专利名称：从中草药中筛选、分离活性物质的方法、含有该活性物质的组合物及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及应用生物传感器技术，以病原分子为靶点，筛选具有与病原分子发生结合作用的中草药以及通过对中草药提取物中各组分与病原分子结合活性的跟踪检测，定向分离能与病原分子结合的活性组分或活性物质，对所得到的活性组分或活性物质进行针对病原分子的体内外生物学活性评估。
背景技术：
国内外研究经验表明，从来自于天然的先导化合物中很有希望得到治疗疑难病症的新药，从天然化合物筛选得到的有效单体的命中率比合成化合物高。临床及实验研究表明，某些中草药制剂可通过各种机制发挥对症病中病原分子的治疗作用，但由于中草药组成成分复杂，尤其是受方法学的限制，中草药中具有抗病原分子作用的有效物质基础尚不清楚。
脓毒症是由病原分子介导的全身性炎症反应综合征，是导致临床危重病人死亡的主要原因。脓毒症发生的病理生理学机制为病原体侵入机体后，其菌体的致炎病原分子被机体非特异性免疫系统中炎症反应细胞膜上/细胞内相应的模式识别受体识别，导致炎症反应细胞活化，释放炎症介质而引发组织器官的损伤。特别是伴有严重内毒素(LPS)血症的G-杆菌的感染。G-菌菌血症的病死率为20～30％，而由菌血症发展而来的脓毒症休克其病死率可高达50～80％。目前针对脓毒症的治疗，临床上尚缺乏有效的措施，因此导致感染性疾病的治疗更为棘手，研究其发病机理并寻找有效的治疗措施一直是临床医学关注的焦点。
近年来，随着对病原体相关分子(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)及其模式识别受体(pattern recognition receptors，PRRs)的发现，人类对脓毒症的认识发生了质的飞跃。脓毒症发生的病理生理学机制为病原体侵入机体后，其菌体的致炎病原分子/病原体相关分子被机体非特异性免疫系统中炎症反应细胞膜上/细胞内相应的模式识别受体识别，导致炎症反应细胞活化，释放炎症介质而引发组织器官的损伤。
现在我们知道，在微生物的进化过程中，尽管作为脊椎动物病原体的微生物种类繁多，但是由于构成其细胞结构的分子相对保守，因此脊椎动物的非特异性免疫系统可以使用有限数量的受体分子识别结构保守的病原体相关分子。存在于哺乳动物炎症反应细胞膜上的Toll样受体家族(Toll-like receptors，TLRs)及Nod蛋白(Nod proteins)就是哺乳动物识别病原体相关分子的模式识别受体。TLRs是一种跨膜蛋白，目前已发现11种；Nod蛋白是哺乳动物非特异性免疫系统进行胞内识别病原体的模式受体，有Nod1及Nod2两种。目前，比较清楚的识别模式是TLR4识别G-菌的脂多糖/内毒素(Lipopoly-saccharide/endotoxin，LPS)，Nod蛋白识别G+菌的肽聚糖(peptidoglycan，PGN)，TLR9识别细菌基因组DNA(CpG-congtainingoligonucleotides，CpG DNA)，TLR2主要识别PGN、酵母多糖脂蛋白(ZymosanLipoprotein)，TLR3识别双链RNA，TLR5识别鞭毛蛋白，TLR6识别脂肽(Lipopeptides)，TLR7、TLR8识别单链RNA等。
许多病原体如细菌、真菌等均能介导脓毒症的发生，但临床上由G-菌、G+菌介导的脓毒症占95％以上。细菌多个病原分子参与脓毒症的发生，但细菌介导脓毒症发生的主要病原分子是G-菌的LPS、G+菌的PGN和G-菌、G+菌所共有的CpGDNA。LPS、PGN和CpG DNA三个病原分子中任何一个单一分子均可介导致死性脓毒症的发生，然而临床上任何病原体所引发的脓毒症其病原分子都不是单一的，因此只将某一种病原分子作为靶点，可能只能解决脓毒症的部分问题，这可能是既往主要以单一的LPS分子为靶点的脓毒症防治效果欠佳的原因。因此，如能有效地拮抗上述三个主要的病原分子，脓毒症的防治就有可能取得突破性进展。
