专利名称：一种脂肪酸合酶抑制剂及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及酶的抑制剂及其制造方法与应用，特别是涉及一种脂肪酸合酶(原称脂肪酸合成酶)抑制剂及其制造方法与其在以脂肪酸合酶为靶点的相关疾病的预防及辅助治疗中的应用。
背景技术：
目前，无论在发达国家还是发展中国家，肥胖症的发病率都呈上升趋势。肥胖被认为是一种易于发现、明显、由多因素决定的复杂的代谢失调症，可影响整个机体正常功能的生理过程(George L.Wolff.The Journal of Nutrition.127，91871-1873(1997))。肥胖可增加患II型糖尿病和心脑血管等疾病的概率(Hubert，H.B.Annu.Rev.Public.Health.7493-502(1986))。这种顽症的蔓延所带来的健康、经济和社会心理等方面的后果是严重的。
2000年，Loftus等人在《Science》上报道脂肪酸合酶(原称脂肪酸合成酶，Fattyacid synthase，EC.2.3.1.85，缩写为FAS)的抑制剂以丙二酰辅酶A为中介，抑制下丘脑中的进食激素神经信号肽Y(NPY)的表达，从而可抑制食欲，使肥胖小鼠的摄食量和体重显著降低(Loftus T.M.et al.Science，2882379-2381(2000))。该文提出FAS可能和动物进食的控制有密切关系，是治疗肥胖症的潜在靶点。抑制FAS的活性既能够阻滞生脂通路，减少脂肪的体内合成，又能够造成丙二酰辅酶A浓度的升高，从而达到降低食欲的目的，具有双重功效。合适的脂肪酸合酶抑制剂既能调节脂肪的代谢和储存，又能降低食欲从而减少食物的摄入量，且其作用并不依赖于特定的基因缺陷。
近年，科学家发现在多种癌细胞中脂肪酸合酶过量存在，而在大多数正常细胞中该酶的含量却较低(Alo P.L，Visca P.，Marci A.，et al.Cancer，77474(1996)；Pizer E.，Lax S.，Kuhajda F.，et al.Cancer，83528(1998)等)；体外实验表明，脂肪酸合酶抑制剂能阻止多种癌细胞的生长(Pizer E.S.，Wood F.D.，HeineH.S.，et al.Cancer Res，561189(1996)；Furuya Y.，Akimoto S.，YasadaK.，et al.Anticancer Res，174589(1997)等)，用该酶抑制剂处理接种肿瘤的小鼠动物模型，可使肿瘤生长受阻，降低小鼠的死亡率(Pizer E.S.，Wood F.D.，Heine H.S.，et al.Cancer Res，561189(1996))。2000年，美国科学家F.Kuhajda针对该领域的研究成果发表了综述，并提出抑制脂肪酸合酶有可能成为肿瘤治疗中一条新的化疗途径(Kuhajda F.P.，Nutrition，16202-208(2000))，使脂肪酸合酶抑制剂有了更广泛的应用前景。
医学期刊《The New England Journal of Medicine》(新英格兰医学杂志)所报道的最新研究，对90万美国健康成年男女进行16年的追踪调查，表明癌症死亡率和肥胖程度(体重系数)具有密切相关关系，肥胖人群的癌症死亡率也高(Calle E.E.，Rodriguez C.，Kimberly W-T.，et al.The New England Journal of Medicine，348(17)1625-1638(2003))。该项研究第一次用科学数据揭示了癌症和肥胖症呈相关关系。
