体存储病、亨廷顿氏病及帕金森氏病)、将基因转入造血祖细胞以治疗淋巴-血液疾病(例如镰状红细胞和β-地中海贫血以及血友病)，还用于HIV感染(Yee and Zaia(2001)Som.Cell Mol.Genet.26，159-74；Deglon and Aebischer(2001)Curr.Topics Micro.Immunol.261，191-210；Salmon and Trono，Curr.Topics Micro.Immunol.261，211-28；Amadoand Chen，Curr.Topics Micro.Immunol.261，229-44)。
有某些慢病毒载体在肿瘤学中潜在用途的报告。慢病毒载体已用于体外传递免疫原性蛋白到灭活的癌细胞中以生产抗癌疫苗(Nawrocki等(2001)Expert Opin.Biol.Ther.1，193-204；Koya等(2002)Leukemia 16，1645-54)、体外传递免疫调节蛋白到树突细胞以刺激抗肿瘤反应(Stripecke等(2003)Blood Cells Mol.Dis.31，28-37)、传递毒素例如白喉毒素(Yu等(2001)Cancer Gene Ther.8，628-35)、传递自杀基因例如HSV胸苷激酶(Kong等(2003)In Vivo 17，153-6；Del Palma等(2003)Nat.Med.9，789-95)或传递转运蛋白(Dingli等(2003)GeneTher.102，489-96)，以尝试直接杀死癌细胞。然而，没有目标为置换细胞外可溶蛋白调节物的慢病毒治疗用途报道，该调节物通过细胞受体发挥减缓癌细胞生长的作用。
尽管在医药界中对癌症治疗的关注高度优先，仍然需要新的治疗方法以寻求这类疾病的进展。大多数癌症治疗方法具有高毒性特性，患者不能耐受。靶向肿瘤位置而不全身给药的新治疗分子有希望提供改良的药物功效而同时使副作用最小。
msp36显示明显希望用于治疗乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、肺癌和其它可能的癌症类型。和大多数治疗一样，剂量水平是该蛋白的最大功效的关键。理想状态下，msp36蛋白质在长时间内(即大于6个月)以恒定的剂量传递，这将是缓解乳腺、前列腺、卵巢和肺肿瘤或恶性肿瘤的最主要治疗方法。
发明概述本发明涉及在肿瘤或恶性肿瘤部位产生治疗水平的msp36的方法。含msp36基因的慢病毒载体被传递到肿瘤位置或其附近，该msp36基因与在靶组织中有活性的启动子有效连接。慢病毒载体将有效连接至启动子的msp36基因传递入细胞，在那里msp36基因稳定整合入细胞DNA。启动子指导生物活性msp36蛋白质的合成，该蛋白从细胞中分泌。活性msp36增加了由肿瘤细胞或周围基质细胞合成的低到不可检测的msp36水平，抑制肿瘤的细胞周期、迁移能力、MMP-9的合成，和/或阻止肿瘤位置的血管生成。
GenBank检索号AF149412和M60047中描述了人msp36基因序列，AF271896中描述了牛msp36基因序列，AF065441中描述了小鼠序列。编码蛋白的完整基因或cDNA或其片段可用于本发明，该蛋白能够结合酸性或碱性FGF并抑制小鼠Matrigel肿瘤试验中的肿瘤细胞生长、MMP-9合成或血管生成。
慢病毒载体中与msp36基因有效连接的启动子可以是组成型或诱导型，可以是组织特异性。已知许多组织特异性启动子。msp36的前导序列可以是同源或异源的。msp36基因可以是含有内含子的全长基因、cDNA、基因或cDNA的片段或其组合。慢病毒载体可来源于人、猿、猫、马、牛或感染其它哺乳动物物种的慢病毒。慢病毒载体可包含其它治疗性、自杀性或毒性基因，例如有效连接诱导型启动子或穿过IRES(内部核糖体进入位点)的HSV胸苷激酶(de Felipe(2002)Curr.Gene Ther.2，355-78)。此外，慢病毒药物制剂可与其它治疗性调节物一起传递，以治疗癌症或恶性肿瘤。