国内外研究经验表明，从来自于天然的中草药中很有希望得到治疗脓毒症的新药，从中草药中筛选得到的有效单体的命中率比合成化合物高。
同时，临床及实验研究表明，某些中药制剂可通过促进LPS代谢、抑制巨噬细胞的活化等机制发挥对脓毒症的治疗作用，但由于中草药组成成分复杂，尤其是受方法学的限制，中药中抗LPS作用的有效物质基础尚不清楚。
化合物1，2，3，4，6-O-五没食子酰-β-D-葡萄糖(1，2，3，4，6-β-D-pentagalloyglucose，PGG)不是一个新的化合物，在文献《Adachi H，Konishi K，Horikoshi I.The effectsof 1，2，3，4，6-penta-O-galloyl-beta-d-glucose on rat liver mitochondrial respiration.ChemPharm Bull(Tokyo)1989；37(5)1341-1344》中提到，研究表明PGG作为一种黄嘌呤氧化酶抑制剂，可对线粒体的呼吸及氧化磷酸化产生影响，该影响可能通过作用氢化可的松脱氢酶和NADH脱氢酶实现。但未见用于治疗疾病的药物中，更未见用于治疗脓毒症的药物中。
发明内容本发明的主要目的是提供一种从中草药中筛选、分离治疗疾病的活性组分或活性物质的方法。
本发明的另一个目的是通过利用生物传感技术方法，从具有抗菌/抗炎的中草药中筛选、分离并具有治疗脓毒症作用的抗LPS/Lipid A的有效组分或活性物质。
本发明的再一个目的是通过利用生物传感技术方法，从具有抗菌/抗炎的中草药中筛选、分离包含活性物质PGG的药物组合物，本发明的又一个目的是包含活性物质PGG的药物组合物在制备治疗脓毒症的药物中的应用。
一种从中草药中筛选活性组分或活性物质的方法，其原理是通过利用光学原理的光学生物传感器技术，在生物传感器的样品池表面包被固相受体，当受体与其流动相的配体发生结合作用时，以共振角度进入光线衰减区的激光就会发生共振角度的改变，这一变化通过计算机FASTplot和FASTfit程序处理后就可以检测到传感器表面受体与其配体分子之间的相互作用及亲合力。通过特异性的洗脱及回收，即可得到纯度极高的配体分子。
其包括如下步骤①应用生物传感器技术，将病原分子包被于生物传感器的样品池作为固定相配基；使病原分子结构上发挥重要生物学作用的基团外露，以此作为与中草药中治疗疾病的活性物质发生结合作用的靶点，对能与病原分子发生结合作用的中草药进行筛选、并将此结合作用作为进一步分离中草药中拮抗病原分子活性组分或活性物质的检测手段；②以中草药提取物为流动相，使该中草药提取物中的活性物质与固定相的病原分子结合，筛选能够与病原分子发生结合作用的中草药；③将筛选出的与病原分子具有较强结合活性的中草药提取物，经吸附柱层析或高效液相色谱(HPLC)方法或者两种方法相结合进行分离，对所得到的不同组分再次通过生物传感器进行结合活性检测，即可得到能与病原分子发生结合作用<p>表5复方岩白菜素分散片与普通片中马来酸氯苯那敏溶出曲线对比
从表4、表5中可以看出，本发明三批样品的溶出度均一性良好，批内个体差异小，批间重现性好，三批分散片的溶出度均较市售普通片明显加快，5分钟岩白菜素的平均溶出度为73.8％，比普通片在5分钟时的溶出度提高了28.0％以上；马来酸氯苯那敏的平均溶出度为60.0％，比普通片
本发明优点在于，配方中加入氯化钠2.25kg，使等渗效果更好，同时具有稳定溶液的作用，另外在制剂制备过程中，调节PH值，使溶液pH值控制4.0～5.0之间；这样可以稳定溶液，延长贮存期。
具体实施例方式以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。