目前为止，已报道的脂肪酸合酶抑制剂较少，只有合成的C75(Kuhajda F.P.，Pizer E.S.，Li J.N.，et al.Proc Natl Acad Sci USA，97，3450-3454(2000))，较早发现的天然产物浅蓝菌素(cerulenin)(Vance D.，Goldberg I.，Mitsuhashi O.et al.Biochem Biophys Res Commun.48，649-656(1972))和绿茶中的酯型儿茶素EGCG(Wang X.，Tian W.X..Biochem Biophys Res Commun，288(5)1200-1206(2001))和ECG(Wang X.，Song K.S.，Guo Q.X.，et al.Biochem Pharmacol，662039-2047(2003))。这些抑制剂所具有的共同缺点是抑制活性不够高，应用价值受到局限，因此提高脂肪酸合酶抑制剂的抑制活性具有重要的实际应用价值。
茶是当今世界上被广泛饮用的大众饮料，也是受很多保健专家推荐饮用的保健饮料之一。饮茶在中国已有二千年以上的历史，至汉代茶已由一种草药发展为日常饮用的饮料。绿茶具有减肥、控制体重和预防癌症的保健功能。研究表明，绿茶和红茶的提取物对脂肪酸合酶具有较强的抑制作用，其抑制功能甚至比绿茶所含的儿茶素EGCG和ECG还强；另一方面，茶提取物对模型小鼠的减重及抑食功能和其对脂肪酸合酶的抑制能力正相关(张睿，肖文平，田维熙。云南大学学报(自然科学版)，26(6A)42-47(2004))。本发明的发明人已于2001年2月23日申请了相关专利“茶叶温浸提取物的新用途”，专利号为01104308.3，该专利已经阐明，茶叶温浸提取物具有抑制脂肪酸合酶活性的作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种抑制活性较高的脂肪酸合酶抑制剂。
本发明所提供的脂肪酸合酶抑制剂，是将茶叶温浸提取物或儿茶素类化合物经酸处理得到的。
所述儿茶素类化合物为酯型儿茶素和单体儿茶素。
在实际应用中，用于处理茶叶温浸提取物或儿茶素类化合物的酸优选为强酸、中强酸或有机酸。其中，强酸可以为无毒的非氧化性强酸，优选为硫酸或盐酸；中强酸可以为PKa值为1-2的无毒的非氧化性中强酸，优选为磷酸；有机酸可以为PKa值为1-5的无毒的非氧化性有机酸，优选为草酸、苹果酸、柠檬酸、酒石酸或乙酸。
为了使处理的效果更好，酸处理的温度一般为25-120℃。
所述处理时间可由所用酸的强弱和温度决定，酸性越强、温度越高所需的处理时间越短，当使用强酸，如硫酸处理时，在室温下(25℃)处理较长时间(19小时)后，所得产物对脂肪酸合酶的抑制活性仍有一定提高(为原始活性的2.6倍)。
本发明的第二个目的是提供一种上述脂肪酸合酶抑制剂的制备方法。
本发明所提供的脂肪酸合酶抑制剂的制备方法，是将茶叶温浸提取物或儿茶素类化合物与酸在25-120℃条件下反应得到脂肪酸合酶抑制剂。
所述用于对茶叶温浸提取物或儿茶素类化合物处理的酸为强酸、中强酸或有机酸，所述强酸可以为硫酸、盐酸或其它无毒的非氧化性强酸，优选为盐酸，浓度为0.2-3.0mol/L；中强酸可以为PKa值为1-2的无毒的非氧化性中强酸，优选为磷酸；有机酸可以为PKa值为1-5的无毒的非氧化性有机酸，优选为草酸、苹果酸、柠檬酸、酒石酸或乙酸，浓度为0.25-2.0mol/L，优选为1mol/L。温度越高处理速度越快，效果越明显，温度越低，则所需时间越长，所述加热温度为25-120℃，优选为70℃-100℃，加热时间优选为30-170分钟。
所述茶叶温浸提取物是用有机溶剂在20℃-40℃条件下对茶叶温浸得到的；所述有机溶剂为10％-95％的乙醇水溶液，优选为50％-70％的乙醇水溶液；所述温浸时间为2-5小时，优选为3小时。
所述儿茶素类化合物包括酯型儿茶素和单体儿茶素，与酸混合前需将纯的或混合的儿茶素类化合物溶于纯水。
为便于包装和携带，反应结束后，可对经上述方法得到的脂肪酸合酶抑制剂进行干燥处理。
本发明显著提高了茶叶提取物以及茶叶的成分儿茶素类化合物(包括酯型儿茶素和单体儿茶素)抑制脂肪酸合酶的能力，从而提供了一类具有较高抑制活性的脂肪酸合酶抑制剂。本发明在制备以脂肪酸合酶为靶点的疾病的预防及辅助治疗方面，特别是在制备控制体重、防治与肥胖相关的疾病以及防治癌症等方面的药物中具有重大意义。同时，本发明的脂肪酸合酶抑制剂在保健品及化妆品的生产中也会有较大的应用价值。
具体实施例方式
下述实施例中，所用的脂肪酸合酶均为用常规方法(W.X.Tian et al.，1985.J.Biol.Chem.，260(20)11375-11387；田维熙等，1996.不同生长期蛋鸡的体脂水平和肝脏脂肪酸合成酶活性的关系.生物化学杂志，12(2)234-236)自新鲜鸡肝中分离提纯的，并经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测为单一带。
脂肪酸合酶活性采用乙酰辅酶A、丙二酰辅酶A、NADPH为底物的标准测活方法测定(W.X.Tian et al.，1985.J.Biol.Chem.，260(20)11375-11387；田维熙等，1996.不同生长期蛋鸡的体脂水平和肝脏脂肪酸合成酶活性的关系.生物化学杂志，12(2)234-236)。
实施例1、绿茶温浸提取物用1M硫酸在100℃下处理制备脂肪酸合酶抑制剂取经粉碎的绿茶加入到10倍重量60％的乙醇中，在30℃、搅拌的条件下温浸2小时，离心取上清液，得到绿茶温浸提取物。向绿茶温浸提取物中加入等体积的2M硫酸，混合后硫酸终浓度为1M，在100℃下恒温处理，每隔一定时间取50μl放到950μl的50％乙醇中(合计绿茶温浸提取物被稀释40倍)，取3μl加入脂肪酸合酶活性测定系统中，测定该酶的活性Ai。对照是经稀释40倍的绿茶温浸提取物，取3μl加入脂肪酸合酶活性测定系统中，测定该酶的活性A0。以对照测定的活性作为1.0，Ai/A0为处理液作用下酶的相对剩余活性，该活性越低表明处理液抑制作用越强。测定结果显示处理液的抑制活性(用被抑制的酶的相对剩余活性表示)随着处理时间增加而增强，但在24min到27min时抑制程度变化已经不明显，说明其活性已经基本达到最高。对处理24min后的处理液，以不同处理液加量测定对脂肪酸合酶的抑制程度，可得到抑制曲线，并由此曲线中酶的剩余活性50％处(也就是抑制程度50％处)可以得到处理液的半抑制浓度(IC50)为1.8μg茶干重/ml，而处理前绿茶温浸提取物的半抑制浓度经测定为37μg茶干重/ml，因而处理后IC50值降低了约20倍，即抑制活性增强了约20倍。
实施例2、绿茶温浸提取物用1M硫酸在70℃下处理制备脂肪酸合酶抑制剂用与实施例1相同的方法得到绿茶温浸提取物，向绿茶温浸提取物中加入等体积的2M硫酸，在70℃下恒温处理，每隔一定时间取50μl放到450μl的50％乙醇中(合计绿茶温浸提取物被稀释20倍)，取5μl加入脂肪酸合酶活性测定系统中，测定该酶的活性Ai。对照是稀释20倍的绿茶温浸提取物，取5μl加入脂肪酸合酶活性测定系统中，测定该酶的活性A0。以对照测定的活性作为1.0，Ai/A0为处理液作用下酶的相对剩余活性。测定结果显示了处理液的抑制活性随着处理时间增加而增强，在170min时抑制程度达到最高。对处理170min后的处理液，以不同处理液加量测定对脂肪酸合酶的抑制程度，可得到抑制曲线，并由此曲线中可以得到该处理液的IC50为1.3μg茶干重/ml，因而处理后IC50值降低了约28倍，即抑制活性增强了约28倍。此结果表明70℃下硫酸处理仍非常有效，但所需时间比100℃下处理要长。
实施例3、绿茶温浸提取物用1M硫酸在40℃下处理制备脂肪酸合酶抑制剂用与实施例1相同的方法得到绿茶温浸提取物，向绿茶温浸提取物中加入等体积的2M硫酸，在40℃下恒温处理，每隔一定时间取50μl放到450μl的50％乙醇中(合计绿茶温浸提取物被稀释20倍)，取10μl加入脂肪酸合酶活性测定系统中，测定该酶的活性Ai。对照是稀释20倍的绿茶温浸提取物，取10μl加入脂肪酸合酶活性测定系统中，测定该酶的活性A0。以对照测定的活性作为1.0，Ai/A0为处理液作用下酶的相对剩余活性。测定结果显示了处理液的抑制活性随着处理时间增加而增强，但增强的速度已明显缓慢，至390分钟时离最大抑制程度仍有很大距离。此时测定得到的半抑制浓度为13.6μg茶干重/ml，抑制活性仅提高到2.7倍。因此40℃下硫酸处理仍然有效，但抑制活性提高的速度已大大低于70℃下处理。
