专利名称：栉孔扇贝h2a基因克隆与n末端表达技术的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学技术领域，涉及栉孔扇贝H2A基因克隆与N末端表达技术，具体地说是从栉孔扇贝基因组中克隆出栉孔扇贝组蛋白基因H2A的DNA全序列和氨基酸序列，还涉及到该基因及其N末端在药物生产、饲料添加剂以及防腐剂和保鲜剂生产中的应用。
背景技术：
抗菌肽是一类广泛存在于整个生物界中的双亲性小分子碱性多肽，是机体先天免疫的关键因子。Steiner最早在天蚕中发现后，到目前为止，在各种生物中总共发现了800多种抗菌肽。根据抗菌肽的序列、二级结构和抗菌特性等，将已发现的抗菌肽分为四大类(1)不含半胱氨酸的线型抗菌肽，如天蚕素、马盖宁等；(2)具有半胱氨酸的环型抗菌肽，如防御素，抗真菌肽等；(3)富含某一种或两种氨基酸的抗菌肽，主要包括富含脯氨酸的抗菌肽以及富含甘氨酸的抗菌肽等；(4)由前体大分子酶解产生的抗菌肽，如肢口纲中鲎的血蓝蛋白。前三类抗菌肽均是由核基因独立编码，其表达调控多在转录水平，目前研究相对较多，而对第四类抗菌肽分子的表达调控多在翻译后水平，依赖于前体分子和相应的特异性酶，目前研究工作相对滞后，在扇贝中的研究更是完全空白。组蛋白(histones)是指染色体中的碱性蛋白质，是机体组成性表达的蛋白，该蛋白的H2A的N末端富含二种碱性氨基酸(赖氨酸和精氨酸)，这些强极性氨基酸使其带上大量电荷，等电点(pI)大于10.5，耐热，100℃处理一般不破坏抑菌活性。这些性质正是抗菌肽分子所具有的一般特征，推测其可能具有成为抗菌肽前体的可能。
抗菌肽的作用机理与传统抗生素不同，它的靶位点主要是病原体细胞膜，因此不易产生抗性，并且抗菌肽对真核细胞几乎没有毒副作用，仅仅作用于原核细胞和发生病变的真核细胞。抗菌肽不仅作用于革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌，而且也作用于真菌、原虫、某些病毒和肿瘤细胞，同时，还能加速免疫和伤口愈合过程。由于病原菌对抗生素逐步产生抗药性，抗菌肽为开发新的抗细菌、抗真菌、抗病毒和抗肿瘤药物开辟了广阔的前景。国外目前已有4种抗菌肽药物进入III期临床，2种进入II期临床测试。
此外，把抗菌肽基因导入植物体，使之整合到染色体基因组上，产生抗病的植物体已取得可喜进展。因此，抗菌肽的研究不仅在理论上具有重要意义，而且在实践上具有巨大的潜力。
扇贝养殖是我国传统的海水养殖产业，是我国海水养殖和沿海地区经济发展的支柱性产业。但从1994年以来，养殖贝类开始出现大规模死亡现象，经济损失十分惨重。养殖贝类病害的不断爆发及病因的多样性迫切要求从扇贝本身的免疫防御因子入手研究其抗病机制和制定新的疾病防治措施。扇贝的防御机制主要依赖血细胞的活动，包括吞噬和包裹外来物质，合成抗菌肽并释放到血淋巴。抗菌肽在软体动物上的研究始于1996年，Charlet等从贻贝(Mytilus Edulis)中分离到了富含半胱氨酸的贻贝素(mytilin)和贻贝霉素(mytimicin)，氨基酸序列比对表明与昆虫抗菌肽有较高的相似性。Hubert从贻贝(Mytilus galloprovincialis)纯化到含4对二硫键的MGD1，其具有广谱的抗G+和G-活性，随后MGD1在发育过程中的表达、细胞内定位及空间结构与活性的关系都进行了相关的研究。国内在贝类抗菌肽方面的报道仅见于魏玉西等从菲律宾蛤仔(Ruditapesphilippinesis)血淋巴中纯化到的一种具有抗菌活性的蛋白。
发明内容
本发明的目的是从栉孔扇贝中克隆到H2A基因，为进一步研究栉孔扇贝新颖的防御机制提供基础，并为栉孔扇贝的病害防治、基因辅助选育及进一步开发为医药产品和饲料添加剂奠定基础。