实施例1一、处方研究(1000瓶)甘油25kg果糖12.5kg氯化钠 2.25kg注射用水适量全量250L二.制备工艺(1000瓶)a.取50L注射用水，加入处方量的甘油、果糖与氯化钠，搅拌使其溶解；b.再按体积加入0.1％(w/v，50g)的针剂用活性炭，充分搅拌，并加热至约70℃，搅拌30分钟，趁热粗滤脱炭；放冷至室温；c.补加注射用水至近全量，测定溶液的pH值和含量，使pH值控制4.0～5.0之间；d.用0.22μm微孔滤膜反复过滤，至溶液澄清；e.滤液按每瓶250ml灌装于250ml无色透明的输液瓶中，加涤纶薄膜，加塞，扎铝盖；f.于115℃热压灭菌30分钟；g.按质量标准检验；h.检验合格的产品进行包装，即得甘油果糖注射液成品。
实施例2一、处方研究(500瓶)甘油25kg果糖12.5kg
具体包括如下步骤A根据亲和型特异选择性生物传感器IAsys plus(Affinity-sensor IAsys plus)样品池的包被流程，将LPS或Lipid A包被在样品池中，并计算包被的LPS或LipidA的量，具体如下①仪器包被温度设定为20℃～25℃，搅拌速率设定为80次/秒～100次/秒；②放入样品池，异丙醇清洗；③PBS/AE清洗，然后异丙醇清洗；④加入1～2mg/ml的LPS或Lipid A氯仿溶液10～30μl，留置1～2min；⑤PBS/AE清洗，然后0.1～0.2M HCl清洗，留置1min；⑥PBS/AE清洗，然后10mM NaOH清洗，留置1～2min；⑦PBS/AE清洗，计算包被值；⑧1.0～2.0mg/ml BSA 90～120μl，保留5～10min；PBS/AE清洗，保留1～2min；⑨检查包被后的共掁图形；在样品池中包被LPS或Lipid A；B回收与Lipid A或者LPS结合的物质①将赤芍5～10μl提取液加入样品池；②与Lipid A或者LPS的结合、解离反应；③分别用亲合反应液反复冲洗，盐酸溶液梯度洗脱，平衡后吸出再生反应液；④回吸收的再生反应液用NaOH调至pH接近7.0后，冷冻抽干，作为下一步分离的参考标准品；C离子交换柱或硅胶柱流出组份与Lipid A或者LPS结合①pH8～9的赤芍提取液静置2～3小时后离心弃上清；②沉淀加入pH6.0～7.0的PBS复溶；③HCl滴定调整pH值为6.0～6.5；④静置2～3小时后离心收集上清；⑤过离子交换柱或硅胶柱层析，收集与Lipid A或者LPS具有高结合活性的组分，旋转蒸发浓缩，低温冷冻抽干即得到与Lipid A或者LPS高结合的中草药活性成分。
D高效液相色谱分离与制备将所得到的中草药活性成分用高效液相色谱法进行进一步的分离，收集与Lipid A或者LPS具有高结合活性的组分，对所得到的组分进行纯度和质谱检测，如不是单一的化合物，则用同法进行进一步的分离，直至得到单一的活性物质。
将LPS的活性中心Lipid A包被于生物传感器(Affinity-Sensor IAsys plus)的样品池作为固定相配基，以明确能够结合Lipid A的中草药提取物为流动相，使固定相的Lipid A阴离子基团与中草药提取物中提取液中的活性物质结构中的阳离子基团通过静电势作用实现结合，通过特异性的洗脱、回收，重新得到高纯度的能够治疗某种疾病的中草药，并以此建立了定向分离、纯化能够与Lipid A特异性结合的化学物质的技术平台。
光学生物传感器技术的原理是利用光学原理，在生物传感器的样品池表面包被固相受体，当受体与其流动相的配体发生结合作用时，以共振角度进入光线衰减区的激光就会发生共振角度的改变，这一变化通过计算机FASTplot和FASTfit程序处理后就可以检测到传感器表面受体与其配体分子之间的相互作用及亲合力，通过特异性的洗脱及回收，即可得到纯度极高的配体分子。
通过对赤芍提取液中各组分与Lipid A结合活性的跟踪检测，分离得到三个与Lipid A具有高亲合力的单体化合物；结构分析明确了其中一个的结构为1，2，3，4，6-O-五没食子酰-β-D-葡萄糖(1，2，3，4，6-β-D-pentagalloyglucose，PGG)，其结构式为 虽然PGG不是一个新的化合物，但是对其生物学活性研究表明①PGG与LipidA具有较高的亲合力，其Kd值为3.2×10-6M；②PGG在体内外实验中对LPS均具有较强的中和作用，并能够显著抑制由LPS介导的TNF-α和/或IL-6的释放；③PGG对LD100LPS攻击动物具有显著的保护作用，并呈明显量效关系。
