专利名称：人生长抑素受体2亚型和大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶共表达载体及其建立和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域的分子克隆和基因治疗，具体涉及构建人生长抑素受体2亚型与大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶共表达载体及其建立和应用，利用“自杀”基因结合放射性显像和内照射等多重作用杀伤肿瘤细胞。
背景技术：
肿瘤是当今社会威胁人类健康的最严重的疾病之一，临床上常规多通过手术、放疗、化疗等方法进行治疗，但在大多数情况下，这些治疗方法不能从根本上治愈病痛，而且毒副作用大，因此疗效不尽如人意。基因治疗的出现给人们带来了新的希望，所谓基因治疗，就是将某种核酸物质(基因表达载体或其他)转移到患者体内，实现特定基因的表达，或封闭特定基因的功能，以达到治疗疾病目的的一种技术。它在治疗肿瘤、病毒性疾病(如乙肝、HIV感染等)和一些遗传、代谢类疾病等的尝试中都取得了令人鼓舞的成效，显示出良好的应用前景。
截至2003年12月，世界各国共批准基因治疗临床方案636项，涉及病人3496人，其中60％以上是针对肿瘤的。目前用于肿瘤基因治疗的基因包括细胞因子基因，肿瘤抑制基因，“自杀”基因，以及外源毒素基因等。其中，包括胞嘧啶脱氨酶(CD)基因在内的“自杀”基因是少数在临床上被证实具有确凿疗效的基因。美国食品与药品管理局(FDA)批准了多项关于“自杀”基因的临床治疗方案，但是单一“自杀”基因治疗的效果尚不令人满意。
生长抑素受体(Somatostatin Receptor，SSTR)是一种G蛋白偶联的膜受体，分布在下丘脑、脑垂体，以及胃肠道、胰腺、胆囊、肾上腺、及甲状腺等部位。SSTR在大多数生长抑素起源的肿瘤中都有高密度的表达，如垂体腺瘤、胰岛细胞瘤、类癌瘤、嗜铬细胞瘤及小细胞肺癌等，另外在乳腺、肾、结肠的腺癌，以及脑膜瘤、高分化星形细胞瘤及淋巴瘤中已有一定的表达。
SSTR存在五种不同的分子亚型SSTR1，SSTR2，SSTR3，SSTR4，SSTR5。20世纪90年代初五种亚型的SSTR分子被相继克隆出来。在同一种类的肿瘤中还存在SSTR亚型表达的差异。如在肺癌中小细胞肺癌中以SSTR2为主，而肺腺癌、肺鳞癌这两种非小细胞肺癌中以SSTR1为主。
生长抑素受体能够与生长抑素(Somatostatin)及其类似物(Somatostatinanalog，SSA)发生高特异性、高亲和力的结合，通过膜内信号传递机制产生生物活性，生长抑素的生物学活性不仅仅止于它对内外分泌腺的抑制作用，经研究还发现它可以通过多种途径作用于肿瘤，抑制肿瘤生长1.直接抗增殖作用通过与肿瘤部位的生长抑素受体结合上调腺苷酸环化酶、磷酸蛋白激酶的活性，降低Ca2+浓度，以及抑制磷脂酰肌醇-3-激酶途径抑制促肿瘤细胞增殖的细胞因子和分子信号，并促进肿瘤细胞发生凋亡。
2.间接抗增殖作用通过抑制促肿瘤生长的激素和生长因子如生长激素(GH)、表皮生长因子(EGF)等以及抑制血管内皮生长因子(VEGF)的促血管形成作用，抑制肿瘤的生长、修复、浸润、和血行性转移。
自上世纪80年代以来，人们开始进行SSTR肿瘤显像以及放射性靶向性治疗研究，即应用放射性核素标记SST或SSA，识别和结合SSTR阳性的肿瘤细胞，进行肿瘤的显像诊断和放射性靶向治疗，并可作为报告基因跟踪目的基因的表达，这些研究均取得了理想的结果。1994年，FDA通过临床应用111In-Octeotide进行全身显像，目前又通过了99mTc标记配基可用于肺癌显像。在SSTR家族成员中，SSTR2由于与多种配基结合时具有较高的亲和力和特异性，因此应用最为广泛。但是其应用范围限于SSTR2阳性的肿瘤细胞，并不是在所有人类肿瘤中都表达SSTR2基因，这样，SSA对SSTR2基因阴性的肿瘤不能起到抑肿瘤作用和靶向性放疗作用。