本发明利用构建基因组文库、同源克隆以及体外重组表达等技术，对栉孔扇贝H2A基因及其N末端多肽进行了研究，首次从栉孔扇贝中克隆到H2A基因全长，该基因具有序列表中所示的序列，并首次利用同源克隆技术和体外重组表达技术从栉孔扇贝中表达了具有较强抑菌效果的组蛋白N末端活性多肽。
本发明从栉孔扇贝中克隆到H2A基因，该基因的基因组序列和该基因编码的氨基酸序列以及其中的部分序列，该基因基因组DNA有一个375bp的开放阅读框，编码125个氨基酸，3’非编码区长包含有两个终止信号，即茎环结构和多聚腺苷酸加尾信号。利用pPIC9K表达载体在毕赤酵母中表达了该蛋白N末端的39aa，表达产物对革兰氏阳性细菌藤黄微球菌、革兰氏阴性菌亮弧菌和毕赤酵母均具有明显的抑菌活性。它具有SEQ ID NO 1所示的序列序列表(1)SEQ ID NO 1的信息序列特征长度606碱基对类型核酸链型双链拓扑结构线形分子类型DNA来源栉孔扇贝(Chlamys farreri)序列描述ATGTCTGGACGAGGAAAGGGAGGAAAAGTTAAGGGAAAGGCAAAGAGCCGATCATCCCGTGCCGGGCTTCAGTTTCCAGTCGGACGTATCCATCGTCTGCTCCGTAAGGGAAACTATGCCGAGAGAGTTGGAGCCGGTGCCCCAGTCTACTTGGCTGCTGTCCTCGAGTACTTAGCTGCTGAGGTTTTGGAATTGGCAGGAAACGCCGCTAGAGATAACAAGAAGACCAGGATCATCCCCCGTCATCTCCAGTTGGCTATCAGGAACGACGAGGAGTTGAACAAACTGCTGTCCGGTGTCACCATTGCCCAGGGTGGTGTTCTGCCAAACATCCAGGCTGTCCTTCTCCCCAAGAAGACCCAGAAACCTGCCAAGTAAACAGTTCCGGCGTCATTTGGCTCCACACAAAACGGCCCTTTTCAGGGCCACCCACATTACTCAAAAAGTATCCTTATGAACTACCTCGAAATTATACGCAAAAAAAAAACAACAACAAGAACAAACAAACACAGGTCCATTATTCTCGGATATAAGTACACAAAAATGACAAATACATTACAACAGTACACATGATAACACAAGGCATTAGAAACAAAACAAAATAAA(2)SEQ ID NO 2的信息序列特征长度125个氨基酸类型氨基酸链型单链拓扑结构线形来源栉孔扇贝(Chlamys farreri)序列描述MSGRGKGGKVKGKAKSRSSRAGLQFPVGRIHRLLRKGNYAERVGAGAPVYLAAVLEYLAAEVLELAGNAARDNKKTRI IPRHLQLAIRNDEELNKLLSGVTIAQGGVLPNIQAVLLPKKTQKPAK本发明的栉孔扇贝H2A基因的克隆方法以及其N末端39aa的体外重组表达，包括下列步骤a)栉孔扇贝基因组文库的构建；b)栉孔扇贝H2A基因的同源克隆；c)栉孔扇贝H2A的N末端表达载体的构建；d)栉孔扇贝H2A的N末端表达产物的抑菌试验。
本发明从栉孔扇贝中克隆到H2A基因及其N末端体外重组的方法包括(1)栉孔扇贝基因组DNA的提取及纯化；(2)栉孔扇贝基因组文库构建；(3)栉孔扇贝H2A特异性的兼并引物的设计及扩增；(4)栉孔扇贝H2A蛋白N末端39aa的体外重组表达；(5)表达产物的活性分析。
具体操作如下1、栉孔扇贝基因组DNA的提取及纯化利用北京赛百盛科技有限公司的DNA提取纯化Kit从栉孔扇贝肌肉柱中提取总DNA，利用Bechman730分光光度计确定提取的DNA的质量。