为了实现上述目的，采用如下技术方案①按照Thermo公司生物传感器操作说明，将Lipid A包被于生物传感器的样品池，由于Lipid A具有亲水端和疏水端，当Lipid A包被在样品池表面形成脂质单分子层后，其疏水的脂肪酸被固定于样品池表面，而亲水端外露，用于和配体结合；根据包被图形即可知道的包被量，即建立中草药的筛选靶点。②以此包被的外露亲水端，从具有拮抗内毒素作用的中草药提取液内垂钓与Lipid A结合的物质，并选择0.01N的HCl做为特异性洗脱液，回收到微量与Lipid A较高结合的物质。虽然与lipid A结合的成分不只一种，但是通过特异性的梯度洗脱，便可能得到纯度较高、结合力较高的结合组分。③通过对回收物进行再次的结合反应测定、LPS中和试验和紫外扫描，得到了对所需物质的初步吸收峰值，特别是对活性基团吸收峰值的确定，为下游的硅胶柱层析和高效液相色谱(HPLC)制备提供参考标准。④硅胶柱层析和HPLC分离单体化合物，得到并明确一个与Lipid A具有高亲合力的单体化合物PGG。在每一步单体成份的的分离过程中，都可以利用与待分离成份与Lipid A的亲合力以监控该成份的存在的部位。
本发明还通过补充实验测定PGG与LPS的结合、中和活性；PGG对LPS介导的巨噬细胞产生TNF-α和/或IL-6的抑制；PGG对LD100LPS攻击动物具有显著的保护作用，研究其用于治疗脓毒症。
以Lipid A为靶点，从中草药中筛选、垂钓，并定向分离拮抗LPS活性的中草药单体物质，具有简便、快捷、稳定可靠的优点，目前国内外尚未见类似的研究。
本发明相对于传统方法具有以下有益效果，①省时传统方法判定一个物质的抗LPS功能最少需要约60分钟，本发明最多需10分钟。②省力对测定的物质不需要特殊处理。③特异性强即只选择与LPS/Lipid A结合的物质。④结果准确由于中草药化学成份复杂，对鲎试剂反就产生干扰，假阴性、假阳性高，本发明不需要其它的成份，特异性高，因此结果准确。⑤实时监控传统的单体分离由于不能建立特异性的筛选、分离靶点，因此有时需要最后才能进行结果判定，而本方法可以随时取样测定与LPS/Lipid A亲合力。同时由于可以微量回吸收与LPS/Lipid A结合的成份进行分析，为下游分离工作提供了指导。而传统的方法在分离的早期是无法达到这一目的。
图1.LPS O55B5在样品池中的包被曲线图2.Lipid A在样品池中的包被曲线图3.42种中草药提取液与Lipid A的结合反应4.生物传感器回吸收物与Lipid A和结合5.生物传感器回吸收物的紫外扫描结果图6.回吸收物与LPS O111B4混合后的紫外扫描结果图7.LPS O111B4的紫外扫描8.硅胶柱流出组分与Lipid A结合9.硅胶柱分离的10-15组分色谱制备10.HPLC制备物与Lipid A的结合11.HPLC制备42min流出峰的紫外扫描结果图12. 42min化合物的红外光谱图13. 42min流出组分的质谱图-1图14. 42min流出组分的流出组分的质谱图-2图15. 42min流出组分的核磁共振图谱图16.PGG和Lipid A的FASTfit解离常数计算17.PGG对LPS的中和作用图18.PGG对细胞活力的影响图19.PGG对LPS攻击小鼠的保护作用
具体实施方式下面结合附图和具体实施例详细描述本发明。
实施例1样品池的包被1.1实验方法根据Thermo公司样品池的包被流程，将LPS及Lipid A包被在样品池中，并计算包被的LPS和Lipid A的量。具体步骤如下①仪器包被温度设定为22℃，搅拌速率设定为85次/sec，数据采集设定为2次/sec；②放入样品池，异丙醇清洗，收集数据曲线1min；③PBS/AE清洗，采集数据10min；异丙醇清洗，采集数据曲线1min；④加入2mg/ml的LPS氯仿溶液20μl，留置1min；⑤PBS/AE清洗，采集数据5min；0.1M HCl清洗，留置1min；⑥PBS/AE清洗，采集数据5min；10mM NaOH清洗，留置1min；⑦PBS/AE清洗，采集数据5min，计算包被值；⑧1.5mg/ml BSA 90μl，保留5min；PBS/AE清洗，保留1min；⑨检查包被后的共掁图形；⑩同法在样品池中包被Lipid A。