胞嘧啶脱氨酶(cytosine deaminase，CD)是一种转换药物前体的“自杀”基因，其表达产物可以将无毒性的药物前体5-FC(5-fluorocytosine，5-氟胞嘧啶)，转变为细胞毒性化疗药物5-FU(5-fluorouracil，5-氟尿嘧啶)。其优势是人体可以耐受大剂量的5-FC而不产生明显的毒副作用，在肿瘤局部产生高浓度的杀伤作用，同时引发较强的“旁观者效应”-CD基因阴性靶细胞由于邻近细胞带有药物转变基因也被杀伤。但是单一的基因治疗目前看来难以起到满意的临床治疗效果，而且在实验中难于定位治疗转基因、难于监控疗效等问题，都限制了研究的进展。我们需要一种能够良好监控目的基因转移、表达的方法。
发明内容
本发明通过建立“自杀”基因--胞嘧啶脱氨酶(CD)与报告基因--人生长抑素受体(SSTR)2的共表达载体，利用“自杀”基因/前体药物系统，并协同SSTR2靶向的放射性显像和内照射杀伤肿瘤细胞，抑制肿瘤生长。
人生长抑素受体2亚型与大肠肝菌胞嘧啶脱氨酶共表达载体，其具有序列表<400>1的序列。
上述载体构建方法按以下步骤进行
(1)RT-PCR克隆人SSTR2基因培养含人SSTR2基因的细胞，待细胞生长至足够数量时，提取细胞总RNA，反转录成cDNA第一链，以str5和str3为引物，PCR扩增人SSTR2cDNA，PCR产物经电泳回收后，用EcoR I和NotI酶切，克隆入pcDNA3载体的相应位点，得到pcDNA3-SSTR2，并进行序列测定。RT-PCR所用引物如下str55’-ttt gaattc atg gac atg gcg gat gag cca ctc aat gga-3’；str35’-ttt gcg gcc gctcag ata ctg gtt tgg agg tct cca t-3’。
(2)基因拼接与载体构建以pIRES2-EGFP载体为模板，用引物ir5和si3进行PCR，获得3’端带有SSTR2部分序列的IRES核苷酸序列，同时以pcDNA3-SSTR2为模板，用引物ist5和str3进行PCR，获得5’端带有IRES部分序列的SSTR2核苷酸序列；上述两次PCR产物混合作为模板，以ir5和str3为引物进行PCR，获得IRES-SSTR2序列串联体，并经测序证实；该串联体用BamHI/NotI酶切后，克隆入同酶切割的pIRES2-EGFP-CD，以取代其中的IRES-EGFP序列，得到pIRES-SSTR2；进一步以BcoRI和SmaI酶切pAd-CD载体，得到CD基因，并克隆入pIRES-SSTR2相应位点，最终获得CD和SSTR2双顺反子表达载体pCD-IRES-SSTR2(pCIS)；相关引物序列如下ir55’-tca agc ttc gaa ttc tgc agt cga cgg tac-3’；si35’-cgc cat gtc cat ggt tgt ggc cat att atc atc-3’ist55’-atg gcc aca acc atg gac atg gcg gat gag cca-3’。
共表达载体在制备用于肿瘤治疗的药物中的应用。
本发明将“自杀”基因CD和报告基因SSTR2通过IRES连接，内部核糖体进入位点(IRES)可以将2个基因串联起来，在同一启动子作用下使2个基因转录产生一条双顺反子mRNA，后者在翻译时，核糖体分别识别5’端的翻译起始位点和位于2个基因编码序列之间的IRES，独立地翻译产生2种蛋白。通过上述方法构建了2个基因的共表达载体，进而建立了共表达上述基因的细胞系。本发明利用报告基因SSTR2可以良好监测“自杀”基因CD的表达，提供了一种非侵入性、可重复性、定量性显像方法，将有助于人类基因治疗试验以及分子、细胞治疗动物模型的研究；通过与SSTR2配基SSA标记核素的不同，实现显像或治疗的不同效果；SSA与SSTR2结合后的抑肿瘤作用、SSA标记治疗核素起到的靶向治疗作用、CD基因的杀伤作用，三者有机的结合起来，相互促进，起到单一治疗不可达到的效果。体外和动物实验证实了CD/5-FC“自杀”基因/前体药物系统协同SSTR2介导的放射性显像和杀伤对肿瘤生长的抑制作用，为“自杀”基因联合放射性免疫杀伤和显像治疗肿瘤提供一种新途径。
图1CD和SSTR2双顺反子表达载体构建流程2RT-PCR获得hSSTR2基因电泳照片；图3pCD-IRES2-SSTR2(pCIS)EcoRI/BamHI酶切鉴定；图4间接免疫荧光检测pCIS稳定转染的SKBr3细胞；图55-FC对pCIS稳定转染的人乳腺癌SKBr3(SKBr3-pCIS)细胞的杀伤作用；图6移植瘤长成的裸鼠动物模型；