2、栉孔扇贝基因组文库构建其特征在于，所述的基因组文库构建利用Clontech公司Universal GenomeWalkerTMKit3、栉孔扇贝H2A基因DNA全长序列的克隆根据已经获得的H2A的氨基酸序列，利用多序列比对软件，找出其保守的氨基酸位点，设计相应的兼并引物GSPF5’-AAYGAYGARGARYTRAAYAA-3’和特异性的接头引物Adaptor primer1GTAATACGACTCACTATAGGGC；Adaptor primer2ACTATAGGGCACGCGTGGT，PCR扩增，PCR产物用1.0％琼脂糖电泳进行检测，用胶回收试剂盒(上海中科开瑞生物芯片公司)进行PCR产物的回收和纯化，再与pMD-18T simple载体(大连宝生物工程有限公司)连接，转化XL1-blue菌株，挑选阳性克隆提取质粒，用载体引物和特异性引物进行PCR检测，确认插入片段大小后进行序列测定。测得的序列经BLAST(HTTP//WWW.NCBI.NLM.GOV.BLAST)分析拼接后得到全长序列。
PCR扩增所用体系以及反应条件25μl反应体系2.5μl 10×PCR buffer1.0μl MgCl2(2.5mM)2.0μl dNTP(2.5mM)1μl引物GSPF(10pmol/μl)1μl引物Adaptor primer(10pmol/μl)16.3μl of PCR-grade water0.2μl(1U)Taq polymerase(Promega)1μl基因组文库模板。
反应在PTC-100 Programmable Thermal Controller Cycler(MJ Research)中进行，反应条件为首先94℃预变性5分钟，然后进入下列循环94℃变性25秒，48℃退火30秒，72℃延伸110秒，共进行35个循环，最后72℃延伸10分钟。
H2A的N末端39aa的体外重组表达通过RT-PCR技术，从栉孔扇贝中扩增出H2A的N末端39aa编码区序列，将其克隆到巴斯德毕赤酵母分泌型表达pPIC9K中，构建重组表达质粒pPIC9K-Buf，经Sal I酶切线性化后，采用PEG方法转化毕赤酵母宿主菌GS115。利用G418和PCR方法筛选阳性克隆后，涂布MD平板进行筛选，30℃孵育3-5d。将筛选出来的重组克隆接种到50mlBMMY培养基，30℃振荡培养至OD600介于1-2之间，离心后重悬于5mlBMMY培养基中诱导，每天加入终浓度0.5％的甲醇，30℃振荡诱导培养5天，离心保存上清；SDS-PAGE(Tricine方法)检测表达产物，采用琼脂孔扩散法，以藤黄微球菌和亮弧菌作为受试菌株检验表达产物活性。
具体实施例方式
下面的实施例中将对本发明作进一步的阐述，但本发明不限于此。
实施实例1.一种克隆得到的栉孔扇贝H2A基因，具有以下序列序列表(1)SEQ ID NO 1的信息序列特征长度606碱基对类型核酸链型双链拓扑结构线形来源栉孔扇贝(Chlamys farreri)序列描述ATGTCTGGACGAGGAAAGGGAGGAAAAGTTAAGGGAAAGGCAAAGAGCCGATCATCCCGTGCCGGGCTTCAGTTTCCAGTCGGACGTATCCATCGTCTGCTCCGTAAGGGAAACTATGCCGAGAGAGTTGGAGCCGGTGCCCCAGTCTACTTGGCTGCTGTCCTCGAGTACTTAGCTGCTGAGGTTTTGGAATTGGCAGGAAACGCCGCTAGAGATAACAAGAAGACCAGGATCATCCCCCGTCATCTCCAGTTGGCTATCAGGAACGACGAGGAGTTGAACAAACTGCTGTCCGGTGTCACCATTGCCCAGGGTGGTGTTCTGCCAAACATCCAGGCTGTCCTTCTCCCCAAGAAGACCCAGAAACCTGCCAAGTAAACAGTTCCGGCGTCATTTGGCTCCACACAAAACGGCCCTTTTCAGGGCCACCCACATTACTCAAAAAGTATCCTTATGAACTACCTCGAAATTATACGCAAAAAAAAAACAACAACAAGAACAAACAAACACAGGTCCATTATTCTCGGATATAAGTACACAAAAATGACAAATACATTACAACAGTACACATGATAACACAAGGCATTAGAAACAAAACAAAATAAA(2)SEQ ID NO 2的信息(a)序列特征长度125个氨基酸类型氨基酸链数单链几何结构线形(b)分子类型蛋白质(c)来源栉孔扇贝(Chlamys farreri)(d)序列描述MSGRGKGGKVKGKAKSRSSRAGLQFPVGRIHRLLRKGNYAERVGAGAPVYLAAVLEYLAAEV
LELAGNAARDNKKTRIIPRHLQLAIRNDEELNKLLSGVTIAQGGVLPNIQAVLLPKKTQKPAK本发明从栉孔扇贝中克隆到H2A基因及其N末端体外重组的方法包括1.(1)栉孔扇贝基因组DNA的提取及纯化，利用北京赛百盛科技有限公司的DNA提取纯化Kit从栉孔扇贝肌肉柱中提取总DNA，利用Bechman730分光光度计确定提取的DNA的质量。
(2)栉孔扇贝基因组文库构建，为了构建栉孔扇贝基因组文库，利用ScaI，SmaI，StuI，DraI and SspI消化总栉孔扇贝基因组DNA，通过氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提去除杂蛋白，酒精沉淀消化的基因组DNA.70％酒精洗涤沉淀后用TE溶解。然后与合成的修饰的接头连接。
(3)栉孔扇贝H2A特异性的兼并引物的设计及扩增根据已经获得的H2A的氨基酸序列，利用多序列比对软件，找出其保守的氨基酸位点，设计相应的兼并引物GSPF5’-AAYGAYGARGARYTRAAYAA-3’和特异性的接头引物Adaptor primer1GTAATACGACTCACTATAGGGC；Adaptor primer2ACTATAGGGCACGCGTGGT，PCR扩增，PCR产物用1.0％琼脂糖电泳进行检测，用胶回收试剂盒(上海中科开瑞生物芯片公司)进行PCR产物的回收和纯化，再与pMD-18T simple载体(大连宝生物工程有限公司)连接，转化XL1-blue菌株，挑选阳性克隆提取质粒，用载体引物和特异性引物进行PCR检测，确认插入片段大小后进行序列测定。测得的序列经BLAST(HTTP//WWW.NCBI.NLM.GOV.BLAST)分析拼接后得到全长序列。
(4)栉孔扇贝H2A蛋白N末端39aa的体外重组表达通过RT-PCR技术，从栉孔扇贝中扩增出H2A的N末端39aa编码区序列，将其克隆到巴斯德毕赤酵母分泌型表达pPIC9K中，构建重组表达质粒pPIC9K-Buf，经Sal I酶切线性化后，采用PEG方法转化毕赤酵母宿主菌GS115。利用G418和PCR方法筛选阳性克隆后，涂布MD平板进行筛选，30℃孵育3-5d。将筛选出来的重组克隆接种到50mlBMMY培养基，30℃振荡培养至OD600介于1-2之间，离心后重悬于5mlBMMY培养基中诱导，每天加入终浓度0.5％的甲醇，30℃振荡诱导培养5天，离心保存上清(5)表达产物的活性分析利用Tricine SDS-PAGE方法检测表达产物(Schagger and Von Jagow，1987)。采用琼脂孔扩散法，以藤黄微球菌和亮弧菌作为受试菌株检验表达产物活性，于SOB液体培养基培养至O.D600为0.6，取400μl菌悬液与100mL固体培养基混匀，并铺在无菌培养皿中，待凝固后在平皿中打直径为2mm的小孔，并在孔中分别滴人10μl的待测上清液，37℃培养过夜培养观测抑菌效果。
