检测免疫反应的方法

专利名称：检测免疫反应的方法
技术领域：
本发明涉及检测化合物的免疫反应的方法，尤其是在筛选用于治疗疾病的化合物中。
背景技术：
传统上，转化的永生免疫细胞系一直用作药物筛选的效应物。例如，巨噬细胞系(RAW 264.7)在免疫调节和抗癌药物筛选领域中是一种最常用的细胞系。然而，这种方案可能忽视重要的原则广谱免疫调节反应的开始要求巨噬细胞，B细胞和T细胞的间接相互作用。结果，具有潜力担当免疫调节药的化学物和/或药物在这些“传统的”筛选体系中会轻易地得出不能诱导癌细胞系的凋亡和/或抗癌细胞因子(例如，TNF-α)的分泌，因为它们的活化途径中缺乏一些必要组分。因此，它们不能显示出作为免疫调节药物的真正潜力。
发明目的本发明的目的是解决现有技术所述的至少一种或多种问题。最低程度，本发明的目的是给公众提供一种有用的选择。
发明概述本发明提供检测物质的免疫反应的方法，包括将所述化合物与有生存能力的脾细胞温育的步骤。
优选地，有生存能力的脾细胞抽提自大鼠。
优选地，所述物质与脾细胞在缓冲液中于约20-40℃，更优选约37℃下温育。
另外，与有生存能力的脾细胞温育的物质通过两维聚丙烯酰胺凝胶电泳(2DE)进行分析，优选以检测至少一种下列蛋白的产量TNF-α，IFN-γ和iNOS，hoemotic蛋白LH-2，细胞色素C氧化酶多肽IV前体，DNA聚合酶β，鸟嘌呤核苷酸-结合蛋白G，T-细胞表面糖蛋白CD5前体以及α-甘露糖苷酶II。
优选地，所述物质与脾细胞在缓冲液中于pH约5-9，更优选于pH约7下温育。
附图简述本发明优选的实施方案通过实施例方式并参照附图现将加以解释，在附图中

图1利用Wright-Giemsa染色(X1000)示出分离的脾细胞；图2示出Rg1对TNF-α，IFN-γ分泌和iNOS合成的影响，图2A，2B和2C分别示出Rg1处理后TNF-α，IFN-γ分泌和iNOS合成的免疫印迹；图3示出采用和没采用Rg1(5μg/ml)处理后从脾细胞中分泌TNF-α和IFN-γ的时程；图4示出通过“二位一体(Two-in-One)凝胶”比较，在Rg1存在或缺乏下，脾细胞中的差异蛋白表达。Rg1处理样品示于左边，而对照样品示于右边。4A示出pH 4-5.5的样品，而4B示出pH 5.5-7的样品；图5示出通过总结Rg1对脾细胞蛋白表达的影响，Rg1对脾细胞中蛋白表达的影响，以及涉及Rg1对脾细胞的免疫调节活性的可能的调节机理。
优选实施方案的详述本发明参照附图通过实施例方式在以下段落中加以描述。
本发明的目的，特征和方面在下文中公开，或者从下文中显而易见。本领域普通技术人员应理解，下文仅是对示例性实施方案的描述，并非旨在限制本发明的范围，更宽的范围体现在代表性解释中。
在本发明中，与传统利用细胞系的方法相反，脾细胞原始培养物用于药物筛选中。这种脾细胞培养物含有全部3种对起始广谱免疫反应所必需的免疫细胞(约30％B淋巴细胞，60％CD3+T淋巴细胞和5％巨噬细胞)。这类脾细胞可抽提自任何适于药物筛选的哺乳动物，例如大鼠，狗，猫，小鼠，豚鼠，牛，鹿，猴子等。
为了实施药物筛选功能，脾细胞必须是有生存能力的。术语“有生存能力”在此表示脾细胞仍是活的，对此现有技术能够操作。这种有生存能力的细胞在细胞和0.4％w/v台盼蓝溶液1∶1的混合物中不会被台盼蓝染色。有生存能力的脾细胞可采用已知方法从动物中去除，合适的实施例将在下文中进行描述。非生存能力的细胞在筛选平台上不可用作效应物，因为它们不能被药物候选物刺激，和/或彼此有效相互作用。有生存能力的脾细胞通常可在动物细胞培养工作所常用的大多数培养基中令人满意地加以培育。然而，脾细胞不可经受极端温度范围(即低于20℃和高于40℃)。有生存能力的脾细胞的最适温度为37℃。此外，如果培养基处于极端pH(即高于pH 9和低于pH 5)下，脾细胞的生存力也将下降。