用慢病毒载体传递的msp36基因治疗含低或不可测msp36水平的乳腺癌肿瘤将导致msp36蛋白的长期稳定表达。由慢病毒载体指导的外源msp36的表达在乳腺癌小鼠模型中抑制肿瘤细胞生长、侵袭潜力和肿瘤血管生成。
我们描述了通过传递包含msp36基因的慢病毒载体来治疗患者中乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌和肺癌的方法，该基因在肿瘤部位表达局部治疗水平的msp36蛋白。本发明方法涉及利用直接注射将慢病毒载体给予到肿瘤位置或其附近。包含msp36基因的慢病毒载体可与其它癌症治疗联合传递，例如手术干预、放射疗法、激素疗法、免疫疗法、化学疗法或冷冻疗法。
发明详述本发明涉及通过给予带有与启动子有效连接的msp36基因的慢病毒载体，在肿瘤位置传递有效治疗量的msp36，来治疗患者中的癌症或恶性肿瘤的方法。这种癌症或恶性肿瘤包括乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、肺癌和任何其它癌症，其中相对于正常非癌变组织msp36水平降低或不存在。
本文所用的“基因”指哺乳动物msp36，优选人msp36、编码全部或部分msp36的基因、cDNA、DNA、核酸、寡核苷酸、多核苷酸或其片段或部分。该基因可包含内含子。msp36基因包含普通人群中所述的天然多态性，其改变核苷酸顺序并可改变氨基酸序列。作为非限制性实例，片段或部分包括至少70-100个或更多核苷酸的核酸片段。基因可通过化学或重组方法制备。
本文所用的“变体”指msp36基因，其具有不改变翻译氨基酸序列的保守核苷酸改变，或者具有导致msp36基因产生的翻译氨基酸序列改变一个或多个氨基酸的非保守核苷酸改变。术语“变体”包括氨基酸的缺失、插入或二者。术语“变体”也包括插入或除去参与或指导糖基化或其它翻译后修饰的氨基酸残基，并且可包括msp36多肽的N-端前导序列或其它氨基酸的存在。Msp36的变体也可包括融合蛋白，例如谷胱甘肽-S-转移酶(GST)。
本文所用的“生物活性”msp36多肽指显示类似于(但不必相同)msp36多肽活性的多肽。生物活性msp36多肽抑制癌细胞的细胞周期、抑制体外实验中的癌细胞迁移(Albini(1998)Pathol.Oncol.Res.4，230-41)、降低癌细胞或周围基质组织中MMP-9的生成、加强凋亡、降低肿瘤细胞生长速度、降低肿瘤细胞侵袭潜力或体内抑制癌细胞诱导的血管生成。剂量依赖性可不与msp36多肽一致。该多肽可在各种细胞中制备，包括真核和原核细胞，包括细菌、昆虫和哺乳动物(例如小鼠、大鼠和人)细胞。
本文所用的“慢病毒载体”包括基于HIV-1或HIV-2的载体，或基于猿、猫、马或牛免疫缺陷病毒的载体，或基于可感染其它哺乳动物物种的慢病毒的载体。载体通常为复制缺陷性。
本文所用的“药物组合物”包含含有msp36基因的慢病毒载体，以及一种或多种药物可接受载体、稀释剂或赋形剂，可包含其它活性成份。药物组合物的制剂可以是水性或非水性的等渗无菌溶液或混悬液。
包含msp36基因的慢病毒载体可通过各种方式给药，包括注射或局部应用。慢病毒载体可通过肿瘤内、血管内、皮下、肌内、腹膜内或吸入给药传递到患者中的位置。
本文所用的患者指已被医师诊断为患有癌症或恶性肿瘤的人。癌症可起源或位于各种组织或器官，包括但不限于乳腺、前列腺、卵巢和肺。该患者可患有早期癌症或晚期癌症。其它癌症治疗可在用含msp36基因的慢病毒药物制剂治疗之前、同时或之后应用。