实施实例2.栉孔扇贝H2A的基因的克隆与表达方法1栉孔扇贝基因组DNA的提取及纯化利用北京赛百盛科技有限公司的DNA提取纯化Kit从栉孔扇贝肌肉柱中提取总DNA，利用Bechman730分光光度计确定提取的DNA的质量(李太武，李成华等。2003)。
2栉孔扇贝基因组文库构建其特征在于，所述的基因组文库构建利用Clontech公司Universal GenomeWalkerTMKit进行构建。
3栉孔扇贝含H2A的基因聚群DNA全长序列的克隆根据已经获得的H2A的氨基酸序列，利用多序列比对软件，找出其保守的氨基酸位点，设计相应的兼并引物GSPF5’-AAYGAYGARGARYTRAAYAA-3’和特异性的接头引物Adaptor primer1GTAATACGACTCACTATAGGGC；Adaptor primer2ACTATAGGGCACGCGTGGT，PCR扩增，PCR产物用1.0％琼脂糖电泳进行检测，用胶回收试剂盒(上海中科开瑞生物芯片公司)进行PCR产物的回收和纯化，再与pMD-18T simple载体(大连宝生物工程有限公司)连接，转化XL1-blue菌株，挑选阳性克隆提取质粒，用载体引物和特异性引物进行PCR检测，确认插入片段大小后进行序列测定。测得的序列经BLAST(HTTP//WWW.NCBI.NLM.GOV/BLAST)分析拼接后得到全长序列。
PCR扩增所用体系以及反应条件25μl反应体系2.5μl 10×PCR buffer1.0μl MgCl2(2.5mM)2.0μl dNTP(2.5mM)1μl引物GSPF(10pmol/μl)1μl引物Adaptor primer(10pmol/μl)16.3μl of PCR-grade water0.2μl(1U)Taq polymerase(Promega)1μl基因组文库模板。
反应在PTC-100 Programmable Thermal Controller Cycler(MJ Research)中进行，反应条件为首先94℃预变性5分钟，然后进入下列循环94℃变性25秒，48℃退火30秒，72℃延伸50秒，共进行35个循环，最后72℃延伸10分钟。
4、H2A的N末端39aa的体外重组表达通过RT-PCR技术，从栉孔扇贝中扩增出H2A的N末端39aa编码区序列，将其克隆到巴斯德毕赤酵母分泌型表达pPIC9K中，构建重组表达质粒pPIC9K-Buf，经Sal I酶切线性化后，采用PEG方法转化毕赤酵母宿主菌GS115。利用G418和PCR方法筛选阳性克隆后，涂布MD平板进行筛选，30℃孵育3-5d。将筛选出来的重组克隆接种到50mlBMMY培养基，30℃振荡培养至OD600介于1-2之间，离心后重悬于5mlBMMY培养基中诱导，每天加入终浓度0.5％的甲醇，30℃振荡诱导培养5天，离心保存上清；SDS-PAGE(Tricine方法)检测表达产物，采用琼脂孔扩散法，以藤黄微球菌和亮弧菌作为受试菌株检验表达产物活性。
实施例3重组H2A N末端产物在体外对细菌的抑制活性抗菌肽在体外具有抑菌活性，所以我们研究了在实施例4-5中重组的H2A N末端在体外对革兰氏阳性菌和阴性菌的抑制活性。采用琼脂孔扩散法，以藤黄微球菌和亮弧菌作为受试菌株检验表达产物活性，于SOB液体培养基培养至O.D600为0.6，取400μl菌悬液与100mL固体培养基混匀，并铺在无菌培养皿中，待凝固后在平皿中打直径为2mm的小孔，并在孔中分别滴入10μl，20μl，50μl的空白对照组上清液和待测组上清液，37℃培养过夜培养观测抑菌效果。结果表明重组H2A N末端产物以依赖浓度的方式对革兰氏阳性菌和阴性菌均表现出明显地抑制活性，其对革兰氏阳性菌的抑菌活性强于阴性菌，而空白对照组未检测到任何抑菌活性，结果如附
图1、2、3所示，栉孔扇贝H2A的N末端重组表达产物的抑菌结果。图1空白对照组，图2藤黄微球菌，图3亮弧菌。