1.2实验结果包被后的共掁图像为对称的单峰图形，证明所包被的LPS在样品池中分布均匀，见图1、图2。A、B两点间差的绝对值即为LPS O55B5和LipidA在样品池中的包被量，分别为183.2和251arc second，符合实验要求。
实施例242种中草药提取液与Lipid A的结合反应测定结果2.1实验方法制备42种中草药提取液，分别取5μl上样，测定其与Lipid A的结合反应，检测方法同上。
2.2实验结果赤芍、金银花、乌梅等10种中草药与Lipid A具有高亲合结合的能力(RU结果＞90arc second)。图3的结果显示，中草药与Lipid A结合存在较大的差异，(RU10.54arc second～1204.1arc second)，说明可能这些中草药的抗LPS作用存在较大的差异，其中赤芍与Lipid A具有相当强的特异性结合能力。
实施例3赤芍抗LPS单体的分离研究3.1回收与Lipid A结合的物质3.1.1实验方法赤芍5μl提取液加入样品池，经过与Lipid A的结合、解离反应后，分别再用亲合反应液反复冲洗，盐酸溶液梯度洗脱，平衡后吸出再生反应液，0.1N的HCl再生反应，回吸收的再生反应液加入NaOH，冷冻抽干。
3.1.2实验结果应用生物传感器的回收功能，通过非特异的洗脱去除无效组分，再经特异性的梯度洗脱，将与Lipid A结合的物质从样品池表面洗脱下来，最后将各梯度洗脱组分再次进行与Lipid A的结合测定，结果显示0.01N的Hcl特异性洗脱液回收的物质(其中主要含有酸碱中和后的盐成分)与Lipid A结合的RU最高，见图4。
3.2回收与lipidA结合物质的紫外扫描3.2.1实验方法回吸收物用去热原水溶解后，以去热原水为参照，进行190nm～1100nm的全波段紫外扫描，观察其紫外吸收峰。同时将回吸收物加入等体积的0.05EU/ml LPS标准品LPS O111B4，37℃水浴30min，以LPS为参照，再次测定紫外吸收峰。
3.1.2实验结果紫外扫描吸收峰值为200.4、215.1、276.8nm，结果见图5；在该样品内加入LPS标准品后，其紫外吸收峰值为206.2、247.3、975.5，见图6；单纯的LPS O111B4标准品的紫外吸收峰值为975.5nm，见图7。这提示回吸收物与LPS结合后，其276.8nm吸收峰消失，而出现了247.3nm的新吸收峰，提示回吸收物与LPS作用与其自身的276.8nm吸光基团有关，因此276.8nm的吸收峰可能是其活性中最重要的吸收峰，可做为该活性物质的示踪基团。
3.3硅胶柱流出组份与lipidA结合情况3.3.1实验方法赤芍提取液(pH8)静置2小时后离心弃上清，沉淀加入pH6.0的PBS复溶，HCl滴定调整pH值为6.2，静置2小时后离心，沉淀再用1/4上清体积pH6的PBS复溶(1N的HCl调节)，合并两次上清液，旋转蒸发浓缩，低温冷冻抽干。
3.3.2实验结果在实验中显示，赤芍提取液用NaOH沉淀后，实验中发现沉淀物中含有与lipid A高结合的物质。其中以pH值8沉淀最为理想。沉淀物通过硅胶层析后，其流出组份分部收集，测定与lipidA的结合。硅胶柱洗脱液共收集115管，合并相同的Rf值，得到12个不同的组分(由于柱层析分离更充分，因此其分离出的组分要较薄层层析所观察到的实际组分多)，经生物传感器检测显示，5-10、10-15、21-25、31-35、110-115等组分均与Lipid A有一定的结合，其中以10-15组分最高，其紫外扫描结果与回收物的紫外扫描结果类同。结果见图8。
3.4高效液相色谱分离与制备3.4.1实验方法①色谱分离与Lipid A结合最高RU的组分用60％甲醇配制成0.5mg/ml浓度，进样检测波长275nm，进行色谱分离。②色谱制备色谱柱柱温25℃，流速15ml/min，进样浓度200mg/ml，进样体积200μl，根据流出峰进行收集，负压抽干。PBS配制成1mg/ml浓度，上样，生物传感器测定与Lipid A结合。