Wu等(1991)J.Biol.Chem.266，16778-85中已作为HBp17描述了人msp36，Lametsch等(2000)J.Biol.Chem.275，19469-74和Kurtz等(1997)Oncogene 14，2671-81中已分别作为FGF-BP描述了牛和鼠msp36。HBp17被描述为肝素结合生长因子家族的成员。msp36基因的DNA序列显示大约17KD的多肽；SDS-PAGE上的迁移显示大小约为36KD。表观大小的差异可能是由于粘附在多肽上的糖。
Lee(WO 02/34282)描述了利用大肠杆菌表达系统产生重组msp36，以及体外用裸DNA和腺病毒载体传递msp36基因到肿瘤细胞。Lee鉴定了体外msp36对乳腺癌细胞的作用，并且显示出细胞周期时间、细胞迁移和MMP-9分泌的抑制。Lee也显示了当这些细胞被包裹在Matrigel基质中并植入裸小鼠中时体内对血管生成的抑制。
可获得用于本发明方法的编码所需msp36的遗传材料。GenBank检索号AF149412和M60047中描述了人msp36基因的基因序列，AF271896中描述了牛msp36基因序列，AF065441中描述了小鼠序列。
用于本发明方法的充分开发的系统利用基于HIV-1的慢病毒载体。该系统归纳于Ailles和Naldini(2002)Curr.Topics Micro.Immunol.261，31-52中。已对慢病毒载体进行了广泛地修改以增加其应用于人类时的安全性。在转移载体中仅仅保留了大约10％的原始病毒序列。产生慢病毒载体所需的包装细胞用多至4个单独的质粒转染，以使重组降到最低。在大多数慢病毒载体结构中，治疗基因序列与CMV启动子有效连接。
包含msp36基因的慢病毒载体可配制在药物可接受载体、稀释剂或稀释剂中，可包含其它的活性成分。药物组合物的制剂可为水性或非水性的等渗无菌溶液或混悬液。优选配方是磷酸缓冲盐水(PBS)。PBS中可存在其它载体，例如乳糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、组氨酸、甘氨酸、明胶、胶原、聚乙烯吡咯烷酮。载体列表不是穷尽性的。药物制剂可储存在4℃、-20℃或-80℃，并且在给予患者前恢复到室温，或由粉末或无水制剂重新配制。
慢病毒载体药物制剂可利用注射器注射到组织部位中。注射部位可为肿瘤内、血管内、皮下、肌内或腹膜内。药物制剂可局部应用于手术部位，例如在切除原发性肿瘤后。此外，制剂可被雾化以吸入给药。
治疗剂量指含msp36基因的慢病毒载体的量，其改善、减小或消除癌症或恶性肿瘤。含msp36基因的慢病毒载体的量根据给药途径、所应用的组织、患者的状态(包括年龄、体重、性别和癌症或恶性肿瘤的严重程度)而变化，所有这些都由医生或从业者决定。可通过利用细胞培养物和动物模型的标准方法来确定治疗效果和毒性，从而决定治疗剂量和毒性剂量的范围。慢病毒载体剂量的测量可通过在培养物中感染细胞和有限稀释来进行，或基于ELISA法测定p24衣壳蛋白(Perkin-Elmer，Boston，MA)。优选剂量是具有高疗效指数和低毒性指数的剂量。通过转导单位(TU)测定的治疗患者癌症的慢病毒载体范围为105至1010TU/剂。
可与其它癌症治疗一起在药物制剂中传递慢病毒载体。例如，拓扑异构酶抑制剂(例如喜树碱)、微管蛋白结合剂(例如紫杉醇)、烷化剂(例如苯丁酸氮芥)、抗代谢物(例如L-天冬酰胺酶)或免疫抑制剂(例如地塞米松)制剂可与慢病毒载体制剂混合或重新配制，并且注射或局部应用于患者。