图7、图8、图9荷瘤小鼠注射99mTc-Octreotide后显像结果。
具体实施例方式
人生长抑素受体2亚型(SSTR-2)与大肠肝菌胞嘧啶脱氨酶(CD)共表达载体，其具有序列表<400>1的序列。其构建方法按以下步骤进行(1)RT-PCR克隆人SSTR2基因培养含人SSTR2基因的细胞如人胚肾293(HEK293)细胞、小细胞肺癌细胞株NCI-H446，待细胞生长至约8×106时，弃去培养液，加入1ml TRIZOL，按照操作说明提取细胞总RNA，溶于DEPC处理的H2O中，应用SuperScriptTM试剂盒反转录成cDNA第一链，以str5和str3为引物，PCR扩增人SSTR2cDNA，PCR产物电泳结果显示有预期大小(1110bp)DNA片段出现，见图2RT-PCR获得hSSTR2基因电泳照片左侧条带.DL2000DNA markers(2000，1000，750，500，250，100bp)；右侧条带.PCR产物，可见hSSTR2在1000条带偏上位置。产物经电泳回收后，克隆入pcDNA3载体的相应位点，得到pcDNA3-SSTR2，进行序列测定并与Genbank中的人SSTR2mRNA比较，证实序列完全正确。
RT-PCR所用引物如下str55’-ttt gaa ttc atg gac atg gcg gat gag cca ctc aat gga-3’；str35’-ttt gcg gcc gct cag ata ctg gtt tgg agg tct cca t-3’。
(2)基因拼接与载体构建应用重叠延伸基因拼接(SOE)结合PCR的方法，获得了IRES-SSTR2编码序列串联体，具体为以pIRES2-EGFP载体为模板，用引物ir5和si3进行PCR，获得3’端带有SSTR2部分序列的IRES核苷酸序列，同时以pcDNA3-SSTR2为模板，用引物ist5和str3进行PCR，获得5’端带有IRES部分序列的SSTR2核苷酸序列。上述两次PCR产物混合作为模板，以ir5和str3为引物进行PCR，获得IRES-SSTR2序列串联体，并经测序证实。该串联体用BamHI/NotI酶切后，克隆入同酶切割的pIRES2-EGFP-CD，以取代其中的IRES-EGFP序列，得到pIRES-SSTR2。进一步以EcoRI和SmaI酶切pAd-CD载体，得到CD基因，并克隆入pIRES-SSTR2相应位点，最终获得CD和SSTR2双顺反子表达载体pCD-IRES-SSTR2(pCIS)，酶切鉴定结果见图3pCD-IRES2-SSTR2(pCIS)EcoRI/BamHI酶切鉴定MDL 2000DNA marker，0pIRES2-EGFP空载体，1、2pCD-IRES2-SSTR2，可见酶切产物条带位于1500左右的位置(CD大小1513bp)；测序结果见序列表<400>11-1513为CD序列；1514-2121为IRES序列；2122-3231为SSTR2序列。
ir55’-tca agc ttc gaa ttc tgc agt cga cgg tac-3’；si35’-cgc cat gtccat ggt tgt ggc cat att atc atc-3’ist55’-atg gcc aca acc atg gac atggcg gat gag cca-3’。
CD和SSTR2双顺反子表达载体构建过程参见图1CD和SSTR2双顺反子表达载体构建流程图。
CD和SSTR2共表达细胞系的建立转染前24h，将人乳腺癌SKBr3细胞接种于6孔培养板中，使细胞生长至底面积60％。对于每孔细胞，将8μl脂质体和4μg pCIS载体分别溶于250μl无血清RPMI 1640培养液，并混合成为转染液，静置20min后加入进行转染。20h后换正常培养液培养48h，加入含400μg/mL G418培养液筛选，3周后获得稳定转染的细胞克隆，挑取10个单克隆，分别扩大培养和冻存。