待检测的化合物一般以溶液的形式存在，然后通过多种方法将其施用给有生存能力的脾细胞。例如，化合物(没有内毒素污染)可被直接添加到有生存能力的脾细胞上。这当然会随待检测化合物的不同而不同，但是将化合物添加给脾细胞不是本发明的主题。
在检测人参Rg1的免疫反应中采用有生存能力的脾细胞将在下文详细描述。
实施例高度纯化的Rg1为人参中一种主要的皂角苷，已经显示可抑制癌细胞的生长。其刺激DNA，蛋白和脂类在动物组织中的生化合成。Rg1还显示担当免疫调节剂，使得内皮细胞中一氧化氮产量在Rg1诱导后增加，T辅助细胞活性，细胞因子IL-1以及自然杀伤细胞的产量增加。其他属性包括选择性增强淋巴细胞的增殖和IL-2的产生。假设人参苷(ginsenoside)抗致癌效应可能与或通过胱冬肽酶(caspase)3和/或由活性氧起始的凋亡效应相关。尽管对人参效应的研究历史悠久，但其作用的分子机理大部分仍知之甚少。
材料和方法动物周龄8-10、体重200g的雄性Sprague Dawley大鼠由香港理工大学应用生物和化学技术系动物中心(the animal holding center of theDepartment of Applied Biology and Chemical Technology，The HongKong Polytechnic University)提供。所有研究都是根据最新公布的对实验室动物护理和使用的NIH指南(the NIH Guide for the Care and Useof Laboratory Animals)中所述的原理和程序进行的。动物伦理学批文已从香港理工大学动物伦理学分委员会获得。
制备大鼠脾细胞将大鼠在醚深度麻醉下放置，并经腹部大动脉放血。通过无菌技术移出脾脏，接着在10ml含有1000U/ml青霉素-链霉素(PS)(Gibco，USA)的RPMI-1640(Gibco，USA)培养基中洗涤两次。把脾脏切成小块后，在塑料注射器中用柱塞上下抽吸。制备单个细胞悬浮液，并放置在含有1000U/ml PS和5％柠檬酸葡萄糖的同样培养基中。然后通过梯度离心将单细胞悬浮液分层到Ficoll-Pague Plus梯度(Amersham Bioscience，H.K.Ltd.)上而分离脾细胞，室温下以400g离心35分钟。收集含脾细胞的组分。室温下加入4倍体积的冰冷氯化铵溶液(pH 7.4)而裂解红细胞5分钟，将脾细胞在普通培养基中洗涤两次。淋巴细胞用Wright-Giema着色剂染色后，再在光学显微镜下检查。台盼蓝染色后，经光学显微镜检查细胞生存力和数目。将脾细胞(1×106)培养在含有1000U/ml PS、补充有2g/L碳酸钠的完全RPMI-1640培养基上。24小时温育后，使细胞重悬浮在含有10％FCS(Gibco，USA)的同样培养基上，并进行多种处理。
用Rg1刺激脾细胞将Rg1(常用剂量5μg/ml)加入到位于37℃、5％CO2培养箱内6孔平底板(Nunc Maxisorp，USA)上脾细胞的PBS缓冲液中。在不同时间点(12-72小时)从温育混合物中采集条件培养基的样品。这些样品储存在-80℃备用。样品保存不超过两个月。此外，在Rg1处理的脾细胞的样品(间隔12和24小时)中使用2-DE分析也进行全蛋白的表达。与PBS温育24小时的细胞用作对照。