以下非限制性实施例描述了本发明治疗乳腺癌的实践。然而，本发明不限于乳腺癌，并且可用于任何肿瘤组织中msp36水平降低或无法检测的癌症。
实施例1.含msp36基因的慢病毒载体的构建和其在转导哺乳动物细胞中能指导生物活性msp36合成的证明人msp36基因可利用聚合酶链反应(PCR)从乳腺cDNA库分离(Marathon-Ready cDNA，BD Biosciences(Clontech)，Palo Alto，CA)。按照厂商说明书，两种引物(例如正向引物5′-actggatccgtgtgctcagaacaag-3′和反向引物5′-tgacatctcttaaaggaacccgttctc-3′)可在Perkin-Elmer 480型热循环仪(shelton，CT)中以37℃退火、72℃延长和94℃变性的条件使用。所得PCR产物克隆入pBluescript II(Stratagene，La Jolla，CA)。
Zufferey等(1998)J.Virol.72，9873-80、Yam等(2002)Mol.Ther.5，479-84和Logan等(2002)Curr.Opin.Bioteclmol.13，429-36中描述了慢病毒载体，而且可通过商业化途径获得，例如ViraPowerTM慢病毒表达系统(Invitrogen)和LentiPakTM(Genetix Pharmaceuticals，Cambridge，MA)。这些载体具有方便的限制性酶切位点以插入cDNA，并包含CMV启动子。人msp36基因与其同源信号序列和poly(A)位点一起被引入。
通过磷酸钙沉淀，共转染载体质粒构建物和2个核心包装质粒和VSV-G包膜质粒。将20ug(450ul)的质粒混合物加入含5×106293细胞(CRL-1573，ATCC，Manassas，VA)的100mm平板中，该细胞在Iscove改良Dulbecco培养基(JRH，Biosciences，Lenexa，KS)和10％FBS中培养。在转染16小时后加入新鲜培养基，在新鲜培养基加入24小时后收获条件培养基。通过低速离心澄清培养基，通过0.2um醋酸纤维素薄膜过滤器过滤，储藏在-80℃。通过使用293细胞有限稀释物的定量PCR，测定病毒制剂的滴度(以转导单位为单位，TU)，并且利用p24衣壳蛋白ELISA试验(Perkin-Elmer)测量总的病毒颗粒。
将慢病毒载体制品(107TU/ml)加入以2×105个细胞接种的HeLa细胞中。在48小时收获培养基，通过ELISA定量msp36蛋白的量。
实施例2.msp36比活的测定按实施例1所示，转染5个293细胞的100mm平板。在转染24和48小时后收获条件培养基，按实施例1中所述的方法收集和处理。鉴定该培养基的p24衣壳蛋白和TU。将条件培养基加入HeLa细胞，如实施例1所述在24和48小时后从这些培养物收获含msp36的条件培养基。
利用旋转柱将培养基浓缩到约10ug/mL的msp36蛋白。通过ELISA定量msp36的产生，并且检测1ug/mL蛋白诱导MCF7乳腺癌细胞中p21表达的能力。在24和72小时时收集细胞，通过蛋白质印迹检测p21。慢病毒指导的msp36诱导P21的水平可与在大肠杆菌中产生的重组msp36相比。
实施例3.体外乳腺癌细胞中的转导效率在1-5的MOI下用包含msp36基因的慢病毒载体转染3种乳腺癌细胞系(MDAMB435、MCF7和T47D)。48小时后收获一半的细胞，通过使用慢病毒载体特异性引物的定量PCR测定被转导的细胞百分率。同样在48小时采集另一半的细胞，用于p21诱导的蛋白质印迹检测。收集培养基并通过ELISA定量msp36蛋白的产生。
实施例4.将基因传递产生的msp36水平与对靶乳腺癌细胞系的有效性关联，终点为a)细胞周期的抑制；b)细胞迁移的抑制；和c)MMP-9分泌的抑制。