实施例4、绿茶温浸提取物用1M硫酸在室温(25℃)下处理制备脂肪酸合酶抑制剂用与实施例1相同的方法得到绿茶温浸提取物，向绿茶温浸提取物中加入等体积的2M硫酸，在25℃下恒温处理，每隔一定时间取50μl放到450μl的50％乙醇中(合计绿茶温浸提取物被稀释20倍)，取5μl加入脂肪酸合酶活性测定系统中，测定该酶的活性Ai。对照是稀释20倍的绿茶温浸提取物，取5μl加入脂肪酸合酶活性测定系统中，测定该酶的活性A0。以对照测定的活性作为1.0，Ai/A0为处理液作用下酶的相对剩余活性。测定结果显示了处理液的抑制活性随着处理时间增加而增强，但增加的速度非常缓慢。处理19小时处理液的IC50值为14.3μg茶干重/ml，与处理前相比增强到2.5倍，可见室温下硫酸处理对绿茶温浸提取物的活性提高仍然有效，但速度很慢。
实施例5、绿茶温浸提取物用1M盐酸在100℃下处理制备脂肪酸合酶抑制剂用与实施例1相同的方法得到绿茶温浸提取物，向绿茶温浸提取物中加入等体积的2M盐酸，在100℃下恒温处理，每隔一定时间取50μl放到950μl的50％乙醇中(合计绿茶温浸提取物被稀释40倍)，取5μl加入脂肪酸合酶活性测定系统中，测定该酶的活性Ai。对照是稀释40倍的绿茶温浸提取物，取5μl加入脂肪酸合酶活性测定系统中，测定该酶的活性A0。以对照测定的活性作为1.0，Ai/A0为处理液作用下酶的相对剩余活性。测定结果显示了处理液的抑制活性随着处理时间增加而快速增强，在35min时抑制程度达到很高。对处理35min后的处理液，以不同处理液加量测定对脂肪酸合酶的抑制程度，可得到抑制曲线，并由此曲线中可以得到该处理液的IC50为1.7μg茶干重/ml，因而处理后IC50值降低了约21倍，即抑制活性增强了约21倍。此结果表明100℃下1M盐酸处理和1M硫酸处理的结果相似。
实施例6、绿茶温浸提取物用1M乙酸(pKa＝4.76)在100℃下处理制备脂肪酸合酶抑制剂用与实施例1相同的方法得到绿茶温浸提取物，向绿茶温浸提取物中加入等体积的2M乙酸，在100℃下恒温处理，每隔一定时间取50μl放到950μl的50％乙醇中(合计绿茶温浸提取物被稀释40倍)，取10μl加入脂肪酸合酶活性测定系统中，测定该酶的活性Ai。对照是稀释40倍的绿茶温浸提取物，取10μl加入脂肪酸合酶活性测定系统中，测定该酶的活性A0。以对照测定的活性作为1.0，Ai/A0为处理液作用下酶的相对剩余活性。测定结果显示了处理液的抑制活性随着处理时间增加抑制而缓慢增加。对处理200min后的处理液，以不同处理液加量测定对脂肪酸合酶的抑制程度，可得到抑制曲线，并由此曲线中可以得到该处理液的IC50为14.2μg茶干重/ml，因而处理后IC50值降低了约2.6倍，即抑制活性增强了约2.6倍。此结果表明100℃下1M乙酸处理对提高绿茶绿茶温浸提取物抑制脂肪酸合酶的能力仍然有效，但乙酸这样的弱酸比盐酸、硫酸这样的强酸提高抑制活性的能力明显弱了很多。
实施例7、绿茶温浸提取物用1M磷酸在100℃下处理制备脂肪酸合酶抑制剂用与实施例1相同的方法得到绿茶温浸提取物，向绿茶温浸提取物中加入等体积的2M磷酸，在100℃恒温，在20，40，60和100min时取50μl放到450μl的50％乙醇中(合计绿茶温浸提取物被稀释20倍)，取10μl加入脂肪酸合酶活性测定系统中，测定该酶的活性Ai。对照是稀释20倍的绿茶温浸提取物，取10μl加入脂肪酸合酶活性测定系统中，测定该酶的活性A0。以对照测定的活性作为1.0，Ai/A0为处理液作用下酶的相对剩余活性。测定结果表明处理液随着处理时间增加抑制活性增加，和同样温度硫酸及乙酸处理的结果比较，处理20和40min的效果和硫酸处理4min和8min时的效果相仿，但效果大大高于乙酸处理。处理100min后效果达到最大，此时的处理液测定的IC50为2.4μg茶干重/ml，因而处理后IC50值降低了约15倍，即抑制活性增强了约15倍。此结果表明100℃下1M磷酸处理对提高绿茶绿茶温浸提取物抑制脂肪酸合酶的能力显著有效，比乙酸提高的快，比盐酸、硫酸提高的慢。