Western印迹和免疫检测在不同时间点采集与Rg1温育和没有与Rg1温育的脾细胞培养物的上清液，并且用于检测TNF-α和IFN-γ。同样，脾细胞裂解液用于检测iNOS的表达。上清液/裂解液中的蛋白含量通过Bradford方法(Bio-Rad Laboratory，USA)确定。对于各个分析，通过12.5％还原性SDS-PAGE胶在恒压(150V)下电泳1小时，分析350μg蛋白。蛋白转移至硝酸纤维素膜(Millipore，USA)上。洗涤和封闭后，以1∶500的稀释度，对这些膜用下列探针进行检查兔抗大鼠iNOS(Transduction Laboratories，USA)，兔抗大鼠TNF-α(PropTech，USA)或兔抗大鼠IFN-γ(PropTech，USA)。室温温育2小时后，洗涤这些膜，然后与1∶20,000稀释的结合有IgG(Sigma，USA)的山羊抗兔辣根过氧化物酶(HRP)温育。使用SuperSignal West PicoChemiluminescent试剂盒(Pierce，USA)检测阳性结合，而使用分子动力学密度仪(Molecular Dynamics Densitometer)(Bio-RadLaboratories，USA)扫描曝光的X线胶片(Kodak)。
ELISA测定使用OptEIATM大鼠IFN-γ和TNF-α试剂盒(Pharmigen，USA)进行IFN-γ以及TNF-αELISA测定。对使用或没用Rg1刺激的脾细胞进行检测。在这些试剂盒中，单克隆抗大鼠IFN-γ或TNF-α抗体用作一级抗体，而生物素酰化的单克隆抗大鼠IFN-γ或TNF-α抗体用作二级抗体。加入亲和素-HRP结合物后，再加入2，2-Azin-bis-3-thylbenzthiazoline-6-sulfonic acid显色，并且采用微滴定板读数仪(Bio-Rad Laboratories，USA)在吸光度405nm处监测颜色变化。与标准相比，计算IFN-γ和TNF-α的量。
2-DE分析脾细胞裂解液样品制备在与或不与Rg1温育后，将培养皿上的脾细胞以RPMI-1640冲洗一遍。随后，加入含有0.2g/L EDTA的0.5g/L胰蛋白酶，温育3分钟。以1000g离心5分钟收集细胞，并用PBS(pH 7.2)洗涤两次。然后将脾细胞用最低量的含有4％Triton X-100，9M尿素和1mMPMSF的裂解缓冲液(通常200μl)在冰上裂解10分钟。以3000g离心10分钟收集上清液，采用Bio-Rad Laboratories，USA的蛋白分析试剂盒通过改进的Bradford法测量蛋白含量。经同样处理的不同动物的细胞裂解液以1∶1的蛋白比率合并在一起，并用作2-DE分析。120μl的脾细胞裂解液[在含有9M尿素，2％w/v Triton X-100，0.5％w/vDDT(Sigma，USA)，0.4％v/v IPG缓冲液4-7(Amersham PharmaciaBiotech，Uppsala，Sweden)和痕量溴酚兰的缓冲液中至终体积300μl中]用于胶内样品再水合。
2-DE把样品上样到IPG胶条pH 4-7(3×170mm，Bio-RadLaboratories，USA)。使用Protean IEF仪(Bio-Rad Laboratories，USA)或IPGphor(Amersham Biosciences，USA)进行再水合和随后的等电聚焦。室温下在覆盖有低粘度石蜡油的IPG胶条固定器上以50V进行再水合16小时。然后依序使用500V(1小时)，1000V(1小时)，4000V(2小时)和8000V(2小时)进行等电聚焦。胶条平衡在pH 6.8，含有1％(w/v)DTT(Sigma，USA)、9M尿素、30％v/v甘油、2％w/vSDS和痕量溴酚兰的50mM Tris-HCl平衡缓冲液中10分钟。平衡后，IPG胶条转移至12.5％SDS-PAGE凝胶(1600×1600×1mm)，用于在Protean VI电泳槽中室温下以恒电流30mA/凝胶电泳进行第二维分离。随后，使用与MALDI-TOF分析相容的方法对胶银染。银染的胶以分子动力学密度仪(Bio-Rad Laboratories，USA)扫描。所得2-DE形式采用软件Melanie III(Bio-Rad Laboratories，USA)加以分析。在银染蛋白点中以体积百分比变化的基础上，对相对量的变化进行评价。目的点变化在多凝胶上测试用于重现性。