3.4.2实验结果硅胶柱分离的10～15组分经过色谱分离，以乙腈为流动相在18％的条件下，分离的效果较好，以此为条件进行色谱制备，见图9。将色谱制备的样品冷冻抽干后，经生物传感器检测显示，42min、75min、100min、68min等流出峰与Lipid A具有一定的结合，其中以42min的RU最大，结果见图10。
3.5结构分析3.4.1实验方法将与Lipid A结合力最高的组分进行紫外光谱、红外光谱、质谱和核磁共掁进行结构分析。
3.4.2实验结果①紫外扫描42min流出组分进行紫外扫描，其吸收峰分别为199.2、214.9、276.8nm，通过三种化合物的紫外吸收峰值比较；提示它具有相同的紫外吸收基团。结果见图11-14②红外光谱对42分钟化合物的红外光谱分析结果如下，结果见图12。
③质谱42min的质谱图如图13-14。
④核磁共掁谱见图15。
⑤质谱及核磁共掁分析如下42min化合物的质谱分析结果为分子离子峰的m/e＝942.0，粹片离子峰解析MS-FAB(neg.)m/z771[M-153-H20]-，175.0[M-765-H]-，分子量为940，与1，2，3，4，6-五-O-没食子酰-β-D-葡萄糖(C41H32O26)分子量相符。
42min的核磁共掁谱见图15。分析结果为该样品的核磁共振谱测试在氘代甲醇中进行。[α]D+41°(c，0.30，MeOH)，氢谱在6.89ppm与7.10ppm之间有5个单峰，其积分值表明每个峰代表2个质子，应为对称取代的苯环上的质子。而另外5组峰则来自于酰化的β-葡萄糖，分别为δ6.22(d，J＝8.4Hz，H-1)，5.89(t，J＝8.4Hz，H-2)，5.61(t，J＝9.5Hz，H-4)，5.58(dd，J＝8.4，9.8Hz，H-3)，4.51(dd，J＝12，1.7Hz，H-6)，4.39(m，H-5，H-6’)。碳谱中，葡萄糖的C-1的化学位移为93.84ppm，与普通的葡萄糖相比，向高场位移了许多，这是由于1位和2位OH被酰化引起的，其它碳原子的化学位移分别为74.44，74.13，72.22，69.84，63.14。而在100～170ppm范围，有5组共振峰，而每一组都包含5个峰，这些共振峰为没食子酸的谱峰，其中167ppm附近的一组峰为羰基峰，146，140，120，110附近的4组峰则分别对应于苯环上的C-3和C-5，C-4，C-1，C-2和C-6。
综合以上红外光谱分析结果、质谱及核磁共掁谱，通过与文献比较，可以确证该化合物为1，2，3，4，6-O-五没食子酰-β-D-葡萄糖(1，2，3，4，6-β-D-pentagalloylglucose，PGG)。其结构式为
实施例4PGG的体外拮抗LPS作用研究4.1PGG与Lipid A的亲合力测定4.1.1实验方法分别以不同浓度的PGG为流动相，与样品池包被Lipid A进行结合反应，具体方法见第一部分，并通过FASTplot和FASTfit作图，测定其解离平衡常数(KD)。
4.1.2实验结果PGG与LPS的活性中心Lipid A具有较高的结合亲合力，其KD值为3.2×10-6M，见图16。
4.2GPP对LPS的LPS中和实验4.2.1实验方法将不同浓度的PGG与定量的LPS标准品LPS O111B4等体积混合，配成终浓度为PGG 8、4、2、1、0μg/ml和LPS标准品0.1EU/ml，37℃孵育30分钟后，测定中和后的LPS值，结果以EU/ml报告，并计算中和率LPS中和率＝(总LPS实测值-中和后LPS实测值)/总LPS实测值。
4.2.2实验结果PGG能够呈剂量依赖性地抑制LPS催化的鲎试剂凝集反应，PGG在8、4、2、1μg/ml的浓度能够中和78.5％、75.4％、35.8％、24.9％的LPS活性，显示了较强的LPS中和作用(图17)。