实施例8、绿茶温浸提取物用1M苹果酸(pKa＝3.40)在100℃下处理制备脂肪酸合酶抑制剂用与实施例1相同的方法得到绿茶温浸提取物，向绿茶温浸提取物中加入等体积的2M苹果酸，在100℃下恒温处理，在20，40，60和100min时取50μl放到450μl的50％乙醇中(合计绿茶温浸提取物被稀释20倍)，取10μl加入脂肪酸合酶活性测定系统中，测定该酶的活性Ai。对照是稀释20倍的绿茶温浸提取物，取10μl加入脂肪酸合酶活性测定系统中，测定该酶的活性A0。以对照测定的活性作为1.0，Ai/A0为处理液作用下酶的相对剩余活性。测定结果表明处理液随着处理时间增加抑制活性增加，处理20min时效果和磷酸处理相似，40min时效果还略高于磷酸，但此后抑制活性不再增加，最终效果不如磷酸处理。对处理40min后的处理液测定的IC50为5μg茶干重/ml，因而处理后IC50值降低了7.4倍，即抑制活性增强了7.4倍。此结果表明100℃下1M苹果酸处理对提高绿茶绿茶温浸提取物抑制脂肪酸合酶的能力仍有效，明显比乙酸提高的快，比盐酸、硫酸提高的慢，和磷酸的效果接近。
实施例9、绿茶温浸提取物用1M柠檬酸(pKa＝3.13)在100℃下处理制备脂肪酸合酶抑制剂用与实施例1相同的方法得到绿茶温浸提取物，向绿茶温浸提取物中加入等体积的2M柠檬酸，在100℃下恒温处理，在20，40，60和100min时取50μl放到450μl的50％乙醇中(合计绿茶温浸提取物被稀释20倍)，取10μl加入脂肪酸合酶活性测定系统中，测定该酶的活性Ai。对照是稀释20倍的绿茶温浸提取物，取10μl加入脂肪酸合酶活性测定系统中，测定该酶的活性A0。以对照测定的活性作为1.0，Ai/A0为处理液作用下酶的相对剩余活性。测定结果表明处理液随着处理时间增加抑制活性增加，但活性提高的速度比苹果酸和磷酸处理时略低，而比乙酸处理活性提高的快。处理60min后活性达到最大，此时的处理液测定的IC50为8.5μg茶干重/ml，因而处理后IC50值降低了约4.3倍，即抑制活性增强了约4.3倍。此结果表明100℃下1M柠檬酸处理对提高绿茶温浸提取物抑制脂肪酸合酶的能力仍有效，比乙酸提高的快，比盐酸、硫酸和磷酸提高的慢。
实施例10、绿茶温浸提取物用0.5M柠檬酸在100℃下处理制备脂肪酸合酶抑制剂用与实施例1相同的方法得到绿茶温浸提取物，向绿茶温浸提取物中加入等体积的1M柠檬酸，在100℃下恒温处理，在20，40，100，150和210min时取50μl放到950μl的50％乙醇中(合计绿茶温浸提取物被稀释40倍)，取10μl加入脂肪酸合酶活性测定系统中，测定该酶的活性Ai。对照是稀释40倍的绿茶温浸提取物，取10μl加入脂肪酸合酶活性测定系统中，测定该酶的活性A0。以对照测定的活性作为1.0，Ai/A0为处理液作用下酶的相对剩余活性。测定结果表明处理液随着处理时间增加抑制活性增加，活性提高的速度和1M柠檬酸处理时相近。处理210min时测定的处理液IC50为6.25μg茶干重/ml，因而处理后IC50值降低了约5.9倍，即抑制活性增强了约5.9倍。此结果表明在100℃下用0.5M柠檬酸处理对提高绿茶温浸提取物抑制脂肪酸合酶的能力仍有效，比用1M柠檬酸处理时的终活性还略高。
实施例11、绿茶温浸提取物用0.25M草酸(pKa＝1.27)在100℃下处理制备脂肪酸合酶抑制剂用与实施例1相同的方法得到绿茶温浸提取物，向绿茶温浸提取物中加入等体积的0.5M草酸，在100℃下恒温处理，在20，40，80和120min时取50μl放到950μl的50％乙醇中(合计绿茶温浸提取物被稀释40倍)，取10μl加入脂肪酸合酶活性测定系统中，测定该酶的活性Ai。对照是稀释40倍的绿茶温浸提取物，取10μl加入脂肪酸合酶活性测定系统中，测定该酶的活性A0。以对照测定的活性作为1.0，Ai/A0为处理液作用下酶的相对剩余活性。测定结果表明处理液随着处理时间增加抑制活性增加，活性提高的速度比苹果酸和柠檬酸处理时略高。处理120min后的处理液测定的IC50为5.4μg茶干重/ml，因而处理后IC50值降低了约6.8倍，即抑制活性增强了约6.8倍。此结果表明100℃下0.25M草酸处理对提高绿茶绿茶温浸提取物抑制脂肪酸合酶的能力仍有效，比苹果酸和柠檬酸酸处理提高的多，比盐酸、硫酸和磷酸提高的少。