实施例4.栉孔扇贝H2A的N末端重组表达产物在药物生产、饲料添加剂以及防腐剂和保鲜剂生产中的应用。
鉴于栉孔扇贝H2A N末端重组表达产物具有较强的抗菌抑菌活性，纯化的栉孔扇贝H2A的N末端重组表达产物将可以按照一定剂量作为抗菌药物、防腐剂或保鲜剂在相关行业使用，同时重组巴斯德毕赤酵母的培养物及其纯化的栉孔扇贝H2A N末端重组表达产物可以按照一定的比例作为饲料添加剂使用。
权利要求
1.一种克隆得到的栉孔扇贝H2A基因，其特征在于栉孔扇贝H2A基因的基因组序列和该基因编码的氨基酸序列以及其中的部分序列，该基因基因组DNA有一个375bp的开放阅读框，编码125个氨基酸，3’非编码区长包含有两个终止信号，即茎环结构和多聚腺苷酸加尾信号。利用pPIC9K表达载体在毕赤酵母中表达了该蛋白N末端的39aa，表达产物对革兰氏阳性细菌藤黄微球菌、革兰氏阴性菌亮弧菌和毕赤酵母均具有明显的抑菌活性。
2.按照权利要求1所述的栉孔扇贝含H2A的基因聚群，其特征在于栉孔扇贝H2A基因基因组编码区序列ATGTCTGGACGAGGAAAGGGAGGAAAAGTTAAGGGAAAGGCAAAGAGCCGATCATCCCGTGCCGGGCTTCAGTTTCCAGTCGGACGTATCCATCGTCTGCTCCGTAAGGGAAACTATGCCGAGAGAGTTGGAGCCGGTGCCCCAGTCTACTTGGCTGCTGTCCTCGAGTACTTAGCTGCTGAGGTTTTGGAATTGGCAGGAAACGCCGCTAGAGATAACAAGAAGACCAGGATCATCCCCCGTCATCTCCAGTTGGCTATCAGGAACGACGAGGAGTTGAACAAACTGCTGTCCGGTGTCACCATTGCCCAGGGTGGTGTTCTGCCAAACATCCAGGCTGTCCTTCTCCCCAAGAAGACCCAGAAACCTGCCAAGTAAACAGTTCCGGCGTCATTTGGCTCCACACAAAACGGCCCTTTTCAGGGCCACCCACATTACTCAAAAAGTATCCTTATGAACTACCTCGAAATTATACGCAAAAAAAAAACAACAACAAGAACAAACAAACACAGGTCCATTATTCTCGGATATAAGTACACAAAAATGACAAATACATTACAACAGTACACATGATAACACAAGGCATTAGAAACAAAACAAAATAAA序列特征长度606碱基对类型核酸链型双链拓扑结构线形分子类型DNA最初来源栉孔扇贝(Chlamys farreri)
3.按照权利要求1所述的栉孔扇贝H2A基因，其特征在于栉孔扇贝H2A的基因编码蛋白的氨基酸序列MSGRGKGGKVKGKAKSRSSRAGLQFPVGRIHRLLRKGNYAERVGAGAPVYLAAVLEYLAAEVLELAGNAARDNKKTRIIPRHLQLAIRNDEELNKLLSGVTIAQGGVLPNIQAVLLPKKTQKPAK序列特征长度125个氨基酸类型氨基酸链型单链拓扑结构线形分子类型蛋白质来源栉孔扇贝(Chlamys farreri)
4.一种权利要求1所述中栉孔扇贝H2A基因的克隆方法以及其N末端39aa的体外重组表达，包括下列步骤a)栉孔扇贝基因组文库的构建；b)栉孔扇贝含H2A的组蛋白聚群的同源克隆；c)栉孔扇贝H2A的N末端表达载体的构建；d)栉孔扇贝H2A的N末端表达产物的抑菌试验。
5.按照权利要求4所述的栉孔扇贝H2A基因的克隆方法，其特征在于，所述的基因组文库构建利用Clontech公司Universal GenomeWalkerTMKit。