肿瘤细胞体外杀伤实验(1)MTT(噻唑蓝)法测定5-FC对SKBr3-pCIS细胞克隆的杀伤作用pCIS稳定转染的SKBr3细胞克隆和未经转染的SKBr3细胞培养于96孔板中，分别于掺入200μg/ml 5-FC后的0h、36h和72h进行MTT检测，每孔加入20μl 1.5mg/ml的MTT，继续培养4h后吸去培养液，加入150μl DMSO溶解结晶，用酶联免疫检测仪测定各孔490nm光吸收值，并计算相同处理样品的平均值。结果如表1所示。
表1SKBr3-pCIS克隆200μg/mL 5-FC作用不同时间MTT检测结果(OD490nm)；
表1 Con1、2为未经转染的SKBr3细胞；CIS1-10为pCIS稳定转染的SKBr3细胞克隆。表中可以看出CIS7、2的敏感度较高。
(2)间接免疫荧光检测SSTR2的表达选择对5-FC杀伤敏感的7号克隆，同时随机选取1号克隆和未经转染的SKBr3细胞进行对比研究。细胞培养于6孔板中的盖玻片上，弃去培养液，PBS(pH7.4)洗2次，4％多聚甲醛固定30min，用0.01％Triton和0.3％双氧水各处理30min，5％羊血清封闭30min后，依次与稀释的兔抗人SSTR2抗体和FITC标记的羊抗兔IgG孵育，PBS洗涤，滴一滴PBS在载玻片中央，取出盖玻片，细胞面朝下轻放于载玻片液滴上，荧光显微镜下观察。间接免疫荧光结果见图4间接免疫荧光检测pCIS稳定转染的SKBr3细胞SSTR2在建系的SKBr3-pCIS 7号细胞克隆(左图)中有较高水平的表达，5号克隆(中图)表达量较低，而未经转染的SKBr 3细胞(右图)检测不到SSTR2表达。
(3)5-FC对建系细胞的杀伤作用研究培养(2)中证实共表达CD和SSTR2的SKBr 3细胞(SKBr 3-pCIS克隆7)，分别加入10，50，150，500和1000μg/mL 5-FC，于作用后不同时间进行细胞计数，并按照下式计算细胞死亡率细胞死亡率(％)＝(SKBr3细胞数-SKBr3-pCIS细胞数)/SKBr3细胞数×100％结果显示见图55-FC对pCIS稳定转染的人乳腺癌SKBr3(SKBr3-pCIS)细胞的杀伤作用在10-1000μg/mL药物浓度范围内，细胞均被有效杀伤，随着药物浓度的增加和作用时间延长，杀伤率逐步增高，但在5-FC浓度在150μg/mL以上变化时，细胞杀伤率变化不大，因此可将150-200μg/mL作为研究和体内应用的参考药物浓度。
(4)hSSTR2/188Re-SSA与CD/5-FC系统的协同杀伤作用pCIS转染建系细胞中加入188Re-SSA+5-FC，由于SSA的抑肿瘤作用、188Re的放射性杀伤和CD将5-FC转化为5-Fu的化疗作用三重相结合，肿瘤细胞的死亡率大大提高。
动物实验
(1)显像实验已进行显像实验pCIS转染建系SKBr3细胞接种裸鼠皮下建立肿瘤动物模型，瘤体长至1×1×1cm时尾静脉注射99mTc-Octreotide进行肿瘤显像，见图6、图7、图8、图9。图7注射99mTc-Octreotide后12h，荷瘤小鼠肝脏、肠道显像，移植肿瘤显像(箭头所指)；图8注射后24h，荷瘤小鼠，肿瘤显像最为明显(箭头所指)；图9注射后17h、20h、24h、28h显像结果，可以看出24h肿瘤部位显像剂浓集程度最高，显像效果最好。
(2)治疗实验裸鼠双侧臀部皮下接种SKBr3细胞，建立移植瘤动物模型，瘤体内直接注射Ad-hSSTR2-CD，经尾静脉注射188Re-SSA+5-FC，由于上述的多重作用，肿瘤生长缓慢，部分瘤体出现缩小。
序列表<110>汪静<120>人生长抑素受体2亚型和大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶共表达载体及其建立和应用<160>1<210>1<211>3231<212>DNA<213>人和大肠杆菌<400>1aggctagcaa tgtcgaataa cgctttacaa acaattatta acgcccggtt accaggcgaa 60gaggggctgt ggcagattca tctgcaggac ggaaaaatca gcgccattga tgcgcaatcc 120ggcgtgatgc ccataactga aaacagcctg gatgccgaac aaggtttagt tataccgccg 180tttgtggagc cacatattca