实施例12、绿茶温浸提取物用0.2M盐酸在100℃下处理制备脂肪酸合酶抑制剂用与实施例1相同的方法得到绿茶温浸提取物，向绿茶温浸提取物中加入等体积的0.4M盐酸，在100℃下恒温处理，在20，40，60和90min时取50μl放到950μl的50％乙醇中(合计绿茶温浸提取物被稀释40倍)，取10μl加入脂肪酸合酶活性测定系统中，测定该酶的活性Ai。对照是稀释40倍的绿茶温浸提取物，取10μl加入脂肪酸合酶活性测定系统中，测定该酶的活性A0。以对照测定的活性作为1.0，Ai/A0为处理液作用下酶的相对剩余活性。测定结果表明处理液随着处理时间增加抑制活性增加，活性提高的速度比1M盐酸处理时慢。处理90min后的处理液测定的IC50为6.13μg茶干重/ml，因而处理后IC50值降低了约6倍，即抑制活性增强了约6倍。此结果表明100℃下0.2M盐酸处理对提高绿茶绿茶温浸提取物抑制脂肪酸合酶的能力仍有效，但比1M盐酸处理时提高的慢。
实施例13、绿茶温浸提取物用3M盐酸在70℃下处理制备脂肪酸合酶抑制剂用与实施例1相同的方法得到绿茶温浸提取物，向绿茶温浸提取物中加入等体积的6M盐酸，在100℃下恒温处理，在3，10，20min时取50μl放到950μl的50％乙醇中(合计绿茶温浸提取物被稀释40倍)，取10μl加入脂肪酸合酶活性测定系统中，测定该酶的活性Ai。对照是稀释40倍的绿茶温浸提取物，取10μl加入脂肪酸合酶活性测定系统中，测定该酶的活性A0。以对照测定的活性作为1.0，Ai/A0为处理液作用下酶的相对剩余活性。测定结果表明处理液随着处理时间增加抑制活性增加，活性提高的速度1M盐酸处理时高。处理3min后的处理液测定的IC50为5.44μg茶干重/ml，因而处理后IC50值降低了约6.8倍，即抑制活性增强了约6.8倍。处理20min后的处理液测定的IC50为0.99μg茶干重/ml，因而处理后IC50值降低了37倍，即抑制活性增强了37倍。此结果表明100℃下3M盐酸处理对提高绿茶绿茶温浸提取物抑制脂肪酸合酶的能力非常有效，比1M盐酸处理提高的快。
实施例14、绿茶温浸提取物用1M盐酸在120℃下处理制备脂肪酸合酶抑制剂用与实施例1相同的方法得到绿茶温浸提取物，向绿茶温浸提取物中加入等体积的2M盐酸，在120℃下恒温处理30min，对处理液测定的IC50为0.97μg茶干重/ml，因而处理后IC50值降低了约38.1倍，即抑制活性增强了约38.1倍。此结果表明120℃下1M盐酸处理对提高绿茶绿茶温浸提取物抑制脂肪酸合酶的能力非常有效，比1M盐酸100℃下处理时抑制活性提高的更快、更高。
实施例15、绿茶温浸提取物用0.5M酒石酸在100℃下处理制备脂肪酸合酶抑制剂用与实施例1相同的方法得到绿茶温浸提取物，向绿茶温浸提取物中加入等体积的1M酒石酸，在100℃下恒温处理，在20，40，80和150min时取50μl放到950μl的50％乙醇中(合计绿茶温浸提取物被稀释40倍)，取10μl加入脂肪酸合酶活性测定系统中，测定该酶的活性Ai。对照是稀释40倍的绿茶温浸提取物，取10μl加入脂肪酸合酶活性测定系统中，测定该酶的活性A0。以对照测定的活性作为1.0，Ai/A0为处理液作用下酶的相对剩余活性。测定结果表明处理液随着处理时间增加抑制活性增加，活性提高的速度和0.5M及1M柠檬酸处理时相仿。处理150min后的处理液测定的IC50为7.27μg茶干重/ml，因而处理后IC50值降低了约5倍，即抑制活性增强了约5倍。此结果表明100℃下0.5M酒石酸处理对提高绿茶绿茶温浸提取物抑制脂肪酸合酶的能力仍有效，比1M盐酸处理时提高的慢，和柠檬酸处理的效果相近。