银染使蛋白显现按本发明人使用MALDI-TOF质谱仪的制造商Bruker Deltonics(USA)所建议的质谱仪相容的方案进行银染。简而言之，首先将凝胶在含有50％v/v甲醇，12％v/v乙酸，0.0375％v/v甲醛的固定溶液中固定2小时。随后用50％甲醇另洗涤凝胶20分钟。洗涤步骤重复两次。凝胶在含有0.05％硫代硫酸二钠的溶液中氧化1分钟，接着用milli-Q水洗涤(三次，每次20分钟)。把凝胶在含有0.0375％甲醛的0.2％硝酸银中温育20分钟。再次用milli-Q水洗涤凝胶三次，每次20分钟。然后在含有0.0375％甲醛和0.004％硫代硫酸二钠的15％碳酸钠溶液中使凝胶显色，直到凝胶达到所需量的染色。该过程不应长于10分钟。最后，用含有12％乙酸的25％甲醇终止反应。
蛋白鉴定或通过软件Melanie III(Bio-Rad，USA)进行图像分析，或直接利用如前所述的“二位一体”胶法(Wang，A.Y.Y.，Cheung，B.Y.，Wong，M.S.，Lo，S.C.L.两维电泳后“二位一体”凝胶用于点匹配，Proteomics2003，3，580-583)加以比较，而将不同处理后差异表达的蛋白定位于2-DE凝胶上。使用MALDI-TOF-MS(Autoflex，Bruker Daltonics，Germany)通过肽质量指纹识别选择和鉴定若干种差异表达的蛋白点。含有差异表达的蛋白点的胶塞从2-DE凝胶上切去，并用胰蛋白酶消化(采用由Bruker Daltonics，Germany建议的方案，该方案是如先前由Shevchenko等(Shevchenko A，Wilm M，Vorm O，Mann M.质谱测序蛋白银染的聚丙烯酰胺凝胶。Aanl.Chem.68850-8，1996)所述方法的改进)。简而言之，胶塞被切成小块，用milli-Q水洗涤两次，接着用25mM碳酸氢铵的50％乙腈洗涤。样品中的半胱氨酸残基用10mMDTT还原，并用55mM碘代乙酰胺处理而衍生化。乙腈再水合和干燥后，样品用胰蛋白酶(5ng/μl胰蛋白酶的25mM碳酸氢铵)37℃下消化过夜。消化样品用50％乙腈/1％三氟乙酸通过超声抽提。收集含有消化的肽的上清液。消化的肽(0.5μl-1.5μl)与1-2μl的α-氰基-4-羟基肉桂酸(10mg/ml的50％乙腈，0.1％三氟乙酸)基质和100fM促肾上腺皮质激素(ATCH)片段18-39混合作为内标。仪器以阳离子反射方式在20kV加速压下操作。所得肽质量指纹使用矩阵科学(Matrix Science)的MSCOT搜索引擎对Swiss-Prot进行检索。所有检索都使用1-100kDa的质量窗以质量公差±100ppm进行。每个样品允许有一个失误切割，而半胱氨酸假定是氨基甲酰胺基甲基化的，以及甲硫氨酸为氧化形式。
结果脾细胞分离如上文方法所述制备脾细胞，并在Wright-Giemsa染色后检查细胞。采用Leica Q500MC成像处理和分析系统(Leica，Germany)，分离的脾细胞(大和小淋巴细胞)图像示于图1中。未见红细胞污染。台盼蓝染色证实95％以上的分离细胞是有生存能力的。由于大和小淋巴细胞皆存在，该制备物可用作研究Rg1的免疫调节活性的效应物。