4.3对LPS刺激的人外周血单核细胞(hPBMC)释放TNF-α和IL-6的抑制作用4.3.1实验方法①量效作用培养4h后的hPBMC加入终浓度为100ng/ml的LPS O111B4，并同时加入不同终浓度的PGG，以LPS 100ng/ml阳性对照，以加入PBS为阴性对照，4h后取上清，ELISA法测定TNF-α和IL-6。②时效作用培养4h后的hPBMC，分别于100ng/ml的LPS O111B4加入的前20、10min(表示“-”)、同时加入及后10、20min(表示“+”)加入终浓度为80μg/ml的PGG，以LPS 100ng/ml阳性对照，以加入PBS为阴性对照，4h后，取上清，ELISA法测定TNF-α和IL-6。
4.3.2实验结果①量效作用PGG能够呈剂量依赖性地抑制LPS刺激的TNF-α和IL-6释放(表1)。②时效作用PGG在LPS刺激前20、10min加入培养细胞，对TNF-α和IL-6均有显著的抑制作用；在10min内加入，虽仍能显著抑制TNF-α和IL-6的分泌(p＜0.05)，但作用要显著弱于同时加入的0时相点(p＜0.05)；但是当在LPS作用细胞20min后加入，其抑制效果明显降低，与LPS对照组比较已无统计学差异；结果见表2。
表1PGG对LPS刺激的hPBMC释放TNF-αe和IL-6影响的量效作用
*，p＜0.05vs LPS；**，p＜0.01vs LPS表2PGG对LPS刺激的hPBMC释放TNF-α和IL-6影响的时效作用
*，p＜0.05 vs LPS；**，p＜0.01 vs LPS；◆，p＜0.05 vs 0min；
4.4PGG对细胞活力影响的测定(MTT法)4.4.1实验方法hPBMC加入不同浓度的PGG培养2h，离心去上清，每孔加入200μl新鲜RPMI 1640培养液，再加入20μl MTT溶液(5mg/ml)，37℃继续培养4h后离心去孔内培养液，每孔加入150μl二甲基亚砜，振荡10min，酶联免疫检测仪490nm处测量各孔的吸光值。
4.4.2实验结果此浓度的PGG对细胞的活性不产生影响，见图18。
4.5PGG对致死剂量LPS攻击小鼠的保护作用4.5.1实验方法NHI小鼠100只，雌雄各半，分为PGG对照组、LPS对照组及PGG 20、40、80mg/kg三个剂量处理组，每组各20只。PGG对照组由尾静脉注射80mg/kg的PGG；LPS对照组注入20mg/kg的LPS O111B4及生理盐水100μl/20g；PGG处理组于LPS注入后立即分别注射20、40、80mg/kg的PGG，每只动物液体注入总量为200μl/20g。分别于8、16、24、48、72h观察动物的存活情况。
4.5.2实验结果20mg/kg的LPS攻击小鼠后，LPS组小鼠在8小时即开始出现死亡，大部分动物集中在8～16h内死亡，24h后LPS组动物已全部死亡；PGG组动物在8～16h小时也出现动物死亡，但动物的死亡数量较少，死亡时间也明显延迟，24h后动物基本上不再死亡。不同剂量的PGG 72h保护率分别为25％、45％(p＜0.05)、70％(p＜0.01)。说明PGG具有较好的剂量效应关系。结果见图19。
权利要求
1.一种从中草药中筛选、分离活性组分或活性物质的方法，包括如下步骤①应用生物传感器技术，将病原分子包被于生物传感器的样品池作为固定相配基，使病原分子结构上发挥重要生物学作用的基团外露，以此作为与中草药中治疗疾病的活性物质发生结合作用的靶点；②以中草药提取物为流动相，使该中草药提取物中的活性物质与固定相的病原分子结合，筛选能够与病原分子发生结合作用的中草药；③将筛选出的与病原分子具有较强结合活性的中草药提取物，经吸附柱层析或者高效液相色谱(HPLC)方法或者两种方法相结合进行分离，对所得到的不同组分再次通过生物传感器进行结合活性检测，即可得到能与病原分子发生结合作用的活性组分或活性物质。
2.根据权利要求1所述的从中草药中筛选、分离活性组分或活性物质的方法，其特征在于，所述生物传感器为亲和型生物传感器。