实施例16、绿茶温浸提取物用0.25M酒石酸在100℃下处理制备脂肪酸合酶抑制剂用与实施例1相同的方法得到绿茶温浸提取物，向绿茶温浸提取物中加入等体积的0.5M酒石酸，在100℃下恒温处理，在20，40，80和150min时取50μl放到950μl的50％乙醇中(合计绿茶温浸提取物被稀释40倍)，取10μl加入脂肪酸合酶活性测定系统中，测定该酶的活性Ai。对照是稀释40倍的绿茶温浸提取物，取10μl加入脂肪酸合酶活性测定系统中，测定该酶的活性A0。以对照测定的活性作为1.0，Ai/A0为处理液作用下酶的相对剩余活性。测定结果表明处理液随着处理时间增加抑制活性增加，活性提高的速度比0.5M酒石酸处理时慢。处理1500min后的处理液测定的IC50为9.8μg茶干重/ml，因而处理后IC50值降低了约3.7倍，即抑制活性增强了约3.7倍。此结果表明100℃下0.5M酒石酸处理对提高绿茶绿茶温浸提取物抑制脂肪酸合酶的能力仍有效，但比1M酒石酸处理时提高的慢。
实施例17、酯型儿茶素(epigallocatechin gallate，EGCG)用1M硫酸在60℃下处理制备脂肪酸合酶抑制剂向6.8mg/ml的EGCG水溶液中加入等体积的2M硫酸，在60℃恒温18小时，取50μl放到450μl的50％乙醇中(相当于被稀释20倍)，取10μl加入脂肪酸合酶活性测定系统中，测定该酶的活性Ai。对照是稀释20倍的EGCG水溶液，取10μl加入脂肪酸合酶活性测定系统中，测定该酶的活性A0。以对照测定的活性作为1.0，Ai/A0为处理液作用下酶的相对剩余活性。处理18小时后的处理液测定的IC50为0.48μg/ml，处理前为24μg/ml。因而处理后IC50值降低了50倍，即抑制活性增强了50倍。此结果表明60℃下1M硫酸处理可大幅度提高EGCG抑制脂肪酸合酶的能力。
实施例18、单体儿茶素D-(+)catechin用1M硫酸在100℃下处理制备脂肪酸合酶抑制剂在10mg/ml的D-(+)catechin水溶液里，加入等体积的2M硫酸，在100℃下恒温处理30min，取50μl放到450μl的50％乙醇中(合计被稀释20倍)，取10μl加入脂肪酸合酶活性测定系统中，测定该酶的活性Ai。对照是稀释20倍的D-(+)catechin水溶液，取10μl加入脂肪酸合酶活性测定系统中，测定该酶的活性A0。以对照测定的活性作为1.0，Ai/A0为处理液作用下酶的相对剩余活性。处理30min后的处理液测定的IC50为10μg/ml，处理前为1600μg/ml。因而处理后IC50值降低了约160倍，即抑制活性增强了约160倍。此结果表明100℃下1M硫酸处理可大幅度提高D-(+)catechin抑制脂肪酸合酶的能力。
实施例19、控制体重和进食的动物实验选用雌性CD-1小鼠，8周龄，体重25-27克，3组(每组6只)分笼饲养，自由采食含高糖的高能饲料，连续饲养7天。分别于第一天、第四天和第六天给每只小鼠注射0.2ml试验样品溶液。试验组1注射样品为实施例1制备的脂肪酸合酶抑制剂，经乙酸乙酯萃取、干燥、再溶于纯水，浓度为12.2mg/ml。试验组2注射样品为实施例18制备的脂肪酸合酶抑制剂，经乙酸乙酯萃取、干燥、再溶于纯水，浓度为10mg/ml。对照组注射的样品为纯水。结果如表1和表2所示，表1为试验组小鼠每天平均体重的变化值，试验期间对照组小鼠的平均体重无明显变化。表2为试验组小鼠注射本发明脂肪酸合酶抑制剂后24小时的平均摄食量变化值，试验期间对照组小鼠每天的平均摄食量变化不大。结果试验组1小鼠每次注射后第二天体重和摄食量均明显下降，停止注射后则恢复，其中第一次注射后24小时摄食量下降超过了50％(注射前24小时平均摄食量为3.15克)。试验组2小鼠注射后体重和摄食量均明显下降，始终处于原始值之下，其中第一次注射后24小时摄食量下降接近50％，而停止注射后恢复较慢。上述实验结果表明本发明的脂肪酸合酶抑制剂有明显的降低进食和控制体重的作用。
表1 注射本发明脂肪酸合酶抑制剂样品后小鼠每天平均的体重变化(单位克)
表2 注射本发明脂肪酸合酶抑制剂后小鼠24小时平均摄食量的变化(单位克)