6.按照权利要求4所述的栉孔扇贝H2A基因的克隆方法根据已经获得的H2A的氨基酸序列，利用多序列比对软件，找出其保守的氨基酸位点，设计相应的兼并引物GSPF5’-AAYGAYGARGARYTRAAYAA-3’和特异性的接头引物Adaptor primer1GTAATACGACTCACTATAGGGC；Adaptor primer2ACTATAGGGCACGCGTGGT，PCR扩增，PCR产物用1.0％琼脂糖电泳进行检测，用胶回收试剂盒(上海中科开瑞生物芯片公司)进行PCR产物的回收和纯化，再与pMD-18T simple载体(大连宝生物工程有限公司)连接，转化XL1-blue菌株，挑选阳性克隆提取质粒，用载体引物和特异性引物进行PCR检测，确认插入片段大小后进行序列测定。测得的序列经BLAST(HTTP//WWW.NCBI.NLM.GOV.BLAST)分析拼接后得到全长序列。PCR扩增所用体系以及反应条件25μl反应体系2.5μl 10×PCR buffer1.0μl MgCl2(2.5mM)2.0μl dNTP(2.5mM)1μl引物GSPF(10pmol/μl)1μl引物Adaptor primer(10pmol/μl)16.3μl of PCR-grade water0.2μl(1U)Taq polymerase(Promega)1μl基因组文库模板。反应在PTC-100 Programmable Thermal Controller Cycler(MJ Research)中进行，反应条件为首先94℃预变性5分钟，然后进入下列循环94℃变性25秒，48℃退火30秒，72℃延伸110秒，共进行35个循环，最后72℃延伸10分钟。
7.一种权利要求4所述的栉孔扇贝H2A基因的N末端39aa的体外重组表达，期特征在于通过PCR技术，从插入栉孔扇贝H2A基因的质粒中扩增出H2A的N末端39aa编码区序列，将其克隆到巴斯德毕赤酵母分泌型表达pP工C9K中，构建重组表达质粒pPIC9K-Buf，经Sal I酶切线性化后，采用PEG方法转化毕赤酵母宿主菌GS115。利用G418和PCR方法筛选阳性克隆后，涂布MD平板进行筛选，30℃孵育3-5d。将筛选出来的重组克隆接种到50mlBMGY培养基，30℃振荡培养至OD600介于1-2之间，离心后重悬于5mlBMMY培养基中诱导，每天加入终浓度0.5％的甲醇，30℃振荡诱导培养5天，离心保存上清；SDS-PAGE(Tricine方法)检测表达产物，采用琼脂孔扩散法，以藤黄微球菌和亮弧菌作为受试菌株检验表达产物活性。
8.栉孔扇贝H2A基因的N末端序列重组表达产物在药物生产、饲料添加剂以及防腐剂和保鲜剂生产中的应用。
全文摘要
本发明涉及分子生物学技术领域，是栉孔扇贝蛋白H2A基因克隆及N末端抗菌多肽的克隆表达技术。本发明利用同源克隆技术获得了栉孔扇贝组蛋白H2A基因组全长，该基因DNA有一个375bp的开放阅读框，编码125个氨基酸，3’非编码区包含有两个终止信号，即茎环结构和多聚腺苷酸加尾信号。利用pPIC9K表达载体在毕赤酵母(Pichia pastoris)中表达了该蛋白N末端的39aa，表达产物对革兰氏阳性细菌藤黄微球菌(Micrococcus luteus)和革兰氏阴性菌亮弧菌(Vibrio splendidus)均具有明显的抑菌活性，其中对阳性菌的活性大于阴性菌；同时表达产物对毕赤酵母也有较明显的抑菌活性。本发明利用同源克隆技术和体外重组表达技术从栉孔扇贝中表达了具有较强抑菌效果的组蛋白N末端活性多肽，可为进一步研究栉孔扇贝新颖的防御机制提供基础，并为栉孔扇贝的病害防治、基因辅助选育及进一步开发为医药产品和饲料添加剂奠定基础。
文档编号A61K38/16GK1800389SQ200510044889
公开日2006年7月12日 申请日期2005年10月8日 优先权日2005年10月8日
发明者宋林生, 李成华, 赵建民, 相建海 申请人:中国科学院海洋研究所