根据IFN-γ，TNF-α和iNOS产量测定Rg1对脾细胞的影响在成功制备有生存能力的脾细胞之后，加入Rg1作为刺激物以研究这些脾细胞可能的反应。Western印迹检测IFN-γ和TNF-α在培养基中的分泌。iNOS的表达也在脾细胞裂解液中加以测试。大多数药理学研究Rg1所用的浓度为5-20μg/ml。一方面，预备研究利用5μg/ml的Rg1，导致在IFN-γ和TNF-α试验中的阳性结果。因此，5μg/ml的Rg1用于本发明人试验中。IFN-γ，TNF-α和iNOS在不同时间间隔处Rg1诱导时Western印迹的结果示于图2(2A为TNF-α，2B为IFN-γ，而2C为iNOS)中。没有Rg1处理的脾细胞用作比较用对照。结果显示，对照组在72小时的温育过程中，细胞培养基或脾细胞裂解液均未检测到IFN-γ，TNF-α和iNOS。另一方面，当用5μg/ml Rg1刺激时，可检测到两个细胞因子和iNOS。TNF-α在间隔24小时和48小时皆被检测到，而IFN-γ在24小时被检测到。诱导的NOS在用Rg1温育后12小时和24小时被检测到。随后，利用ELISA对培养基的系列样品进行这些抗癌细胞因子(IFN-γ和TNF-α)的定量记录。各个条件重复测定三次，结果示于图3中。两个细胞因子的分泌方式诱导后很相似。这些细胞因子的数量在Rg1诱导后增加1000倍以上，而其水平在温育24小时时达到最高。24小时后，两个细胞因子分泌水平随着温育时间延长开始下降。该结果也与Western印迹的结果一致，在Western印迹中，最高的IFN-γ和TNF-α分泌出现在Rg1诱导后24小时处。
Rg1对蛋白表达的影响由于Rg1发现在温育24小时后诱导IFN-γ和TNF-α生产，因此在温育24小时后还研究了Rg1对脾细胞蛋白质组(proteome)的影响。同样处理的样品以1∶1的蛋白比率合并，并用于如材料和方法中所述的2-DE分析。无论在PBS还是在含有Rg1的PBS中，全部样品皆在温育24小时后采集。与PBS温育的样品用作比较用对照。为了便于鉴定差异表达的蛋白，如前所述(Wang等，2003)进行“二位一体”凝胶方法。简而言之，样品第一维IEF(使用或没用Rg1温育)分开在不同Protean IEF细胞中但同时进行。IEF完成后，将IEF胶条切成等半。半份IEF胶条对应于同样的pH范围，但以不同样品(有或无Rg1温育)电泳，并排放到Protean VI电泳装置中制备的第二维SDS-PAGE的顶部。所得对照样品的凝胶和Rg1处理样品的凝胶在银染后利用Melanin III加以比较。图4表明蛋白表达在正常样品和Rg1处理样品中的差异。在用正常样品电泳的一半凝胶中约有102个蛋白点被检测，而在用Rg1处理的样品电泳的另一半凝胶中有122个蛋白点被检测。
蛋白鉴定在凝胶内胰蛋白酶消化后，MALDI-TOF-MS用于鉴定差异表达的蛋白。7个差异表达的蛋白点通过MASCOT搜索引擎得以成功鉴定。6个蛋白被上调，包括细胞色素C氧化酶，homeotic蛋白LH-2，T细胞表面糖蛋白CD5，DNA聚合酶β，α-甘露糖苷酶II以及鸟嘌呤核苷酸结合蛋白G。其他蛋白发现是下调的，并且被鉴定为假设的抗增殖因子。7个鉴定的蛋白的详情汇总在表1中。
表I.脾细胞的差异表达的蛋白点的身份。
讨论大鼠脾细胞由巨噬细胞，T细胞和B细胞组成。这群细胞用作效应物对Rg1是否存在免疫调节活性进行测试。利用Western印迹和ELISA，发现Rg1刺激了脾细胞的IFN-γ，TNF-α和iNOS的产生。Rg1诱导后，IFN-γ和TNF-α的产量在24小时达到峰值。本发明人的结果与Gao等(Gao H.，Wang，F.，Lien，E.J.，Trousdale M.D.PharmaceuticalResearch 1996，13，1196-200)的报道相似，其中在用三七(Panaxnotoginseng)的粗制品对分离自小鼠脾脏的淋巴细胞诱导后24小时和48小时检测到最高量的IFN-γ和TNF-α。在本发明人的试验中，对IFN-γ和TNF-α的产生达到其峰值的时间较短。这可能是由于下列事实纯化的Rg1而非粗制品用于本发明人的研究中。