实施例20、强酸加热处理绿茶温浸提取物得到的脂肪酸合酶抑制剂对癌细胞生长的作用试验组1样品为实施例1制备的脂肪酸合酶抑制剂，经乙酸乙酯萃取、干燥、再溶于二甲基亚砜。试验组2样品为实施例17制备的脂肪酸合酶抑制剂，经乙酸乙酯萃取、干燥、再溶于二甲基亚砜。对照组样品为纯二甲基亚砜。对肝癌细胞株Bel-7402进行体外培养，试验组中加入定量样品，对照组中加入等量二甲基亚砜。用噻唑蓝还原法(MTT法)检测细胞增生水平，得到细胞抑制率。分别用终浓度为5，10，20，40，60μg/mL的试验组1样品和试验组2样品对肝癌细胞株进行处理。表3为各样品浓度下，和对照组相比试验组的癌细胞抑制率。随着样品浓度的增加，癌细胞生长的抑制率提高，表明本发明的脂肪酸合酶抑制剂具有显著的抑制癌细胞生长的作用。
表3 本发明的脂肪酸合酶抑制剂对肺癌细胞株生长的抑制率(％)
权利要求
1.一种脂肪酸合酶抑制剂，是将茶叶温浸提取物或儿茶素类化合物经酸处理得到的。
2.根据权利要求1所述的脂肪酸合酶抑制剂，其特征在于所述儿茶素类化合物为酯型儿茶素或单体儿茶素。
3.根据权利要求1或2所述的脂肪酸合酶抑制剂，其特征在于所述用于处理茶叶温浸提取物或儿茶素类化合物的酸为强酸、中强酸或有机酸；所述强酸为无毒的非氧化性强酸；中强酸为PKa值为1-2的无毒的非氧化性中强酸；有机酸为PKa值为1-5的无毒的非氧化性有机酸。
4.根据权利要求3所述的脂肪酸合酶抑制剂，其特征在于所述强酸为硫酸或盐酸；中强酸为磷酸；有机酸为草酸、苹果酸、柠檬酸、酒石酸或乙酸。
5.根据权利要求1或2所述的脂肪酸合酶抑制剂，其特征在于所述酸处理的温度为25-120℃。
6.一种权利要求1或2所述的脂肪酸合成酶抑制剂的制备方法，是将茶叶温浸提取物或儿茶素类化合物与酸在25-120℃条件下反应得到脂肪酸合酶抑制剂。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于所述用于处理茶叶温浸提取物或儿茶素类化合物的酸为强酸、中强酸或弱酸，所述强酸为无毒的非氧化性强酸；中强酸为PKa值为1-2的无毒的非氧化性中强酸；有机酸为PKa值为1-5的无毒的非氧化性有机酸；所述用于处理茶叶温浸提取物或儿茶素类化合物的酸的终浓度为0.2-3.0mol/L，加热温度为25-120℃。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于所述强酸为硫酸或盐酸；中强酸为磷酸；有机酸为草酸、苹果酸、柠檬酸、酒石酸或乙酸；所述用于处理茶叶温浸提取物或儿茶素类化合物的酸的终浓度为1mol/L，加热温度为70℃-100℃，加热时间为20-210分钟。
9.根据权利要求6-8任一所述的制备方法，其特征在于所述茶叶温浸提取物是用有机溶剂在20℃-40℃条件下对茶叶温浸得到的；所述有机溶剂为10％-95％的乙醇水溶液，所述温浸时间为2-5小时。
10.权利要求1或2所述的脂肪酸合成酶抑制剂在制备控制体重、预防和辅助治疗肥胖相关疾病以及预防和辅助治疗癌症的药物和保健品中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种脂肪酸合酶抑制剂及其制造方法与应用，其目的是提供一种脂肪酸合酶抑制剂及其制造方法与其在以脂肪酸合酶为靶点的相关疾病的预防及辅助治疗中的应用。该脂肪酸合酶抑制剂，是将茶叶温浸提取物或儿茶素类化合物经酸处理得到的。本发明所提供的脂肪酸合酶抑制剂的制备方法，是将茶叶温浸提取物或儿茶素类化合物与酸在25－120℃条件下反应得到脂肪酸合酶抑制剂。本发明在制备以脂肪酸合酶为靶点的疾病的预防及辅助治疗方面，特别是在控制体重、预防和辅助治疗肥胖相关疾病以及预防和辅助治疗癌症的药物和保健品中具有重大的潜在应用价值。
文档编号A61K31/353GK1836708SQ20051005645
公开日2006年9月27日 申请日期2005年3月23日 优先权日2005年3月23日
发明者田维熙, 张睿, 肖文平, 王燕, 李兵辉 申请人:田维熙