软琼脂糖上的无贴壁依赖性生长。与未处理的对照细胞相比，实施例3的msp36转导的MDAMB435和T47D乳腺癌细胞在2.5个星期时在软琼脂糖中显示出无贴壁依赖性生长的抑制(Alley andLieber(1984)Br.J.Cancer 49，225-33)。
细胞形态学检查。与非转导或模拟转导的对照细胞群相比，msp36转导的MDAMB435和T47D乳腺癌细胞显示出形态学改变。可通过ELISA测定转导细胞的msp36产生。此外，这些细胞表达p21，如蛋白质印迹的测定。
使用跨孔迁移试验测定的侵袭潜力降低。可利用24孔BiocoatTMMatrigelTM侵袭室(Becton Dickinson)，用包被Matrigel的8um聚碳酸酯过滤器测定细胞侵袭潜力。将来自实施例3的105个msp36转导的MDAMB435细胞在上室中平板培养48小时。下室含有DMEM+10％FBS，或含有无FBS的DMEM作为对照。在培育后，细胞用3％戊二醛固定，用Giemsa染色。通过擦拭除去滤器上表面的细胞，计数迁移到下室的细胞数。
MMP-9产生的减少。msp36转导的乳腺癌细胞和非转导细胞在1ug/mL msp36-条件培养基的存在下检测。MMP-9的产生通过信号识别蛋白体的受体检测(Yamagata等(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.151，158-62)。
实施例5.通过治疗预先接种了人乳腺癌细胞的裸小鼠以改善肿瘤生长和血管生成，确定基因传递系统所传递的msp36的功效，并比较传递msp36基因与传递msp36蛋白储藏的功效。
检测4个裸小鼠群，每群5只裸小鼠1)未治疗对照；2)用msp36载体治疗；3)用msp36蛋白治疗；4)对照载体。将3×106个MDAMB435肿瘤细胞注射到每只裸小鼠的两个乳房脂肪垫中。在注射肿瘤7-10天后，用注射器将3种浓度(在实施例3中确定)之一的含msp36基因的慢病毒载体注射到一组小鼠的每个肿瘤部位。作为阳性对照，将msp36蛋白注射到单独一组动物的肿瘤部位中。作为阴性对照，将盐水注射至第3组小鼠的肿瘤部位，第4组小鼠注射不含msp36基因的慢病毒载体。每2天进行测径器测量，以检测发育中肿瘤的大小。当肿瘤大小在任何方向达到20mm时(大约5-7周)，处死小鼠并且通过肉眼目测、组织病理学和免疫组化检测原发性肿瘤、引流淋巴结和肺。RT-PCR和PCR测定msp36蛋白表达的存在、msp36RNA转录物的存在和msp36-LV DNA的存在。制备另外的组织切片以通过免疫组化测定CD31，一种与新血管形成相关的蛋白标记。
本文引用的全部文献通过引用整体结合到本文中。
显而易见的是，可对上文所述的本发明进行各种修改而不偏离本发明的范围和精神。
权利要求
1.一种表达多肽的方法，所述方法包括将DNA构建物稳定引入靶哺乳动物细胞，所述DNA构建物包含编码msp36多肽或其功能变体的核苷酸序列，其中所述DNA构建物包含在慢病毒基因传递载体中。
2.权利要求1的方法，其中通过将所述慢病毒基因传递载体注射到包含所述靶哺乳动物细胞的靶组织或器官中，体内将所述DNA构建物引入所述靶哺乳动物细胞中。
3.权利要求1的方法，其中通过所述慢病毒基因传递载体的转导将所述DNA构建物体外引入所述靶哺乳动物细胞中。
4.权利要求1、2或3的方法，其中所述靶哺乳动物细胞是哺乳动物上皮细胞。
5.权利要求1、2或3的方法，其中所述靶哺乳动物细胞是前列腺上皮细胞。
6.权利要求1、2或3的方法，其中所述靶哺乳动物细胞是卵巢上皮细胞。
7.权利要求1、2或3的方法，其中所述靶哺乳动物细胞是肺上皮细胞。