另一方面，Rg1对分子水平的作用方式可能已被揭示出来，这在其他研究中尚未发现。脾细胞中的差异蛋白表达通过Rg1诱导加以研究。基于直接比较“二位一体”凝胶的蛋白表达，发现了蛋白表达在正常样品和Rg1处理样品之间的显著变化。有87个蛋白发现是上调的，而另有38个蛋白发现是下调的。还有38个点没有任何显著的变化。
胰蛋白酶消化后，利用MALDI-TOF-MS对差异表达蛋白进行了选择和鉴定。有7个蛋白成功地得以鉴定，其中6个是上调蛋白。它们是细胞色素C氧化酶，homeotic蛋白LH-2，T细胞表面糖蛋白CD5，DNA聚合酶β，α-甘露糖苷酶II以及鸟嘌呤核苷酸结合蛋白G。剩余蛋白点(假设的抗增殖因子)发现是下调的。从文献中可知，DNA聚合酶β相关于DNA合成。其上调表明Rg1刺激DNA合成。该刺激是否通过类固醇激素依赖的或不依赖的途径介导现在还未知。Rg1对DNA合成的刺激效果也在大鼠和小鼠骨髓细胞中被观察到。另一方面，还有两个上调蛋白homeotic蛋白LH-2和T细胞表面糖蛋白CD5已知参与B细胞和T细胞增殖。据报道，homeotic蛋白LH-2是B淋巴细胞分化的早期标记，也参与控制B细胞分化(Xu，Y.，Baldassare，M.，Fisher，P.，Rathbun，G.，Oltz，E.M.，Yancopoulos，G.D.，Jessell，T.M.，Alt，F.W.Proc Natl Acad Sci USA.，1993，90，227-31)。T细胞表面糖蛋白CD5为一跨膜蛋白，已知在调节T细胞增殖中担当受体(Vermeer，L.A.，deBoer，N.K.，Bucci，C.，Bos，N.A.，Kroese，F.G.，Alberti，S.Eur.J.Immunol.1994，24，585-92)。另两个鉴定的上调蛋白细胞色素C氧化酶和α-甘露糖苷酶II可能参与细胞代谢过程。细胞色素C氧化酶是一种参与呼吸链的氧化性磷酸化作用的线粒体膜酶(Kadenbach，B.Biochim.Biophys.Acta 2003，1604，77-94)。由于ATP是呼吸过程的终产物之一，当细胞色素C增加时ATP的合成也很可能增加。已知细胞内高的ATP含量归功于细胞生长和增殖用的能量供应。细胞色素C氧化酶还参与cAMP生成的跨膜信号传导途径(Frizzell，R.A.Am J Respir Crit Care Med.1995，151，S54-8)。α-甘露糖苷酶II为高尔基膜蛋白，控制甘露糖转化为复合的N-glycon。其可能参与溶酶体合成，因为注定为溶酶体的蛋白在高尔基体内通过加入6-磷酸甘露糖被共价修饰。然而，其真正的功能还不清楚。
鸟嘌呤核苷酸结合蛋白G是另一上调蛋白，为膜相关蛋白，其将许多类型的膜受体连接到多种第二信使系统上(Gilman，A.G.Ann.Rev.Biochem.1987，56，615-49)。β和γ亚基为把α亚基(一种外周蛋白)固定至质膜上的疏水整合膜蛋白。已知G蛋白的一个组分Gsα·GTP能够结合到腺苷酰基环化酶，这刺激cAMP的产生(Lania，A.，Mantovani，G.，Spada，A.Eur.J.Endocrin.2001，145，543-559)。据报道，Rg1可增加老年动物中胞内cAMP和cGMP，导致白介素2(IL-2)的表达以及脾细胞增殖(Liu M.，Zhang J.T.Yao Xue Xue Bao，1996，31，95-100)。因此，鸟嘌呤核苷酸结合蛋白G的上调可能暗示cAMP水平相应的增加，而这又诱导IL-2表达和脾细胞增殖的相应增加。假设的抗增殖因子，尽管其真正的功能还未确立，但据信抑制细胞增殖。因此，这种蛋白在Rg1处理后的下调表明细胞增殖的机会增加。