cctggacacc acgcaaaccg ccggacaacc gaactggaat 240cagtccggca cgctgtttga aggcattgaa cgctgggccg agcgcaaagc gttattaacc 300catgacgatg tgaaacaacg cgcatggcaa acgctgaaat ggcagattgc caacggcatt 360cagcatgtgc gtacccatgt cgatgtttcg gatgcaacgc taactgggct gaaagcaatg 420ctggaagtga agcaagaagt cgcgccgtgg attgatctgc aaatcgtcgc cttcccttag 480gaagggattt tgtcgtatcc caacggtgaa acgttgctgg aagaggcgtt acgcttaggg 540gcagatgtag tgggggcgat tccgcatttt gaatttaccc gtgaatacgg cgtggagtcg 600
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1.人生长抑素受体2亚型与大肠肝菌胞嘧啶脱氨酶共表达载体，其具有序列表<400>1的序列。
2.如权利要求1所述的共表达载体构建方法按以下步骤进行(1)RT-PCR克隆人SSTR2基因培养含人SSTR2基因的细胞待细胞生长至足够数量时，提取细胞总RNA，反转录成cDNA第一链，以str5和str3为引物，PCR扩增人SSTR2 cDNA，PCR产物经电泳回收后，用EcoRI和NotI酶切，克隆入pcDNA3载体的相应位点，得到pcDNA3-SSTR2，并进行序列测定；上述的RT-PCR所用引物如下str55’-ttt gaa ttc atg gac atg gcg gat gag cca ctc aat gga-3’；str35’-ttt gcg gcc gct cag ata ctg gtt tgg agg tct cca t-3’；(2)基因拼接与载体构建以pIRES2-EGFP载体为模板，用引物ir5和si3进行PCR，获得3’端带有SSTR2部分序列的IRES核苷酸序列，同时以pcDNA3-SSTR2为模板，用引物ist5和str3进行PCR，获得5’端带有IRES部分序列的SSTR2核苷酸序列；上述两次PCR产物混合作为模板，以ir5和str3为引物进行PCR，获得IRES-SSTR2序列串联体，并经测序证实；该串联体用BamHI/NotI酶切后，克隆入同酶切割的pIRES2-EGFP-CD，以取代其中的IRES-EGFP序列，得到pIRES-SSTR2；进一步以EcoRI和SmaI酶切pAd-CD载体，得到CD基因，并克隆入pIRES-SSTR2相应位点，最终获得CD和SSTR2双顺反子表达载体pCD-IRES-SSTR2(pCIS)；相关引物序列如下ir5 5’-tca agc ttc gaa ttc tgc agt cga cgg tac-3’；si 35’-cgc cat gtc cat ggt tgt ggc cat att atc atc-3’ist55’-atg gcc aca acc atg gac atg gcg gat gag cca-3’。
3.如权利要求1所述的共表达载体在制备用于肿瘤治疗的药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及人生长抑素受体2亚型与大肠肝菌胞嘧啶脱氨酶共表达载体及其建立与应用。利用内部核糖体进入位点(IRES)串联SSTR－2与CD，使两者同步表达，建立新的报告基因系统；利用生长抑素受体介导的抑制肿瘤增殖作用、放射性杀伤和显像作用及CD的“自杀”效应，联合杀伤肿瘤。三者有机的结合起来，相互促进，起到单一治疗不可达到的效果，为“自杀”基因联合放射性免疫杀伤和显像治疗肿瘤提供一种新途径。
文档编号A61P35/00GK1782085SQ200510054960
公开日2006年6月7日 申请日期2005年3月17日 优先权日2004年3月18日
发明者汪静, 贾林涛, 王喆, 李国权 申请人:汪静