3.根据权利要求1所述的从中草药中筛选、分离活性组分或活性物质的方法，其特征在于，所述生物传感器为亲和型特异选择性生物传感器IAsysPlus(Affinity-sensor IAsys plus)。
4.根据权利要求1所述的从中草药中筛选、分离活性组分或活性物质的方法，其特征在于，所述吸附柱层析为离子交换柱层析或者硅胶柱层析。
5.根据权利要求1所述的从中草药中筛选、分离活性组分或活性物质的方法，其特征在于，所述病原分子为致炎病原分子内毒素(LPS)或类脂A(Lipid A)。
6.根据权利要求1所述的从中草药中筛选、分离活性组分或活性物质的方法，所述病原分子为肽聚糖或细菌基因组DNA(CpG DNA)。
7.根据权利要求5所述的从中草药中筛选、分离活性组分或活性物质的方法，其特征在于，所述作为流动相的中草药为具有抗炎作用的中草药，其抗炎基础在于本身含有可与病原分子结合的活性组分，所述活性组分通过静电势作用实现与所述病原分子发生特异性结合作用。
8.根据权利要求7所述的从中草药中筛选、分离活性组分或活性物质的方法，其特征在于，所述中草药为赤芍、地丁、阿胶、桅子、枳实、大黄、射干、青果、乌梅、白鲜皮、金银花等84种中草药中一种或一种以上的组合。
9.根据权利要求1所述的从中草药中筛选、分离活性组分或活性物质的方法，其特征在于，所述中草药提取物为水和/或乙醇提取液。
10.根据权利要求1所述的从中草药中筛选、分离活性组分或活性物质的方法，包括如下步骤①应用生物传感器技术，将类脂A(Lipid A)包被于亲和型特异选择性生物传感器IAsys Plus(Affinity-sensor IAsys plus)的样品池作为固定相配基；使类脂A(Lipid A)结构上发挥重要生物学作用的阴离子基团外露，以此作为与中草药中治疗疾病的活性物质发生结合作用的靶点；②以中草药提取液为流动相，使所述中草药提取液中的活性物质与固定相的类脂A(Lipid A)阴离子基团与中草药提取液中的活性物质结构中的阳离子基团通过静电势作用实现结合，筛选能够与类脂A(Lipid A)发生结合作用的中草药赤芍；③将筛选出的与类脂A(Lipid A)具有较强结合活性的赤芍提取液，经吸附柱层析和高效液相色谱(HPLC)方法进行分离，对所得到的不同组分再次通过亲和型特异选择性生物传感器IAsys Plus(Affinity-sensor IAsys plus)进行与类脂A(Lipid A)的结合活性检测，即可得到能与类脂A(Lipid A)发生结合作用的活性组分或活性物质。
11.一种如权利要求1所述的方法制备的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括活性物质1，2，3，4，6-O-五没食子酰-β-D-葡萄糖(1，2，3，4，6-β-D-pentagalloylglucose，PGG)，其结构式为
12.权利要求11所述的药物组合物在制备治疗脓毒症药物中的应用。
全文摘要
一种从中草药中筛选、分离活性组分或活性物质的方法及其药物组合物和在治疗脓毒症中的应用，应用生物传感器技术，将病原分子包被子生物传感器的样品池作为固相配基，以中草药提取物为流动相，使该中草药提取物中的活性物质与固定相的病原分子结合，筛选能够与病原分子发生结合作用的中草药，将筛选出提取物经吸附柱层析和高效液相色谱(HPLC)方法进行分离，对所得到的不同组分再次通过生物传感器进行结合活性检测，得到能与病原分子发生结合作用的活性组分或活性物质。如以LPS的活性中心Lipid A为固定相配基，通过对赤芍提取液与Lipid A的结合反应检测，筛选、分离活性物质1，2，3，4，6－O－五没食子酰－β－D－葡萄糖(PGG)，并将其用于制备治疗脓毒症药物组合物中的应用。该方法具有省时、省力、特异性强、结果准确、能够实时监控等优点。
文档编号A61P31/00GK1864702SQ20051007067
公开日2006年11月22日 申请日期2005年5月18日 优先权日2005年5月18日
发明者郑江, 吕根法, 周红, 郭毅斌, 曹红卫, 王宁, 卫国, 冯文曦 申请人:中国人民解放军第三军医大学第一附属医院