上述结果还显示，Rg1处理后12小时和24小时检测到iNOS。诱导的NOS已知产生一氧化氮，其在诸如血管舒张、抑制血小板聚集和神经传递的不同生理过程中起重要作用。一氧化氮也已知担当细胞毒介导剂，并且归功于巨噬细胞的杀菌和杀肿瘤活性[36]。因此，iNOS的上调可用于评价细胞的杀菌活性。这种酶的产生可能受到细胞因子(IFN-γ和TNF-α)的调节。Karupiah等报道了病毒复制受到IFN-γ诱导的NOS的抑制(Karupiah，G.，Xie，Q.W.，Buller，R.M.，Nathan，C.，Duarte，C.，MacMicking，J.D.Science 1993，261，1445-48)。这些研究人员提出了诱导NOS对于IFN-γ的实际抗病毒效果是必需和足够的。文献中还清楚记载了IFN-γ可与TNF-α协同作用，促进iNOS的基因表达。此外，细胞色素C氧化酶和ATP在Rg1处理后的增加可能还增加iNOS的生成。蛋白激酶C(PKC)活性对于iNOS表达是必要的，其中PKC在结合到膜受体的过程中需要ATP。还已知PKC-介导的信号传导刺激G蛋白的活性。因此，iNOS的增加也会导致IL-2，IFN-γ和TNF-α的量的增加。7种鉴定的蛋白以及IL-2，IFN-γ，TNF-α和iNOS可能的相互作用所显现出的免疫调节效果汇总在图5中。
总之，免疫调节是一复杂的活动，涉及多种蛋白和细胞组分之间的相互作用。使用脾细胞对Rg1免疫调节活性进行筛选已证明在了解涉及Rg1免疫调节的机理方面是成功的。本发明可提供大规模筛选免疫调节用TCM以及癌症治疗新药物的构思。
尽管本发明的优选实施方案已通过实施例详细描述，但是显而易见，本领域技术人员会对此进行修饰和改进。另外，本发明的实施方案不应解释为仅受到实施例或附图的限制。然而，特别值得注意的是，这些修饰和改进也落入本发明的范围内，正如权利要求书所述。例如，作为一个实施方案的部分所述的特征可用于另一实施方案中从而产生其他实施方案。因此，本发明旨在覆盖如同在权利要求的范围内的这些修饰和变化及其等同物。
权利要求
1.一种检测物质对生物体的工作机理的方法，包括将该化合物与有生存能力的脾细胞温育的步骤。
2.权利要求1的方法，其中有生存能力的脾细胞抽提自大鼠。
3.权利要求1的方法，其中该物质与脾细胞在缓冲液中约20-40℃下温育。
4.权利要求3的方法，其中该物质与脾细胞在缓冲液中约37℃下温育。
5.权利要求1的方法，其进一步包括通过两维聚丙烯酰胺凝胶电泳分析与有生存能力的脾细胞温育的物质的步骤。
6.权利要求5的方法，其进一步包括检测至少一种下列蛋白和/或其前体和/或其分解产物产量的步骤TNF-α，IFN-γ和iNOS，hoemotic蛋白LH-2，细胞色素C氧化酶多肽IV前体，DNA聚合酶β，鸟嘌呤核苷酸-结合蛋白G，T-细胞表面糖蛋白CD5前体以及α-甘露糖苷酶II。
7.权利要求1的方法，其中该物质与脾细胞在缓冲液中pH约5-9下温育。
8.权利要求7的方法，其中该物质与脾细胞在缓冲液中pH约7下温育。
9.权利要求1的方法，其中工作机理为免疫反应。
全文摘要
传统上，转化的永生免疫细胞系一直用作药物筛选的效应物。这种方案可能忽视重要的原则广谱免疫调节反应的开始要求巨噬细胞，B细胞和T细胞的间接相互作用。本发明利用有生存能力的脾细胞提供检测物质的免疫反应的方法。
文档编号A61P37/00GK1645143SQ20051000420
公开日2005年7月27日 申请日期2005年1月14日 优先权日2004年1月14日
发明者卢俊立, 黄文秀, 王渊渊 申请人:香港理工大学