8.权利要求1、2或3的方法，其中所述DNA构建物进一步包含与编码msp36多肽或其功能变体的所述核苷酸序列有效连接的启动子，并且体内或体外在所述靶哺乳动物细胞中是有效的。
9.权利要求8的方法，其中所述启动子是乳腺特异性启动子。
10.权利要求8的方法，其中所述启动子是前列腺特异性启动子。
11.权利要求8的方法，其中所述启动子是卵巢腺特异性启动子。
12.权利要求8的方法，其中所述启动子是肺特异性启动子。
13.权利要求8的方法，其中所述启动子是组成型启动子。
14.权利要求8的方法，其中所述启动子是诱导型启动子。
15.权利要求8的方法，其中所述DNA构建物进一步包含自杀基因。
16.一种抑制哺乳动物中肿瘤生长的方法，其中所述肿瘤在病原学上与msp36基因或多肽缺陷相关，所述方法包括直接给予含有所述肿瘤的靶组织或器官中的细胞慢病毒载体，所述慢病毒载体包含与启动子有效连接的编码msp36多肽的核酸序列，其中所述核酸序列的表达导致肿瘤生长的调节。
17.权利要求16的方法，其中通过将所述载体注射在所述肿瘤部位或其附近来给予所述靶组织或器官所述载体。
18.权利要求16的方法，其中所述肿瘤生长的调节是增强肿瘤的凋亡。
19.权利要求16的方法，其中所述肿瘤生长的调节是降低肿瘤细胞的MMP9合成和/或分泌。
20.权利要求16的方法，其中所述肿瘤生长的调节是在所述肿瘤部位或其附近减少血管生成。
21.权利要求16的方法，其中所述肿瘤生长的调节是降低肿瘤细胞生长速度。
22.权利要求16的方法，其中所述肿瘤生长的调节是降低肿瘤细胞侵袭潜力。
23.权利要求16的方法，所述方法进一步包括选自手术介入、放射治疗、激素治疗、免疫疗法、化学疗法或冷冻疗法的其它治疗。
24.一种具有稳定整合的慢病毒DNA构建物的靶哺乳动物细胞，所述DNA构建物包含编码msp36多肽或其功能变体的核苷酸序列，所述核酸序列与在所述靶哺乳动物细胞中有活性的启动子有效连接。
25.权利要求24的转化靶哺乳动物细胞，其中所述启动子是乳腺特异性的。
26.权利要求24的转化靶哺乳动物细胞，其中所述启动子是前列腺特异性的。
27.权利要求24的转化靶哺乳动物细胞，其中所述启动子是卵巢特异性的。
28.权利要求24的转化靶哺乳动物细胞，其中所述启动子是肺特异性的。
29.权利要求24的转化靶哺乳动物细胞，其中所述启动子为组成型。
30.权利要求24的转化靶哺乳动物细胞，其中所述启动子为诱导型。
31.权利要求24的转化靶哺乳动物细胞，其中所述细胞来自小鼠。
32.权利要求24的转化靶哺乳动物细胞，其中所述细胞来自大鼠。
33.权利要求24的转化靶哺乳动物细胞，其中所述细胞来自人。
34.一种上皮细胞，所述上皮细胞表达通过慢病毒转导引入其中的正常msp36基因。
35.一种用于体内或体外治疗靶细胞中msp36基因缺陷的重组慢病毒载体，所述载体包含与启动子有效连接的正常msp36基因，所述启动子在所述靶细胞中有效。
36.权利要求35的重组载体，所述载体具有复制缺陷。
37.权利要求35的重组载体，其中所述靶细胞是乳房上皮细胞。
38.权利要求35的重组载体，其中所述靶细胞是前列腺上皮细胞。
39.权利要求35的重组载体，其中所述靶细胞是卵巢上皮细胞。
40.权利要求35的重组载体，其中所述靶细胞是肺上皮细胞。
41.一种药物组合物，所述组合物包含权利要求35的载体和药物可接受载体。
全文摘要
慢病毒载体有利地用于传递表达的MSP36基因，用于治疗癌症。
文档编号A61K48/00GK1921892SQ200480037000
公开日2007年2月28日 申请日期2004年10月18日 优先权日2003年10月17日
发明者P·托曼 申请人:艾克蒂斯生物公司